SK282523B6

SK282523B6 - Použitie bakteriocínu obsahujúceho lantionín na výrobu liečiva a farmaceutický prípravok na vnútornú aplikáciu

Info

Publication number: SK282523B6
Application number: SK837-94A
Authority: SK
Inventors: Peter Blackburn; Steven J. Projan; Edward B. Goldberg
Original assignee: Applied Microbiology, Inc.
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2002-10-08
Also published as: KR100282166B1; JPH07508499A; CZ166194A3; EP0623024A1; HU219234B; ATE152353T1; GR3024049T3; HUT70839A; BR9305754A; DE69310346D1; EP0623024B1; CZ282676B6; CA2127987A1; HU9402110D0; DE69310346T2; WO1993013793A1; MX9300207A; NZ249007A; NZ299034A; IL104364A

Abstract

Je opísané použitie bakteriocínu obsahujúceho lantionín na výrobu liečiva na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami v gastrointestinálnom trakte. Farmaceutický prípravok vhodný na vnútornú aplikáciu na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami vrátane baktérií rodu Helicobacter, ako je Helicobacter pylori, ktorý obsahuje bakteriocín obsahujúci lantionín, chelatačné činidlo a ako ďalšiu zložku, ktorá je odlišná od chelatačného činidla, kyslé vehikulum.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia bakteriocínu obsahujúceho lantionin na výrobu liečiva a farmaceutického prípravku vhodného na vnútornú aplikáciu na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch.

Doterajší stav techniky

Antimikrobiálna účinnosť bakteriocínu obsahujúceho lantionin, nizínu, je obmedzená na určité gram-pozitívne organizmy a je optimálna pri pH 5,0. Antimikrobiálna účinnosť nizínu sa zvýši, keď sa používa v kombinácii s chelatačným činidlom, ako je EDTA. Bolo zistené, že účinnosť kombinácií nizínu s chelatačnou zlúčeninou je podstatne vyššia alebo optimálna pri pH nad 5,0. Tak napríklad sa zistilo, že antimikrobiálna účinnosť kombinácie nizínu a EDTA proti Staphylococcus aureus, je podstatne vyššia pri pH 8,0 v porovnaní s účinnosťou rovnakej kombinácie proti S. aureus pri pH 5,0. Tiež sa zistilo, že kombinácia chelatačnej zlúčeniny s nizínom je účinná proti gram-negatívnym baktériám, čo je účinnosť, ktorú samotný nizín za normálnych okolností nemá.

Prítomnosť patogénnych mikroorganizmov v gastrointestinálnom trakte spôsobuje rôzne gastrointestinálne choroby, ako je diarrhea, gastritis, peptické a dvanástnikové vredy a karcinómy žalúdka. Ide najmä o Escherichia a Salmonella, ale tiež o určité druhy Clostridia, Bacillus, Bacteriodes, Campylobacter a Yersinia, ktoré môžu byť zodpovedné za diarrheu, najmä u novonarodených hospodárskych zvierat. (R. E. Holland, 1990, Clin. Microbiol. Rew. 3: 345, „Some infectious causes of diarrhea in young farm animals“.) Helicobacter pylori je príčinou gastritis a peptických a duodenálnych vredov (Peterson, W. L.,.1991, New Eng. J. Med. 324: 1043, ,,Helicobacter pylori and peptic ulcer disease“) a tiež sú spojované so vznikom karcinómu žalúdka. (Henderson, B. E., Ross, R. K. a Pike, M.

C. , 1991, Science 254: 1131, „Toward the primary prevention of cancer,“ Nomura, A. Stemmermann, G. A., Chyou, P. H., Kato, L, Perez- Perez, G. a Blaser, M. J. (1991) New Eng. J. Med. 325: 1132 ,Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii.“; Parsonnet, J., Friednan, G. D., Vandersteen, D. P., Chang, Y., Vogelman, J. H., Orentreich, N, a Sibley, R. K. (1991) New Eng. J. Med. 325: 1127; Forman, D., Sitas, F., Newell,

D. G., Stacey, A. R., Boreham, J., Peto, R., Campbell, T. C., Li, J. a Chen, J. (1990) Int. J. Cancer 46: 608, „Geographic association of Helicobacter pylori antibody prevalence and gastric cancer mortality in rural China“).

Mnohé gastrointestinálne patogény sú gram-negatívne baktérie, teda organizmy, pri ktorých by nebolo možné očakávať účinnosť nizínu. (Hurst, A., 1981, „Nisin“ Adv. in App. Mier, V. 27, str. 85 až 121.) Tak napríklad Helicobacter pylori (ktorý bol v literatúre tiež označovaný názvom Campylobacter pylori) je gram-negatívny mikroaerofilný bacil, ktorý kolonizuje žalúdočnú sliznicu. Od roku 1983, keď bol prvýkrát citovaný v súvislosti s histologickou gastritis, boli publikované práce, v ktorých je sledovaný vzťah medzi potlačovaním infekcie H. pylori a zlepšením gastrických porúch. Napriek tomu, že boli skúšané rôzne antibiotiká proti infekciám H. pylori, žiadne z nich sa až dosiaľ neukázalo ako prijateľné, a preto nebolo proti tomuto organizmu schválené žiadne činidlo ani žiadny liečebný režim. Dlhodobé vyhladenie tohto organizmu bolo dosiahnuté len zriedkakedy a samotné antibiotikum môže spôsobovať neprijateľné vedľajšie účinky. (Peterson, W. L.,

1991, New Eng. J. Med. 324: 1043 .Helicobacter pylori and peptic ulcer disease; Warren, J. R., 1983, Lancet 1: 1273, „Unidentified eurved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis“;, Morgan et al., 1988, Gastroenterology 95: 1178, „Nitrofurans in the treatment of gastritis associated with Campylobacter pylori“, Glupczynski, Y. et al., 1988, Am. J. Gastroenterol. 83: 365 „Campylobacter py/ori-associated gastritis: a double-blind placebo controlled trial with amoxycillin“; Rauws, E. A. et al., 1988, Gastroenterology 94: 33, „Campylobacter pyfori-associated chronic antral active gastritis“; Glupczynski, Y. 1990, Helicobacter pylori, gastritis, and peptic ulcer“; Malfertheiner, P., Ditschuneit, H., Eds. Springer-Verlag, Berlín, Germany 49-58; Rauws, E. A. a Tytgat, G. N. 1990 Lancet 335: 1233 „Cure of duodenal ulcer associated with eradication of Helicobacter pylori. O. Riordan, T. et al., 1990, Gut 31: 999 „Adjuvant antibiotic therapy in duodenal ulcers treated with colloidal bismuth subcitrate“; Weil, J. et al., 1990, Aliment. Pharmacol. Ther., 4: 651 .Helicobacter pylori infection treated with a tripotassium dicitrato bismuthate and metronidazole combination“; Coghlan, J. G., Gilligan, D., Humphries, H., et al., 1987, Lancet 2: 1109 „Campylobacter pylori and recurrence of duodenal ulcer a 12-month follow-up study“; Marshall, B. J. Goodwin, C. S., Warren, J. R. et al., 1988, Lancet 2: 1437, „Prospective double-blind trial of duodenal ulcer relapse after eradication of Campylobacter pylori“).

