SK281021B6 - Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konštrukt na expresiu dna, hostiteľská bunka, spôsob produkcie humánneho polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomálna bunková línia - Google Patents

Abstract

Je opísaný purifikovaný a izolovaný polynukleotid zvolený zo súboru zahrnujúceho a) DNA človeka, majúcu sekvenciu SEQ ID NO: 5, uvedený v opise a b) molekulu DNA, ktorá pri stringentných podmienkach hybridizuje s nekódujúcim reťazcom DNA podľa odstavca a). Ďalej je opísaná hostiteľská bunka transformovaná touto molekulou DNA a spôsob produkcie humánneho polypeptidu, kódovaného uvedeným polynukleotidom, zahrnujúci kultiváciu uvedenej bunky a jeho izoláciu. Tento polypeptid je schopný sa špecificky viazať na proteín kinázu A (PKA). Uvedené sú tiež monoklonálna a antiidiotypová protilátka proti opísanému polypeptidu a hybridomálna bunková línia produkujúca uvedenú monoklonálnu protilátku.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa všeobecne týka proteínov, viažucich proteín kinázu A. Konkrétnejšie sa vynález týka nových proteínov a nukleotidových sekvencií kódujúcich tieto proteíny, ktoré lokalizujú v bunkách proteín kinázu A. Vynález, zahrnuje tieto aspekty: purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konštrukt na expresiu DNA, hostiteľská bunka, spôsob produkcie humánneho polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomálna bunková línia.

Doterajší stav techniky

Extraceluláme signály, ako sú hormóny a cytokíny, modulujú mnohé bunkové procesy aktiváciou adenylátcyklázy, zvyšovaním hladiny cAMP v bunkách a konečne aktiváciou cAMP-dependentnej kinázy (PKA). PKA je všadeprítomný enzým, ktorý funguje v mnohých intracelulárnych dráhach, napríklad pri regulácii metabolizmu glykogénu reverzibilnou fosforyláciou glykogénfosforylázy (Walsh et al., J. Biol. Chem., 243: 3763 až 3765 (1969)) a regulácii signalizácie prostredníctvom MAP kinázy inhibíciou aktivácie Raf-1 pomocou Ras (Vojtek et al., Celí, 74: 205 až 214 (1993) a Hafner et al., Mol. Celí. Biol. 14: 6696 až 6703 (1994)). Inaktívna PKA existuje ako tetramér, v ktorom sú dve totožné inaktívne podjednotky, viazané do diméru zahrnujúceho dve regulačné podjednotky. K aktivácii PKA pomocou cAMP dochádza tak, že sa molekula cAMP pripojí ku každej z regulačných podjenodtiek (R), pričom dôjde k uvoľneniu aktívnej katalyzačnej podjednotky (C). Bola identifikovaná len jedna forma podjednotky C, ale existujú dve triedy podjednotiek R, t. j. RI a RII, so zrejme odlišnými subcelulámymi distribúciami. Izoformy RI (Ria a RIβ) sú, ako bolo oznámené, prevažne cytoplazmatické a sú vylúčené z jadra, zatiaľ čo až 75 % izoforiem RII (Rlla a RIIp) má povahu častíc, ktoré sú spojené buď s plazmatickou membránou, cytoskeletovými zložkami, sekrečnými granulami, Golgiho aparátmi, centrozómami alebo možno jadrami (Scott, Pharmac. Ther. 50: 123 až 145 (1991)). Predpokladá sa, že rozdiely (buď fyzikálne alebo fyzilogické) medzi rôznymi podjednotkami R predstavujú prostriedok, pomocou ktorého sú bunky schopné aktivitu podjednotky C obmedziť na požadovanú dráhu.

Nedávne dôkazy ukázali, že bunky schopné zamerať aktivitu PKA umiestnením inaktívneho enzýmu do susedstva potenciálnych substrátov, pričom dôjde k obmedzeniu aktivity podjednotky C po jej uvoľnení, vyvolanom naviazaním cAMP na podjednotky R. Pri tomto „rozparcelovaní“ dochádza k segregácii PKA vo vzťahu k zložkám v danej signalizačnej dráhe, čo prispieva k špecificite PKA pri odpovediach na rôzne extraceluláme stimuly. K rozparcelovaniu PKA dochádza aspoň čiastočne prostredníctvom interakcie alebo obmedzenia podjednotky R špecifickými proteínmi, ktoré lokalizujú alebo zakotvujú inaktívny holoenzým na špecifických miestach vnútri bunky. Proteíny, ktoré špecificky segregujú PKA boli označené skratkou AKAP (tvorenou prvými písmenami anglického názvu „A Kinase Anchor Proteins“ (proteíny zakotvujúce kinázu A)) (Hirsch et al., J. Biol. Chem., 267: 2131 až 2134 (1992)). S ohľadom na skutočnosť, že - ako bolo ukázané - niektoré AKAP viažu a zakotvujú iné proteíny okrem PKA, označuje sa táto trieda proteínov obvykle názvom „kotevné proteíny“ (anchoring proteins).

Až doteraz bolo identifikované množstvo kotevných proteínov (pozri ďalej uvedená diskusia), ktoré evidentne viažu PKA prostredníctvom spoločného karboxyterminál neho sekundárneho štruktúrneho motívu, ktorý zahrnuje amfipatickú oblasť skrutkovice (Scott a McCartney, Mol. Endo., 8 : 5 až 11 (1994)). Väzbu PKA k väčšine, ak nie k všetkým identifikovaným kotevným proteínom, je možné blokovať za prítomnosti peptidu (Ht31), ktorý napodobňuje túto spoločnú sekundárnu skrutkovicovú štruktúru, zatiaľ čo mutant peptidu Ht31 obsahujúci jednu substitúciu aminokyseliny s tým, že narušuje skrutkovicovú povahu peptidu, nemá žiadny účinok na väzbu PKA ku kotevnému proteínu (Carr et al., J. Biol. Chem., 266: 14188 až 14192 (1991)). Napriek tomu, že sa interakcie PKA/kotevný proteín zúčastňuje spoločná sekundárna štruktúra, vykazujú kotevné proteíny (alebo homológy kotevných proteínov obsiahnuté v rôznych druhoch) obvykle jedinečnú primárnu štruktúru, dôkazom čoho je rastúci počet kotevných proteínov, ktoré boli identifikované v rôznych organizmoch. Jedinečná aminokyselinová štruktúra predovšetkým v aminoterminálnych oblastiach proteínov je pravdepodobne čiastočne príčinou skutočnosti, že kotevné proteíny boli identifíkované ako jedinečné proteíny v rôznych špecifických typoch buniek a v rôznych špecifických intracelulárnych oddieloch, v ktorých bolo rozmiestenie PKA pozorované.

Tak napríklad kotevné proteíny, ktoré sú prevažne cxprimované v mozgu cicavcov, boli identifikované na potkanovi (AKAP 150) a krave (AKAP 75) [Bergman et al., J., Biol. Chem., 266: 7207 až 7213 (1991)] a podobný proteín existuje aj u človeka (AKAP 79) [Carr et al., J. Biol. Chem, 287: 16816 až 16823 (1992)]. Totožnosť, pokiaľ ide o aminokyseliny a imunologická krížová reaktivita medzi týmito neurónovo špecifickými proteínmi ukazuje, že ide o homológy v rámci jedného druhu. Ako ďalší príklad je možné uviesť AKAP 100, ktorý sa javí ako špecifický pre srdcové a kostrové svaly človeka a potkana a zároveň je v nižšom rozsahu exprimovaný v mozgových bunkách týchto cicavcov, Ako ešte ďalší príklad je možné uviesť proteín AKAP Ht31 (Carr et al., J., Biol.'Chem., 267: 13376 až 13382 (1992)), ktorý sa javí ako špecifický pre tyroidné bunky. Naopak AKAP 95 sa exprimuje v mnohých typoch buniek a nevykazuje zrejmú špecificitu voči typu tkaniva alebo buniek.

Pokiaľ ide o rozmiestenie do špecifických oddielov vnútri bunky, sú proteíny AKAP 75 a proteín asociovaný s mikrotubulami (MAP-2) [Threurkauf a Vallee, J. Biol. Chem., 257: 3284 až 3290 (1982) a DeCamilli et al., J. Celí. Biol., 103: 189 až 203 (1986)], AKAP 79 [Glantz et al., J. Biol. Chem., 268: 12796 až 12804 (1993)] a AKAP 150 [Glantz et al., Mol., Biol. Celí, 3: 1215 až 1228 (1992)] tesne asociované s cytoskeletovými štruktúrnymi proteínmi, pričom AKAP 75 je špecifickejšie asociovaný s postsynaptickými hustotami [Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (1992)]. Ešte ďalšie kotevné proteíny sú rozmiestnené v menej rozšírených štruktúrach; AKAP 350 je asociovaný s centrozómami [KeryeT et al., Exp. Celí Res., 204: 230 až 240 (1993)], AKAP 100 so sarkoplazmatickým retikulom v srdcovom tkanive potkana [McCartney et aí., J. Biol. Chem., 270: 9327 až 9333 (1995)], 85kDa proteín AKAP spája PKA s Golgiho aparátom [Rios et al., EMBO J., 11: 1723 až 1731 (1992)].

