SK289118B6 - Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov - Google Patents

Abstract

Podstata spôsobu purifikácie nižších alkylgalaktozidov spočíva v tom, že zmes získaná po enzymatickej transglykozylácii laktózy, obsahujúca laktózu, glukózu, galaktózu, zvyškový alkohol a alkylgalaktozid, sa po odseparovaní alkoholu kultivuje s kvasinkami selektívne konvertujúcimi monosacharidy na etanol pri teplote 20 až 40 °C, hodnote pH 3,0 až 7,0 v prítomnosti laktózy s koncentráciou 3 až 25 % hmotn., pričom laktóza sa odstráni z vyfermentovaného média kryštalizáciou a následne sa požadovaný alkylgalaktozid získa štandardnými izolačnými postupmi.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu purifikácie alkylgalaktozidov, pripravených enzymaticky z laktózy.

Doterajší stav techniky

Alkylglykozidy patria do skupiny neionogénnych biodegradovateľných činidiel s vysokou povrchovou aktivitou. Sú netoxické, hypoalergénne, nedráždia pokožku a navyše nezaťažujú životné prostredie. Vďaka ich skvelým čistiacim, peniacim, emulzifikačným a antimikrobiálnym účinkom majú široké uplatnenie pri potravinárskej výrobe, pri výrobe čistiacich prostriedkov, kozmetických prípravkov a tiež v oblasti farmaceutického priemyslu. Sú tiež veľmi stabilné v kyslom aj zásaditom prostredí a nereagujú v prítomnosti kyslíka. Ich vlastnosti priamo súvisia s dĺžkou uhlíkového reťazca. Veľkou výhodou je, že sa dajú ľahko biologicky odbúrať a že sa pripravujú z prirodzených obnoviteľných zdrojov, ako sú napríklad sacharidy a alkoholy (Das-Bradoo, S. a kol.: J. Biotechnol. 110, 2004, s. 273-285; Bilaničová, D. a kol.: Czech J. Food Sci. 28, 2010, 69-73).

Alkylglykozidy sa skladajú z hydrofilnej cukornej a hydrofóbnej alkoholovej zložky. Cukornou zložkou môžu byť mono-, di- alebo polysacharidy. Hydrofobicita molekuly je daná prítomnosťou alkoholov nasýtených/nenasýtených, lineárnych/rozvetvených. Primárne alifatické alkoholy s dĺžkou reťazca C1 až C5 sa využívajú na produkciu nižších alkylglykozidov.

Vo všeobecnosti je možné alkylglykozidy pripraviť chemickou alebo enzýmovou cestou. Chemická syntéza alkylglykozidov má niekoľko krokov a obvykle pri nej vzniká zmes anomérov z dvoch možných cyklických foriem glykozidov. Pri tzv. Fischerovej alkylácii vzniká najčastejšie zmes izomérov s prevládajúcou formou α-pyranozidu, a to pri použití glukózy aj galaktózy. Tým, že sa tvoria oba anoméry, sa však znižujú výťažky β-anoméru alkylglykozidu ako cieľového produktu a tiež to komplikuje proces jeho purifikácie. Táto reakcia je navyše časovo náročná, prebieha v podmienkach vysokých reakčných teplôt a v prítomnosti katalyzátorov s rôznym stupňom toxicity. Na to, aby pri použití chemických metód vznikli anomericky čisté glykozidy, je potrebná ochrana hydroxylovej skupiny sacharidov, aktivácia anomérneho uhlíka a následná deprotekcia, čo sú pomerne zdĺhavé a náročné kroky, ktoré chemickú prípravu alkylglykozidov znevýhodňujú a predražujú (Banková, E. a kol.: Biotechnol. Biotec. Eq. 20, 2006, s. 114 - 116; Bilaničová, D. a kol.: Czech J. FoodSci. 28, 2010, 69 - 73).

Čisté β-anoméry alkylglykozidov je možné pripraviť jednokrokovou enzýmovou syntézou z prekurzora sacharidu použitím glykozidáz. Glykozidázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú primárne hydrolýzu glykozidovej väzby. Enzymatická príprava alkylglykozidov prebieha na rozdiel od chemickej syntézy pri miernych reakčných podmienkach a vďaka enzýmom je regio- a stereoselektívna.

