CZ71797A3 - Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konstrukt pro expresi DNA, hostitelská buňka, způsob produkce humánního polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomální buněčná linie - Google Patents

Description

Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konstrukt pro expresi DNA, hostitelská buňka, způsob produkce humánního polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomální buněčná linie

Oblast techniky

Vynález se obecně týká proteinů vázajících protein kinasu A. Konkrétněji se vynález týká nových proteinů a nukleotidových sekvencí kódujících tyto proteiny, které lokalizují v buňkách protein kinasu A. Vynález zahrnuje tyto aspekty: Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konstrukt pro expresi DNA, hostitelská buňka, způsob produkce humánního polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomální buněčná linie

Dosavadní stav techniky

Extracelulární signály, jako hormony a cytokiny, modulují mnohé buněčné procesy aktivací adenylát cyklasy, zvyšováním hladiny cAMP v buňkách a konečně aktivací cAMPdependentní kinasy (PKA). PKA je všudypřítomný enzym, který funguje v mnoha intracelulárních drahách, například při regulaci metabolismu glykogenu reversibilní fosforylací glykogen fosforylasy (Walsh et al., J. Biol. Chem., 243: 3763 až 3765 (1969)) a regulaci signalizace prostřednictvím MAP kinasy inhibicí aktivace Raf-1 pomocí Ras (Vojtek et al. Cell, 74: 205 až 214 (1993) a Hafner et al., Mol. Cell.

Biol. 14: 6696 až 6703 (1994)). Inaktivní PKA existuje jako tetramer, v němž jsou dvě totožné katalytické podjednotky vázány do dimeru zahrnujícího dvě regulační podjednotky.

K aktivaci PKA pomocí cAMP dochází tak, že se molekula cAMP připojí ke každé z regulačních podjednotek (R), přičemž

- 2 dojde k uvolnění aktivní katalytické podjednotky (C). Byla identifikována pouze jedna forma podjednotky C, ale existují dvě třídy podjednotek R, tj. RI a RII, se zřejmě odlišnými subcelulárními distribucemi. Isoformy RI (Rla a Rip) jsou, jak bylo oznámeno, převážně cytoplasmatické a jsou vyloučeny z jádra, zatímco až 75 % isoforem RII (Rlla nebo RIip) má povahu částic, které jsou spojeny bud s plasmatickou membránou, cytoskeletálními složkami, sekrečními granulemi,

Golgiho aparáty, centrosomy nebo možná jádry (Scott,

Pharmac. Ther. 50: 123 až 145 (1991)). Předpokládá se, že rozdíly (bud fyzikální nebo fyziologické) mezi různými podjednotkami R představují prostředek, pomocí něhož jsou buňky schopny omezit aktivitu pojednotky C na požadovanou dráhu.

Nedávné důkazy ukázaly, že buňky jsou schopny zaměřit aktivitu PKA umístěním inaktivního enzymu do sousedství potenciálních substrátů, přičemž dojde k omezení aktivity podjednotky C po jejím uvolnění vyvolaném navázáním cAMP na podjednotku R. Při tomto rozparcelování dochází k segregaci PKA ve vztahu ke složkám v dané signalizační dráze, což přispívá k specificitě PKA při odpovědích na různé extracelulární stimuly. K rozparcelování PKA dochází alespoň zčásti prostřednictvím interakce nebo omezení podjednotky R specifickými proteiny, které lokalizují nebo zakotvují inaktivní holoenzym na specifických místech uvnitř buňky. Proteiny, které specificky segregují PKA byly označeny zkratkou AKAP (tvořené prvními písmeny anglického názvu A Kinase Anchor Proteins (proteiny zakotvující kinasu A)) (Hirsch et al. J. Biol. Chem., 267: 2131 až 2134 (1992)). S ohledem na skutečnost, že - jak bylo ukázáno - některé AKAP vážou a zakotvují jiné proteiny kromě PKA, označuje se tato třída proteinů obvykle názvem kotevní proteiny (anchoring proteins).

• · · ·

Až dosud byla identifikována řada kotevních proteinů (viz dále uvedená diskuse), které zjevně vážou PKA prostřednictvím společného karboxyterminálního sekundárního strukturního motivu, který zahrnuje amfipatickou oblast šroubovice (Scott a McCartney, Mol. Endo., 8: 5 až 11 (1994)). Vazbu PKA k většině, pokud ne ke všem identifikovaným kotevním proteinům, je možno blokovat za přítomnosti peptidu (Ht31), který napodobuje tuto společnou sekundární šroubovicovou strukturu, zatímco mutant peptidu Ht31 obsahující jednu substituci aminokyseliny narušující škroubovicovou povahu peptidu, nemá žádný účinek na vazbu PKA ke kotevními proteinu (Carr et al., J. Biol. Chem., 266: 14188 až 14192 (1991)). Přestože se na interakci PKA/kotevní protein podílí společná sekundární struktura, vykazují kotevní proteiny (nebo homology kotevních proteinů obsažené v různých druzích) obvykle jedinečnou primární strukturu, čehož důkazem je rostoucí počet kotevních proteinů, které byly identifikovány v různých organismech. Jedinečná aminokyselinová struktura především v aminoterminálních oblastech proteinů je pravděpodobně zčásti příčinou skutečnosti, že kotevní proteiny byly identifikovány jako jedinečné proteiny v různých specifických typech buněk a v různých specifických intracelulárních oddílech, v nichž bylo rozmístění PKA pozorováno.

Tak například kotevní proteiny, které jsou převážně exprimovány v mozku savců, byly identifikovány u krysy (AKAP 150) a krav (AKAP 75) [Bergman et al., J. Biol. Chem. 266: 7207 až 7213 (1991)] a podobný protein existuje i u člověka (AKAP 79) [Carr et al., J. Biol. Chem. 267: 16816 až 16823 (1992)]. Totožnost, pokud se týče aminokyselin a imunologická křížová reaktivita mezi těmito neuronově specifickými proteiny ukazuje, že se jedná o homology v rámci jednoho druhu. Jako další příklad je možno uvést AKAP 100, který se zdá být specifickým pro srdeční a kosterní svaly • · · · · · člověka a krysy a zároveň je v nižším rozsahu exprimován v mozkových buňkách těchto savců. Jako ještě další příklad je možno uvést protein AKAP Ht31 (Carr et al. J. Biol. Chem. 267: 13376 až 13382 (1992)), který se jeví jako specifický pro thyroidní buňky. Naopak AKAP 95 se exprimuje v řadě typů buněk a nevykazuje zjevnou specifičnost vůči typu tkáně nebo buněk.

Pokud se týče rozmístění do specifických oddílů uvnitř buňky, jsou proteiny AKAP 75 a protein asociovaný s mikrotubulemi (MAP-2) [Threurkauf a Vallee, J. Biol. Chem., 257: 3284 až 3290 (1982) a DeCamilli et al., J. Cell. Biol., 103: 189 až 203 (1986)], AKAP 79 [Glantz et al., J. Biol. Chem. 268: 12796 až 12804 (1993)] a AKAP 150 [Glantz et al., Mol. Biol. Cell, 3: 1215 až 1228 (1992)] těsně asociovány s cytoskeletálními strukturními proteiny, přičemž AKAP 75 je specifičtěji asociován s postsynaptickými hustotami [Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (1992)]. Ještě další kotevní proteiny jsou rozmístěny v méně rozšířených buněčných strukturách; AKAP 350 je asociován s centrosomy [Keryer et al., Exp. Cell Res., 204: 230 až 240 (1993)],

AKAP 100 se sarkoplasmatickým retikulem v srdeční tkáni krysy [McCartney et al., J. Biol. Chem. 270: 9327 až 9333 (1995)], 85kDa protein AKAP spojuje PKA s Golgiho aparátem [Rios et al., EMBO J., 11: 1723 až 1731 (1992)].

Protein AKAP 95 se zřejmou oblastí vázající zinc finger DNA se zdá být výhradně obsažen v jádře [Coghlan et al., J. Biol. Chem. 269: 7658 až 7665 (1994)]. Doména vázající DNA v proteinu AKAP 95 má svou úlohu při přímém zapojení PKA do transkripce genu, možná prostřednictvím umístění PKA vzhledem k fosforylačnímu a transkripčnímu faktoru. Jiné různé buněčné aktivity, u nichž bylo prokázáno ovlivnění vazbou kotevního proteinu/PKA, byly prokázány narušením této interakce, například narušením vazby PKA/kotevní protein ·· ···· · ·· ·· ···· ·· · · · · · ·· · • ·· · ·· · · ···· v T-buňkách vede k reversi cAMP-indukovaného potlačení exprese interleukinu 2 [Lockerbie et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 21A: 76, Abstrakt D2155 (1995)] a narušení vazby PKA/kotevní protein v neuronech hippokampu vede k zeslabení proudů v úplných buňkách prostřednictvím receptorů a-amino3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionová kyselina/kainát glutamátu [Rosenmund et al., viz výše uvedená citace]. Schopnost kotevních proteinů regulovat expresi IL-2 a regulovat aktivitu glutamátového receptorů v kombinaci s dřívějším zjištěním, že kotevní proteiny jsou schopny vázat kalcineurin, vede k předpokladu řady terapeutických aplikací kotevních proteinů a molekul modulujících vazbu kotevního proteinu k buněčným složkám.