Proteín AKAP 95 so zrejmou oblasťou viažucou „zinc finger“ DNA sa zdá byť výlučne obsiahnutý v jadre [Coghlan et al., J. Biol. Chem., 269: 7658 až 7665 (1994)]. Doména viažuca DNA v proteíne AKAP 95 má svoju úlohu pri priamom zapokení PKA do transkripcie génu, možno prostredníctvom umiestnenia PKA vzhľadom na fosforylačný a transkripčný faktor. Iné rôzne bunkové aktivity, pri ktorých bolo dokázané ovplyvnenie väzbou kotevného proteínu/PKA, boli zistené narušením tejto interakcie, napríklad narušenie väzby ΡΚΛ/kotevný proteín vedie k reverzii cAMP-indukovaného potlačenia expresie interleukínu 2 [Lockerbie et al., J. Celí. Biochem. Suppl. 2IA: 76, Abstract D2155 (1995)] a narušenie väzby PKA/kotevný proteín v neurónoch hipokampu vedie k zoslabeniu prúdov v úplných bunkách prostredníctvom receptorov a-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-izoxazolpropiónová kyselina/kainát glutamátu [Rosenmund et al., pozri uvedenú citáciu]. Schopnosť kotevných proteinov regulovať expresiu IL-2 a regulovať aktivitu glutamátového receptora v kombinácii so skoršími zisteniami, že kotevné proteíny sú schopné viazať kalcineurín, vedie k predpokladu mnohých terapeutických aplikácií kotevných proteinov a molekúl modulujúcich väzbu kotevného proteínu k bunkovým zložkám.

S ohľadom na rôznorodosť pokiaľ ide o expresiu v rôznych typoch buniek, subeelulárnu lokalizáciu a fyziologické aktivity až doteraz identifikovaných kotevných proteínov, existuje teda v tomto obore potreba pokračovať v identifikácii nových kotevných proteinov a nukleových kyselín, ktorými sú tieto proteíny kódované. Jedinečnosť primárnych štruktúr kotevných proteinov poskytuje cieľ pre špecificky regulovanú lokalizáciu PKA, a tým jej funkciu v špecifických bunkových procesoch.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú purifikované a izolované polynukleotidové sekvencie, ktoré kódujú proteíny vykazujúce biologické vlastnosti väzby a subeelulámeho rozparcelovania (compartmentalization) PKA. Polynukleotid, ktorý sa v súčasnosti uprednostňuje, vykazuje sekvenciu SEQ ID NO: 5. Polynukleotidy podľa vynálezu tiež zahrnujú polynukleotidy, ktoré hybridizujú pri stringentných hybridizačných podmienkach k polynukleotidu so sekvenciou SEQ ID NO: 5. Polynukleotidy podľa vynálezu môžu byť tvorené DNA alebo RNA a môžu hybridizovať k nekódujúcenu alebo kódujúcemu reťazcu molekuly DNA. DNA môže byť cDNA, genómová DNA a chemicky syntetizovaná DNA. Polynukleotidy podľa vynálezu môže byť identifikované štandardnými technikami, ako je komplementárna, hybridizácia pri podmienkach nízkej stringencie a PCR pri použití primárov zostrojených na základe znalosti sekvencie polynukleotidov podľa vynálezu.

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež rekombinantné expresné konštrukty, ktoré obsahujú polynukleotidy podľa vynálezu operabilne pripojené k regulačným elementom transkripcie, ako sú promótory a terminátory transkripcie. Regulačné elementy transkripcie môžu byť homológne alebo heterológne.

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež hostiteľské bunky transformované alebo transfekované polynukleotidmi podľa vynálezu. Tieto hostiteľské bunky môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické. Takto transformované alebo transfekovanc hostiteľské bunky sú veľmi užitočné pre expresu polypeptidov viažucich PKA podľa tohto vynálezu, ktoré môžu byť izolované z buniek alebo médií, použitých pre ich rast.

Ešte ďalším predmetom tohto vynálezu sú polypeptidy viažuce PKA, ktoré kódované polynukleotidmi podľa tohto vynálezu. Prednostným polypeptidom viažucim PKA je polypeptid, ktorý je kódovaný polynokleotidom so sekvenciou SEQ ID NO: 5. Polynukleotidy podľa vynálezu je možné purifikovať z prírodných zdrojov alebo produkovať rekombinantnými metódami pri použití hostiteľských buniek podľa vynálezu. Do rozsahu vynálezu patria aj va riantné polypeptidy, ktoré si zachovávajú biologickú aktivitu polypeptidu divokého typu, vrátane ich analógov odvodených adíciami, deléciami alebo substitúciami konzervatívnych aminokyselín, ktoré modulujú funkčné alebo imunologické vlastnosti polypeptidu viažuceho PKA. Iné variantné polypeptidy zahrnujú fuzionované proteíny, do ktorých sú zavedené prídavné polypeptidové sekvencie uľahčujúce purifikáciu alebo imobilizáciu na skúškových nosičoch. Ďalšie polypeptidy podľa vynálezu môžu byť identifikované na základe imunologickej krížovej reaktivity s polypeptidom, ktorý je kódovaný polynukleotidom so sekvenciou SEQ ID NO: 5.

Ďalej sú predmetom vynálezu polypeptidy a nepeptidové molekuly, ktoré špecificky viažu polypeptidy viažuce opísané PKA.

Prednostné väzbové molekuly zahrnujú protilátky (napríklad polyklonálne, monoklonálne, rekombinantné protilátky alebo ich väzbové fragmenty Väzbové molekuly sú užitočné pre purifikáciu polypeptidov viažucich PKA, identifikáciu buniek exprimujúcich proteíny viažuce PKA a moduláciu in vivo interakcie medzi PKA a polypeptidmi viažucimi PKA.

Ešte ďalším predmetom tohto vynálezu sú hybridomálne bunkové línie produkujúce protilátky, vykazujúce špecifickú imunoreaktivitu vzhľadom na polypeptidy viažuce PKA podľa tohto vynálezu. Takéto hybridómy je možné produkovať a identifikovať pomocou techník, ktoré sú dobre známe v tomto obore.

V ďalšom opise sú tiež uvedené skúšky, pomocou ktorých je možné identifikovať molekuly narušujúce interakciu medzi PKA a proteínmi viažucimi PKA podľa tohto vynálezu (napríklad imobilizované väzbové skúšky, roztakové väzbové skúšky, skúšky založené na scintilačnej proximite, skúšky založené na sereeningu dihybridov a potí), V niektorých prípadoch môže byť žiaduce modelovať väzbu medzi PKA a polypeptidmi podľa tohto vynálezu, ý iných prípadoch môže byť žiaduce špecificky modulovať väzbu medzi polypeptidom viažucim PKA a bunkovou zložkou (inou ako PKA), ku ktorej sa tento polypeptid viaže. V obidvoch prípadoch predstavujú polypeptidy podľa vynálezu užitočný cieľ pre sereening pri stanoveniach podľa tohto vynálezu. Stanovenia podľa tohto vynálezu je možné uskutočňovať rôznymi spôsobmi, napríklad ako stanovenia v bunkách, ako sú stanovenia s dihybridovým scrccningom alebo komplementárne stanovenia, ktoré sú opísané v US 5 283 173 a WO 91/16457. Skúšky tohto typu sú veľmi užitočné na to, aby zistili intracelulámu účinnosť zlúčenín. Skúšky, ktoré nie sú založené na bunkách, zahrnujú stanovenie na báze scintilačnej proximity, cAMP-kompetitívne stanovenie, stanovenie EL1SA, rádioimunoeseje, chemiluminescenčné stanovenie a pod. Takéto skúšobné postupy sú dobre známe v tomto obore a sú všeobecne opísané v nasledujúcich publikáciách: Boudet et al., J., Immunol. Meth., 142: 73 až 82 (1991); Ngai et al., J. Immunol. Meth., 158: 267 až 176 (1993); Pruslin et al., J. Immunol. Meth., 137: 27 až 35 (1991); Udenfriend et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8672 až 8676 (1985); Udenfriend et al., Anál, Biochem., 161: 494 až 500 (1987); Bosworth a Towers, Náture, 341: 167 až 168 (1989); Gilman, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 67: 305 až 312 (1970) a v US patente č. 4 568 649.

Užitočnosť zlúčenín modulujúcich väzbu kotevného proteínu je jasná. Tak napríklad pokiaľ ide o malé molekuly, môže byť zistená schopnosť inhibovať väzbu PKA/kotevný proteín alebo interakciu kotevného proteínu so špecifickými zložkami bunky. Modulátory tohto typu sú schopné delokalizovať špecifické oblasti PKA a postihovať len za meranú signalizačnú dráhu. Identifikácia modulátorov väzby kotcvného proteínu k iným bunkovým zložkám môže byť rovnako prospešná. Tak napríklad faktory ovplyvňujúce aktivitu kalcineurínu podobným spôsobom, ako to robia skôr identifikované imunosupresanty, ale s menej vedľajšími účinkami by mohli byť užitočné pri liečení chorôb, ktoré sú teraz liečené toxickejšie imunosupresantmi. Identifikácia faktorov, modulujúcich účasť kotcvného proteínu v bunkových aktivitách, by tiež mohla byť užitočná pri nahradzovaní terapeutických intervencií, ktoré sú v súčasnosti obvyklé. Tak napríklad faktory, regulujúce reguláciu expresie IL-2 kotevným proteínom, by mohli byť užitočné ako alternatíva podávania exogónneho rekombinantného IL-2.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. Tieto príklady majú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú. Príklad 1 sa týka identifikácie T-bunka špecifického kotevného proteínu z cDNA knižnice človeka. Príklad 2 opisuje RII väzbovú špecifickú identifikovaného kotevného proteínu. Príklad 3 sa týka stanovenia nukleotidovej sekvencie kotevného proteínu. Príklad 4 uvádza expresiu klonu kotevného proteínu. Príklad 5 sa týka distribúcie kotevného proteínu v bunke a tkanive. Príklad 6 sa týka potenciálnych terapeutických aplikácií kotevného proteínu a molekúl modulujúcich väzbu kotevného proteínu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 Identifikácia kotevných proteínov exprimovaných v T-bunke

Pri pokuse o identifikáciu nových kotevných proteínov v T-bunke sa cDNA knižnica z Jurkatových T-buniek človeka subklonovaná do ZAPII Express (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) podrobí screeningu použitím techník „Rlla overlay“, ktoré sú opísané v Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (19932).