Teraz sa v súvislosti s vynálezom zistilo, že bakteriocín obsahujúci lantionin a chelatačné činidlo sa hodí na výrobu liečiv, ktoré sú účinné aj pri nízkej hodnote pH.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je použitie bakteriocínu obsahujúceho lantionin na výrobu liečiva na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami v gastrointestinálnom trakte.

Vo zvláštnom uskutočnení tohto vynálezu sú tieto poruchy vyvolané gramnegatívnymi baktériami, najmä baktériami zvolenými zo súboru pozostávajúceho z baktérií rodu Helicobacter, Salmonella, Escherichia, Clostridia, Bacillus, Bacteroides, Campylobacter a Yersinia a obzvlášť mikroorganizmom Helicobacter pylori alebo Campylobacter jejuni. Liečivo navyše môže obsahovať chelatačné činidlo, výhodne kyselinu etyléndiamíntetraoctovú (EDTA), citrát alebo ich zmes.

Okrem bakteriocínu a chelatačného činidla obsahuje liečivo navyše výhodne kyslé vehikulum, ktoré je prednostne zvolené zo súboru pozostávajúceho z acetátu, propionátu, citrátu, laktátu, sukcinátu, fumarátu, malonátu, adipátu, sorbátu, fosfátu alebo askorbátu.

Ako bakteriocín obsahujúci lantionin je na použitie podľa vynálezu vhodný najmä nizín.

Predmetom vynálezu je aj farmaceutický prípravok vhodný na vnútornú aplikáciu na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami vrátane baktérií rodu Helicobacter, ako je Helicobacter pylori, v gastrointestinálnom trakte, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje bakteriocín obsahujúci lantionin, chelatačné činidlo a ako ďalšiu zložku, ktorá je odlišná od chelatačného činidla, kyslé vehikulum.

Kyslé vehikulum sa vo farmaceutickom prípravku podľa vynálezu výhodne nachádza v množstve zaisťujúcom pH prípravku v rozmedzí od 2,5 do 5,0.

Farmaceutický prípravok podľa vynálezu je prednostne vo forme prášku, tablety alebo tobolky vhodnej na orálne podávanie a ako bakteriocín obsahuje nizín, ako chelatačné činidlo obsahuje EDTA a ako kyslé vehikulum obsahuje citrát.

Liečivá vyrobené použitím vynálezu sú baktericídne úČinné v kyslej oblasti pH pod 5,0 a majú významnú účinnosť proti gramnegatívnym baktériám. Pôsobia rýchlo, takže keď sa dopravia do žalúdka a gastrointestinálneho traktu, nemala by byť ich účinnosť obmedzená rýchlosťou vyprázdňovania obsahu žalúdka. Na rozdiel od antibiotík je okrem toho možné používať tieto prípravky bezpečne. Možno ich používať samostatne ako súčasť liečebného režimu alebo v kombinácii s inými farmaceutickými činidlami alebo liečivami.

Nasleduje podrobnejší opis tohto vynálezu.

Účinnosť prípravkov podľa vynálezu sa skúšala proti baktériám E. coli, ktoré sa vyskytujú v črevách cicavcov a ktoré sú často zodpovedné za gastrointestinálne poruchy.

Prežitie E. coli nie je ovplyvňované expozíciou samotnej EDTA alebo citrátu, ani expozíciou samotného nížinu. Okrem toho suspenzie E. coli exponované kyseline dobre prežívajú v kyslom prostredí, kým hodnota pH neklesne pod 2,5. Keď sa však (ako je to opísané ďalej) nizín kombinuje s EDTA v kyslej oblasti pH, dosiahne sa podstatné zníženie životaschopnosti baktérii už po jednej minúte od expozície takým nizínovým prípravkom. Pri pH 3,5 sa dosiahne zníženie počtu životaschopných baktérií o viac ako 6 desatinných radov už po jednej minúte od počiatku expozície prípravku zahŕňajúceho nizín a chelatačné činidlo. Pri hodnote pH nižší ako 3,5 sa síce prejaví určité zníženie účinnosti nizínových prípravkov, ale dokonca i pri pH 2,5 je účinnosť takého prípravku stále ešte tisíckrát vyšší ako účinnosť samotného nizínu (pozri tabuľka 1).

Nizín aktivovaný EDTA pôsobí bakteriocídne proti E. coli v prítomnosti rôznych kyslých vehikúl, ako sú acetáty, citráty, laktáty a sukcináty (pozri tabuľky 2 až 5). Ako je zrejmé z výsledkov dosiahnutých pri pH 3,5, rýchlu bakteriocídnu účinnosť nizínových prípravkov je možné ovplyvniť voľbou kyslého vehikula. Vo všetkých ilustrovaných prípadoch je pozorovaný pokles bakteriocídnej účinnosti nizínových prípravkov so zvyšujúcou sa koncentráciou každého kyslého aniónu. Napriek tomu, všetky tieto kyslé vehikulá sú vhodné na zvýšenie aktivity nizínu pôsobením chelatačných činidiel. Expozícia baktérii takým nizínovým prípravkom po dobu dlhšiu, ako je jedna minúta, účinne znižuje počet baktérií i v tom prípade, keď prípravky obsahujú menej účinné koncentrácie kyslých vehikúl.

Hodnotenie germicídnej účinnosti nizínu aktivovaného chelatačným činidlom v kyslých vehikulách proti gram-negatívnym baktériám

Rýchla účinnosť rôznych prípravkov obsahujúcich nizín aktivovaný chelatačnou látkou bola hodnotená v kyslých vehikulách pri použití germicídnej skúšky uskutočňovanej v suspenzii.