S ohledem na různorodost jak pokud se týče exprese v různých typech buněk, subcelulární lokalizace a fyziologických aktivit až dosud identifikovaných kotevních proteinů, existuje tedy v tomto oboru potřeba pokračovat v identifikaci nových kotevních proteinů a nukleových kyselin, kterými jsou tyto proteiny kódovány. Jedinečnost primárních struktur kotevních proteinů poskytuje cíl pro specificky regulovanou lokalizaci PKA a tím její funkci ve specifických buněčných procesech.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou purifikované a izolované polynukleotidové sekvence, které kódují proteiny vykazující biologické vlastnosti vazby a subcelulárního rozparcelování (compartmentalization) PKA. Polynukleotid, kterému se v současné době dává přednost, vykazuje sekvenci SEQ ID NO:5. Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují polynukleotidy, které hybridizují za stringentních hybridizačních podmínek k polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO:5. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být tvořeny DNA nebo RNA • · · · a mohou hybridizovat k nekódujícímu nebo kódujícímu řetězci molekuly DNA. DNA může být cDNA, genomová DNA nebo chemicky syntetizovaná DNA. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být identifikovány stardardními technikami, jako je komplementace, hybridizace za podmínek nízké stringence a PCR za použití primerů sestrojených na základě znalosti sekvence polynukleotidů podle vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou dále také rekombinantní expresní konstrukty, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu operabilně připojené k regulačním elementům transkripce, jako jsou promotory a terminátory transkripce. Regulační elementy transkripce mohou být homologní nebo heterologní.

Předmětem vynálezu jsou dále také hostitelské buňky transformované nebo transfekované polynukleotidy podle vynálezu. Tyto hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní. Takto transformované nebo transfekované hostitelské buňky jsou obzvlášt užitečné pro expresi polypeptidů vázajících PKA podle tohoto vynálezu, jež mohou být izolovány z buněk nebo médií použitých pro jejich růst.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu jsou polypeptidy vázající PKA, které jsou kódovány polynukleotidy podle tohoto vynálezu. Přednostním polypeptidem vázajícím PKA je polypeptid, který je kódován polynukleotidem o sekvenci SEQ ID NO:5. Polypeptidy podle vynálezu je možno purifikovat z přírodních zdrojů nebo produkovat rekombinantími metodami za použití hostitelských buněk podle vynálezu. Do rozsahu vynálezu spadají i variantní polypeptidy, které si zachovávají biologickou aktivitu polypeptidu divokého typu, včetně jejich analogů odvozených adicemi, delecemi nebo substitucemi konzervativních aminokyselin, které modulují funkční nebo imunologické vlast-

nosti polypeptidu vázajícího PKA. Jiné variantní polypeptidy zahrnují fúzované proteiny, do nichž jsou zavedeny přídavné polypeptidové sekvence usnadňující purifikací nebo imobilizaci na zkouškových nosičích. Další polypeptidy podle vynálezu mohou být identifikovány na základě imunologické křížové reaktivity s polypeptidem, který je kódován polynukleotidem o sekvenci SEQ ID NO:5.

Dále jsou předmětem vynálezu polypeptidy a nepeptidové molekuly, které specificky vážou polypeptidy vázající PKA popsané výše. Přednostní vazebné molekuly zahrnují protilátky (například polyklonální, monoklonální, rekombinantní protilátky nebo jejich vazebné fragmenty). Vazebné molekuly jsou užitečné pro purifikací polypeptidů vázajících PKA, identifikaci buněk exprimujících proteiny vázající PKA a modulaci in vivo interakce mezi PKA a polypeptidy vázajícími PKA.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu jsou hybridomální buněčné linie produkující protilátky vykazující specifickou imunoreaktivitu vzhledem k polypeptidům vázajícím PKA podle tohoto vynálezu. Takové hybridomy je možno produkovat a identifikovat technikami, které jsou dobře známy v tomto oboru.

V dalším popisu jsou také uvedeny zkoušky, pomocí kterých lze identifikovat molekuly narušující interakci mezi PKA a proteiny vázajícími PKA podle tohoto vynálezu (například imobilizované vazebné zkoušky, roztokové vazebné zkoušky, zkoušky založené na scintilační proximitě, zkoušky založené screeningu di-hybridů apod.). V některých případech může být žádoucí modulovat vazbu mezi PKA a polypeptidy podle tohoto vynálezu. V jiných případech může být žádoucí specificky modulovat vazbu mezi polypeptidem vázajícím PKA a buněčnou složkou (jinou než PKA), k níž se tento polypeptid váže. V obou případech představují polypeptidy podle vynálezu užitečný cíl pro screeníng při stanoveních podle tohoto vynálezu. Stanovení podle tohoto vynálezu je možno provádět různými způsoby, například jako stanovení v buňkách, jako jsou stanovení s dihybridovým screeningem nebo komplementační stanovení, jež jsou popsány v US 5 283 173 a WO 91/16457. Zkoušky tohoto typu jsou obzvláště užitečné pro zjištění intracelulární účinnosti sloučenin. Zkoušky, které nejsou založen na buňkách, zahrnují stanovení na bázi scintilační proximity, cAMP-kompetitivní stanovení, stanovení ELISA, radioimunoeseje, chemiluminiscentní stanovení apod. Takové zkušební postupy jsou dobře známy v tomto oboru a jsou obecně popsány například v následujících publikacích: Boudet et al., J. Immunol. Meth., 142: 73 až 82 (1991); Ngai et al., J. Immunol. Meth., 158: 267 až 276 (1993); Pruslin et al., J. Immunol. Meth., 137: 27 až 35 (1991); Udenfriend et all, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 8672 až 8676 (1985); Udenfriend et al., Anal. Biochem., 161: 494 až 500 (1987); Bosworth a Towers, Nátuře, 341: 167 až 168 (1989); Gilman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 67: 305 až 312 (1970); a v US patentu č. 4 568 649.

Užitečnost sloučenin modulujících vazbu kotevního proteinu je nabíledni. Tak například u malých molekul může být zjištěna schopnost inhibovat vazbu PKA/kotevní protein nebo interakci kotevního proteinu se specifickými složkami buňky. Modulátory tohoto typu jsou schopny delokalizovat specifické oblasti PKA a postihovat pouze zaměřenou signalizační dráhu. Identifikace modulátorů vazby kotevního proteinu k jiným buněčným složkám může být stejně prospěšná. Tak například faktory ovlivňující aktivitu kalcineurinu podobným způsobem, jako to činí dříve identifikované imunosupresanty, ale s méně vedlejších účinků, by mohly být užitečné při léčení chorob, jež jsou nyní léčeny toxičtějšími imunosupresanty. Identifikace faktorů modulujících ·· ···· ··· ·· ·· · účast kotevního proteinu v buněčných aktivitách by také mohla být užitečná při nahrazování terapeutických intervencí, které jsou v současné době obvyklé. Tak například faktory regulující regulaci exprese IL-2 kotevním proteinem by mohly být užitečné jako alternativa podávání exogenního rekombinantního IL-2.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Příklad 1 se týká identifikace T-buňka specifického kotevního proteinu z cDNA knihovny člověka. Příklad 2 popisuje RII vazebnou specificitu identifikovaného kotevního proteinu. Příklad 3 se týká stanovení nukleotidové sekvence kotevního proteinu. Příklad 4 uvádí expresi klonu kotevního proteinu. Příklad 5 se týká distribuce kotevního proteinu v buňce a tkáni. Příklad 6 se týká potenciálních terapeutických aplikací kotevního proteinu a molekul modulujících vazbu kotevního proteinu.

Příklad 1

Identifikace kotevních proteinů exprimovaných v T-buňce

Při pokusu o identifikaci nových kotevních proteinů v T-buňce se cDNA knihovna z Jurkatových T-buněk člověka subklonovaná do ZAPII Express (Stratagene, La Jolla, Kalifornie, USA) podrobí screeningu za použití technik Rlla overlay, které jsou popsány v Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 16816 až 16823 (1992).