V krátkosti sa tento postup môže opísať takto: 1 μΐ fágu knižnice (5 x 10⁴ pfu) sa pri k 600 pl suspenzie E. coli kmeňa XL-1 Blue MRF' (Stratagene v 10 mM sírane horečnatom s optickou denzitou OD₆₀₀ = 0,5. Baktérie a tá sa inkubujú 15 minút pri 37 °C a po tomto čase sa do suspenzie pridá 7,5 ml vrchného agaru [médium NZY (N-Z-Amin, typ A, 10 g/liter; kvasinkový extrakt, 5 g/liter; 86mM chlorid sodný; 8mM heptahydrát síranu horečnatého; Bacto-agar, 15 g/liter; pH 7,5), 0,7 % agarózy). Výsledná zmes sa ihneď potom nanesie na misky NZY predhriate na toplotu 37 °C. Misky sa nechajú schladiť na teplotu miestnosti a potom sa 4 hodiny inkubujú pri 42 °C. Na misky sa umiestnia nitrocelulózové filtre, ktoré boli predtým máčané v lOmM izopropyl-l-tio-p-D-galaktopyranozide (IPTG) a pokračuje sa 4 hodiny v inkubácii pri 37 °C. Filtre sa odstránia a trikrát premyjú v TBS (50mM Tris, pH 7,5, 150mM chlorid sodný) a blokujú cez noc pri 4 °C v médiu Block (TBS, 5 % mlieko neobsahujúce tuk a 0,1 % BSA). Misky sa prekryjú ďalšími podobne preparovanými nitrocelulózovými filtrami a inkubujú cez noc pri 4 °C. Potom sa tieto filtre zoberú, premyjú (uvedeným spôsobom) a blokujú (tiež uvedeným spôsobom) I hodinu pri teplote miestnosti.

Približne 4 pg (6 μΐ) rekombinantnej myšacej Rlla sa zmieša s 2,35 pg (0,5 pl) rekombinantnej katalytickej podjednotky PKA z hovädzieko dobytka v reakčnom médiu obsahujúcom 2,5 μΐ [³²P]ATP (25 pCi, 3 000 Ci/mmol) a 1 μΐ pufra (obsahujúceho 0,5M MOPS, pH 7,0; 0,5M chlorid sodný; 25mM chlorid horečnatý a lOmM DTT). Reakcia sa nechá prebiehať 30 minút pri 30 °C a potom sa nezabudovaná značiaca látka odstráni použitím stĺpca Execelluose GF-5 (Pierce). Filtre sa skúšajú s [³²P]RIIa/ (100 000 cpm/ml v Block) 6 hodín pri teplote miestnosti. Po inkubácii sa filtre trikrát premyjú v TBS s obsahom 1 % namáčadla Tween20 a exponujú sa na rontgenografický film (16 hodín).

Z približne I x 10^s plakov podrobených screeningu bol zistený jeden pozitívny, plak č. 11. Tento plak bol identifikovaný na základe väzby značenej Rlla. S plakom č. 11 sa uskutoční tiež sekundárny sereening, použitím metód opísaných pre prvý sereening. Pritom bolo zistené, že potomstvo plaku č. 11 je tiež schopné viazať Rlla značenú rádioizotopom.

Príklad 2

Specificita väzby Rlla k plaku č. 11

S ohľadom na nedávne správy, že peptid Ht31 (SEQ ID NO: 1) je genericky schopný blokovať väzbu PKA ku kotevným proteínom a že proteínový mutant Ht31 (pozri sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá je uvedená ďalej, pričom prolínová substitúcia je vytlačená hrubo a podtrhnutá) toho schopný nie je, sa skúša špecificita väzby Rlla k plaku č. 11 v paralelných experimentoch, pri ktorých sa uskutočňuje prekrytie Rlla za prítomnosti každého z týchto peptidov Ht31.

orig. 9

V krátkosti sa postupuje takto: Zber na itrocelulózových filtroch sa uskutočňuje spôsobom opísaným v príklade 1, len s tým rozdielom, že sa výsledné zozbierané plaky preinkubujú 15 minút pri teplote miestnosti v médiu Block s obsahom 1 μΜ, buď peptidu Ht31 alebo jeho prolínového mutantu. Po preinkubácii sa filtre skúšajú pomocou [³²P]RIIa spôsobom opísaným V príklade 1 a potom sa filtre podrobia autorádiografii.

Zo získaných autorádiogramov je zrejmé, že preinkubácia praku č. 11 s peptidom Ht31 má za následok blokovanie väzby [³²P]RTIIa, zatiaľ čo preinkubácia s prolínovým mutantom peptidu Ht31 tento účinok nemá. Tieto výsledky ukazujú, že väzba Rlla k polypeptidu kódovanému plakom č. 11, je tvorená sekundárnou štruktúrou plaku č. 11, ktorá sa podobá štruktúre použitej v skôr identifikovaných kotevných proteínoch.

Príklad 3

Klonovanie cDNA plaku č. 11

Pri pokuse o stanovenie nukleotidovej sekvencie inzertu vo fágu plaku č. 11 a pre dedukciu aminokyselinovej sekvencie kódovaného proteínu sa cDNA inzert plaku č. 11 vyštiepi in vivo použitím systému ExAssist/XLOLR (Stratagene) podľa inštrukcií výrobcu.

V krátkosti je možné tento postup opísať takto: Plak č. 11 sa odstráni z misky NZY a zmieša s 500 μΐ pufra SM [lOOmM chlorid sodný, 98mM heptahydrát síranu horečnatého, 50mM Tris HCI, pH 7,5, želatína (0,1 g/liter)] a 20 μΐ chloroformu. Zmes sa premieša vírením a skladuje pri teplote 4 °C (zásobný fág). Bunky XL-1 Blue MRF' a bunky XLOLR (obidve od Stratagene) sa oddelene pestujú cez noc pri 30 °C v médiu LBM doplnenom heptahydrátom síranu horečnatého (lOmM) s obsahom 0,2 % objemového maltózy, 0,5 ml nočnej kultúry buniek XL-1 Blue MRF' sa zriedi 50 ml média LBM (zriedenie v pomere 1/100) a zriedená zmes sa nechá 2 až 3 hodiny rásť pri 37 °C, až do semilogaritmickej fázy (OD₆₀₀ ⁼ 0,2 až 0,5, v prípade buniek XL-1 Blue MRF' alebo OD₆₀o = 0,5 až 1,0, v prípade buniek XLOLR. Kultúra sa odstredí pri 1500 x g a výsledná peleta sa resuspenduje v lOmM heptahydrátu síranu horečnatého na denzitu OD₆₀₀ = 1,0.

200 μΐ buniek XL-1, 250 μΐ opísanej zásobnej fágovej suspenzie a 1 μΐ pomocného fágu ExAssist (Stratagene) sa zmieša a inkubuje 15 minút pri 37 °C. Pridajú sa 3 ml média LBM a zmes a ďalej 2,5 hodiny inkubuje pri 37 °C pri trepaní. Po inkubácii sa zmes 15 minút odstreďuje pri 2000 x g. Supematant sa oddelí, inkubuje 15 minút pri 70 °C a 15 minút sa odstreďuje pri 4000 x g. Výsledný supematant obsahuje vláknitý ág, ktorý obaľuje DNA z plaku č. 11 vo fagemide pBK-CMV. Fagemidy sa zachránia zmiešaním 200 μΐ buniek XLOLR (príprava pozri vyššie) s 10 μΐ zásobného prípravku a zmes sa 15 minút inkubuje pri 37 °C. Po inkubácii sa pridá 300 μΐ média LBM a zmes sa ďalej inkubuje 45 minút pri 37 °C. Výsledná bunková suspenzia sa nanesie pri koncentrácii 200 μΐ/miska na LBM s obsahom 50 pg/ml kanamycínu.

Príprava plazmidu sa uskutočňuje pomocou štandardných postupov a zahrnuje použitie kitu Wizard Miniprep (Promega). Plazmidivá DNA izolovaná z plaku č. 11 sa označí ako kloň č. 11. Z vektora sa štiepením EcoRI a BAmHI vyštiepi inzert cDNA a výsledné fragmenty sa oddelia použitím elektroforézy na agarózovom géli. Stanoví sa dĺžka inzertu, kloň č. 11, ktorá je 2850 bp. Hniezdové delécie klonu č. 11 sa vytvoria pomocou systému Erase-aBase (Promega, Madison, WI, USA) a kloň č. 11 sa sekvenuje použitím primérov Universal T3 (ATTAACCCTCACTAAAG [SEQ 1D NO: 3]) a T7 (GATATCACTCAGCATAA [SEQ ID NO: 4]) a súpravy Prism Ready Dyedeoxy Terminátor Cycle Kit (Perkin Elmer) v zariadení ABI373 DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, Kalifornia, USA).