Bunky E. coli z nočnej kultúry na sójovom živnom agare s tryptikázou (Trypticasa soy nutrient agar (TSA)) sa resuspendujú na hustotu zodpovedajúcu absorbancii 1,0 pri 600 nm v sterilnej deionizovanej a destilovanej vode. Reakcia buniek s každým z analyzovaných bakteriocídnych prípravkov sa začne pridaním 30 μί buniek k 970 μί skúšaného prípravku. Reakčná zmes sa inkubuje pri 30 °C počas aspoň 1 minúty a potom sa 1 minútu odstreďuje v mikrocentrifúge. Bunková paleta sa premyje resuspendovaním v 1 ml neutralizačného tlmivého roztoku. (Neutralizačný tlmivý roztok - zloženie: 50mM Tris-HCl, pH 7,0, 5mM síran horečnatý, 20mM chlorid vápenatý, 0,1 M chlorid sodný a 0,1 % želatína sa pripraví tak, že sa najprv pripraví Tris-tlmivý roztok, nastaví sa jeho pH a pridajú sa soli a želatí na, potom sa vzniknutá zmes mieša za tepla tak dlho, kým nevznikne číry roztok. Tento roztok sa potom 20 minút spracováva v autokláve. Neutralizačný tlmivý roztok sa používa bez riedenia.) Bunky sa 1 minútu odstreďujú v mikrocentrifúge 1 minútu a potom sa resuspendujú v 1 ml neutralizačného tlmivého roztoku. Počet životaschopných buniek sa stanovuje tak, že sa 100 μί bakteriálnej suspenzie alebo sériovo zriedených suspenzií, ktoré sú z nej vyrobené riedením neutralizačným tlmivým roztokom, rozprestrie na živnom agare a po 24 hodinách inkubácie pri 37 °C sa spočítajú prežívajúce kolónie. Zo zistených hodnôt sa vypočíta pomer prežitia v percentách, vztiahnutý na neošetrenú kontrolnú vzorku.

Zistí sa účinnosť nizínu aktivovaného EDTA pri nízkej hodnote pH. Pri pH pod 3,5 je stupeň aktivácie nižší, čo je zrejme dôsledok titrácie karboxylových skupín chelatačného činidla. Ale dokonca i pri pH 2,5 sa stále ešte dosahuje tisícnásobné zvýšenie účinnosti nizínu pomocou EDTA (pozri výsledky uvedené v tabuľke 1). V tabuľkách 1, 2, 4 a 8 až 13 znamenajú hodnoty, ktorým predchádza symbol „<“, hodnoty percenta prežitia, vztiahnuté na počiatočnú koncentráciu životaschopných baktérií (vyjadrenú počtom jednotiek vytvárajúcich kolónie (cfu)/l ml) v skúšanej bakteriálnej suspenzii a alikvotnom objemu tejto suspenzie odoberanej na skúšanie, ktoré zodpovedajú nulovej detekcii prežívajúcich kolónií.

Tabuľka 1

Aktivácia nizínu EDTA proti Escherichia coli Závislosť od kyslej hodnoty pH

Nizín	Hodnota pH
	uq/al
7,0	2 ,0	2 ,5	3,0 3,5	4,0
			%	prežitia	po 1 minúte³
0	0	100^b	-	-	100	-
0	100	-	0,28	3,37	4,43 100	100
1,0	0		0,07	-	5,41	-
1,0	100	-	0,01	0,005	0,0007 ¢10⁴	<10⁴

a) Inkubácia sa vykonáva pri 37 °C v 20mM tlmivého roztoku s octanom sodným s prispôsobenou hodnotou pH.

b) Počiatočný počet životaschopných baktérií - 4 x 10⁷ cfú/ml

Tabuľka 2

Aktivácia nizín-acetátu chelatačným činidlom proti Escherichia coli

Závislosť od koncentrácie acetátu

EDTft,	Mizín	Koncentrácia acetátu tq/1) pri pH 3_h5
au	UB/»1
		0	1		10	30
			% prežitia po 1	minúte³
0	0	100^b	55	80	90	10,1
0	100	-	9/6	70	100	100
1,0	0		40	25	25	10,7
1,0	100	-	0,0005	<10⁴	0,02	0,4

a) Inkubácia sa vykonáva pri 3 7°C.

b) Počiatočný počet životaschopných baktérií - 2 x 10⁷ cfu/ml

Tabuľka 3

Aktivácia nizín-citrátu chelatačným činidlom proti Escherichia coli

Závislosť od koncentrácie citrátu

1 EDTA	Nizín	vnneentrácia citrátu (0/1) orí DH 3,5 1
0 1 3	10	30
		prežitia po	1 minúte®
0	0	100^b 100 56,3	72,9	100
0	100	0,003 0i0007	0,56	14,6
1,0	0	100 50,0	47,9	100
1,0	100	_ 0,0006 0,0002	0,69	20,8 I

a) Inkubácia sa vykonáva pri 37 °C.

b) Počiatočný počet životaschopných baktérií - 5 x 10⁷ cfú/ml.

Tabuľka 4

Aktivácia nizín-laktátu chelatačným činidlom proti Escherichia coli

Závislosť od koncentrácie laktátu

EDTA EH	Ni2ín pq/al	Koncentrácia laktátu (q/1) Dri dH 3.5
0 13	10	30
		\| % prežitia po	1 minúte®
0	0	100^b 22,2 46,7	35,6	⁴ '²
0	100	4,4 0,24	17,8	26,7
i, 0	0	5,1 0,46	0,91	1,58
o	100	ťlO“⁴ 0,02	0;20	2,84

a) Inkubácia sa vykonáva pri 37 °C .

b) Počiatočný počet životaschopných baktérií - 5 x 10⁷ cfu/ml.

Tabuľka 5

Aktivácia nizín-sukcinátu chelatačným činidlom proti Escherichia coli

Závislosť od koncentrácie sukcinátu

EDTA aM	mzln iiq/nl	Koncentrácia sukcinátu (σ/l) pri pH 3.5
0	1 3	10	30
			* prežitia po	1 minúte®
0	0	100^b	85,5 29,9	36,7	13,9
0	100	-	18,3 66,6	83,4	28,4 j
1,0	0		56,8 63,6	46,2	43,2
1 ,0	100	-	0,02 6,21	14,2	4,73 !

a) Inkubácia sa vykonáva pri 37 °C .

b) Počiatočný počet životaschopných baktérií - 3,4 x 10⁶ cfu/ml.

Účinnosť nížinu aktivovaného EDTA pri pH 3,5 bola sledovaná v prítomnosti všetkých skúšaných aniónov kyselín (pozri tabuľky 2 až 5). Pri pH 3,5 pôsobila koncentrácia laktátu 3 g/liter trocha inhibičné na účinnosť nížinu aktivovaného EDTA. Niemenej je táto účinnosť stále ešte tisíckrát vyššia, ako je účinnosť koncentrácie samotného laktátu 3 g/liter. Koncentrácia laktátu 1 g/liter nepôsobí inhibičné na nizín aktivovaný EDTA.

