SK284215B6

SK284215B6 - Processing for producing a virus-inactivated factor VIII-containing fraction by chromatographic method

Info

Publication number: SK284215B6
Application number: SK566-96A
Authority: SK
Inventors: Ales Strancar; Monika Andrea Stadler; Djuro Josic
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 2004-11-03
Also published as: HU222087B1; AU687451B2; ATE228533T1; DE59410213D1; NO961816L; UA43855C2; KR960705841A; EP0726907B1; JPH09504532A; CZ290186B6; SK56696A3; CZ118796A3; ES2182846T3; CN1109045C; IL111263A; EP0726907A1; FI961900A; RU2148411C1; CA2175670C; ZA948667B

Abstract

A process for producing a virus-inactivated, factor VIII-containing fraction by chromatographic methods in which, starting with cryoprecipitate or blood plasma, possibly followed by a treatment with aluminium hydroxide, at least one separating operation is performed by membrane chromatography after the dissolution of the cryoprecipitate. The fractions are subjected to virus inactivation and preferably an additional pasteurisation step.

Description

Vynález sa týka spôsobu výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII chromatografickými metódami.The invention relates to a process for the production of an inactivated virus fraction comprising factor VIII by chromatographic methods.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Faktor VIII je životne dôležitá látka, ktorá má dôležitú úlohu pri zrážaní krvi. Poruchy zrážavosti krvi je teda možné liečiť podávaním faktora VIII. Preto existuje veľká potreba farmaceutických prípravkov obsahujúcich faktor VIII, ktoré by boli vhodné na podávanie pacientom. Bol uskutočnený rad pokusov o izoláciu faktora VIII vo vysoko obohatenej forme z prírodných zdrojov. Sú už známe chromatografické metódy purifikácie faktora VIII z kryoprecipitátov. Kryoprecipitát je frakcia, ktorú je možné získať spracovaním plazmy za chladu. EP 367 840 BI sa týka chromatografického spôsobu izolácie faktora VIII z krvnej plazmy bez predbežnej kryoprecipitácie. Frakcia obsahujúca faktor VIII sa oddeľuje chromatografickou separáciou na hydrofilnom chromatografickom materiáli, ktorý je modifikovaný skupinami meniacimi ióny. EP 0 238 701 sa týka spôsobu výroby ultračistého infekčného antihemofilického faktora, pri ktorom sú predbežne upravené frakcie tvorené kryoprecipitátom zbaveným fíbrinogénu, globulínu, albumínov a iných rušivých zložiek zrážaním etanolom. V európskej patentovej prihláške č. 88 108 458.6 je opísaná chromatografická separácia pomocou ionexov, ktorej sa podrobuje frakcia kryoprecipitátu po inaktivácii vírusov. V EP 0 173 242 A je opísaný spôsob získavania prípravkov obsahujúcich faktor VIII chromatografiou na anexových materiáloch, ktoré sú výhradne založené na uhľohydrátoch, pričom uhľohydrátová matrica je modifikovaná skupinami DEAE. Ako užitočné materiály sú opísané predovšetkým DEAE Sepharose a DEAE celulóza. V GB-A-1 178 958 je opísaná purifikácia faktora Vili pri použití kolón naplnených ECTEOLA celulózou. Táto modifikovaná celulóza obsahuje bázické substituenty zavedené reakciou s epichlórhydrínom a trietanolamínom. Pri opísaných postupoch známych z doterajšieho stavu techniky sa využíva diskontinuálna chromatografická separácia alebo stĺpcová chromatografia. Napriek tomu, že sa týmito spôsobmi dosahujú dosť dobré výsledky, stále pretrváva potreba z ekonomických a etických dôvodov zvýšiť výťažky biologicky hodnotného faktora VIII.Factor VIII is a vital substance that plays an important role in blood clotting. Thus, blood clotting disorders can be treated by administration of factor VIII. Therefore, there is a great need for pharmaceutical compositions containing factor VIII that are suitable for administration to patients. A number of attempts have been made to isolate Factor VIII in highly enriched form from natural sources. Chromatographic methods for the purification of factor VIII from cryoprecipitates are already known. Cryoprecipitate is a fraction obtainable by cold plasma processing. EP 367 840 B1 relates to a chromatographic method for the isolation of factor VIII from blood plasma without preliminary cryoprecipitation. The factor VIII-containing fraction is separated by chromatographic separation on a hydrophilic chromatography material that is modified with ion-exchange groups. EP 0 238 701 relates to a process for the production of an ultra-pure infectious anti-haemophilic factor, wherein the pretreated fractions consist of a cryoprecipitate devoid of fibrinogen, globulin, albumins and other interfering components by ethanol precipitation. In European patent application no. No. 88,108,458.6 discloses ion exchange chromatography separation to which a cryoprecipitate fraction is subjected to virus inactivation. EP 0 173 242 A describes a process for obtaining factor VIII-containing preparations by chromatography on anion exchange materials that are exclusively based on carbohydrates, wherein the carbohydrate matrix is modified by DEAE groups. In particular, DEAE Sepharose and DEAE cellulose are described as useful materials. GB-A-1 178 958 describes the purification of factor VIII using columns packed with ECTEOLA cellulose. This modified cellulose contains basic substituents introduced by reaction with epichlorohydrin and triethanolamine. BACKGROUND OF THE INVENTION BACKGROUND OF THE INVENTION Discontinuous chromatographic separation or column chromatography is used in the prior art processes. Despite the fact that these methods achieve rather good results, there is still a need for economic and ethical reasons to increase the yields of biologically valuable factor VIII.