Sekvencia DNA klonu č. 11 je znázornená v SEQ ID NO: 5. Keďže nebolo možné v nukleotidových sekvenciách detegovať žiadny vhodný iniciačný kodón, nebolo možné stanoviť dedukovanú aminokyselinovú sekvenciu a molekulovú hmotnosť klonu č. 11.

Rešerše „Blast Search“ na nukleotidovej úrovni (16 júna 1995 14:01:37 EDT) sekvencie získanej z priméru T3 ukázala, že existuje s klonom označeným „Homo Sapiens cDNA 3'-end similar to none“ (prírastkové číslo T32770), zatiaľ čo sekvenčné dáta získané použitím priméru T7 vykázali 98 % homológiu v rozsahu 343 báz od polohy 1905 do polohy 2248 klonu č. 11 s klonom označeným „Homo Sapiens partial cDNA 5'-end similar to none“ (prírastkové číslo T31099). Okrem toho vykazuje kloň č. 11 98 % homológiu v rozsahu 332 báz od polohy 2308 do polohy 2640 klonu č. 11 s klonom označeným „Homo Sapiens partial cDNA sequence clone 66DO4 (prírastkové číslo Z24883).

Príklad 4

Expresia klonu č. 11

S cieľom stanovenia približnej molekulovej hmotnosti génového produktu klonu č. 11 sa nočná kultúra klonu č. 11 v bunkách XLOLR (pripravená spôsobom opísaným v príklade 3) nechá rásť na médiu LBM s 12,5 pg/ml tetracyklínu a potom sa použije na inokuláciu 250 μΐ toho istého média. Inkubácia sa nechá prebiehať pri 37 °C až do denzity OD^ = 1,2 a potom sa baktérie peletizujú 15-minútovou centrifugáciou pri zrýchlení 6000 x g. Peleta sa zváži a resuspenduje v 10 objemoch (1 hmotnostný diel na 10 objemových diolov) pufra FP (1 % Triton X-100, 150mM chlorid sodný, lmM EGTA. lmM EDTA, lOmM Tris, pH 7,4, 1 % aprotinín, 0,2 % azid sodný). Bunky sa rozdrvia vo francúzskom lise a lyzát sa vyčerí 30-minútovou centrifugáciou pri 40 000 x g, lyzát sa skoncentruje v koncentrátore Centricon-10 (Amicon). Alikvót koncentrovaného lyzátu sa nanesie na 10 % Tris-glycínový gél (Novex), uskutuční sa elektroforéza a prenos na Immobilon (Millipore). Blot sa skúša pomocou [³²P]RIIa. Deteguje sa jediný pás (asi 120 kDa), ktorý je čiastočne vypudený konkurenčným peptidom Ht31. Tieto výsledky ukazujú, že kloň č. 11 kóduje proteín viažuci PKA, ktorý je možné použiť pri skúškach s cieľom identifikácie inhibítora väzby medzi polypeptidmi viažucimi PKA a PKA.

Príklad 5

Distribúcia klonu č. 11 v bunkách a tkanivách

S cieľom stanovenia bunkovej a tkanivovej distribúcie expresie klonu č. 11 sa pre skúšanie klonu č. 11 na úrovni mRNA použije PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR).

V krátkosti je možné použitý postup opísať takto. Najprv sa skunštruujú priméry s dĺžkou úseku sekvencie klonu č. 11 300 bp na základe sekvencie nukleovej kyseliny, ako bola stanovená v príklade 3. V sekvencii pre kloň č. 11 (SEQ ID NO: 5) zodpovedá primér 2T3 nukleotidom 266 až 283, primér M2T3 nukleotidom 434 až 453, primér R2T3 nukleotidom 601 až 602, primér R2T7 nukleotidom 2229 až 2250, primér M2T7 nukleotidom 2337 až 2400 a primér 2bT7 nukleutidom 2256 až 2592. RNA sa pripraví z rôznych typov buniek a tkanív (ktoré sú opísané ďalej v diskusii výsledkov (použitím súpravy RNA Isolation Kit, Stratagene). RT-PCR sa uskutočňuje takto: RNA (približne 10 pg v 10 μΐ vody) sa najprv denaturuje inkubáciou pri 80 °C počas 3 minút a potom sa RNA inkubuje na ľade at do času, keď sa uskutočnia reakcie s reverznou transkriptázou. Posledné uvedené reakcie sa uskutočňujú takto: Denaturovaná RNA sa zmieša s 8 μΐ pufra 5X MMuLV-RT (Boehringer), 8 μΐ 2,5mM zmesi dNTP, 1 μΐ vody s obsahom vždy 0,5 pg priméru 2T3 a R2T3 alebo 2bT7 a R2T7, μΐ inhibítora RNAse (Boehringer), 1 pl MMuLV-RT (Boehringer) a 11 pl vody a potom nasleduje jednohodinavá inkubácia pri 42 °C.

Reakcia PCR sa uskutočňuje týmto spôsobom: 2 pl reakčnej zmesi, získanej pri reakcii s reverznou transkriptázou sa zmiešajú s 3 pl 2,5mM zmesi dNTP, 3 pl 10X Taq polymerázového pufra (Boehringer), 3 pl /0,3 pg) priméru 2T3 s 3 pl (0,3 pg) priméru R2T3 alebo 3 pl (0,3 pg) priméru 2bT7 a 3 pl (0,3 pg) priméru R2T7, 0,5 pl Taq polymerázy a 14,5 pl vody. Zmes sa 4 minúty zahrieva na 94 °C a potom sa uskutoční 30 reakčných cyklov (94 °C počas 1 minúty, 60 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty).

Amplifikačné produkty z PCR reakcií sa oddelia elektroforézou na 1 % agarózovom géli a potom sa prenesú na membránu Nytran Plus (S+S). Pritom sa používajú štandardné postupy. Produkty PCR sa pripoja k membráne zosieťovaním pomocou UV žiarenia a membrána sa potom 3 hodiny predbežne hybridizuje pri 42 °C v 5X SSPE, 0,5 % SDS, 0,lmM Tris, pH 7,5 a2X Denhardtovom médiu.

Hybridizačné próby sa pripravia značením koncov takto: 2 pl (200 ng) priméru M2T3 sa zmieša s 2 pl priméru. M2T7 (200 ng), 2 pl 10X polynukleotidkinázového pufra (Boehringer), 10 pl ³²P-ATP (100 pCi, 3000 Ci/mmol), pl (2 jednotkami) T4 polynukleotidkinázy (Boehringer) a 2 pl vody. Reakcia sa nechá prebiehať 30 minút pri 37 °C a potom sa zastaví prídavkom 2 pl 0,5M EDTA. Nezabudovaná značiaca látka sa odstráni centrifugáciou na stĺpci Centristep (Princeton Separation Inc.). Potom sa membrána ďalej podrobí pôsobeniu (pri 42 °C) rovnakého perhybridizačného pufra, ale s obsahom celkovo 400 ng (vždy 200 ng každého) ³²P-značeného priméru M2T3 a M2T7. Po hybridizácii sa membrány premyjú pri teplote miestnosti 3 x vždy počas 10 minút 0,5X SSC s 0,2 % SDS a potom nasleduje autorádiografia.

SK 281021 Β6

Výsledky na úrovni buniek ukazujú, že kloň č. 11 je exprimovaný v Rámových bunkách (B-bunky, Jurkatových bunkách (T-bunky), bunkách U973 (monocyty), bunkách T84 (karcinóm hrubého čreva), bunkách HL60 (promyelocytická leukémia), bunkách A549 (epitelia pľúc) a bunkách HeLa (epiteliálny karcinóm). Výsledky z analýzy tkanív ukazujú, že kloň č. 11 je exprimovaný vo vajíčkach, pečeni a okcipitálnom kortexe mozgu človeka.

Príklad 6

Potenciálne terapeutické aplikácie

Predchádzajúce zistenie, že AKAP 79 viaže kalcineurín, je relevantné s ohľadom na skutočnosť, že kalcineurín je cieľom z dvoch silných a klinicky užitočných imunosepresŕv, cyklosporínu a FK506, ktoré obidva inhibujú aktivitu kalcineurínu. Ako je opísané ďalej, ako cyklosporín, tak aj FK506 sú užitočné pri liečení rôznych chorôb, ale vykazujú významné obmedzujúce vedľajšie účinky. Predpokladá sa, že faktory modulujúce väzbu kotevný proteín/kalcineurín môžu v konečnom dôsledku modulovať aktivitu kalcineurínu podobným spôsobom ako aktivitu cyklosporínu alebo FK506. Identifikácia takéhoto modulátora, predovšetkým modulátora s menším rozsahom vedľajších účinkov, ako je rozsah pozorovaný na iných imunosupresívach, by pravdepodobne mala široké terapeutické využitie pri liečení mnohých chorôb, ktoré sú v súčasnosti liečené cyklosporínom alebo FK-506.

Boli oznámené mnohé klinické indikácie cyklosporínu a FK-506. Tak napríklad cyklosporín predstavuje štandard pre potláčanie imunity po transplantáciách, pričom umožňuje uskutočniť transplantáciu pečene, pľúc, čriev a podžalúdkovej žľazy napriek tomu, že sa FK506 všeobecne považuje za silnejšie imunosupresívum. Pacienti, ktorým bola urobená transplantácia, ktorí netolerujú alebo nerešpondujú na cyklosporín alebo FK506, sú niekedy úspešne prevedení na iné liečivo.