V krátkosti lze tento postup popsat takto: 1 μΐ fágu knihovny (5 x 10⁴ pfu) se přidá k 600 μΐ suspenze E. coli kmene XL-1 Blue MRF' (Stratagene) v lOmM síranu horečnatém o optické densitě OD₆₀₀ = 0,5. Bakterie a fág se • · 999 9

99 9 ·· · 9 9 9 9 ·· 9

9 9 9 »··99

99 9 99 99 9999 • •9 999 99

- 10 - ·· · ··· ·· ·· · inkubuje 15 minut při 37°C a po této době se k suspenzi přidá 7,5 ml vrchního agaru [médium NZY (N-Z-Amin, typ A, 10 g/litr; kvasinkový extrakt, 5 g/litr; 86mM chlorid sodný;

8mM heptahydrát síranu horečnatého; Bacto-agar, 15 g/litr; pH 7,5), 0,7 % agarosy]. Výsledná směs se ihned poté nanese na misky NZY předehřáté na teplotu 37 °C. Misky se nechají zchladnout na teplotu místnosti a poté se 4 hodiny inkubují při 42 °C. Na misky se umístí nitrocelulosové filtry, které byly předtím máčeny v lOmM isopropyl-l-thio-p-D-galaktopyranosidu (IPTG) a pokračuje se 4 hodiny v inkubaci při 37 °C. Filtry se odstraní a třikrát promyjí v TBS (50mM Tris, pH 7,5, 150mM chlorid sodný) a blokují přes noc při 4’C v médiu Block (TBS, 5% mléko prosté tuku a 0,1% BSA). Misky se překryjí dalšími podobně preparovanými nitrocelulosovými filtry a inkubují přes noc při 4°C. Poté se tyto filtry sejmou, promyjí (výše uvedeným způsobem) a blokují (také výše uvedeným způsobem) 1 hodinu při teplotě místnosti.

Přibližně 4 μg (6 μΐ) rekombinantní myší Rlla se smísí s 2,35 μg (0,5 μΐ) rekombinantní katalytické podjednotky PKA z hovězího dobytka v reakčním médiu obsahujícím 2,5 μΐ [³²P]ATP (25 μϋί, 3 000 Ci/mmol) a 1 μΐ pufru (obsahujícího 0,5M MOPS, pH 7,0; 0,5M chlorid sodný; 25mM chlorid hořečnatý a lOmM DTT). Reakce se nechá probíhat 30 minut při 30°C a poté se nezabudovaná značící látka odstraní za použití sloupce Execellulose GF-5 (Pierce). Filtry se zkoušejí s [³²P]RIIa (100 000 cpm/ml v Block) 6 hodin při teplotě místnosti. Po inkubaci se filtry třikrát promyjí v TBS s obsahem 1 % smáčedla Tween-20 a exponují na rentgenografický film (16 hodin).

Z přibližně 1 x 10⁶ plaků podrobených screeningu byl zjištěn jeden pozitivní, plak č. 11. Tento plak byl identifikován na základě vazby značené Rlla. S plakem č. 11 se provede také sekundární screening za použití metod ·· ···· · ·· ·· ···· • · · ···· · · · • · · · · · ·· ···· • » · ··· ·· ·· ♦ ··· ·· »· · popsaných pro první screening. Přitom bylo zjištěno, že potomstvo plaku č. 11 je také schopno vázat Rlla značenou radioisotopem.

Příklad 2

Specificita vazby Rlla k plaku č. 11

S ohledem na nedávné zprávy, že peptid Ht31 (SEQ ID NO:1) je genericky schopen blokovat vazbu PKA ke kotevním proteinům a že prolinový mutant Ht31 (viz sekvence SEQ ID NO:2, která je uvedena dále, přičemž prolinová substituce je vytištěna tučně a podtržena) toho schopen není, se zkouší specificita vazby Rlla k plaku č. 11 v paralelních experimentech, při nichž se provádí překryv Rlla za přítomnosti každého z těchto peptidů Ht31.

orig. 9

V krátkosti se postupuje takto: Sběr na nitrocelulosových filtrech se provádí způsobem popsaným v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že se výsledné sesbírané plaky preinkubují 15 minut při teplotě místnosti v médiu Block s obsahem ΙμΜ bud peptidů Ht31 nebo jeho prolinového mutantu. Po preinkubaci se filtry zkoušejí pomocí [³²P]RIIa způsobem popsaným v příkladu 1 a následně se filtry podrobí autoradiografii.

• · ·· ···· ·· ···· • ·· ······ · • · · · · · • · · · ··· · • · · · · *·· ·· ·· ·

Ze získaných autoradiogramu je zřejmé, že preinkubace plaku č. 11 s peptidem Ht31 má za následek blokování vazby [³²P]RIIa, zatímco preinkubace s prolinovým mutantem peptidu Ht31 tento účinek nemá. Tyto výsledky ukazují, že vazbu Rlla k polypeptidů kódovanému plakem č. 11 je tvořena sekundární strukturou plaku č. 11, která se podobá struktuře použité v dříve identifikovaných kotevních proteinech.

Příklad 3

Klonování cDNA plaku č. 11

Při pokusu o stanovení nukleotidové sekvence insertu ve fágu plaku č. 11 a pro dedukci aminokyselinové sekvence kódovaného proteinu se cDNA insert plaku č. 11 vyštěpí in vivo za použití systému ExAssist/XLOLR (Stratagene) podle instrukcí výrobce.

V krátkosti lze tento postup popsat takto: Plak č. 11 se odstraní z misky NZY a smíchá s 500 μΐ pufru SM [lOOmM chlorid sodný, 8mM heptahydrát síranu hořečnatého, 50mM Tris HCl, pH 7,5, želatina (0,1 g/litr)) a 20 μΐ chloroformu.

Směs se promísí vířením a skladuje při teplotě 4°C (zásobní fág). Buňky XL-1 Blue MRF' a buňky XLOLR (obojí od

Stratagene) se odděleně pěstují přes noc při 30°C v médiu LBM doplněném heptahydrátem síranu hořečnatého (lOmM) s obsahem 0,2 % objemového maltosy. 0,5 ml noční kultury buněk XL-1 Blue MRF' se zředí 50 ml média LBM (zředění v poměru 1/100) a zředěná směs se nechá 2 až 3 hodiny růst při 37’C, až do semilogaritmické fáze (OD₆₀₀ = 0,2 až 0,5, v případě buněk XL-1 Blue MRF' nebo OD₆₀₀ = 0,5 až 1,0, v případě buněk XLOLR). Kultura se odstředí při 1 500 x g a výsledná peleta se resuspenduje v lOmM heptahydrátu síranu hořečnatého na destinu Οϋθθθ ^{= x}»°· • ·· · · · · · · · · · ··· · · · ·· ·· · ····· · · ·

200 μΐ buněk XL-1, 250 μΐ zásobní fágové suspenze popsané výše a 1 μΐ pomocného fágu ExAssist (Stratagene) se smísí a inkubuje 15 minut při 37C. Přidají se 3 ml média LBM a směs se dále 2,5 hodiny inkubuje při 37°C za třepání. Po inkubaci se směs 15 minut odstřeďuje při 2000 x g. Supernatant se oddělí, inkubuje 15 minut při 70°C a 15 minut se odstředil je při 4000 x g. Výsledný supernatant obsahuje vláknitý fág, který obaluje DNA z plaku č. 11 ve fagemidu pBK-CMV. Fagemidy se zachrání smísením 200 μΐ buněk XLOLR (příprava viz výše) s 10 μΐ fagemidového zásobního přípravku a směs se 15 minut inkubuje při 37 °C. Po inkubaci se přidá 300 μΐ média LBM a směs se dále inkubuje 45 minut při 37°C. Výsledná buněčná suspenze se nanese při koncentraci 200 μΐ/miska na LBM s obsahem 50 μg/ml kanamycinu.

Příprava plasmidu se provádí standardními postupy a zahrnuje použití kitů Wizard Miniprep (Promega). Plasmidová DNA izolovaná z plaku č. 11 se označí jako klon č. 11. Z vektoru se štěpením EcoRI a BamHI vyštěpí insert cDNA a výsledné fragmenty se oddělí za použití elektroforézy na agarosovém gelu. Stanoví se délka insertu, klon č. 11, která činí 2850 bp. Hnízdové delece klonu č. 11 se vytvoří pomocí systému Erase-a-Base (Promega, Madison, Wi, USA) a klon č.

se sekvenuje za použití primerů Universal T3 (ATTAACCCTCACTAAAG [SEQ ID NO:3]) a T7 (GATATCACTCAGCATAA [SEQ ID NO: 4]) a soupravy Prism Ready DyeDeoxy Terminátor Cycle Kit (Perkin Elmer) v zařízení ABI373 DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, Kalifornie, USA).

Sekvence DNA klonu č. 11 je znázorněna v SEQ ID NO: 5. Jelikož nebylo možno v nukleotidových sekvencích detegovat žádný vhodný iniciační kodon, nebylo možno stanovit dedukovanou aminokyselinovou sekvenci a molekulovou hmotnost klonu č. 11. Rešerše Blast Search na nukleotidové úrovni (16. června 1995 14:01:37 EDT) sekvence získané

- 14 • · · · · ···· z primeru T3 ukázala, že existuje homologie s klonem označeným Homo Sapiens cDNA 3'-end similar to none (přírůstkové číslo T32770), zatímco sekvenční data získaná za použití primeru T7 vykázala 98% homologií v rozsahu 343 bází od polohy 1905 do polohy 2248 klonu č. 11 s klonem označeným Homo Sapiens partial cDNA 5'-end similar to none (přírůstkové číslo T31099). Kromě toho vykazuje klon č. 11 98% homologií v rozsahu 332 bází od polohy 2308 do polohy 2640 klonu č. 11 s klonem označeným Homo Sapiens partial cDNA sequence cloně 66D04 (přírůstkové číslo Z24883).