V EP-A-0 286 323 je opísaný spôsob čistenia polypeptidov pomocou imobilizovaných protilátok. Sú tu tiež opísané ďalšie purifikačné stupne vykonávané na celulózových membránach modifikovaných anexami. Opísaným postupom je tiež možné purifikovať faktor VIII.EP-A-0 286 323 discloses a method for purifying polypeptides using immobilized antibodies. Also described are additional purification steps performed on anion exchange resin modified cellulose membranes. It is also possible to purify Factor VIII as described above.

Úlohou tohto vynálezu je teda vyriešiť technický problém spočívajúci vo vyvinutí spôsobu, ktorý vychádza z doterajšieho stavu techniky, ale umožňuje zlepšenú prípravu faktora VIII, pokiaľ sa týka výťažkov a biologickej účinnosti.It is therefore an object of the present invention to solve the technical problem of developing a prior art process but allowing improved preparation of factor VIII in terms of yields and biological activity.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

S prekvapením bol tento problém vyriešený spôsobom podľa vynálezu. Predmetom vynálezu je spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII, ktorého podstata spočíva v tom, že sa v roztopenom kryoprecipitáte alebo krvnej plazme po prípadnom spracovaní hydroxidom hlinitým inaktivujú vírusy pôsobením di- alebo trialkylfosfátu a nciónového povrchovo aktívneho činidla a potom sa vzniknutá frakcia podrobí aspoň jednej separačnej operácii pri použití membránovej chromatografie na membránach alebo kompaktných diskoch z poréznych hydrofilných polymérov zvolených z polyglycidylmetakrylátov alebo hydrofilizovaného polystyrénu.Surprisingly, this problem was solved by the method of the invention. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the production of a factor VIII inactivated virus fraction, which comprises inactivating the viruses in a molten cryoprecipitate or blood plasma after treatment with aluminum hydroxide with di- or trialkyl phosphate and a non-ionic surfactant. at least one separation operation using membrane chromatography on membranes or compact disks of porous hydrophilic polymers selected from polyglycidyl methacrylates or hydrophilized polystyrene.

Spôsob podľa vynálezu sa môže realizovať pri použití obchodne dostupného kryoprecipitátu alebo krvnej plazmy. Roztopený kryoprecipitát sa prednostne spracováva hydroxidom hlinitým na účely ďalšej predbežnej purifikácie vzorky, ktorou sa predbežne zvýši koncentrácia faktora VIII.The method of the invention may be carried out using commercially available cryoprecipitate or blood plasma. The melted cryoprecipitate is preferably treated with aluminum hydroxide for the purpose of further pre-purifying the sample to pre-increase the factor VIII concentration.

Inaktivácia vírusov sa vykonáva pred vlastnou chromatografickou purifikáciou na materiáloch, ktoré sú usporiadané v alebo na membránach. Inaktivácia vírusov sa pritom uskutočňuje spôsobom opísaným v EP 131 740 Al pomocou spracovania biokompatibiInými organickými rozpúšťadlami (detergentmi), zmesou Tritonu® X-100 a tri-n-butylfosfátu (TNBP), prednostne zmesou Tweenu® a TNBP. Dobré výsledky sa dosahujú tiež pri použití zmesi cholátu sodného a TNBP. Detergenty sa prednostne používajú v množstvách do 15 % hmotnostných.Virus inactivation is performed prior to the actual chromatographic purification on materials arranged in or on membranes. The virus inactivation is carried out as described in EP 131 740 A1 by treatment with biocompatible organic solvents (detergents), a mixture of Triton (R) X-100 and tri-n-butyl phosphate (TNBP), preferably a mixture of Tween (R) and TNBP. Good results are also obtained with a mixture of sodium cholate and TNBP. Detergents are preferably used in amounts up to 15% by weight.