Ako ďalší príklad je možné uviesť zápalovú chorobu čriev (IBD), čo je obvyklý termín pre dve choroby majúce rôzne klinické prejavy, t. j. Crohnovu chorobu a vredovú kolitídu (UC). Cyklosporín bol úspešne použitý pri liečení Crohnovej choroby, pričom štatisticky významné výsledky liečenia sa prejavili prinajmenšom pri jednom z indexov aktivity choroby [Brynskow, Dan. Med. Bull. 41: 332 až 344 (1994)]. Iné indexy, ktoré najlepšie korelejú s rezolúciou akútnych exacerbácií, však vykázali len nevýznamnú tendenciu k zlepšeniu. Cyklosporín vykázal tiež účinnosť pri prudkej akútnej vredovej kolitíde rezistentnej voči steroidom (dáta nie sú štatisticky významné, keďže bolo nutné skúšku ukončiť z etických dôvodov). Ďalšia skúška na pacientoch so sklerotizujúcou cholangitídou a vredovou kolitídou ukázala okrajovú štatistickú významnosť smerom k miernejšiemu priebehu vredovej kolitídy. Po vysadení liečenia došlo obvykle k recidíve a liečenie bolo obmedzené s ohľadom na toxicitu (Choi a Targan, Dig. Dis. and Sci. 39: 1885 až 1892 (1994)). Okrem toho sa pri liečení IBD úspešne používali tiež iné imunosupresiva, ako je methotrexate, azathioprine a 6-MP.

Ako ďalší príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení reumatoidnej artritídy. Pri niekoľkých pokusoch, keď bola táto látka použitá ako liečivo druhej alebo tretej voľby, t. j. u pacientov, ktorí nerešpondovali na iné zavedené terapie a pritom boli postihnutí prudkou chorobou. Pri týchto pokusoch sa zistilo, že cyklosporín je všeobecne rovnako účinný a rovnako toxický ako iné činidlá druhej voľby, ako je zlato, antimalarické prostriedky a azathioprine, D-penicillamine a methotrexate, [Wells a Tugwell, Br. J. Rheum, 32 (suppl. 1): 51 až 56 (1993);

Forre et al., Arth. Rheum., 30: 88 až 92 (1987)]. Tieto pokusy uvádzajú len liečenie „veľmi prudkej aktívnej rcumatoidnej artritídy, pri ktorej je liečenie neúčinné“ s ohľadom na skutočnosť, že cyklosporín vykazuje „potenciálne nevratnú toxicitu“ [Dougados a Torley, Br. J. Rheum. 32 (suppl. 1): 57 až 59 (1993)]. Renálna toxicita je pravdepodobne prevažne sprostredkovaná renálnou vazokonstrikciou, ktorá vyvoláva exaccrbáciu nefrotoxicity nesteroidných protizápalových liečiv (NSAID) a obličkovú chorobu, ktorá je inherentnou súčasťou reumatoidnej artritídy [Leaker a Cairns, Br. J. Hosp. Med., 52: 520 až 534 (1994); Sturrock et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1149 až 1156 (1996); Ludwin a Alexopolulou, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 60 až 64 (1993)]. Pri asi 10 % biopsií obličiek pacientov postihnutých reumatoidnou artritídou, ktorí boli liečení cyklosporínom, boli zistené morfologické znaky toxicity cyklosporínu [Intemational Kidney Biopsy Registry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases, Bt. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 65 až 71 (1993)].

Ako ešte ďalší príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení astmy dependentnej od steroidov. Pri jednom pokuse bol malý počet pacientov náhodným spôsobom rozdelený do skupín, ktoré dostávali buď cyklosporín alebo placebo. Cyklosporínová skupina vykazovala zvýšený prietok vzduchu a FVC ako aj menší počet prípadov záchrany prednizolónom.

Ako ďalší príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu pri liečení nefrotického syndrómu dependentného od steroidov. Ukázalo sa, že pacienti, ktorým bola podávaná nízka dávka cyklosporínu, mali znížené požiadavky na steroid, ale po vysadení cyklosporínu došlo k návratu do pôvodného stavu. Formy nefrotického syndrómu rezistentného voči steroidom vykazujú odpoveď na cyklosporín len v 20 až 30 % prípadov [Meyrier, Nephrol. Dial. Transplant,

9. 596 až 598 (1994); Hulton et al., Pediatr. Nephrol. 8: 401 až 403 (1994)].

Pokiaľ ide o liečenie systémového lupus erythematosus (SLE), jedna štúdia ukázala štatisticky významný pokles indexov aktivity SLE pri prospektivnej nerandomizovanej neriadenej štúdii [Tokuda et al., Arthr. Rheumat., 37: 551 až 558 (1994)]. Iné štúdie však účinnosť pri SLE nepotvrdili.

Ako ďalší príklad je možné uviesť účinnosť cyklosporínu indukovať remisiu inzulín-dependentného diabetes mellitus, ak bol cyklosporín zavedený skoro po začiatočných prejavoch. Remisie trvali v priemere asi jeden rok napriek tomu, že v niektorých prípadoch boli aj dlhšie - až 850 dní [Jenner et al., Diabetológia, 35: 884 až 888 (1992); Bougneres et al., Diabetes, 39: 1264 až 1272 (1990)]. Žiadny dlhodobejší účinok cyklosporínu nebol zaznamenaný pri nasledujúcom rozšírení jednej štúdie [Martin et al., Diabetológia, 34: 429 až 434 (1991)]. Pri jednej štúdii však došlo počas 12 až 18 mesiacov liečenia k zhoršeniu funkcie obličiek, pričom funkcia obličiek sa úplne nevrátila na úroveň dosiahnutú pri podávaní placeba, čo ukazuje, že zrejme došlo k určitému chronickému poškodení obličiek [FeldtRasmusscn et al., Diabetes Medicíne, 7: 429 až 433 (1990)]. Aby sa zvýšil účinok imunosupresívneho liečenia počas inzulín-depententného diabetes mellitus, bola by potrebná skoršia intervencia. Niektorí výskumníci úspešne skúšali profylaktické liečenie znakov diabetes na príbuzných pacientoch z prvého kolena [Elliott and Chase, Diabetológia, 34: 362 až 365 (1991)].

Ako ďalší príklad je možné uviesť účinné liečenie lupienky cyklosporínom [Cuellar et al., Balliere's Clin. Rheum., 8 : 483 až 498 (1994); Ellis et al., JAMA 256: 3110 až 3116 (1986)]. Vysokodávková terapia bola účinná pri lie cení psoriatickej artritídy, čo je veľmi prudká forma deštruktívnej artritídy. Pri prerušení liečenia bola obvykle pozorovaná exacerebácia choroby kože a kĺbov. S ohľadom na potenciálne vedľajšie účinky a potrebu priebežnej dlhodobej liečby je cyklosporín indikovaný len v prípadoch psoriatickej artritídy, na ktorú nezaberajú iné spôsoby liečenia.

Okrem toho bola demonštrovaná účinnosť liečenia prudkej atopickej dermatitídy cyklosporínom pri štúdiách kontrolovaných placebom a dvoma slepými pokusmi [Van Joost et ak, br. J. Derm., 130: 634 až 640 (1994): Cooper, J. Invest. Derm., 102: 128 až 137 (1994)]. Pacienti pri tejto štúdii dávali prednosť vedľajším účinkom liečenia zahrnujúcim nauzeu, abdominálny diskomfort, parestéziu, cholestasis a obličkovú nedostatočnosť pred neliečenou chorobou. Pri inej randomizovanej štúdii, kontrolovanej aplikáciou placeba a dvoma slepými pokusmi sa ukázalo, že podávaním cyklosporínu sa významne zvýšila kvalita života pacientov postihnutých prudkou atopickou dermatitídou [Salek et ak, Br. J. Derm., 129: 422 až 430 (1993)]. Po prerušení liečby cyklosporínom došlo k rýchlej recidíve kožných lézií, ale kvalita života zostala zlepšená.

Cyklosporín bol ďalej použitý pri liečení chronickej dermatitídy rúk, čo je choroba, u ktorej bola konštatovaná prevalencia 4 až 22 %, ktorá sa obvykle lieči topickými steroidmi, ktoré však nezaberajú u mnohých pacientov. Nízke dávky cyklosporínu sa ukázali byť ako účinné pri otvorenej štúdii pre 6 zo 7 liečených pacientov [Reitamo a Granlund, Br. J. Derm., 130: 75 až 78 (1994)]. Po prerušení podávania cyklosporínu došlo k recidíve približne u polovice pacientov.

Ďalej bol tiež cyklosporín použitý na liečenie urtikárie a angioedému, čo sú idiopatické kožné choroby, ktoré sa prejavujú ako žihľavka a podkožné opuchy. Patológia týchto chorôb má vzťah k žírnym bunkám a ich liečenie je často neúčinné. Pri jednej štúdii boli traja pacienti postihnutí týmito chorobami, nerešpondujúci na iné liečenie, liečení cyklosporínom a všetky symptómy u nich vymizli počas jedného týždňa [Fradin et al., J. Am. Acad. Derm., 25: 1065 až 1067 (1991)]. U všetkých pacientov muselo byť liečenie ukončené vzhľadom na vedľajšie účinky a po prerušení liečenia došlo k recidíve symptómov.

Pokiaľ ide o iné reumatologické choroby, uvádzajú štúdie účinné liečenie cyklosporínom aj pokiaľ ide o ďalšie, menej časté, autoimunitné choroby, ako je Behcetova choroba [Pacor et al., Clin. Rheum., 13: 224 až 227 (1994)], Wegnerova granulomatóza [Alien et al., Cyclosporin a Therapy for Wegner's Granulomatosis in ANCA-Associated Vasculitides, lmmunological and Clinical Aspects, Gross cd. Plénum Press (1993)] a imunitné mediovaná trombocytopénia [Schultz et al., Blood 85: 1406 až 1408 (1995)].