Příklad 4

Exprese klonu č. 11

Pro stanovení přibližné molekulové hmotnosti genového produktu klonu č. 11 se noční kultura klonu č. 11 v buňkách XLOLR (připravená způsobem popsaným v příkladu 3) nechá růst na médiu LBM s 12,5 μ9/ιη1 tetracyklinu a poté se jí použije pro inokulaci 250 μΐ téhož média. Inkubace se nechá probíhat při 37°C až do density OD₆₀₀ = 1,2 a poté se bakterie peletizují 15minutovou centrifugací při zrychlení 6000 x g. Peleta se zváží a resuspenduje v 10 objemech (1 hmotnostní díl na 10 objemových dílů) pufru FP (1% Triton X-100, 150mM chlorid sodný, lmM EGTA, lmM EDTA, lOmM Tris, pH 7,4, 1% aprotinin, 0,2% azid sodný). Buňky se rozdrtí ve francouzském lisu a lysát se vyčeří 30minutovou centrifugací při 40 000 x g. Lysát se zkoncentruje v koncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Alikvot koncentrovaného lysátu se nanese na 10% Tris-glycinový gel (Novex), provede se elektroforéza a přenos na Immobilon (Millipore). Blot se zkouší pomocí [³²P]RIIa. Deteguje se jediný pás (asi 120 kDa), který je zčásti vypuzen konkurenčním peptidem Ht31. Tyto výsledky ukazují, že klon č. 11 kóduje protein vázající PKA,

kterého lze použít při zkouškách za účelem identifikace inhibitorů vazby mezi polypeptidy vázajícími PKA a PKA.

Příklad 5

Distribuce klonu č. 11 v buňkách a tkáních

Pro stanovení buněčné a tkáňové distribuce exprese klonu č. 11 se pro zkoušení klonu č. 11 na úrovni mRNA použije PCR s reversní transkriptasou (RT-PCR).

V krátkosti lze použití postup popsat takto:

Nejprve se zkonstruují primery o délce úseku sekvence klonu č. 11 300 bp na základě sekvence nukleové kyseliny, jak byla stanovena v příkladu 3. V sekvenci pro klon č. 11 (SEQ ID NO: 5) odpovídá primer 2T3 nukleotidům 266 až 283, primer M2T3 nukleotidům 434 až 453, primer R2T3 nukleotidům 601 až 602, přiměř R2T7 nukleotidům 2229 až 2250, primer M2T7 nukleotidům 2337 až 2400 a primer 2bT7 nukleotidům 2256 až 2592. RNA se připraví z různých typů buněk a tkání (které jsou popsány dále v diskusi výsledků (za použití soupravy RNA Isolation Kit, Stratagene). RT-PCR se provádí takto: RNA (přibližně 10 μg v 10 μΐ vody) se nejprve denaturuje inkubaci při 80 °C po dobu 3 minut a poté se RNA dále inkubuje na ledu až do doby, kdy se provedou reakce s reversní transkriptasou. Posledně uvedené reakce se provádějí takto: Denaturovaná RNA se smísí s 8 μΐ pufru 5X MMuLV-RT (Boehringer), 8 μΐ 2,5mM směsi dNTP, 1 μΐ vody s obsahem vždy 0,5 μg primeru 2T3 a R2T3 nebo 2bT7 a R2T7, 1 μΐ inhibitoru RNAse (Boehringer), 1 μΐ MMuLV-RT (Boehringer) a 11 μΐ vody, načež následuje jednohodinová inkubace při 42°C.

Reakce PCR se provádí následujícím způsobem: 2 μΐ reakční směsi získané při reakci s reversní transkriptasou se smíchají se 3 μΐ 2,5mM směsi dNTP, 3 μΐ 10X Taq póly16 merasového pufru (Boehringer), 3 μΐ (0,3 μg) primerů 2T3 s 3 μΐ (0,3 μg) primerů R2T3 nebo 3 μΐ (0,3 μg) primerů 2bT7 a 3 μΐ (0,3 μg) primerů R2T7, 0,5 μΐ Taq polymerasy a 14,5 μΐ vody. Směs se 4 minuty zahřívá na 94°C a poté se provede 30 reakčních cyklů (94°C po dobu 1 minuty, 60°C po dobu 1 minuty a 72°C po dobu 1 minuty).

Amplifikační produkty z PCR reakcí se oddělí elektroforézou na 1% agarosovém gelu a potom přenesou na membránu Nytran Plus (S+S). Přitom se používá standardních postupů. Produkty PCR se připojí k membráně zesilováním pomocí UV záření a membrána se následně 3 hodiny předběžně hybridizuje při 42°C v 5X SSPE, 0,5% SDS, 0,lmM Tris, pH 7,5 a 2X Denhardtově médiu.

Hybridizační próby se připraví značením konců následujícím způsobem: 2 μΐ (200 ng) primerů M2T3 se smísí s 2 μΐ primerů. M2T7 (200 ng), 2 μΐ 10X polynukleotid kinasového pufru (Boehringer), 10 μΐ ³²P-ATP (100 μθί, 3 000 Ci/mmol), μΐ (21 jednotkami) T4 polynukleotid kinasy (Boehringer) a 2 μΐ vody. Reakce se nechá probíhat 30 minut při 37°C a potom se zastaví přídavkem 2 μΐ 0,5M EDTA. Nezabudovaná značící látka se odstraní centrifugací na sloupci Centristep (Princeton Separation lne.). Potom se membrána dále podrobí působení (při 42°C) stejného perhybridizačního pufru, ale s obsahem celkem 400 ng (vždy 200 ng každého) ³²P-značeného primerů M2T3 a M2T7. Po hybridizaci se membrány promyjí při teplotě místnosti 3 x vždy po dobu 10 minut 0,5X SSC s 0,2 % SDS, a poté následuje autoradiografie.

Výsledky na úrovni buněk ukazují, že klon č. 11 je exprimován v Rámových buňkách (B-buňky), Jurkatových buňkách (T-buňky), buňkách U973 (monocyty), buňkách T84 (karcinom tračníku), buňkách HL60 (promyelocytická leukémie), buňkách A549 (epithelie plic) a buňkách HeLa (epitheliální

- 17 karcinom). Výsledky z analýzy tkání ukazují, že klon č. 11 je exprimován ve varlatech, játrech a okcipitálním kortexu mozku člověka.

Příklad 6

Potenciální terapeutické aplikace

Předchozí zjištění, že AKAP 79 váže kalcineurin, je relevantní s ohledem na skutečnost, že kalcineurin je cílem dvou silných a klinicky užitečných imunosupresiv, cyklosporinu a FK506, které oba inhibují aktivitu kalcineurinu. Jak je popsáno dále, jak cyklosporin, tak FK506 jsou užitečné při léčení různých chorob, ale vykazují významné omezující vedlejší účinky. Předpokládá se, že faktory modulující vazbu kotevní protein/kalcineurin mohou v konečném důsledku modulovat aktivitu kalcineurinu podobným způsobem jako aktivitu cyklosporinu nebo FK506. Identifikace takového modulátoru, zejména modulátoru s menším rozsahem vedlejších účinků, než je rozsah pozorovaný u jiných imunosupresiv, by pravděpodobně měla široké terapeutické využití při léčení řady chorob, které jsou v současné době léčeny cyklosporinem nebo FK-506.

Byly oznámeny četné klinické indikace cyklosporinu a FK-506. Tak například cyklosporin představuje standard pro potlačování imunity po transplantacích, přičemž umožňuje provedení transplantací jater, plic, střev a slinivky břišní, přestože se FK506 obecně považuje za silnější imunosupresivum. Pacienti, u nichž byla provedena transplantace, kteří netolerují nebo nerespondují na cyklosporin nebo FK506, jsou někdy úspěšně převedeni na jiné léčivo.

Jako další příklad je možno uvést zánětlivou chorobu střev (IBD), což je obvyklý termín pro dvě choroby • · · · mající různé klinické projevy, tj. Crohnovu chorobu a vředovou koliditu (UC). Cyklosporinu bylo úspěšně použito při léčení Crohnovy choroby, přičemž statisticky významné výsledky léčení se projevily přinejmenším u jednoho z indexů aktivity choroby [Brynskow, Dan. Med. Bull. 41: 332 až 344 (1994)]. Jiné indexy, které nejlépe korelují s resolucí akutních exacerbací, však vykázaly jen nevýznamnou tendenci ke zlepšení. Cyklosporin vykázal také účinnost při prudké akutní vředové kolitidě resistentní vůči steroidům (data nejsou statisticky významná, poněvadž bylo nutno zkoušku ukončit z etických důvodů). Další zkouška na pacientech se sklerotizující cholangitidou a vředovou kolitidou ukázala okrajovou statistickou významnost směrem k mírnějšímu průběhu vředové kolidity. Po vysazení léčení došlo obvykle k recidivě a léčení bylo omezeno s ohledem na toxicitu (Choi a Targan, Dig. Dis. and Sci. 39: 1885 až 1892 (1994)). Kromě toho se při léčení IBD úspěšně používalo také jiných imunosupresiv, jako je methotrexate, azathioprine a 6-MP.