Chromatografický separačný stupeň na purifikáciu faktora VIII vo vzorke sa môže vykonávať buď na základných materiáloch modifikovaných skupinami meniacimi ióny, predovšetkým na anexoch, alebo pri použití materiálov modifikovaných imunoafmitnými ligandami. Pritom je rozhodujúce, že uvedené materiály musia byť usporiadané do podoby membrán. Tieto membrány a kompaktné disky sú zhotovené z poréznych poly-(glycidylmetakrylátov) a/alebo z hydrofilizovaného polystyrénu.The chromatographic separation step for the purification of factor VIII in the sample can be carried out either on basic materials modified with ion-exchange groups, in particular on anion exchangers, or using materials modified with immunoaffinity ligands. The decisive factor here is that the said materials must be arranged in the form of membranes. These membranes and compact disks are made of porous poly (glycidyl methacrylates) and / or hydrophilized polystyrene.

Membrána vhodná na delenie sa skladá z kompaktných diskov zhotovených z polymémych nosičov. Základné materiály membrán alebo diskov sú vybavené zodpovedajúcimi skupinami meniacimi anióny alebo imunoafmitnými ligandami. Ako ionexové skupiny prichádzajú do úvahy predovšetkým skupiny meniace anióny, ako sú skupiny kvartémych amínov alebo dietylaminoetylskupiny. Vhodnými katexami sú predovšetkým v podstate slabo a silne kyslé meniče katiónov, ako sú materiály, ktoré sú modifikované sulfónovými skupinami alebo skupinami kyseliny fosforečnej.The diaphragm suitable for separation consists of compact discs made of polymeric carriers. The base materials of the membranes or disks are provided with corresponding anion exchange groups or immunoaffinity ligands. Suitable ion exchange groups are, in particular, anion exchange groups such as quaternary amine groups or diethylaminoethyl groups. Suitable cation exchangers are, in particular, substantially weak and strongly acidic cation exchangers, such as materials modified with sulfonic or phosphoric acid groups.

Skupiny meniace ióny môžu byť pripojené k vláknam základného materiálu prostredníctvom tzv. medzerníkov (spacerov) alebo bez nich. Materiály obsahujúce spacery sa tiež označujú názvom tentaklové (tykadlové) materiály. Zodpovedajúce spacery a ligandy sú uvedené v DE 42 04 694. Ako spacer môže tiež napríklad slúžiť glukózamínový zvyšok. Skupiny meniace anióny, ak sú DEAE alebo skupiny kvartémych amínov, môžu byť tiež pripojené k membránam zhotoveným z porézneho poly(glycidylmetakrylátu) alebo iných uvedených materiálov. Skupiny meniace anióny môžu byť pritom pripojené buď priamo k membránotvomému materiálu alebo tiež prostredníctvom spaceru, napríklad glukózaminového zvyšku.The ion-exchange groups may be attached to the fibers of the base material by means of so-called " or spacers. Materials containing spacers are also referred to as tentacle materials. Corresponding spacers and ligands are disclosed in DE 42 04 694. For example, a glucosamine residue may also serve as a spacer. Anion exchange groups, if DEAE or quaternary amine groups, may also be attached to membranes made of porous poly (glycidyl methacrylate) or other materials mentioned herein. The anion exchange groups can be attached either directly to the membrane-forming material or also by means of a spacer, for example a glucosamine residue.

Podľa ďalšieho rozpracovania spôsobu podľa vynálezu sa používa afinitná membránová chromatografia s imobilizovanými látkami, ktoré majú vysokú afinitu proti faktoru VIII.According to a further embodiment of the process according to the invention, affinity membrane chromatography with immobilized substances having a high affinity against factor VIII is used.