Pri mnohých opísaných štúdiách bolo použitie cyklosporínu alebo FK506 spojené s mnohými nežiaducimi vedľajšími účinkami. Obvykle platí, že všeobecné potlačenie imunity vedie k zvýšenému ohrozeniu infekciami a malignanciami a je nepravdepodobné, že imunosupresíva príbuzné kotevným proteínom by nezahrnovali podobné riziká. Iným vedľajším účinkom je však možné sa vyhnúť, alebo je možné ich znížiť tkanivovou špecificitou kotevného proteínu. Najbežnejším vážnym vedľajším účinkom cyklosporínu aj FK 506 je nefrotoxicita, ktorá je prinajmenšom do určitej miery závislá od podanej dávky a vyskytuje sa u väčšiny pacientov, obvykle v podobe poklesu rýchlosti glomerulárnej filtrácie počas liečenia. Tento vedľajší účinok je však aspoň čiastočne vratný po prerušení podávania liečiva [Leaker and Caims, pozri uvedená citácia]. Obvykle sa nevyvinie progresívna obličková insuficiencia napriek tomu, že pre definitívne zhodnotenie by bolo potrebné uskutočniť ďalšie štúdie. Chronické poškodenie bolo pozorované aj u pacientov, ktorým bol podávaný cyklosporín v nízkych dávkach (3 až 4 mg/kg/deň). Pri biopsii boli u 40 % z týchto pacientov pozorované zmeny zahrnujúce intersticiálnu fibrózu, tubulámu atrofiu a arteriolopatiu [Svarstad et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1462 až 1467 (1994); Young et al., Kidney International, 46: 1216 až 1222 (1994)]. Zmeny endotelových buniek boli tiež zrejmé na histologických rezoch [Kahan, N. Engl. J. Med., 321: 1725 až 1748 (1989)]. Bol urobený predpoklad, že sa nefrotoxicita dostavuje predovšetkým v dôsledku arteriolámej vazokonstrikcie a chronicej miernej ischémie [Leaker and Caims, pozri uvedená citácia] napriek tomu, že sú tieto liečivá tiež priamo toxické voči tubulárnym bunkám a vaskulámym intersticiálnym bunkám [Platz ct al., Transplantation, 58: 170 až 178 (1994)]. Niektoré správy ukazujú, že výskyt a prudkosť nefrotoxicity môžu byť o niečo vyššie pri FK 506 [Platz et al., uvedená citácia].

Inou uvádzanou významnou toxicitou ako cyklosporínu, tak aj FK 506, je neurotoxicita, ktorá sa klinicky prejavuje záchvatmi, konfuziou, slepotou, kómou, bolesťou hlavy, ataxiou, Parkinsonovým syndrómom, parestéziami, psychózou, fokálnymi deficitmi, akinetickým mutizmom, trasením, neuropatiou a poruchami spánku [Shimizu et al., Pediatr. Nephrol., 8: 483 až 385 (1994); Wilson et al., Muscle and Nerve, 17: 528 až 532 (1994); Reece et al., Bone Marrow Transpl. 8: 393 až 401 (1991); Eidelman et al,, Transpl. Proc., 23: 3175 až 3178 (1991); de Groen et al., N. Engl. J. Med., 317: 861 až 566 (1987)]. Po transplantácii pečene bola mierna až prudká neurotoxicita pozorovaná u 10 až 20 % pacientov liečených FK 506 a 3 až 12 % pacientov liečených cyklosporínom. Neurotoxicita bola tiež spájaná s abnormalitami v obsahu lipidov v sére a s dysfunkciou pečene.

Z iných vedľajších účinkov cyklosporínu a/alebo EK 506 je možné uviesť hepatotoxicitu, glukózovú intoleranciu, hepertenziu, hirsutizmus, gastrointestinálne symptómy, žilnú trombózu, pankretitídu a hyperpláziu ďasien [Morris J. Heart Lung Transplant. 12: S275 až S286 (1993); Fung et al., Tmspl. Proc. 23: 3105 až 3108 (1991); Mason Pharmacol. Rev., 42: 423 až 434 (1989); Kahan, N. Engl. J. Med. 321: 1725 až 1738 (1989); Thomason et al., Renal Failure, 16: 731 až 745 (1994)]. S ohľadom na široké využitie cyklosporínu a FK 506 a na inherentné vedľajšie účinky ich aplikácie by bolo vyvinutie alternatívnych imunosupresív výnimočne prospešné.

Tak napríklad je možné, že delokalizácia kalcineurínu z predpokladaného kotevného proteínu T-buniek, by mohla inhibovať aktivitu kalcineurínu pri aktivácii T-buniek. Tak by bolo možné získať imunosupresívum špecifické voči T-bunkám, ktoré by vykazovalo užitočnosť cyklosporínu alebo FK 506, ale menej vedľajších účinkov. Nedávne pozorovanie, že delokalizácia PKA z kotevného proteínu T-buniek zvyšuje expresiu IL-2 v stimulovaných bunkách ukazuje, že PKA lokalizovaná v kotevnom proteíne určitým spôsobom prispieva k regulačnej úlohe pri expresii IL-2 počas aktivácie T-buniek. Delokalizácia PKA špecifická vzhľadom na T-bunky môže preto predstavovať prostriedok na zvýšenie sekrécie IL-2 in vivo, ktorého účinok je porovnateľný s podávaním rekombinantného IL-2. Možno že by bolo možné takto dosiahnuť zníženie toxicity liečenia pomocou IL-2, ako je tu ďalej uvedené.

IL-2 bol schválený pre liečenie metastatického renálneho karcinómu a približne 15 až 20 % pacientov s metastatickým renálnym karcinómom alebo malígnym melanó mom je rešpondentných na liečenie IL-2. Niektoré z týchto odpovedí sú trvalé a prejavujú sa dlhšie ako 66 mesiacov [Dillman, Cancer Biotherapy, 9: 183 až 209 (1994); Whittington a Faulds, Drugs 46: 446 až 514 (1993)]. Liečenie vysokými dávkami (bolus) bolo síce spojené s niekoľkými prudkými vedľajšími účinkami (pozri ďalej). Nízkodávkové subkutánne podávanie alebo liečenie pomocou kontinuálnej infúzie poskytlo nízky stupeň odpovede (12 %) pri súčasnom znížení toxicity [Vogelzang et al., J. Clin. Oncol., 11: 1809 až 1816(1993)].

Liečenie pomocou IL-2 (so súčasným podávaním interferónu a a iných činidiel alebo bez neho) bolo skúšané aj pri liečení iných malignancií. Tak napríklad pri priamej aplikácii IL-2 do nádorového lôžky po resekcii gliómu viedlo k predĺženej klinickej odpovedi, ale nie k vyliečeniu [Merchant et al., J. Neuro., 8: 173 až 188 (1990)]. Pri ďalších skúškach bola oznámená účinnosť pri lymfóme [Dillman, pozri uvedená citácia], kolorektálnom karcinóme [Whittington a Faulds, pozri uvedená citácia], obmedzenom AML [Bruton a Koeller, Pharmacotherapy, 14: 635 až 656 (1994)], rakovine vaječníkov a skorej rakovine močového mechúra [Whittington a Faulds, pozri uvedená citácia]. Počet účastníkov každej z týchto štúdií bol však príliš malý na to, aby to umožnilo zistiť štatistickú významnosť pozorovanej účinnosti.

IL-2 bol tiež používaný v kombinácii s adoptívnou imunoterapiou a ukázalo sa, že je účinný pri liečení metastatického renálneho karcinómu [Pierce et al., Sem. Oncol., 22: 74 až 80 (1995); Belldegrun et al., J. Urol., 150: 1384 až 1390 (1993)], okrem toho môže byť IL-2 tiež účinný pri liečení určitých infekčných chorôb prostredníctvom zníženia bakteriálneho zaťaženia kože a hladiny antigénu u pacientov s leprózou po intradermálnej injekcii [Kaplan, J. Infect. Dis., 167 (suppl. 1): S18 až 22 (1993)]. Tiež bolo pozorované, že lymfocyty od pacientov postihnutých tuberkulózou produkujú nižšiu hladinu IL-2 v porovnaní s lymfocytmi PPD-pozitívnych zdravých kontrolných jedincov [Sanchez et al., Inf. Immun., 62: 5673 až 5678 (1994)], čo ukazuje, že liečenie IL-2 môže mať zmysel pri liečení mykobakteriálnych infekcií.

Napriek potenciálnej terapeutickej hodnote IL-2 je tento cytokín tiež spojený s významnou toxicitou [ak nie je uvedené niečo iné, sú zdrojom týchto informácií uvedené citácie Whittington a Faulds, Dillman a Bruton a Koeller], Hlavným vedľajším účinkom obmedzujúcim takéto liečenie je syndróm kapilárneho krvácania. Podávanie IL-2 zvyšuje vaskulárnu permeabilitu, čo vyvoláva inlersticiálny a pľúcny edém, pričom sa u pacientov vyvíja hypotenzia a značný počet z nich vyžaduje presory. Intenzívna resuscitácia kvapaliny môže vyvolať pľúcny edém ohrozujúci život. Až 20 % pacientov môže vyžadovať intubáciu a mechanickú ventiálciu. Podávanie vo vysokých dávkach v podobe bolusu vyvoláva prudšie krvácanie ako podávanie v nízkej dávke alebo pomalá kontinuálna infúzia a pri niektorých liečebných režimoch môže 100 % pacientov vyžadovať podporu ICU pri liečení IL-2. Tiež bola pozorovaná myokarditída, kardiomyopatia a srdcová arytmia. Dôsledkom hypotenzie indukovanej syndrómom vlásočnicového krvácania môže byť akútne zlyhanie obličiek.