Jako další příklad lze uvést účinnost cyklosporinu při léčení rheumatoidní arthritis. Při několika pokusech, kdy bylo této látky použito jako léčiva druhé nebo třetí volby, tj. u pacientů, kteří nerespondovali na jiné zavedené terapie a přitom byly postiženi prudkou chorobou. Při těchto pokusech se zjistilo, že cyklosporin je obecně stejně účinný a stejně toxický, jako jiná činidla druhé volby, jako je zlato, antimalarické prostředky a azathioprine, D-penicillamine a methotrexate. [Wells a Tugwell, Br. J. Rheum., (suppl. 1): 51 až 56 (1993); Forre et al., Arth. Rheum., 30: 88 až 92 (1987)]. Tyto pokusy uvádějí pouze léčení velmi prudké aktivní rheumatoidní arthritis, u níž je léčení neúčinné s ohledem na skutečnost, že cyklosporin vykazuje potenciálně nevratnou toxicitu [Dougados a Torley, Br. J. Rheum. 32 (suppl. 1): 57 až 59 (1993)]. Renální toxicita je pravděpodobně převážně zprostředkována

renální vasokonstrikcí, která vyvolává exacerbaci nefrotoxicity nesteroidních protizánětlivých léčiv (NSAID) a ledvinovou chorobou, jež je inherentní součástí rheumatoidní arthritis [Leaker a Cairns, Br. J. Hosp. Med., 52: 520 až 534 (1994); Sturrock et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1149 až 1156 (1994); Ludwin a Alexopolulou, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 60 až 64 (1993)]. Při asi 10 % biopsií ledvin u pacientů postižených rheumatoidní arthritis, kteří byli léčeni cyklosporinem, byly zjištěny morfologické znaky toxicity cyklosporinu [International Kidney Biopsy Registry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 65 až 71 (1993)].

Jako ještě další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu při léčení asthmatu dependentního na steroldech. Při jednom pokusu byl malý počet pacientů náhodným způsobem rozdělen do skupin, které dostávaly bud cyklosporin nebo placebo. Cyklosporinová skupina vykazovala zvýšený průtok vzduchu a FVC, jakož i menší počet případů záchrany prednisolonem.

Jako další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu při léčení nefrotického syndromu dependentního na steroidech. Ukázalo se, že pacienti, kterým byla podávána nízká dávka cyklosporinu, měli snížené požadavky na steroid, ale po vysazení cyklosporinu došlo k návratu na původní stav. Formy nefrotického syndromu resistentního vůči steroidům vykazují odpověd na cyklosporin pouze 20 až 30 % případů [Meyrier, Nephrol. Dial. Transplant, 9. 596 až 598 (1994); Hulton et al., Pediatr. Nephrol. 8: 401 až 403 (1994) ] .

Pokud se týče léčení systemického lupus erythematosus (SLE), jedna studie ukázala statisticky významný pokles indexů aktivity SLE při prospektivní nerandomizo• ·· · váné neřízené studii [Tokuda et al., Arthr. Rheumat., 37:

551 až 558 (1994)]. Jiné studie však účinnost u SLE nepotvrdily.

Jako další příklad je možno uvést účinnost cyklosporinu indukovat remisi inzulin-dependentní diabetes mellitus, pokud byl cyklosporin zaveden časně po počátečních projevech. Remise trvaly v průměru asi jeden rok, přestože v některých případech byly i delší - až 850 dnů [Jenner et al. , Diabetologia, 35: 884 až 888 (1992); Bougneres et al., Diabetes, 39: 1264 až 1272 (1990)]. Žádný dlouhodobější účinek cyklosporinu nebyl zaznamenán při následujícím rozšíření jedné studie [Martin et al., Diabetologia, 34: 429 až 434 (1991)]. Při jiné studii však došlo v průběhu 12 až 18 měsíců léčení ke zhoršení funkce ledvin, přičemž funkce ledvin se úplně nevrátila na úroveň dosaženou při podávání placeba, což ukazuje, že zřejmě došlo k určitému chronickému poškození ledvin [Feldt-Rasmussen et al., Diabetes Medicine, 7: 429 až 433 (1990)]. Pro zvýšení účinku imunosupresivního léčení v průběhu inzulin-dependentní diabetes mellitus by bylo zapotřebí časnější intervence. Někteří výzkumníci úspěšně zkoušeli profylaktické léčení znaků diabetes u příbuzných pacientů z prvního kolene [Elliott and Chase, Diabetologia, 34: 362 až 365 (1991)].

Jako další příklad je možno uvést účinné léčení lupénky cyklosporinem [Cuellar et al., Balliere's Clin. Rheum., 8: 483 až 498 (1994); Ellis et al., JAMA 256: 3110 až 3116 (1986)]. Vysokodávková terapie byla účinná při léčení psoriatické arthritis, což je obzvláště prudká forma destruktivní arthritis. Při přerušení léčení byla obvykle pozorována exacerbace choroby kůže a kloubů. S ohledem na potenciální vedlejší účinky a potřebu průběžné dlouhodobé léčby je cyklosporin indikován pouze v případech psoriatické arthritis, na kterou nezabírají jiné způsoby léčení.

···· ·· · ·

Kromě toho byla demonstrována účinnost léčení prudké atopické dermatitis cyklosporinem při studiích kontrolovaných placebem a dvěma slepými pokusy [Van Joost et al., Br. J. Derm., 130: 634 až 640 (1994); Cooper, J.

Invest. Derm., 102: 128 až 137 (1994)]. Pacienti při této studii dávali přednost vedlejším účinkům léčení zahrnujícím nauseu, abdominální diskomfort, paresthesie, cholestasis a ledvinovou nedostatečnost před neléčenou chorobou. Při jiné randomizované studii kontrolované aplikací placeba a dvěma slepými pokusy se ukázalo, že podáváním cyklosporinu se významně zvýšila kvalita života u pacientů postižených prudkou atopickou dermatitis [Salek et al., Br. J. Derm., 129: 422 až 430 (1993)]. Po přerušení léčby cyklosporinem došlo k rychlé recidivě kožních lézí, ale kvalita života zůstala zlepšena.

Cyklosporinu bylo dále použito při léčení chronické dermatitis rukou, což je choroba u níž byla konstatována prevalence 4 až 22 %, jež se obvykle léčí topickými steroidy, které však u mnoha pacientů nezabírají. Nízké dávky cyklosporinu se ukázaly být jako účinné při otevřené studii u 6 ze 7 léčených pacientů [Reitamo a Granlund, Br. J. Derm., 130: 75 až 78 (1994)]. Po přerušení podávání cyklosporinu došlo k recidivě přibližně u poloviny pacientů.

Dále bylo také cyklosporinu použito pro léčení urtikárie a angioedému, což jsou idiopathické kožní choroby, které se projevují jako kopřivka a podkožní otoky. Patologie těchto chorob má vztah k žírným buňkám a jejich léčení je často neúčinné. Při jedné studii byli tři pacienti postižení těmito chorobami nerespondující na jiné léčení léčeni cyklosporinem a všechny symptomy u nich vymizely v průběhu jednoho týdne [Fradin et al., J. Am. Acad. Derm., 25: 1065 až 1067 (1991)]. U všech pacientů muselo být léčení ukončeno • ·

• ·· · • ·· ·· ·*·· • · · • · · ··· · s ohledem na vedlejší účinky a po přerušení léčení došlo k recidivě symptomů.

Pokud se týče jiných rheumatologických chorob, uvádějí studie účinné léčení cyklosporinem i u dalších méně častých autoimunitních chorob, jako je Behcetova choroba [Pacor et al., Clin. Rheum. , 13: 224 až 227 (1994)], Wegnerova granulomatosa [Allen et al., Cyclosporin A Therapy for Wegner's Granulomatosis in ANCA-Associated Vasculitides, Immunological and Clinical Aspects, Gross ed. Plenům Press (1993)] a imunitně mediovaná thrombocytopenie [Schultz et al., Blood 85: 1406 až 1408 (1995)].