Okrem hydrolýzy glykozidovej väzby sú tieto enzýmy za určitých podmienok schopné katalyzovať aj jej vznik, a to prostredníctvom dvoch základných mechanizmov. Prvým je termodynamicky riadená reverzná hydrolýza a druhým transglykozylácia, ktorá je riadená kineticky. Tieto dva mechanizmy sa navzájom líšia použitím donora glykozylu. Pri reverznej hydrolýze je reaktantom monosacharid (napr. glukóza) a pri transglykozylácii je to glykozid (disacharid). Akceptorom glykozylu v reakcii je alkohol. Obe reakcie môžu prebiehať v jednofázovom alebo v dvojfázovom systéme (Ismail, A., Soultani, S., Ghoul, M.: J. Biotechnol. 69, 1999, s. 145 - 149). Posunutiu reakčnej rovnováhy smerom k tvorbe produktu pomáha zníženie aktivity vody v systéme. To však na druhej strane znižuje katalytickú aktivitu glykozidáz. Jedným z riešení je použitie dvojfázového systému, ale aj ten má určité obmedzenia (napr. nestabilita glykozidáz). V dvojfázovom systéme tvorí jednu fázu hydrofóbny alkohol a druhou - vodnou fázou je roztok sacharidu a enzýmu.

Syntéza nižších alkylgalaktozidov - metyl- etyl-, propyl- a čiastočne aj butyl-galaktozidov prebieha v jednofázovom vodnom systéme. V literatúre je ich enzymatická príprava dobre opísaná s využitím voľného aj imobilizovaného enzýmu - β-galaktozidázy (Hronská, H. a kol.: Biocatal. Biotransfor. 34, 2016, s. 219 - 225; Vera, C. a kol.: Process Biochem. 53, 2017, s. 162 - 171).

Izolácia a purifikácia čistého alkylgalaktozidu vyžaduje použitie extrakčných techník, chromatografických metód a postupov opakovanej kryštalizácie. Opísaná bola extrakcia zmesou acetón/voda, pričom podiel acetónu v zmesi sa postupne znižuje. Pri prvej extrakcii s 90 % (v/v) acetónom sa získal propylgalaktozid s čistotou 99 %, ale vo vodnej fáze ostáva ešte značné množstvo produktu, preto sa odporúčajú viacnásobné extrakcie (Vera, C. a kol.: Process Biochem. 53, 2017, s. 162 - 171).

Ďalší spôsob (patent JPH1189591A) uvádza prípravu a izoláciu etylgalaktozidu zo zmesi, ktorá obsahovala laktózu, β-galaktozidázu (Aspergillus oryzae) a kvasinky Saccharomyces cerevisie. Laktóza bola štiepená β-galaktozidázou na glukózu a galaktózu. Vznikajúca glukóza bola kvasinkami ihneď metabolizovaná na etanol, ktorý je potrebný na transglykozyláciu galaktózy v prítomnosti β-galaktozidázy. Po skončení reakcie bol etanol oddestilovaný. Neželané sacharidy boli odstránené zo zmesi pomocou aktívneho uhlia a následnou ionexovou chromatografiou. Po finálnom zakoncentrovaní a vysušení bol týmto spôsobom získaný kryštalický produkt etylgalaktozid s čistotou 99,2 %. Výhodou je, že zdroj alkoholu vzniká činnosťou kvasiniek priamo v reakčnej zmesi. Nevýhodou je zdĺhavá niekoľkodňová reakcia a nižšie celkové výťažky transglykozydačnej reakcie. Hlavnou príčinou sú rozdielne optimálne reakčné podmienky pre kvasinky a enzým, ktoré nie je možné zabezpečiť súčasne (Moriya, K., Nakamura, Z., Ozawa, O.: JPH1189591A, 1997).

Okrem toho sa v literatúre uvádzajú postupy využívajúce pri separácii alkylglykozidov extrakciu z reakčnej zmesi roztokov vody a NaCl a následnú vákuovú destiláciu extraktu, po ktorej sa získa príslušný alkylglykozid (Mingfu, M., Mingqing, C.: CN101239999, 2008) alebo iónové kvapaliny (Haoying, M., Rong, Z.:

CN105907821A, 2016).

Podstata vynálezu

Podstata spôsobu purifikácie nižších alkylgalaktozidov po enzýmovej transglykozylačnej reakcii podľa vynálezu spočíva v tom, že sa do reakčnej zmesi po inaktivácii enzýmu β-galaktozidázy pridávajú kvasinky produkujúce etanol, ale neskvasujúce laktózu a následne sa kultivujú pri teplote 20 až 40 °C, hodnote pH 3,0 až 7,0 v médiu v prítomnosti laktózy v koncentrácii 3 až 25 % hmotn., pričom po skončení kultivácie sa laktóza odstráni z vyfermentovaného média kryštalizáciou a následne sa získa požadovaný alkylgalaktozid bežnými izolačnými postupmi.