Látky majúce afinitu proti faktoru VIII sa na nosičoch imobilizujú prostredníctvom chemicky reaktívnych skupín. Také reaktívne skupiny prednostne atakujú koniec spaceru a nie priamo nosičový materiál. Imobilizácia látok pre faktor VIII sa vykonáva prostredníctvom väzby k reaktívnym skupinám ako je tozylová, trezylová alebo hydrazidová skupina a iné. Zodpovedajúce postupy sú známe z T. M.Substances having affinity for factor VIII are immobilized on carriers through chemically reactive groups. Such reactive groups preferably attack the end of the spacer and not directly the support material. The immobilization of the factor VIII substances is accomplished through binding to reactive groups such as a tosyl, tresyl or hydrazide group and others. Corresponding procedures are known from T. M.

Phillips „Afinity Chromatography“ v „Chromatography“ (E. Heftmann ed.), 5. vydanie, Elsevier, Amsterdam 1992.Phillips "Afinity Chromatography" in "Chromatography" (E. Heftmann ed.), 5th edition, Elsevier, Amsterdam 1992.

Podľa iného prednostného uskutočnenia sa na separáciu faktora VIII používajú materiály, ktoré sú schopné zaistiť hydrofóbnu interakciu. Ako hydrofóbne materiály sa používajú acyklické a/alebo cyklické alkylové reťazce, napríklad alkylové reťazce s 1 až 18 atómami uhlíka, a aromatické látky. Vhodné materiály poskytujúce hydrofóbnu interakciu prednostne zahŕňajú látky s odstupňovanou hydrofobicitou. Hydrofobicitu je možné odstupňovať zavedením polárnych skupín, ako sú protické poláme alebo aprotické poláme skupiny, napríklad hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny. Prednostne sa toto odstupňovanie hydrofobicity vykonáva s ohľadom na príslušné separačná podmienky.According to another preferred embodiment, materials that are capable of providing a hydrophobic interaction are used to separate factor VIII. The hydrophobic materials used are acyclic and / or cyclic alkyl chains, for example alkyl chains of 1 to 18 carbon atoms, and aromatics. Suitable materials providing hydrophobic interaction preferably include graded hydrophobicity. Hydrophobicity can be graded by introducing polar groups such as protic or aprotic polar groups, for example, hydroxy, amino and cyano groups. Preferably, this hydrophobicity grading is performed with respect to the respective separation conditions.

Inaktivácia vírusov sa tiež môže vykonávať spracovaním teplom. Prednostne sa pritom postupuje tak, že sa eluovaná vzorka obsahujúca faktor VIII spracováva v pasterizačnom stupni po prvom membránovom chromatografickom stupni. Zodpovedajúci postup je navrhnutý v DE-A-43 18 435.9. Pritom sa frakcie obohatené faktorom VIII uvádzajú do styku s di- alebo trialkylfosfátmi a prípadne s namáčadlami v prítomnosti stabilizátorov a súčasne alebo následne sa na nich pôsobí počas 5 hodín až 30 hodín zvýšenými teplotami v rozmedzí od 55 do 67 °C. Môže byť výhodné kombinovať obidve tieto metódy inaktivácie vírusov, t. j. spracovanie detergentmi a pôsobenie tepla.Virus inactivation can also be performed by heat treatment. Preferably, the eluted factor VIII-containing sample is treated in a pasteurization step after the first membrane chromatography step. A corresponding procedure is proposed in DE-A-43 18 435.9. The Factor VIII-enriched fractions are contacted with di- or trialkylphosphates and optionally wetting agents in the presence of stabilizers and simultaneously or subsequently treated at elevated temperatures in the range of 55 to 67 ° C for 5 to 30 hours. It may be advantageous to combine both of these methods of virus inactivation, i. j. detergent treatment and heat treatment.

Na odstránenie chemikálii použitých v pasterizačnom stupni môže nasledovať druhá membránová chromatografia. Oddeľovanie pridaných stabilizátorov sa prednostne uskutočňuje pomocou membrány modifikovanej DEAE alebo kvartémymi amóniovými zlúčeninami, ktoré sú usporiadané na povrchu chromatografického nosičového materiálu pri použití spacerov. Zodpovedajúce ligandyje možné usporiadať na povrchu nosičového materiálu tiež bez použitia spacerov. Za zvolených podmienok nie sú stabilizátory týmto anexovým materiálom retardované, zatiaľ čo faktor VIII sa adsorbuje na chromatografickom materiáli.A second membrane chromatography may be followed to remove the chemicals used in the pasteurization step. The separation of the added stabilizers is preferably carried out by means of a DEAE-modified membrane or quaternary ammonium compounds which are arranged on the surface of the chromatographic support using spacer. Corresponding ligands can also be arranged on the surface of the support material without the use of spacers. Under selected conditions, the stabilizers are not retarded by this anion exchange material, while Factor VIII adsorbs on the chromatographic material.