Při mnohých výše popsaných studiích bylo použití cyklosporinu nebo FK506 spojeno s mnoha nežádoucími vedlejšími účinky. Obvykle platí, že obecné potlačení imunity vede ke zvýšenému ohrožení infekcemi a malignancemi a je nepravděpodobné, že imunosupresiva příbuzná kotevním proteinům by nezahrnovala podobná rizika. Jiným vedlejším účinkům je však možno se vyhnout, nebo je možno je snížit tkáňovou specificitou kotevního proteinu. Nejběžnějším vážným vedlejším účinkem cyklosporinu i FK 506 je nefrotoxicita, která je přinejmenším do určité míry závislá na podané dávce a vyskytuje se u většiny pacientů, obvykle v podobě poklesu rychlosti glomerulární filtrace během léčení. Tento vedlejší účinek je však alespoň zčásti vratný po přerušení podávání léčiva [Leaker and Cairns, viz výše uvedená citace]. Obvykle se nevyvine progresivní ledvinová insuficience, přestože pro definitivní zhodnocení by bylo zapotřebí provést další studie. Chronické poškození bylo pozorováno i u pacientů, kterým byl podáván cyklosporin v nízkých dávkách (3 až 4 mg/kg/den). Při biopsii byly u 40 % z těchto pacientů pozorovány změny zahrnující intersticiální fibrosu, tubulární atrofii a arteriolopathii [Svarstad et al., Nephrol. Dial. Transplant, 9: 1462 až 1467 (1994); Young et al., • · ·

- 23 - ·^β · • · · · · ·

Kidney International, 46: 1216 až 1222 (1994)]. Změny endothelových buněk byly také zřejmé na histologických řezech [Kahan, N. Engl. J. Med., 321: 1725 až 1748 (1989)]. Byl učiněn předpoklad, že se nefrotoxicita dostavuje především v důsledku arteriolární vasokonstrikce a chronické mírné ischemie [Leaker a Cairns, viz výše uvedená citace], přestože jsou tato léčiva také přímo toxická vůči tubulárním buňkám a vaskulárním intersticiálním buňkám [Platz et al., Transplantation, 58: 170 až 178 (1994)]. Některé zprávy ukazují, že výskyt a prudkost nefrotoxicity může být o něco vyšší u FK506 [Platz et al., výše uvedená citace].

Jinou uváděnou významnou toxicitou jak cyklosporinu, tak FK 506 je neurotoxicita, která se klinicky projevuje záchvaty, konfusí, slepotou, komatem, bolestí hlavy, ataxií, Parkinsonovským syndromem, paresthesiemi, psychosou, fokálními deficity, akinetickým mutismem, třasem, neuropathií a poruchami spánku [Shimizu et al., Pediatr.

Nephrol., 8: 483 až 385 (1994); Wilson et al., Muscle and Nerve, 17: 528 až 532 (1994); Reece et al., Bone Marrow Transpl. 8: 393 až 401 (1991); Eidelman et al., Transpl. Proč., 23: 3175 až 3178 (1991); de Groen et al., N. Engl. J. Med., 317: 861 až 566 (1987)]. Po transplantaci jater byla mírná až prudká neurotoxicita pozorována u 10 až 20 % pacientů léčených FK 506 a 3 až 12 % pacientů léčených cyklosporinem. Neurotoxicita byla také spojována s abnormalitami v obsahu lipidů v séru a s dysfunkcí jater.

Z jiných vedlejších účinků cyklosporinu a/nebo FK506 je možno uvést hepatotoxicitu, glukosovou intoleranci, hypertensi, hirsutismus, gastrointestinální symptomy, žilní trombózu, pankreatitis a hyperplasii dásní [Morris J. Heart Lung Transplant. 12: S275 až S286 (1993); Fung et al., Transpl. Proč., 23: 3105 až 3108 (1991); Mason Pharmacol. Rev., 42: 423 až 434 (1989); Kahan, N. Engl. J. Med. 321:

«Β Β

ΒΒΒ «Β

Β Β ΒΒΒΒ

1725 až 1738 (1989); Thomason et al., Renal Failure, 16:

731 až 745 (1994)]. S ohledem na široké využití cyklosporinu a FK 506 a na inherentní vedlejší účinky jejich aplikace by bylo vyvinutí alternativních imunosupresiv výjimečně prospěšné.

Tak například je možné, že delokalizace kalcineurinu z předpokládaného kotevního proteinu T-buněk, by mohla inhibovat aktivitu kalcineurinu při aktivaci T-buněk. Tak by bylo možno získat imunosupresivum specifické vůči T-buňkám, které by vykazovalo užitečnost cyklosporinu nebo FK506, ale méně vedlejších účinků. Nedávné pozorování, že delokalizace PKA z kotevního proteinu T-buněk zvyšuje expresi IL-2 ve stimulovaných buňkách ukazuje, že PKA lokalizovaná v kotevním proteinu určitým způsobem přispívá k regulační roli při expresi IL-2 během aktivace T-buněk. Delokalizace PKA specifická vzhledem k T-buňkám může proto představovat prostředek pro zvýšení sekrece IL-2 in vivo, jehož účinek je srovnatelný s podáváním rekombinantního IL-2. Možná, že by bylo možno takto dosáhout snížení toxicity léčení pomocí IL-2, jak je to uvedeno dále.

IL-2 byl schválen pro léčení metastatického renálního karcinomu a přibližně 15 až 20 % pacientů s metastatickým renálním karcinomem nebo maligním melanomem je respondentních vůči léčení IL-2. Některé z těchto odpovědí jsou trvalé a projevují se déle než 66 měsíců [Dillman, Cancer Biotherapy, 9: 183 až 209 (1994); Whittington a Faulds,

Drugs 46: 446 až 514 (1993)]. Léčení vysokými dávkami (bolus) bylo sice spojeno s několika prudkými vedlejšími účinky (viz dále). Nízkodávkové subkutánní podávání nebo léčení pomocí kontinuální infuse poskytlo nízký stupeň odpovědi (12 %) při současném snížení toxicity [Vogelzang et al., J. Clin. Oncol., 11: 1809 až 1816 (1993)].

·· ···· • · · • · · • · · · • · ·

- 25 - ·· ·

Léčení pomocí IL-2 (se současným podáváním interferonu a a jiných činidel nebo bez něho) bylo zkoušeno i při léčení jiných malignancí. Tak například při přímé aplikaci IL-2 do nádorového lůžka po resekci gliomu vedlo k prodloužené klinické odpovědi, ale nikoliv k vyléčení [Merchant et al., J. Neuro., 8: 173 až 188 (1990)]. Při dalších zkouškách byla oznámena omezená účinnost u lymfomu, [Dillman, viz výše uvedená citace], kolorektálního karcinomu, [Whittington a Faulds, viz výše uvedená citace], omezeného AML [Bruton a Koeller, Pharmacotherapy, 14: 635 až 656 (1994)], rakoviny vaječníků a časné rakoviny močového měchýře [Whittington a Faulds, viz výše uvedená citace). Počet účastníků každé z těchto studií byl však příliš malý na to, aby to umožnilo zjistit statistickou významnost pozorované účinnosti.

IL-2 byl také používán v kombinaci s adoptivní imunoterapií a bylo ukázáno, že je účinný při léčení metastatického renálního karcinomu [Pierce et al., Sem. Oncol., 22: 74 až 80 (1995); Belldegrun et al., J. Urol., 150: 1384 až 1390 (1993)]. Kromě toho může být IL-2 také účinný při léčení určitých infekčních chorob prostřednictvím snížení bakteriálního zatížení kůže a hladiny antigenu u pacientů s leprosou po intradermální injekci [Kaplan, J. Infect.

Dis., 167 (suppl. 1): S18 až 22 (1993)]. Také bylo pozorováno, že lymfocyty od pacientů postižených tuberkulózou produkují nižší hladinu IL-2 ve srovnání s lymfocyty PPD-pozitivních zdravých kontrolních jedinců [Sanchez et al., Inf. Immun., 62: 5673 až 5678 (1994)], což ukazuje, že léčení IL-2 může mít smysl při léčbě mykobakteriálních infekcí.

Přes potenciální terapeutickou hodnotu IL-2 je tento cytokin také spojen s významnou toxicitou [pokud není uvedeno jinak, jsou zdrojem těchto informaci výše uvedené ·· ··· · • · · · · ·

- 26 - .. · ··· ·· citace Whittington a Faulds, Dillman a Bruton a Koeller]. Hlavními vedlejšími účinky omezujícími takové léčení je syndrom kapilárního krvácení. Podávání IL-2 zvyšuje vaskulární permeabilitu, což vyvolává intersticiální a plicní edém, přičemž se u pacientů vyvíjí hypotense a značný počet z nich vyžaduje presory. Intenzivní resuscitace kapaliny může vyvolat plicní edém ohrožující život. Až 20 % pacientů může vyžadovat intubaci a mechanickou ventilaci. Podávání ve vysokých dávkách v podobě bolu vyvolává prudší krvácení než podávání v nízké dávce nebo pomalá kontinuální infuse a při některých léčebných režimech může 100 % pacientů vyžadovat podporu ICU při léčení IL-2. Také byly pozorovány myocarditis, kardiomyopathie a srdeční arytmie. Důsledkem hypotense indukované syndromem vlásečnicového krvácení může být akutní selhání ledvin.