Po ukončení enzýmovej transglykolyzačnej reakcie ostáva v reakčnej zmesi okrem želaného produktu (alkylgalaktozid) nespotrebovaná laktóza, zvyškový alkohol a produkty hydrolýzy: glukóza, galaktóza, ktoré významne limitujú efektívnu izoláciu alkylgalaktozidov. Z uvedenej reakčnej zmesi sa odseparuje zvyškový alkohol. Po odstránení alkoholu sa separujú monosacharidy zo zmesi fermentačnými postupmi. Ako produkčné mikroorganizmy sa použijú kvasinky produkujúce etanol, ale ktoré neskvasujú laktózu, pričom je výhodné použiť kvasinky Saccharomyces cerevisiae (pekárenské droždie). Zmes po enzýmovej transglykolyzačnej reakcii sa skoncentruje tak, aby sa obsah laktózy v zmesi pohyboval v rozmedzí 3 až 25 % hmotn. Kultivácia prebieha samovoľne pri pH 3,0 až 7,0, a teplote 20 až 40 °C. Výhodné je udržiavať teplotu v rozmedzí 25 až 35 °C a pH v rozmedzí 5,5 až 6,0, čo sa v prípade potreby dosiahne prídavkom alkalicky reagujúcich roztokov, hlavne NH4OH, KOH, NaOH. Kultivácia prebieha bez prevzdušňovania, zmes sa iba mierne mieša (10 - 50 ot./min.), čo urýchľuje kvasný proces. Pri tomto režime kultivácie vykazujú kvasinky vysokú selektivitu konverzie D-glukózy a D-galaktózy na etanol pri minimálnej tvorbe organických kyselín a ďalších nežiaducich látok. Fermentácia sa uskutočňuje až do úplného vyčerpania monosacharidov a následne sa kvasinky odstránia zo zmesi (napr. centrifugáciou, mikrofiltráciou).

Zmes po fermentácii sa ďalej čistí bežnými priemyselnými postupmi, ako sú dekolorizácia (aktívne uhlie), odsolenie (elektrodialýza, ionovýmenná chromatografia) a pod. Laktóza sa odstráni zo zmesi s alkylglykozidom opakovanou kryštalizáciou. Následne sa príslušný alkylgalaktozid získa zo zakoncentrovaných vodných roztokov kryštalizáciou, prípadne extrakciou s využitím organických činidiel. Naprodukovaný alkohol je možné získať napríklad destiláciou z fermentačnej zmesi a opätovne ho využiť (napr. na prípravu etylgalaktozidov alebo v procese kryštalizácií). Podobne, laktóza získaná z reakčných zmesí kryštalizáciou je vhodná ako substrát na opätovné využitie v transglykozylačných reakciách.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

200 ml zmesi po enzymatickej transglykozylačnej reakcii (120 g/l laktózy, β-galaktozidáza BrennZyme (5 FCC U/cm³), 10 % (v/v) metanol, pH 4,5, teplota 30 °C, miešanie, 6 hod) obsahovalo 39 g/l laktózy, 47,8 g/l glukózy, 12,6 g/l galaktózy, 35,1 g/l metylgalaktozidu a nespotrebovaný metanol. Po úprave pH na hodnotu 8 - 9 sa zmes temperovala 15 minút pri teplote 80 - 90 °C a následne sa ochladila. Z reakčnej zmesi sa oddestiloval zvyškový metanol na vákuovej rotačnej odparke. Po odstránení metanolu sa pridal do tejto zmesi roztok kvasničného extraktu na výslednú koncentráciu 3 - 5 g/l a hodnota pH sa upravila na 6,5. Reakčná zmes sa následne pasterizovala 15 minút pri teplote 90 °C a nakoniec ochladila na teplotu 30 °C. Potom sa pridali do takejto zmesi kvasinky na výslednú koncentráciu 7 g/l. Selektívna fermentácia glukózy a galaktózy prebiehala 24 hodín pri teplote 25 °C až do vyčerpania monosacharidov, pričom obsah laktózy a metylgalaktozidu sa v priebehu fermentácie nemenil. Po ukončení fermentácie pH roztoku bolo 3,5 a následne sa upravilo roztokom KOH na 5,0. Bunková hmota sa odstránila centrifugáciou. Po odfarbení aktívnym uhlím a odsolení pomocou ionovýmennej chromatografie sa roztok obsahujúci laktózu a metylgalaktozid zakoncentroval a nezreagovaná východisková laktóza sa vykryštalizovala po prídavku metanolu zo 70 ml zmesi metanol/voda (75 %/25 %). Po odfiltrovaní laktózy sa filtrát zakoncentroval na olej a metylgalaktozid sa kryštalizoval z 24 ml 75 % vodného etanolu. Kryštály metylgalaktozidu (5,2 g) obsahovali menej ako 1 % nečistôt.