Potom sa faktor VIII eluuje vodným rozpúšťadlovým systémom s postupne vzrastajúcimi koncentráciami soli.Then, Factor VIII is eluted with an aqueous solvent system with gradually increasing salt concentrations.

Frakcia obsahujúca faktor VIII, ktorá sa takto získa, sa skoncentruje, naplní do vhodných nádob a prípadne konvenčnými spôsobmi lyofilizuje.The factor VIII-containing fraction thus obtained is concentrated, filled into suitable containers and freeze-dried, if appropriate, by conventional means.

V prvom membránovom chromatografickom separačnom stupni sa faktor VIII prednostne aplikuje z roztoku s nízkou iónovou silou. Vodný systém má prednostne iónovú silu, ktorá zodpovedá roztoku chloridu sodného s 0 až 150 mM koncentráciou. Pri takej iónovej sile sa faktor VIII ešte adsorbuje na chromatografickom materiáli, zatiaľ čo nečistoty, ktoré sa viažu slabšie, je možné vymyť pri použití vodného systému s rovnakou iónovou silou.In the first membrane chromatographic separation step, factor VIII is preferably applied from a low ionic strength solution. The aqueous system preferably has an ionic strength that corresponds to a sodium chloride solution of 0 to 150 mM concentration. With such an ionic strength, factor VIII is still adsorbed onto the chromatographic material, while impurities that bind weaker can be washed out using an aqueous system with the same ionic strength.

Podľa ďalšieho rozpracovania spôsobu podľa vynálezu sa purifikácia adsorbovaného materiálu môže vykonávať pri použití vodného systému s iónovou silou zodpovedajúcou 200 až 400 mM roztoku chloridu sodného. Desorpcia faktora VIII a elúcia tejto frakcie sa potom uskutočňujú vodným systémom s iónovou silou zodpovedajúcou 500 až 150 mM roztoku chloridu sodného, pričom hodnota pH sa udržuje v rozmedzí od 4 do 9. Pokiaľ sa vykonáva chromatografia, prednostne prebieha pri pH nižšom ako 6, zatiaľ čo anexová chromatografia sa vykonáva skôr pri vyšších hodnotách pH, nad 6.According to a further embodiment of the process according to the invention, the purification of the adsorbed material can be carried out using an aqueous system having an ionic strength corresponding to 200 to 400 mM sodium chloride solution. The desorption of factor VIII and elution of this fraction is then carried out with an aqueous system having an ionic strength corresponding to 500 to 150 mM sodium chloride solution, maintaining the pH in the range of 4 to 9. Preferably, if chromatography is carried out at pH less than 6, anion exchange chromatography is carried out earlier at higher pH values, above 6.

Pokiaľ sa purifikácia faktora VIII vykonáva imunoafinitnou membránovou chromatografiou, potom sa na rozdiel od opísaného spôsobu pri použití anexových materiálov, uskutočňuje elúcia chaotropickými činidlami alebo vysoko koncentrovanými soľnými roztokmi. Prednostne sa elúcia vykonáva s takými koncentráciami chaotropických činidiel alebo soli, ktoré postačujú na rozbitie väzby medzi látkou s vysokou afinitou k faktoru VIII a faktorom VIII. Koncentrácia uvedených látok v konkrétne použitých elučných systémoch závisí od intenzity afinity medzi faktorom VIII a zodpovedajúcou väzbovou zložkou. V dôsledku toho sa elúcia môže vykonávať vodnými roztokmi s nižšou denaturačnou schopnosťou. Prednostne sa na elúciu faktora VIII z imunoafmitnej membrány používajú vodné roztoky močoviny s koncentráciou 1 až 6M, najmä s koncentráciou 2 až 4M alebo zodpovedajúce vysoko koncentrované roztoky soli.When purification of factor VIII is carried out by immunoaffinity membrane chromatography, in contrast to the method described above, using anion exchange materials, elution is effected with chaotropic agents or highly concentrated saline solutions. Preferably, the elution is carried out with concentrations of chaotropic agents or salt sufficient to break the bond between the high affinity factor VIII and the factor VIII. The concentration of said compounds in the particular elution systems used depends on the affinity intensity between Factor VIII and the corresponding binding component. As a result, the elution can be carried out with aqueous solutions of lower denaturing ability. Preferably, aqueous urea solutions at a concentration of 1 to 6M, in particular at a concentration of 2 to 4M, or corresponding highly concentrated salt solutions, are used to elute Factor VIII from the immunoaffinity membrane.