IL-2 může také vyvolat prudkou diarrheu s nerovnováhami elektrolytu, cholestázu, thyroidní abnormality a akutní pankreatitidu. U 15 až 20 % léčených pacientů se vyvíjí anémie vyžadující transfuse [Mac Farlane et al., Cancer 75: 1030 až 1037 (1995)]. Může dojít také k thrombocytopenii s krvácením a k defektům vyvolaným koagulační dráhy. U více než 70 % pacientů dojde ke změnám duševního stavu včetně paranoidních delusí, halucinací, ztráty zájmu, poruch spánku a netečnosti. Také byly oznámeny jevy, jako je koma, poruchy vidění, přechodné ischemické záchvaty a paresthesie. Tyto nevýhody spojené s exogenním IL-2 vyvolávají snahu hledat alternativy, při nichž by například mohla být modulována endogenní produkce IL-2 a tak eliminována nutnost léčení exogenní IL-2. Takové alternativy by mohly být terapeuticky využitelné.

Identifikace kotevních proteinů umožňuje nejen získat možný prostředek pro identifikaci imunosupresivních léčiv a modulátorů produkce IL-2, nýbrž umožňuje i regulovat • · ··

jiné buněčné aktivity pravděpodobně s ohledem na různé metabolické dráhy, na nichž se kotevní proteiny, jak bylo ukázáno, podílejí. Tak například AKAP 79 je důležitý při regulaci iontových kanálů regulovaných receptorem glutamátu v postsynaptické hustotě neuronů, pravděpodobně prostřednictvím vazby PKA, PKC a kalcineurinu. PKA reguluje aktivitu kanálů regulovaných receptorem AMPA a delokalizace nebo inhibice PKA zeslabuje aktivitu AMPA na iontové kanály. PKC reguluje aktivitu kanálů regulovaných receptorem NMDA a kalcineurin desensitizuje receptor NMDA při reakci na stimuly. Tato pozorování ukazují, že lokalizované kinasy (PKA a PKC) mohou regulovat aktivitu glutamátových receptorů v neuronech. Defosforylace kalcineurinem představuje protiregulační mechanismus receptorů NMDA. Tento model je ve fyziologickém souladu s výskytem záchvatů indukovaných cyklosporinem nebo FK506.

Úloha glutamátových receptorů je kromě toho předpokládána při mnoha neurologických chorobách. Glutamát a jiné excitační aminokyseliny mohou vyvolat v neuronech excitotoxicitu a bylo pozorováno, že nadměrná stimulace postsynaptických glutamátových receptorů je toxická vůči neuronům, přičemž vyvolává akutní degeneraci neuronů. Zjistilo se, že hypoxie (například po mrtvici nebo srdeční zástavě) a poškození centrálního nervového systému vyvolává značný výron glutamátu do extracelulárního prostoru. Tento glutamát se potom dostává do interakce s glutamátovými receptory a spouští excitotoxickou kaskádu. Pro ochranu modelových zvířat před poškozením mozku je možno použít antiexcitačních činidel [Olney, Neurobiology of Aging, 15: 259 až 260 (1994)]. Je zajímavé, že antagonisty NMDA jsou toxické k některým typům neuronů, což ukazuje, že glutamát možná inhibuje jiné excitační dráhy v těchto buňkách. Bylo ukázáno, že makrolidové protilátky, jako je FK506, také chrání proti excitotoxicitě u kultivovaných neuronů vyvolané

• · · • · · • ·· · · • · • · ·

NMDA, ale nikoliv kainátem [Manev et al., Brain Res., 624:

331 až 335 (1993) ] .

Glutamát se zřejmě také podílí na Parkinsonově chorobě. Antagonisty NMDA chrání dopaminergické neurony v substantia nigra opic exponovaných MPTP, což je chemická sloučenina indukující Parkinsonovský syndrom u člověka a jiných primátů. Amantadin a nemantin jsou antagonisty NMDA, kterých se používá v Evropě pro léčení Parkinsonovy choroby, ale o obou těchto látkách je známo, že u některých pacientů vyvolávají psychózu. Existují také určité důkazy, že glutamát ergické neurony mohou být při Parkinsonově chorobě hyperaktivní a jejich inhibice by mohla snížit motorické symptomy choroby [Lange a Riederer, Life Sciences, 55: 2067 až 2075 (1994) ].

Glumatát má svou úlohu také při poruchách projevujících se záchvaty. Podílí se na počátku, šíření a udržování aktivity záchvatu. NMDA a ne-NMDA antagonisty jsou silnými antikonvulsivy [Meldrum, Neurology, 44 (suppl. 8):

S14 až S23 (1994)]. Receptory AMPA byly také implikovány při ALS a v současné době probíhá zkoušení antagonistů tohoto receptoru.

Vzhledem ke všem výše uvedeným pozorováním není překvapující, že také četná jiná imunosupresiva jsou ve stádiu klinických zkoušek. Následující informace týkající se takových studií byly získány z publikace Haydon a Haynes, Balliere's Clin. Gastroentero., 8: 455 až 464 (1994);

Thomason a Starzi, Immunol. Rev. 1993, 71 až 98 (1993); a Morris J. Heart Lung Transplant., 12: S275 až S286 (1993). Tak například azaspiran, což je sloučenina SKB, která potlačuje buněčné infiltráty roubů a indukci IL-2R a také ruší produkci IL-2 a IFN-gamma. Azaspiran zřejmě indukuje některé typy supresorových buněk a existují určité důkazy, že dochází k synergickému účinku s cyklosporinem.

Jako další příklad je možno uvést, mycophenolate mofetial (sloučenina vyvinutá firmou Syntex), který inhibuje syntézu purinu a vykazuje selektivní antiproliferativní účinek na T- a B-buňky. Tato látka vyčerpává protilátky a může též odčerpávat adhesní molekuly z povrchu buněk. Toto léčivo má nízkou zjevnou toxicitu a může vyvolávat leukopenii. Již 20 let se ho používá pro léčení lupénky.

Jako další příklad je možno uvést mizoribine (sloučenina vyvinutá firmou Sumitomo), který inhibuje syntézu DNA. Tato látka má stejný mechanismus účinku jako mycophenolate.

Jako další příklad je možno uvést brequinar (sloučenina vyvinutá firmou DuPont-Merck), který inhibuje syntézu pyrimidinu blokováním dihydroorát dehydrogenasy. Je očekávána úplná zpráva o klinických pokusech s touto látkou. Bylo oznámeno, že tato látka synergicky působí s cyklosporinem, ale může vyvolávat thrombocytopenii, dermatitis a mukositis.

Jako další příklad je možno uvést 15-deoxysperqualin (sloučenina vyvinutá firmou Nippon-Kayaku), která převážně ovlivňuje funkci monocytů a makrofágů, včetně inhibice oxidačního metabolismu, syntézy lysosomálního enzymu, produkce IL-1 a exprese antigenů MHC z třídy II na povrchu buněk. Tato sloučenina je ze 70 až 90 % účinná při odmítání ledviny, které neresponduje na jiné způsoby léčení, ale při vysokých dávkách může vykazovat toxicitu na kostní dřeň.

·· ····

Jako další příklad je možno uvést leflunomide (sloučenina vyvinutá firmou Hoechst), který inhibuje působení cytokinů, blokuje aktivaci T-buněk a syntézu protilátky. Není toxický ani vůči ledvinám ani vůči kostní dřeni

Jako další příklad je možno uvést rapamycin (sloučenina vyvinutá firmou Wyeth-Ayerst), který je příbuzný FK506. Jedná se o proléčivo, které se aktivizuje vazbou k imunofilinu, neinhibuje kalcineurin a neblokuje produkci cytokinů v T-buňkách. Neznámým mechanismem rapamycin blokuje přechod G1 na S.

Vynález zahrnuje četné modifikace a variace a výše uvedenými příklady provedení není omezen. Všechny takové modifikace spadají do rozsahu vynálezu, pokud jsou kryty připojenými nároky.