IL-2 môže tiež vyvolať prudkú diareu s nerovnováhami elektrolytu, cholestázu, tyroidné abnormality a akútnu pankreatitídu. U 15 až 20 % pacientov sa vyvíja anémia vyžadujúca transfúzie [Mac Farlane at al., Cancer 75: 1030 až 1037 (1995)]. Môže dôjsť k trombocytopénii s krvácaním a k defektom vyvolaným vzhľadom na koagulačnú dráhu. U viac ako 70 % pacientov dôjde k zmenám dušovného stavu vrátane paranoidných delúzií, halucinácii, straty záujmu, porúch spánku a ľahostajnosti. Tiež boli oznámené javy, ako jc kóma, poruchy videnia, prechodne ischemické záchvaty a parestézia. Tieto nevýhody spojené s exogénnym IL-2 vyvolávajú snahu hľadať alternatívy, pri ktorých by napríklad mohla byť modulovaná endogénna produkcia IL-2, a tak eliminovaná nutnosť liečenia exogénnym IL-2. Takéto alternatívy by mohli byť terapeuticky využiteľné.

Identifikácia kotevných proteínov umožňuje nielen získať možný prostriedok na identifikáciu imunosupresívnych liečiv a modulátorov produkcie IL-2, ale umožňuje aj regulovať iné bunkové aktivity, pravdepodobne s ohľadom na rôzne metabolické dráhy, ktorých sa kotevné proteíny, ako bolo ukázané, zúčastňujú. Tak napríklad AKAP 79 je dôležitý pri regulácii kanálov regulovaných receptorom glutamátu v postsynaptickej hustote neurónov, pravdepodobne prostredníctvom väzby PKA, PKC a kalcineurínu. PKA reguluje aktivitu kanálov regulovaných receptorom AMPA a delokalizácia alebo inhibícia PKA zoslabuje aktivitu AMPA na iónové kanály. PKC reguluje aktivitu kanálov regulovaných receptorom NMDA a kalcineurín desenzituje receptor NMDA pri reakcii na stimuly. Tieto pozorovania ukazujú, že lokalizované kinázy (PKA a PKC) môžu regulovať aktivitu glutamátových receptorov v neurónoch. Defosforylácia kalcineurínom predstavuje protiregulačný mechanizmus receptorov NMDA. Tento model je vo fyziologickom súlade s výskytom záchvatov indukovaných cyklosporínom alebo FK 506.

Úloha glutamátových receptorov je okrem toho predpokladaná pri mnohých neurologických chorobách. Glutamát a iné excitačné aminokyseliny môžu vyvolať v neurónoch excitotoxicitu a bolo pozorované, že nadmerná stimulácia postsynaptických glutamátových receptorov je toxická voči neurónom, pričom vyvoláva akútnu degeneráciu neurónov. Zistilo sa, že hypoxia (napríklad po mŕtvici alebo srdcovom záchvate) a poškodenie centrálneho nervového systému vyvoláva značný výron glutamátu do extracelulárneho priestoru. Tento glutamát sa potom dostáva do interakcie s glutamátovými receptormi a spúšťa excitotoxickú kaskádu. Na ochranu modelových zvierat pred poškodením mozgu je možné použiť antiexcitačné činidlá [Olney, Neurobiology of Aging, 15: 259 až 260 (1994)]. Je zaujímavé, že antagonisti NMDA sú toxickí voči niektorým typom neurónom, čo ukazuje, že glutamát možno inhibuje iné excitačné dráhy v týchto bunkách. Ukázalo sa, že makrolidové protilátky, ako je FK 506, tiež chránia proti pred excitotoxicitou u kultivovaných neurónov vyvolanou NMDA, ale nie kainátom [Manev et al., Brain Res., 624: 331 až 335 (1993)].

Glutamát má zrejme tiež podiel na Parkinsonovej chorobe. Antagonisti NMDA chránia dopaminergické neuróny v substantia nigra opíc exponovaných MPTP, čo je chemická zlúčenina indukujúca Parkinsonov syndróm u človeka a iných primátov. Amantadín a nemantín sú antagonisti NMDA, ktoré sa používajú v Európe na liečenie Parkinsonovej choroby, ale obidve tieto látky, ako je známe, u niektorých pacientov vyvolávajú psychózu. Existujú tiež určité dôkazy, že glutamátergické neuróny môžu byť pri Parkinsonovej chorobe hyperaktívne a ich inhibícia by mohla znížiť motorické symptómy choroby [Lange a Riederer, Life Sciences, 55: 2067 až 2075 (1994)].

Glutamát má svoju úlohu tiež pri poruchách prejavujúcich sa záchvatmi. Má účasť na začiatku, šírení a udržiavaní aktivity záchvatu. NMDA a Ne-NMDA antagonisti sú silnými antikonvulzívami [Meldrum, Neurology, 44 (suppl, 8): S14 až S32 (1994)]. Receptory AMPA boli tiež implikované pri ALS a v súčasnosti prebieha skúšanie antagonistov tohto receptora.

Vzhľadom na všetky uvedené pozorovania nie je prekvapujúce, že tiež mnohé iné imunosupresíva sú v štádiu klinických skúšok. Nasledujúce informácie týkajúce sa takýchto štúdií boli získané z publikácie Haydona Haynes, Balliere's Clin. Gastroentero., 8: 455 až 464 (1994); Thomason a Starzi, Imnunol. Rev. 1993, 71 až 98 (1993); a Morris J. Heart Lung Transplant., 12: S275 až S286 (1993). Tak napríklad azaspiran, čo je zlúčenina SKB, ktorá potláča bunkové infiltráty štepov a indukciu IL-2R a tiež ruší produkciu IL-2 a IFN-gama. Azaspiran zrejme indukuje niektoré typy supresorových buniek a existujú určité dôkazy, že dochádza k synergickému účinku s cyklosporínom.

Ako ďalší príklad jc možné uviesť mycophenolate mofetial (zlúčenina vyvinutá firmou Syntex), ktorý inhibuje syntézu purínu a vykazuje selektívny antiproliferatívny účinok na T- a B- bunky. Táto látka vyčerpáva protilátky a môže tiež odčerpávať adhézne molekuly z povrchu buniek. Toto liečivo má nízku zrejmú toxicitu a môže vyvolávať leukopéniu. Už 20 rokov sa používa na liečenie lupienky.

Ako ďalší príklad je možné uviesť mizoribine (zlúčenina vyvinutá firmou Sumitomo), ktorý inhibuje syntézu DNA. Táto látka má rovnaký mechanizmus účinku ako mycophenolate.

Ako ďalší príklad je možné uviesť brequinar (zlúčenina vyvinutá firmou Duľont-Merck), ktorý inhibuje syntézu pyrimidínu blokovaním dihydroorátdehydrogenázy. Je očakávaná úplná správa o klinických pokusoch s touto látkou. Bolo oznámené, že táto látka synergický pôsobí s cyklosporínom, ale môže vyvolávať trombocytopéniu, dermatitídu a mukositis.

Ako ďalší príklad je možné uviesť 15-deoxysperqualin (zlúčenina vyvinutá firmou Nippon-Kayaku), ktorá prevažne ovplyvňuje funkcie monocytov a makrofágov, vrátane inhibície oxidačného metabolizmu, syntézy lyzozomálneho enzýmu, produkcie IL-1 a expresie antigénov MHC z triedy II na povrchu buniek. Táto zlúčenina je zo 70 až 90 % účinná pri odmietaní obličiek, ktoré nerešponduje na iné spôsoby liečenia, ale pri vysokých dávkach môže vykazovať toxicitu na kostnú dreň.

Ako ďalší príklad je možné uviesť leflunomide (zlúčenina vyvinutá firmou Hoechst), ktorý inhibuje pôsobenie cytokínu, blokuje aktiváciu T-buniek a syntézu protilátky. Nie je toxický ani voči obličkám ani voči kostnej dreni.

Ako ďalší príklad je možné uviesť rapamycín (zlúčenina vyvinutá firmou Weyth-Ayerst), ktorý je príbuzný FK 506. Ide o proliečivo, ktoré sa aktivizuje väzbou na imunofilín, neinhibuje kalcineurín a neblokuje produkciu cytokínu v T-bunkách, Neznámym mechanizmom rapamycínu blokuje prechod Gl na S.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ: ICOS Corporation

20th Avenue, S. E., Bothell,

WA 98021, U. S. A.