Pri pH 3,-5 sa koncentrácia acetátu do 3 g/liter a koncentrácia citrátu do 3 g/liter zdá byť kompatibilná s germicídnou účinnosťou nizínu aktivovaného chelatačnou látkou proti suspenziám E. coli. Tieto anióny sa zdajú byť naj sľubnejšími kyslými vehikulami pre prípravky obsahujúce nizín aktivovaný EDTA. Citrát je najvhodnejším kyslým vehikulom pre prípravky obsahujúce nizín aktivovaný EDTA. Citrát je látka, ktorá sa vyskytuje v prirodzenej strave a ktorá je intermediámym metabolitom, pričom je zároveň účinným aktivátorom bakteriocídnej účinnosti nížinu (pozri tabuľka 3). Nizín-citrátové prípravky je možné považovať za bezpečné prípravky, ktoré sú účinné pri potlačovaní alebo odstraňovaní rastu nežiaducich mikroorganizmov v gastrointestinálnom trakte človeka alebo zvierat.

Citrát je metabolit, ktorý neinhibuje rast baktérií. Baktérie dobre rastú na živnom agare doplnenom citrátom. Nizín v prítomnosti citrátu je však účinný proti gram-negatívnym baktériám. Je teda možné demonštrovať účinnosti nizínu proti gram-negatívnym baktériám pri použití skúšky inhibície rastu na živnom agare doplnenom rôznymi koncentráciami citrátu. Táto nizin-citrátová skúška na agare je všeobecne použiteľná. Nechá sa použiť na skúšanie potenciálnych činidiel iných, ako je citrát, v kombinácii s nizínom na možné aktivačné vlastnosti v súvislosti s bakteriocídnou účinnosťou nizínu. Ako príklady iných organických kyselín, ktoré sa používajú v kombinácii s nizínom, je možné uviesť acetát, propionát, laktát, sukcinát, fumarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát a askorbát.

Z iných činidiel, ktoré zvyšujú účinnosť nizínu, je možné uviesť neiónové a amfotéme povrchovo aktívne látky a emulgátory, kvatéme zlúčeniny, monoglyceridy a mastné kyseliny.

Nizin-citrátová skúška na agare sa vykonáva nasledujúcim spôsobom:

Bunky E. coli sa resuspendujú na optickú hustotu 1,0 pri A_6Oo- ΙΟΟμΙ vzorka tejto bakteriálnej suspenzie sa rovnomerne rozotrie na sójovom živnom agare s tryptikázou (Trypticasa soy nutrient agar (TSA)), doplnenom rôznymi koncentráciami citrátu (napríklad 1, 3, 10 a 30 g/liter). Inkubácia sa vykonáva 1 hodinu pri 37 °C. Vyrobí sa zásobný roztok nizínu a z neho potom sériovo zriedené vzorky v 0,1 % hovädzom sérovom albumíne (BSA). Zo zásobného roztoku a príslušne zriedených vzoriek sa odoberá vždy objem 5 pl a prenesie sa na rastúce baktérie. Misky s TSA sa 24 hodín inkubujú pri 37 °C. Po 24 hodinách pri 37 °C vytvorí E. coli rastúci v TSA, doplnenom citrátom, konfluentný nárast. Účinnosť nizínu proti baktériám rastúcim v prítomnosti citrátu preukazujú čisté zóny v bakteriálnom náraste, kam boli prenesené sériovo zriedené vzorky nizínu. Účinnosť nizínu proti gram-negatívnym baktériám je možné vyjadriť na základe stanovenia minimálneho množstva nizínu, ktoré je potrebné na vytvorenie čistej zóny s inhibovaným rastom. So zvyšujúcou sa koncentráciou citrátu v živnom agare je na inhibíciu rastu E. coli potrebné znižujúce sa množstvo nizínu. Túto skutočnosť dokladajú údaje uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6 Účinnosť nizínu proti baktériám E. coli pestovaným na živnom agare v prítomnosti citrátu

Koncentrácia citrátu Nizín (g/liter) NIC¹ (μς/τηΐ)

O3 333

1370

3123

1013,7

300,06 ’NIC = nominálna inhibičná koncentrácia, t. j. minimálna koncentrácia nizínu, ktorá je potrebná na zabránenie rastu

E. coli kmeňa ATCC 8739 na sójovom agare s tryptikázou, doplnenom rôznymi koncentráciami citrátu, uvedenými hore.

Tiež bola demonštrovaná účinnosť nížinu aktivovaného EDTA alebo inými chelatačnými činidlami v prítomnosti citrátu proti rôznym kmeňom Helicobacter pylori a podobným druhom, najmä Campylobacter jejuni pri použití germicidnej skúšky v suspenzii. Príklady sú uvedené v tabuľkách 7 až 13. Čerstvo narastené bunky H. pylori, pestované v miske s živným agarom (Trypticasa Soy Agar, BBL 11043, doplneným 5 % ovčej krvi zbavenej fibrínu) sa zoberú a nechajú rásť pri 37 °C počas 72 až 96 hodín v komôrke BBL Gaspak(R) Systém s obalom BBL Campy Pak^(R) Microaerophilic systém pri použití Campylobacter mikroaerofilného plynového generátoru (BBL71034). Potom sa bunky resuspendujú v sterilnej deionizovanej a destilovanej vode na hustotu buniek 1,0 A^o- Tým sa získa vhodná zásobná suspenzia. Skúška sa začne prídavkom 50 μί bakteriálnej suspenzie k 950 μί skúšobného roztoku, po ktorom sa zmes 5 minút inkubuje pri 37 °C a potom 1 minútu odstreďuje v mikrocentrifúge. Bunková paleta sa premyje resuspendovaním v 1 ml sterilného neutralizačného tlmivého roztoku opísaného hore a potom sa vzniknutá suspenzia 1 minútu odstreďuje v mikrocentrifúge. Bunky sa resuspendujú v médiu Brucella-Albimi (BBL) a suspenzia sa sériovo zriedi v rovnakom médiu a potom sa jednotlivé suspenzie prenesú na živný agar. Počet životaschopných baktérií sa stanoví tak, že sa 100 μί suspenzie baktérií (alebo príslušne zriedených vzoriek) prenesie na živný agar opisaný hore a spočítajú sa prežívajúce kolónie po 72 až 96 hodinách inkubácie pri 37 °C v modifikovanej atmosfére opísanej hore. Z nameraných hodnôt sa vypočíta pomer prežitia v percentách, vzhľadom na neošetrené kontrolné vzorky.