Príklad 2

100 L zmesi po enzymatickej transglykozylačnej reakcii obsahovalo 4,8 g/l laktózy, 16,8 g/l glukózy, 9,1 g/l galaktózy, 10,5 g/l etylgalaktozidu a nespotrebovaný etanol. Po úprave pH na hodnotu 8,7 (NH4OH) sa zmes temperovala 15 minút pri teplote 85 °C a následne sa ochladila na 40 °C. Po tomto kroku sa z reakčnej zmesi oddestiloval na vákuovej odparke zvyškový etanol a následne sa pridal roztok kvasničného extraktu na výslednú koncentráciu 5 g/l. Hodnota pH sa upravila na 5,5 - 6,0 roztokom KOH. Zmes sa potom temperovala 15 minút pri teplote 75 až 80 °C a po jej ochladení na 30 °C sa do nej pridali kvasinky na výslednú koncentráciu 5 g/l. Selektívna fermentácia glukózy a galaktózy prebiehala 20 až 24 hodín pri teplote 30 °C a pH 5,0 až 5,5 až do vyčerpania monosacharidov. Po ukončení fermentácie sa bunková hmota odstránila centrifugáciou. Zmes sa dekolorizovala prídavkom aktívneho uhlia (0,2 g/l), deionizovala pomocou elektrodialýzy, zakoncentrovala a nezreagovaná východisková laktóza sa vykryštalizovala z 35 l zmesi metanol/voda (75 %/25 %). Po separácii laktózy na vákuovom filtri sa filtrát zakoncentroval na sirup a etylgalaktozid sa kryštalizoval z 96 % vodného etanolu. Kryštály etylgalaktozidu (620 g) obsahovali menej ako 1 % nečistôt.

Príklad 3

100 L zmesi po enzymatickej transglykozylačnej reakcii obsahovalo 9,8 g/l laktózy, 15,6 g/l glukózy, 9,4 g/l galaktózy, 7,3 g/l propylgalaktozidu a nespotrebovaný propanol. Po úprave pH na hodnotu 8,8 sa zmes temperovala 15 minút pri teplote 85 °C a následne sa ochladila na 40 °C. Po tomto kroku sa z reakčnej zmesi na vákuovej odparke odstránil zvyškový propanol. Následne sa do zmesi pridal roztok kvasničného extraktu na výslednú koncentráciu 5 g/l a hodnota pH sa upravila po prídavku NaOH na 5,5 - 6,0. Reakčná zmes sa temperovala 15 minút pri teplote 75 °C a po jej ochladení na teplotu 35 °C sa pridali kvasinky na výslednú koncentráciu 10 g/l. Selektívna fermentácia glukózy a galaktózy prebiehala 15 hodín pri teplote 35 °C a pH 5,0 - 5,5 až do vyčerpania monosacharidov. Po ukončení fermentácie sa bunková hmota odstránila centrifugáciou. Po odfarbení média aktívnym uhlím (0,3 g/l) a odsolení pomocou elektrodialýzy sa roztok obsahujúci laktózu a propylgalaktozid zakoncentroval a extrahoval do n-butanolu (3 x 3,0 l) a po zakoncentrovaní butanolového extraktu sa nezreagovaná východisková laktóza vykryštalizovala z 2,5 l 96 % vodného etanolu. Po odfiltrovaní laktózy sa filtrát zakoncentroval na olej a propylgalaktozid sa kryštalizoval zo zmesi 2,5 l isopropanolu a 2,0 l etylacetátu. Kryštály propylgalaktozidu (530 g) obsahovali menej ako 1 % nečistôt.

Priemyselná využiteľnosť

Vynález je možné využiť pri priemyselnej výrobe nižších alkylgalaktozidov, ktoré majú využitie v potravinárskom, chemickom aj farmaceutickom priemysle.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1 . Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov, vyznačujúci sa tým, že zmes po enzymatickej transglykozylácii laktózy, obsahujúca laktózu, glukózu, galaktózu, zvyškový alkohol a alkylgalaktozid, sa kultivuje po separácii alkoholu zo zmesi s kvasinkami selektívne konvertujúcimi monosacharidy na etanol pri teplote 20 až 40 °C, hodnote pH 3,0 až 7,0 v prítomnosti laktózy s koncentráciou

   3 až 25 % hmotn., pričom laktóza sa odstráni z vyfermentovaného média kryštalizáciou a následne sa požadovaný alkylgalaktozid získa štandardnými izolačnými postupmi.
2. 2. Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov podľa nároku 1, nižší alkylgalaktozid je metylgalaktozid.
3. 3. Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov podľa nároku 1, nižší alkylgalaktozid je etylgalaktozid.
4. 4. Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov podľa nároku 1, nižší alkylgalaktozid je propylgalaktozid.
5. 5. Spôsob purifikácie nižších alkylgalaktozidov podľa nároku 1, vyzna vyzna vyzna vyzna čujúci čujúci čujúci čujúci sa tým, sa tým, sa tým, sa tým, že že že že kvasinkami selektívne konvertujúcimi monosacharidy na etanol sú kvasinky rodu Saccharomyces.