(ii) Názov vynálezu: Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konštrukt pre expresiu DNA, hostiteľská bunka, spôsob produkcie humánneho polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomálna bunková línia (iii) Počet sekvencií: 5 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát: Cermák-Hofejš-Vrba, Advokátní a patentová kancelár (B) Ulice: Národní 32, (C) Mesto: Praha 1, (D) Štát: Česká republika (E) PSČ: 110 00 (v) Strojovo čitateľná forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, Verzia # 1.25 (vi) Dáta o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: PV 717-97 (B) Dátum podania: 17.03.1997 (C) Zatriedenie:

(viii) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón:

(B) Telefax:

(C) Telex:

(2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ reťazca: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

Asp Leu íle Glu Glu Ala Ala Ser Ar? íle Val Asp Ala Val íle 1 5 10 15

Glu Gin Val Lys Ala Ala Gly Ala (2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ reťazca: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Asp Leu íle Glu Glu Ala Ala Ser Arg Pro Val Asp Ala Val íle * 1 S io 15

Glu Gin Val Lys Ala Ala Gly Ala (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 17 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ reťazca: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

ATTAACCCTC ACTAAAG 17 (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 17 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ reťazca: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

GATATCACTC AGCATAA 17 (2) Informácie o SEQ ID NO: 5:

(i) CHarakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 2850 bazových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ reťazca: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvenice: SEQ ID NO: 5:

GGCACGAGGA GCAGCAGGTG GAGGCTGGTG CTGTGCAGCT GAGGGCTGAC CCTGCCATCA 60 AGGAACCTCT CCCCGTGGAA GACGTCTGTC CCAAAGTAGT GTCCACACCC CCCAGTGTCA 120 CAGAGCCTCC AGAAAAGGAA CTGTCCACCG TGAGCAAGCT GCCTGCAGAG CCCCCAGCAT 180 TGCTCCAGAC ACACCCACCT TGCCGAAGAT CAGAGTCCTC GGGCATTCTT CCTAACACCA 240 CAGäCATGAG ATTGCGACCA GGAACACGCA GAGACCACAG TACAAAGCTG GAGCTAGCCC 300 TGACAGGTGG TGAAGCCAAA TCGAT1CCTC TAGAGTGCCC CCTTTCATCC CCAAAGGGTG 360 TACTATTCTC CAGCAAATCA GCTGAGGTGT GTAAGCAAGA TTCCCCCTTC AGCAGGGTGC 420 CAAGGAAGGT CCAGCCAGGC TACCCCGTAG TCCCCGCAGA GAAGCGTAGC TCTGGGGAGA 480 GGGCAAGAGA GACAGGTGGG GCCGAAGGGA CTGGTGATGC CGTCTTGGGG GAAAAGGTGC 540

TTGAAGAAGC TCTGTTGTCT CGGGAGCATG TCTTGGAATT GGAGAACAGC AAGGGCCCCA 600 GCCTGGCCTC TTTAGAGGGG GAAGAAGATA AGGGGAAGAG CAGCTCATCC CAGGTTGGTG 660 GGGCCAGTGC AGGAGGAAGA GTATGTAGCA GAGAAGTTGC CAAGTAGGTT CATCGAGTCG 720 GCTCACACAG AGCTGGCAAA GGACGATGCG GCGCCAGCAC CCCCAGTCGC AGACGCCAAA 780 GCCCAGGACA GAGGTGTCGA GGGAGKACTG GGCAATGAGG AGAGCTTGGA TAGAAATGAG 840 GAGGGCTTGG ÄTAGAAATGA GGAGGGCTTC GATAGAAATG ACGAGAGCW GGATAGAAAT 900 GAGGAGGGCT TGGATAGAAA TGAGGAGATT AAGCGGGCTG CCTTCCAGAT AATCTCCCAA 960 GTGATCTCAG AAGCAACCGA ACAGGTGCTG GCCACCACGG TTGGCAAGGÍ TGCAGGTCGT 1020 GTGTGTCAGG CCAGTCAGCT CCAAGGGCAG AAGGAAGAGA GCTGTGTCCC AGTTCACCAG 1080 AAAACTGTCT TGGGCCCAGA CACTGCGGAG CCTGCCACAG CAGAGGCAGC TGTTGCCCCG 1140 CCGGATGCTG GCCTCCCCTT GCCAGGCCTA CCAGCAGAGG GCTCACCACC ACCAAAGAĽC 1200 TACGTGAGCT GCCTGAAGAG CCTTCTGTCC AGCCCCACCA AGGACAGTAA GCCAAATATC 1260 TCTGCACACC ACATCTCCCT GGCCTCCTGC CTGC-CACTGA CCACCCCCAG TGAAGAGTTG 1320 CCGGACCGGG CAGGCATCCT GGIGGAAGAT GCCACCTGTG TCACCTGCAT GTCAGACAGC 1380 AGCCAAAGTG TCCCTTTGGT GGCTTCTCCA GGACACTGCt CAGATTCTTT CAGCACTTCA 1440 GGGCTTGAAG ACTCTTGCAC AGAGACCAGC TCGAGCCCCA GGGACAAGGC CATCACCCCG 1500 CCACTGCCÄG AAAGŤACTGT GCCCTTCAGC AATGGGGTGC TGAAGGGGGA GTTGTCAGAC 1560 TTGGGGGCTG AGGATGGATG GACCATGGAT GCGGAAGCAG ATCATTCAGG AGGTTCTGAC 1620

AGGAACAGCA TGGMTCCGT GGATAGCTGT TGCAGTCÍCA AGAAGACTGA GAGCTTCCAA 1500 AATGCCCAGG CAGGCTCCAA CCCTAAGAAG GTCGACCTCA TCATCTGGGA GATCGAGGTG 1740 CCAAAGCACT TAGPCGGTCG GCTAATTGGC AAGCAGGGGC GCTATGTGAG TTTTCTGAAG 1900 CAAACATCTG GTGCCAAGAT CTACATTTCA ACCCTGCCTT ACACCCAGAG CGTCCAGATC 1860 TGCCACATAG AAGGCTCTCA ACATCATGTA GACAAAGCGC TGAACTTGAT TGGGAAGAAG 1920 TTCAAAGAGC TGAACCTCAC CAATATCTAC GCTCCCCCAT TGCCTTCACT GGCACTGCCT 1880 TCTCTGCCGA TGACATCCTG GCTCATGCTG CCTGATGGCA TCACCGTGGA GGTCATTGTG 2040 GTCAACCäGG TCAÄTGCCGG GCACCTGTTC GTGCAGCAfiC ACACACACCC TACCMCCAC 2100 GCGCTGCGCA GCCTCGACCA GCAGATGTAC CTCTGTTACT CTCAGCC7GG AATCCCCACC 2160 TTGCCCACCC CAGTGGAAAT AACGGTCATC TGTGCCGCCC CTGGTGCGGA CGGGGCCTGG 2220

TGGCGAGCCC AAGTGGTTGC CTCCTACGAG GAGACCAACG AAGTGGAGAT TCGATACGTG 2280 GACTACGGCG GATATAAGAG GGTGAÄAGTA GACGTGCTCC GGCAAATCAG GTCTGACTTT 2340 GTCACCCTGC CGTTTCAGGG AGCAGAAGTC CTTCTGGÄCA GTGTGATGCC CCTGTCAGAC 2400 GATGACCAGT TTTCACCGGA AGCAGATGCC GCCATCAGCG AGATGACGGG GAATACAGCA 2460 CTGCTTGCTC AGGTGACAAG TTACAGTCCA ACTGGTCŤTC CTCTGATTCA GCTGTGGAGT 2520 GTGGTTGGAG ATGAAGTGGT GTTGATAAAC CGGTCCCTGG TGGAGCGAGG CCTTGCCCAG 2580 TGGGTAGACA GCTACTACAC AAGCCTTTGA CCCCCATGCT GCTTCCTGAG AGTCTTTTTT 2640 GCACTGTTGA AATTGGGCTT GGCACTCAAG TCAAAGATGA ACATCGGAAT AACAAACATT 2700

GTCCTCTCCA GAAAGTCCTT TCTTTATCCA TACTGTAGTC CTATTGAGAA CACATTTCGT 2760 CTCTGAGAAA AAAGGATGGA ACTATGGGTT CTCITCGCAA AGCCAAAGGA 7AGTGTTTAA 2620 CAAGCCAGCT GGCŤTATCCT GGCTCGTGCC 2650

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódujúci PKA-viažuci proteín, pričom tento polynukleotid obsahuje sekvenciu kódujúcu proteín uvedenú v SEQ ID NO: 5.
2. 2. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podľa nároku 1, ktorým je molekula DNA.
3. 3. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podľa nároku 2, ktorým je molekula cDNA.
4. 4. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podľa nároku 2, ktorým je molekula genómovej DNA.
5. 5. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podľa nároku 2, ktorým je úplne alebo čiastočne chemicky syntetizovaná molekula DNA.
6. 6. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódujúci PKA-viažuci proteín, pričom tento polynukleotid je zvolený zo súboru zahrnujúceho

   a) DNA človeka, majúcu sekvenciu SEQ ID NO: 5 a

   b) molekulu DNA, ktorá pri stringentných podmienkach hybridizuje s nekódujúcim reťazcom DNA podľa odstavca a).
7. 7. Konštrukt na expresiu DNA s obsahom molekuly DNA podľa nároku 2.
8. 8. Hostiteľská bunka transformovaná molekulou DNA podľa nároku 2.
9. 9. Spôsob produkcie humánneho polypeptidu kódovaného polynukleotidom so sekvenciou SEQ ID NO: 5, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľská bunka podľa nároku 8 kultivuje vo vhodnom médiu a polypeptid sa izoluje z tejto hostiteľskej bunky alebo z jej rastového média.
10. 10. Purifikovaný a izolovaný PKA-viažuci proteín kódovaný polynukleotidom so sekvenciou SEQ ID NO: 5.
11. 11. Polypeptid, ktorý je schopný sa špecificky viazať k polypeptidu podľa nároku 10.
12. 12. Polypeptid podľa nároku 11, ktorým je protilátka.
13. 13. Polypeptid podľa nároku 12, ktorým je monoklonálna protilátka.
14. 14. Antiidiotypová protilátka, ktorá je špecifická voči monoklonálnej protilátke podľa nároku 13.
15. 15. Hybridomálna bunková línia produkujúca monoklonálnu protilátku podľa nároku 13.