Závislosť účinnosti nizínu proti Helicobacter pylori na jeho koncentrácii v prítomnosti alebo neprítomnosti citrátu s koncentráciou 1 g/liter pri pH 5,0 je ilustrovaná údajmi uvedcnými v tabuľke 7. I keď je H. pylori gram-negatívna baktéria, vykazuje nizín, ktorý bol považovaný za látku účinnú len proti gram-pozitívnym baktériám, prekvapivo určitú bakteriocídnu účinnosť proti tomuto organizmu. Účinnosť nizínu proti H. pylori sa však podstatne zvýši v prítomnosti citrátu.

Závislosť účinnosti nizínu proti H. pylori od koncentrácie citrátu pri pH 5,0 a 7,0 je ilustrovaná údajmi uvedenými v tabuľke 8. Všeobecne má samotný citrát malý účinok na životaschopnosť týchto bakteriálnych druhov pri pH 5,0, napriek tomu, že pri pH 7,0 sa pri použití vyšších koncentrácií citrátu životaschopnosť organizmov trocha zníži. Účinky samotného citrátu sú prekvapujúce, pretože citrát je metabolit. Zvýšená účinnosť nizínu v prítomnosti citrátu dostačuje k úplnému usmrteniu suspenzie H. pylori (10⁵ cfu/ml) za 5 minút pri 37 °C.

Údaje uvedené v tabuľke 9 ilustrujú skutočnosť, že účinnosť nizínu proti H. pylori pri pH 5,0 a 7,0 sa tiež podstatne zvýši v prítomnosti chelatačne účinnej EDTA. Samotná chelatačná látka má malý vplyv na životaschopnosť týchto organizmov s výnimkou vyšších koncentrácií. Účinnosť nizínu aktivovaného EDTA však dostačuje na celkové usmrtenie suspenzie H. pylori (105 cfu/ml) v priebehu 5 minút pri 37 °C.

Bakteriálna účinnosť nizínu proti H. pylori v prítomnosti alebo neprítomnosti citrátu alebo EDTA v určitom rozmedzí hodnôt pH je ilustrovaná údajmi uvedenými v tabuľke 10 a 11. Napriek tomu, že je H. pylori izolovaný zo žalúdka, ktorého lúmen je kyslý, životaschopnosť tohto organizmu je prekvapivo zlá pri expozícii nízkym hodnotám pH. H. pylori kolonizuje epitel žalúdočnej sliznice, a to je menej kyslé mikroprostredie v porovnaní s lúmenom žalúdka. Napriek obmedzenej životaschopnosti H. pylori pri nízkych hodnotách pH pri týchto pokusoch, ukazujú zistené údaje, že pri nizínu s citrátom alebo EDTA je možné očakávať bakteriocídnu účinnosť proti H. pylori v podmienkach, ktoré sa podobajú na podmienky prevládajúce v žalúdku a jeho epitelu sliznice, kde je H. pylori schopný prosperovať.

Campylobacter jejuni je gram-negatívna baktéria, ktorá kolonizuje črevá vtákov a cicavcov a spojuje sa s otravami potravou. Bakteriocídna účinnosť nizínu v prítomnosti a neprítomnosti citrátu alebo EDTA proti C. jejuni je ilustrovaná údajmi uvedenými v tabuľke 12 a 13. Samotný nizín je vysoko účinný proti tejto gram-negatívnej baktérii. Ukázalo sa tiež, že pri pH 5,0 sú vyššie koncentrácie citrátu toxické proti tejto baktérii. Je teda možné očakávať že kombinácia nizínu s citrátom alebo EDTA bude účinná proti C. jejuni, ako to ilustrujú údaje uvedené v tabuľkách 12 a 13.

Tabuľka 7

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Helicobacter pylori Závislosť účinnosti od koncentrácie nizínu

kmeň ATCC#	Citrát PH 5r0	Nizín (iw/nl). 0 10 30 100 300
ATCC j 43579	0 0, 14	% prežitia po 5 minútach^a 100^ 0,39 0,085 0,0056 86,2 0,21 0,008 0,001 1, 89X10’⁵

a) inkubácia sa vykonáva pri 37 °C

b) počiatočný počet životaschopných baktérií je 3,19 x 10⁷ cfu/ml

Tabuľka 8

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Helicobacter pylori Závislosť účinnosti od koncentrácie citrátu pri pH 5,0 a 7,0

kmeň ATCC/	PH	Nizín	T Koncentrácia citrátu (a/1)
ua/iil	0	1	3	10
				4 prežitia po 5 minútach³
ATCC 43579	5,0	0	100^b	100	100	100
		100	9,62	<0,01	<0,01	<0,01
ATCC 43504	5,0	0	100^c	83,6	42,9	22,1
		0	100^d	25, 8	4, 39	50, 9
		100	n.a.	0,033	0,066	0,14
		100	0,043	<3,1X1O'³	0,92	2,44
ATCC 43579	7,0	0	100^e	12,1	0,26	0,02
		100	0,78	<8,1X1O'³	<8,1X1O'³	<8 ,lX10‘³
ATCC 43504	7/0	0	100^f	17,7	8,94	0 ,82
		100	2,08	<0,01	<0,01	<0,01

a inkubácia sa vykonáva pri 37 °C 5 minút b počiatočný počet životaschopných baktérií je 1,04 x 10⁴ cfu/ml c počiatočný počet životaschopných baktérií je 1,40 x 10⁵ cfu/ml d počiatočný počet životaschopných baktérií jc 3,26 x 10⁵ cfu/m e počiatočný počet životaschopných baktérií je 1,24 x 10⁵ cfu/ml f počiatočný počet životaschopných baktérií je 9,62 x 10⁴ cfu/ml