·· ····

- 31 - ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: ICOS Corporation

20th Avenue, S.E., Bothell, WA 98021,

U.S.A.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Purifikovaný a izolovaný polynukleotid, konstrukt pro expresi DNA, hostitelská buňka, způsob produkce humánního polypeptidu, polypeptidy, protilátky a hybridomální buněčná linie (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Čermák-Hořejš-Vrba, Advokátní a
	patentová kancelář
(B) ULICE:	Národní 32,
(C) MĚSTO:	Praha 1,
(D) ZEMĚ:	Česká republika
(E) PSČ:	110 00

(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verze #1.25 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PV 717-97 (B) DATUM PODÁNÍ: 17. 3. 1997 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

• · · · · ·

··· • · (viii) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON:

(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile 15 10 15

Glu Gin Val Lys Ala Ala Gly Ala 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid ·· ···· (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Pro Val Asp Ala Val Ile 15 10 15

Glu Gin Val Lys Ala Ala Gly Ala 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

ATTAACCCTC ACTAAAG 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA ·· ···· (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GATATCACTC AGCATAA 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2850 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GGCACGAGGA GCAGCAGGTG GAGGCTGGTG CTGTGCAGCT GAGGGCTGAC CCTGCCATCA 60

AGGAACCTCT CCCCGTGGAA GACGTCTGTC CCAAAGTAGT GTCCACACCC CCCAGTGTCA 120

CAGAGCCTCC AGAAAAGGAA CTGTCCACCG TGAGCAAGCT GCCTGCAGAG CCCCCAGCAT 180

TGCTCCAGAC ACACCCACCT TGCCGAAGAT CAGAGTCCTC GGGCATTCTT CCTAACACCA 240

CAGACATGAG ATTGCGACCA GGAACACGCA GAGACGACAG TACAAAGCTG GAGCTAGCCC 300

TGACAGGTGG TGAAGCCAAA TCGATTCCTC TAGAGTGCCC CCTTTCATCC CCAAAGGGTG 360

TACTATTCTC CAGCAAATCA GCTGAGGTGT GTAAGCAAGA TTCCCCCTTC AGCAGGGTGC 420

CAAGGAAGGT CCAGCCAGGC TACCCCGTAG TCCCCGCAGA GAAGCGTAGC TCTGGGGAGA 480

GGGCAAGAGA GACAGGTGGG GCCGAAGGGA CTGGTGATGC CGTGTTGGGG GAAAAGGTGC 540 ·· ····

TTGAAGAAGC TCTGTTGTCT CGGGAGCATG

GCCTGGCCTC TTTAGAGGGG GAAGAAGATA

GGGCCAGTGC AGGAGGAAGA GTATGTAGCA

GCTCACACAG AGCTGGCAAA GGACGATGCG

GCCCAGGACA GAGGTGTCGA GGGAGAACTG

GAGGGCTTGG ATAGAAATGA GGAGGGCTTG

GAGGAGGGCT TGGATAGAAA TGAGGAGATT

GTGATCTCAG AAGCAACCGA ACAGGTGCTG

GTGTGTCAGG CCAGTCAGCT CCAAGGGCAG

AAAACTGTCT TGGGCCCAGA CACTGCGGAG

CCGGATGCTG GCCTCCCCTT GCCAGGCCTA

TACGTGAGCT GCCTGAAGAG CCTTCTGTCC

TCTGCACACC ACATCTCCCT GGCCTCCTGC

CCGGACCGGG CAGGCATCCT GGTGGAAGAT

AGCCAAAGTG TCCCTTTGGT GGCTTCTCCA

GGGCTTGAAG ACTCTTGCAC AGAGACCAGC

CCACTGCCAG AAAGTACTGT GCCCTTCAGC

TCTTGGAATT GGAGAACAGC AAGGGCCCCA 600

AGGGGAAGAG CAGCTCATCC CAGGTTGGTG 660

GAGAAGTTGC CAAGTAGGTT CATCGAGTCG 720

GCGCCAGCAC CCCCAGTCGC AGACGCCAAA 780

GGCAATGAGG AGAGCTTGGA TAGAAATGAG 840

GATAGAAATG AGGAGAGCTT GGATAGAAAT 900

AAGCGGGCTG CCTTCCAGAT AATCTCCCAA 960

GCCACCACGG TTGGCAAGGT TGCAGGTCGT 1020

AAGGAAGAGA GCTGTGTCCC AGTTCACCAG 1080

CCTGCCACAG CAGAGGCAGC TGTTGCCCCG 1140

CCAGCAGAGG GCTCACCACC ACCAAAGACC 1200

AGCCCCACCA AGGACAGTAA GCCAAATATC 1260

CTGGCACTGA CCACCCCCAG TGAAGAGTTG 1320

GCCACCTGTG TCACCTGCAT GTCAGACAGC 1380

GGACACTGCT CAGATTCTTT CAGCACTTCA 1440

TCGAGCCCCA GGGACAAGGC CATCACCCCG 1500

AATGGGGTGC TGAAGGGGGA GTTGTCAGAC 1560

TTGGGGGCTG AGGATGGATG GACCATGGAT GCGGAAGCAG ATCATTCAGG AGGTTCTGAC 1620

AGGAACAGCA TGGATTCCGT GGATAGCTGT

AATGCCCAGG CAGGCTCCAA CCCTAAGAAG

CCAAAGCACT TAGTCGGTCG GCTAATTGGC

CAAACATCTG GTGCCAAGAT CTACATTTCA

TGCCACATAG AAGGCTCTCA ACATCATGTA

TTCAAAGAGC TGAACCTCAC CAATATCTAC

TCTCTGCCGA TGACATCCTG GCTCATGCTG

GTCAACCAGG TCAATGCCGG GCACCTGTTC

GCGCTGCGCA GCCTCGACCA GCAGATGTAC

TTGCCCACCC CAGTGGAAAT AACGGTCATC

TGGCGAGCCC AAGTGGTTGC CTCCTACGAG

GACTACGGCG GATATAAGAG GGTGAAAGTA

GTCACCCTGC CGTTTCAGGG AGCAGAAGTC

GATGACCAGT TTTCACCGGA AGCAGATGCC

CTGCTTGCTC AGGTGACAAG TTACAGTCCA

GTGGTTGGAG ATGAAGTGGT GTTGATAAAC

TGGGTAGACA GCTACTACAC AAGCCTTTGA ··· · · · · ·

- 36 - .· í ........

TGCAGTCTCA AGAAGACTGA GAGCTTCCAA 1680

GTCGACCTCA TCATCTGGGA GATCGAGGTG 1740

AAGCAGGGGC GCTATGTGAG TTTTCTGAAG 1800

ACCCTGCCTT ACACCCAGAG CGTCCAGATC 1860

GACAAAGCGC TGAACTTGAT TGGGAAGAAG 1920

GCTCCCCCAT TGCCTTCACT GGCACTGCCT 1980

CCTGATGGCA TCACCGTGGA GGTCATTGTG 2040

GTGCAGCAGC ACACACACCC TACCTTCCAC 2100

CTCTGTTACT CTCAGCCTGG AATCCCCACC 2160

TGTGCCGCCC CTGGTGCGGA CGGGGCCTGG 2220

GAGACCAACG AAGTGGAGAT TCGATACGTG 2280

GACGTGCTCC GGCAAATCAG GTCTGACTTT 2340

CTTCTGGACA GTGTGATGCC CCTGTCAGAC 2400

GCCATGAGCG AGATGACGGG GAATACAGCA 2460

ACTGGTCTTC CTCTGATTCA GCTGTGGAGT 2520

CGGTCCCTGG TGGAGCGAGG CCTTGCCCAG 2580

CCCCCATGCT GCTTCCTGAG AGTCTTTTTT 2640

GCACTGTTGA AATTGGGCTT GGCACTCAAG TCAAAGATGA ACATCGGAAT AACAAACATT 2700 ·· ···· • · · • · · ·· · · • · ·· ·

GTCCTCTCCA GAAAGTCCTT TCTTTATCCA TACTGTAGTC CTATTGAGAA GACATTTCGT 2760

CTCTGAGAAA AAAGGATGGA ACTATGGGTT CTCTTCGCAA AGCCAAAGGA TAGTGTTTAA 2820

CAAGCCAGCT GGCTTATCCT GGCTCGTGCC 2850

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci kódující protein uvedenou v SEQ ID NO: 5.
2. 2. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kterým je molekula DNA.
3. 3. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kterým je molekula cDNA.
4. 4. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kterým je molekula genomové DNA.
5. 5. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kterým je úplně nebo zčásti chemicky syntetizovaná molekula DNA.
6. 6. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid zvolený ze souboru zahrnujícího

   a) DNA člověka mající sekvenci SEQ ID NO: 5 a

   b) molekulu DNA, která za stringentních podmínek hybridizuje k nekódujícímu řetězci DNA podle odstavce a).
7. 7. Konstrukt pro expresi DNA zahrnující molekulu DNA podle nároku 2.
8. 8. Hostitelská buňka transformovaná molekulou DNA podle nároku 2.
9. 9. Způsob produkce humánního polypeptidu kódovaného polynukleotidem se sekvencí SEQ ID NO: 5, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle ná·· ···· ·· ···· roku 8 kultivuje ve vhodném médiu a polypeptid se izoluje z této hostitelské buňky nebo z jejího růstového média.
10. 10. Purifikovaný a izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidem se sekvencí SEQ ID NO: 5.
11. 11. Polypeptid, který je schopen se specificky vázat k polypeptidu podle nároku 10.
12. 12. Polypeptid podle nároku 11, kterým je protilátka .
13. 13. Polypeptid podle nároku 12, kterým je monoklonální protilátka.
14. 14. Anti-idiotypová protilátka, která je specifická vůči monoklonální protilátce podle nároku 13.
15. 15. Hybridomální buněčná linie produkující monoklonální protilátku podle nároku 13.