Pri hydrofóbnej interakčnej chromatografii sa vzorka aplikuje z vodného roztoku s veľmi vysokou iónovou silou, napríklad z vysoko koncentrovaného roztoku síranu amónneho (až do koncentrácie 4M) alebo chloridu sodného (až do koncentrácie 5M). Elúcia sa predovšetkým vykonáva postupne alebo kontinuálne soľnými roztokmi s nižšou iónovou silou. Ako roztoky s nižšou iónovou silou na elúciu vzoriek pri hydrofóbnej interakčnej membránovej chromatografii sa tiež môžu použiť vodné roztoky s organickými rozpúšťadlami, predovšetkým zriedené alkoholické roztoky.For hydrophobic interaction chromatography, the sample is applied from an aqueous solution of very high ionic strength, for example from a highly concentrated ammonium sulfate solution (up to 4M) or sodium chloride (up to 5M). In particular, the elution is carried out successively or continuously with saline solutions of lower ionic strength. Aqueous solutions of organic solvents, in particular dilute alcoholic solutions, can also be used as solutions of lower ionic strength for the elution of samples in hydrophobic interaction membrane chromatography.

Spôsob podľa vynálezu s prekvapením zaisťuje rýchlu a nekomplikovanú purifikáciu faktora VIII, ktorý sa získava súčasne s vysokou čistotou a vo vysokom výťažku. Okrem toho, špecifická aktivita faktora VIII získaného týmto spôsobom je dosť vysoká, čo je možné vysvetliť nízkou denaturáciou aktívneho faktora pri spôsobe podľa vynálezu.Surprisingly, the process of the invention provides for a rapid and uncomplicated purification of factor VIII, which is obtained simultaneously with high purity and high yield. In addition, the specific activity of factor VIII obtained by this method is quite high, which can be explained by the low denaturation of the active factor in the method of the invention.

Claims

Process for the production of a factor VIII inactivated virus fraction, characterized in that in the molten cryoprecipitate or blood plasma, after the optional treatment with aluminum hydroxide, the viruses are inactivated by treatment with di- or trialkylphosphate and a nonionic surfactant and then subjected to at least one separation fraction operation using membrane chromatography on membranes or compact disks of porous hydrophilic polymers selected from polyglycidyl methacrylates or hydrophilized polystyrene.

Method according to claim 1, characterized in that the separation operation is carried out on an ion exchange material, in particular an anion exchange material, which is arranged in or on the membrane.

Method according to claim 1 and / or 2, characterized in that the further inactivation of the virus is carried out in a pasteurization step, optionally followed by an additional separation operation using membrane chromatography.

Method according to either of Claims 1 and / or 3, characterized in that the membrane chromatography is carried out on a material having a high affinity for factor VIII.

The method according to any one of claims 1 and / or 4, characterized in that the high affinity factor VIII material is modified with high and / or low molecular weight ligands.

Method according to claim 4 and / or 5, characterized in that the modified material having a high affinity for factor VIII carries immobilized ligands with a high affinity for factor VIII.

Method according to either of Claims 1 and / or 3, characterized in that the chromatographic material permits hydrophobic interaction with the Factor VIII to be separated or carries suitable ligands which mediate the hydrophobic interaction.

Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the sample to be purified is applied in an aqueous system with a low ionic strength corresponding to 0 to 150 mM sodium chloride solution on a membrane containing an ion exchange substance, optionally washed with an aqueous system. with a higher ionic strength corresponding to 200 to 400 mM sodium chloride solution and then eluted with an aqueous system with a high ionic strength corresponding to 500 to 1500 mM sodium chloride solution, maintaining the pH between 4 and

9th

Method according to one of claims 1, 3 and / or 7, characterized in that the sample to be purified is applied from a very high ionic strength solution to a membrane carrying hydrophobic ligands on its surface and eluted with solvent systems with lower ionic strength.

A process according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the eluted fraction containing factor VIII is concentrated, filled into suitable containers and / or lyophilized.

Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the virus inactivation is carried out by treatment with up to 15% by weight of a detergent.