Tabuľka 9

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Helicobacter pylori Závislosť účinnosti od koncentrácie EDTA pri pH 5,0 a 7,0

kmeň ATCC#	PH	Nížin uq/pi	íaML.gPTA
0	1,0	10	100
				% prežitia	po 5 ninútach^a
ATCC	5,0	0	100^b	13 ,63	8,82	0, 43
43579
		100	4/7	<5,0xl0*³	<5, OxlO³	<5/0xlO‘³
ATCC	7,0	0	100^c	94, 1	21, 0	1, 62
4352 5
		100	5/88	<0/03	<0/03	<0»03

b) počiatočný počet životaschopných baktérií je 2,04 x 10⁵ cfu/ml

c) počiatočný počet životaschopných baktérií je 3,40 x 10⁴ cfo/ml

Tabuľka 10

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Helicobacter pylori Závislosť účinnosti od koncentrácie citrátu pri pH v rozmedzí od 2,5 do 5,0

ikmerí [ATCC#	Citrát *	Mizín
uoZal
2/5	3,0	3/5	4,0	5,0
ATCC	0	0		t prežitia po 5	minútach®	100^b
43579	0	100	-	-	-	8,	5X10'^{3 e}
	0	100	-	-	-	-	0, 30^c
	0₍ 1	0	<s,0xl0·*	1,1x10’	0/18	5,56	97/2^b
ATCC 43504	o. i	100	<5,0x10“*	Ι,ΙχΙΟ'³	l/lxlO^-3	2/OxlO’³ 2	7xlC’^{3 b}
0	0	-	-	-	-	100^d
	0	0	-	-	-	-	100^e
	0	100	-	-	-	-	0,69^d
	0	100	-	-	-	-	4 ₍ S6^e
	0,1	0	O, 14	<0,004	<0,004	0,36	68,5^d
	0/1	100	<0, 004	<0,004	<0/004	<0,004	0,022^d
	0,3	0	0, 027	<0,027	29,7	17,6	100^e
	0,3	100	<0,027	<0,027	2, 7	0,32	0,18^e

a) inkubácia sa vykonáva pri 37 °C 5 minút v prostredí s pH nastaveným citrátom alebo pri použití 20mM acetátu, pH 5,0

b) počiatočný počet životaschopných baktérií je

1,85 x 10⁶ cfu/ml

c) priemer z piatich experimentov

ď) počiatočný počet životaschopných baktérií je

2.7 x 10⁵ cfu/ml

e) počiatočný počet životaschopných baktérií je

3.7 x 10⁴ cfu/ml

Tabuľka 11

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Helicobacter pylori Závislosť účinnosti od koncentrácie EDTA pri pH v rozmedzí od 2,5 do 5,0

kmefí ATCC#	EDTA _mM	Niaín	Hodnota pH
iaZal
2,5	3.0	3,5	4.0	5.0
ATCC	0	0		% prežitia po	5 minútach®	100^b
43504	o	0	-	-	-	-	100^c
	0	100	-	-	-	-	02 l^d
	0	100	-	-	-		, 03^e
	1,0	0	0,023	<0,021	94,2	11, 6	10, 0^b
	1,0	0	0,013	0,001	0, 015	16, 5	100^c
	1,0	100	<0,021	<0,021	0, 012	<0.021	0,53^b
	1,0	100	<0,001	<0,001	0,005	0,54	0,32^c

b) počiatočný počet životaschopných baktérií je

8,6 x 10⁴ cfu/ml

c) počiatočný počet životaschopných baktérií je

9,82 x 10⁵ cfu/ml

d) inkubácia v prítomnosti citrátu s koncentráciou 1 g/liter

e) inkubácia v prítomnosti 20mM acetátu

Tabuľka 12

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Campylobacter jejuni

ATCC 29 428

Závislosť účinnosti od koncentrácie citrátu pri pH 5,0 (kmeň ATCC 29 428)

Nížin uq/nl	Koncentrácia citrátu (σ/l) pri pH 5.0
0 1 3	10
0	% prežitia po 5 minútach® 100^b 2,9 <6,4x10*3 <6,4x10'3
100	<6,4X103 <6,4x103 <6,4x10*3	<6,4xlO’^J

a inkubácia sa vykonáva pri 37 °C 5 minút b počiatočný počet životaschopných baktérií je

1,57 x 10⁵ cfu/ml

Tabuľka 13

Bakteriocídna účinnosť nizínu proti Campylobacter jejuni

ATCC 29 428

Závislosť účinnosti od koncentrácie EDTA pri pH 5,0 (kmeň ATCC 29 428)

a) inkubácia sa vykonáva pri 37 °C 5 minút

b) počiatočný počet životaschopných baktérií je

1,84 x 10⁶ cfu/ml

Účinnosť nizínu aktivovaného EDTA, citrátom alebo inými chelatačnými činidlami je tiež možné demonštrovať pri použití germicídnych suspenzných skúšok proti druhu Salmonella. Čerstvo vypestované bunky S. typhimurium sa odoberú z misky so živným agarom (Trypticasa Soy Agar, BBL11043), kde boli pestované 24 hodín pri 37 °C. Bunky sa resuspendujú na hustotu 1,0 A600, a tak sa získa vhodná zásobná suspenzia. Skúška sa začne prídavkom 30 μΐ bakteriálnej suspenzie k 970 μΐ skúšobného roztoku. Nasleduje inkubácia aspoň 1 minútu a potom jednominútové odstreďovanie v mikrocentrifuge. Bunková paleta sa premyje resuspendovaním v 1 ml sterilného neutralizačného tlmivého roztoku, paleta sa opäť suspenduje a potom sa vzniknutá suspenzia sériovo zriedi neutralizačným tlmivým roztokom. Počet živých buniek sa stanoví tak, že sa bakteriálne suspenzie a sériovo zriedené vzorky (vždy 100 μ!) rozprestrú na živnom agare a po 24 hodinách inkubácie pri 37 °C sa spočítajú prežívajúce kolónie.

Bakteriocínové prípravky, účinné pri nízkej hodnote pH, podľa vynálezu sa prednostne podávajú orálne vo forme farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú účinné množstvo bakteriocínu obsahujúceho lantionín a farmaceutický vhodný nosič. Nosič môže tiež zahrňovať účinné množstvo chelatačného činidla a/alebo kyslého vehikula a/alebo povrchovo aktívnej látky alebo emulgátora, mono glyceridu alebo mastnej kyseliny. Bakteriocín obsahujúci lantionín môže byť zvolený zo súboru zahŕňajúceho nizín, subtilín, epidermín, Pep 5, ankovenín, galidermín, duromycín alebo cinamicín. Ako vhodné chelatačné činidlá, na ktoré sa však vynález neobmedzuje, je možné uviesť EDTA, vápenatú soľ EDTA (CaEDTA), sodnovápenatú soľ EDTA (CaNa₂EDTA) a iné alkyldiamíntetraacetáty a ďalej tiež citrát. V niektorých prípadoch môže byť chelatačné činidlo totožné s kyslým vehikulom, ako je tomu v prípade, keď je kyslým vehikulom i chelatačným činidlom citrát. Vhodnými kyslými vehikulami na použitie v prípravkoch podľa vynálezu sú acetát, propionát, citrát, laktát, sukcinát, fumarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát a askorbát.

Prípravky podľa vynálezu sú tiež účinné pri mierne kyslej hodnote pH (napríklad 5,0) a dokonca i pri vyšších hodnotách pH (napríklad 8,0) proti patogénnym baktériám, ktoré môžu obývať gastrointestinálny trakt, ako je E. coli a

S. typhimurium, ako je to opísané v US patente č. 5 135 910. Uvedená citácia US patentu č. 5 135 910 predstavuje náhradu za prenesenie obsahu celého tohto patentu do opisu tohto vynálezu.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu je teda možné tiež vyrábať ako antacidové prípravky alebo je možné ich podávať v kombinácii s antacidovým prípravkom, pričom dôsledkom takého podávania môže byť napríklad vyššia hodnota pH v žalúdku, ako je hodnota pred podaním. I za týchto podmienok sú prípravky na báze nizínu a chelatačného činidla účinné proti patogénnym baktériám.

Ako farmaceutický vhodné nosiče prichádzajú do úvahy pevné, polopevné alebo kvapalné riedidlá alebo tiež kapsuly. V niektorých vykonávaniach vynálezu môže byť kyslé vehikulum totožné s farmaceutickým nosičom. Ako iné farmaceutický vhodné nosiče je možné uviesť deriváty celulózy, želatínu, laktózu, škrob atď.

Farmaceutické prípravky môžu mať podobu roztokov, koloidov alebo emulzií, práškov, tabliet, kapsúl alebo gélov.

Suché formy prípravkov, účinných pri nízkej hodnote pH, je možné spracovávať lisovaním na tablety a vzniknuté tablety je možné poťahovať koncentrovanými cukrovými roztokmi. Poťahovacie roztoky môžu obsahovať tiež iné farmaceutický vhodné látky, ako je arabská guma, želatína, mastenec alebo oxid titaničitý a rôzne farbivá. Prípravky podľa vynálezu môžu mať tiež podobu tvrdých želatínových kapsúl, ktoré obsahujú granuly bakteriocínu, kyslého vehikula a chelatačného činidla v kombinácii s pevným nosičom, ako je laktóza, zemiakový škrob, kukuričný škrob, deriváty celulózy alebo želatína.

Kvapalné prípravky na orálne podávanie môžu mať podobu sirupov alebo suspenzií obsahujúcich peptid bakteriocín, chelatačné činidlo, kyslé vehikulum, cukor, vodu, glycerol alebo propylénglykol. Také kvapalné prípravky môžu prípadne obsahovať tiež farbiace činidlá, aromatizačné látky, sladidlá, ako je sacharín a zahusťovadlá, ako sú deriváty celulózy.

Aplikačné vlastnosti prípravku je prirodzene možné modifikovať, tak napríklad k jednoduchým vodným prípravkom je možné pridávať zahusťovadlá, emulgátory alebo časticové látky, na účely prípravy koloidnej suspenzie. Alternatívne je možné vytvárať osmoticky vyvážené roztoky obsahujúce vhodnú dávku, ktoré sa dajú podávať v objemoch takých malých, ako napríklad 10 ml, alebo takých veľkých, ako sú napríklad 4 litre. Ako osmoticky vyvážené roztoky je možné uviesť napríklad roztoky, ktoré sa obyčajne požívajú na preplachovanie gastrointestinálneho traktu (Di Palma, J. A. a Brady 74 C. E., 1989, Am. J. Gastroenterol. 84: 1008, „Colon Cleansing for Diagnostic and

Surgical Procedures: Polyethylene glycol Lavage Solution“; Di Palma, J. A. a Marshal, J. B., 1990, Gastrointestinal Endoscopy 1990, 36: 285, „Comparison of a new Sulfate-fŕee Polyethylene glycol Electrolytc Lavage Solution versus a Štandard Solution for Colonoscopy Cleansing“; Fordtran, J. S., et al., 1990, Gastroenterol. 98: 11, „A lowSodium Solution for Gastrointestinal Lavage“).

Je možné očakávať, že účinnosť gastrointestinálnych preplachovacích roztokov, používaných na prečisťovanie gastrointestinálneho traktu, sa prídavkom germicídnych prípravkov podľa vynálezu zlepší.

Typická denná dávka prípravkov podľa vynálezu sa môže meniť v závislosti od druhu patogénneho mikroorganizmu vyvolávajúceho liečenú infekciu, od miesta infekcie a symptómov liečenej choroby. Obyčajne sa očakáva, že orálna dávka bude ležať v rozmedzí od 0,1 mg/dávka do 300 mg/dávka, vztiahnuté na bakteriocínovú látku obsahujúcu lantionín a v rozmedzí od 0,1 g/dávka do 30 g/dávka, vztiahnuté na chelatačné činidlo. Tak napríklad, vzhľadom na to, že sa objem obsahu žalúdka mení v závislosti od času, ktorý uplynul od posledného jedla, jednoduché vodné prípravky na gastrointestinálne použitie je možné pripraviť takto:

Keď sa má zaistiť výsledná koncentrácia v žalúdku 0,1 % citrát + 0,001 % nizín (10 pg/ml), pričom objem dávky má byť 10 ml a ak sa predpokladá, že objem obsahu žalúdku je približne 100 ml:

Dávka 1: 1,0 mg nizínu a 0,1 g citrátu

citran sodný	1,0%
nizín	0,01 %
sacharín	0,005 %
polysorbát 20	1,0%
glycerol	10,0%
voda	87,985 %
Keď sa má zaistiť výsledná koncentrácia v žalúdku

3,0 % citrát + 0,03 % nizín (300 qg/ml), pričom objem dávky má byť 10 ml a ak sa predpokladá, že objem obsahu žalúdku je približne 100 ml:

Dávka 2: 30 mg nizínu a 3,0 g citrátu

citran sodný	30,0 %
nizín	0,3 %
sacharín	0,005 %
polysorbát 20	1,0%
glycerol	0,0 %
voda	58,695 %
Keď sa má zaistiť výsledná koncentrácia v žalúdku
0,1 % citrát + 0,001	% nizín (10 pg/ml), pričom objem
dávky má byť 10 ml	a ak sa predpokladá, že objem obsahu
žalúdku je približne 1 000 ml:
Dávka 3: 10 mg nizínu a 1,0 g citrátu
citran sodný	10,0%
nizín	0,1 %
sacharín	0,005 %
polysorbát 20	1,0%
glycerol	10,0%
voda	78,895 %
Keď sa má zaistiť výsledná koncentrácia v žalúdku
3,0 % citrát + 0,03	% nizín (300 pg/ml), pričom objem
dávky má byť 100 ml a ak sa predpokladá, že objem obsa-
hu žalúdku je približne 1 000 ml:
Dávka 4: 300 mg nizínu a 30,0 g citrátu
citran sodný	30,0 %
nizín	0,3 %

sacharín polysorbát 20 glycerol voda

0,005 %

1,0 %

10,0 %

58,695 %

Keď sa má zaistiť výsledná koncentrácia v žalúdku 3,0 % citrát + 0,03 % nizín (300 pg/ml), pričom objem dávky má byť 100 ml a ak sa predpokladá, že objem obsahu žalúdku je približne 100 ml:

Dávka 5: 60 mg nizínu a 6,0 g citrátu

citran sodný	6,0 %
nizín	0,06 %
sacharín	0,005 %
polysorbát 20	1,0%
glycerol	10,0%
voda	82,935 %
V závislosti od typu patogénneho mikroorganizmu a

druhu liečenej choroby, môže liečebný režim zahrňovať tiež podávanie iných liečiv a farmaceutických prípravkov. Tieto liečivá môžu byť súčasťou farmaceutického prípravku podľa vynálezu alebo sa môžu podávať v rámci kombinovaného liečebného režimu zahŕňajúceho podávanie bakteriocínového prípravku, účinného pri nízkej hodnote pH a iného liečiva, ktoré je užitočné na liečbu gastrointestinálneho traktu. Tak napríklad pri liečbe diarrhey, ktorá môže byť spôsobená infekciou patogénneho mikroorganizmu, napríklad druhu Salmonella, sa môže bakteriocínový prípravok, účinný pri nízkej hodnote pH, podávať v podobe farmaceutického prípravku, ktorý tiež obsahuje kaolín, pektín alebo iné spojivo. Také symptómy je tiež možné liečiť súbežným podávaním bakteriocínovcho prípravku, účinného pri nízkej hodnote pH a spojiva. Pri takých liečebných režimoch sa tiež môžu používať antacidové prípravky a neočakáva sa, že by antacid mohol ovplyvniť účinnosť prípravku na báze nizínu a chelatačného činidla.

Pri liečbe infekcií spôsobených patogénnym mikroorganizmom Helicobacter pylori sa môže bakteriocínový prípravok, účinný pri nízkej hodnote pH, podávať v spojení s inou farmaceutický účinnou látkou proti H. pylori, ako je soľ bizmutu, napríklad subcitrát bizmutu alebo subsalicylát bizmutu. Prípravky podľa vynálezu sa môžu podávať v spojení s inými činidlami, ako je cimetidín, ranitidín, omeprazol, antacidy, inhibítory ureázy alebo ich kombinácie, ktoré slúžia na liečbu niektorých chorôb a symptómov spojených s prítomnosťou H. pylori v gastrointestinálnom trakte. Pri týchto liečebných režimoch sa účinné farmaceutické činidlá môžu podávať súbežne alebo striedavo s farmaceutickými prípravkami podľa vynálezu, pričom spôsob podávania sa môže v priebehu liečby podľa potreby meniť.

H. pylori bol izolovaný z dentálneho povlaku, ktorý môže predstavovať rezervoár opakujúcich sa infekcií žalúdka. (Desa; H. G., Gill, H. H., Shankaran, K., Mehta, P. R., and Prabha, S. R. (1991) Dental Plaque: a permanent reservoir of Helicobacter pyloril Scand. J. Gastroenterol. 26: 1205 a Shames, B., Krajden, S., Fukasa, M., Babida, C. a Penner, J. L. (1989) Evidence for the Occurrence of the Samé Strain of Campylobacter pylori in the Stornách and Dental Plaque. J. Clin. Microbiol. 27: 2849.)

Bakteriocínové prípravky, ktoré sú vhodné na použitie proti H. pylori v dentálnom povlaku, sa teda môžu používať v kombinácii s bakteriocinovými prípravkami, účinnými pri nízkej hodnote pH, proti H. pylori v gastrointestinálnom trakte.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie bakteriocínu obsahujúceho lantionin na výrobu liečiva na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami v gastrointestinálnom trakte.
2. Použitie podľa nároku 1, kde poruchy sú vyvolané gramnegatívnymi baktériami.
3. Použitie podľa nároku 2, kde poruchy sú vyvolané baktériami zvolenými zo súboru pozostávajúceho z baktérií rodu Helicobacter, Salmonella, Escherichia, Clostridia, Bacillus, Bacteroides, Campylobacter a Versinia.
4. Použitie podľa nároku 3, kde poruchy sú vyvolané mikroorganizmom Helicobacter pylori alebo Campylobacter jejuni.
5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde liečivo navyše obsahuje chelatačné činidlo.
6. Použitie podľa nároku 5, kde chelatačným činidlom je EDTA, citrát alebo ich zmes.
7. Použitie podľa nároku 5 alebo 6, kde liečivo okrem bakteriocínu a chelatačného činidla obsahuje navyše kyslé vehikulum.
8. Použitie podľa nároku 7, kde kyslé vehikulum je zvolené zo súboru pozostávajúceho z acetátu, propionátu, citrátu, laktátu, sukcinátu, fumarátu, malonátu, adipátu, sorbátu, fosfátu alebo askorbátu.
9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde bakteriocínom je nizín.
10. Farmaceutický prípravok vhodný na vnútornú aplikáciu na prevenciu a liečenie gastrointestinálnych porúch vyvolaných patogénnymi mikroorganizmami vrátane baktérií rodu Helicobacter, ako je Helicobacter pylori, v gastrointestinálnom trakte, vyznačujúci sa tým, že obsahuje bakteriocín obsahujúci lantionin, chelatačné činidlo a ako ďalšiu zložku, ktorá je odlišná od chelatačného činidla, kyslé vehikulum.
11. Farmaceutický prípravok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že kyslé vehikulum obsahuje v množstve zaisťujúcom pH prípravku v rozmedzí od 2,5 do 5,0.
12. Farmaceutický prípravok podľa nároku 10 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že ako chelatačné činidlo obsahuje EDTA.
13. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10až 12, vyznačujúci sa tým, že ako kyslé vehikulum obsahuje acetát, propionát, citrát, laktát, sukcinát, fúmarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát alebo askorbát.
14. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10až 13, vyznačujúci sa tým, že ako bakteriocín obsahuje nizín.
15. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10až 14, vyznačujúci sa tým, že je vo forme prášku, tablety alebo tobolky vhodnej na orálne podávanie a ako bakteriocín obsahuje nizín, ako chelatačné činidlo obsahuje EDTA a ako kyslé vehikulum obsahuje citrát.