SK279673B6

SK279673B6 - Prípravok zabraňujúci vypadávaniu vlasov

Info

Publication number: SK279673B6
Application number: SK1490-93A
Authority: SK
Inventors: Joaquin J. Jimenez; Adel A. Yunis
Original assignee: University Of Miami
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1999-02-11
Also published as: DE69228814D1; CA2112496A1; IE922088A1; EP0591378B1; TW272128B; HUT66153A; CZ280874B6; WO1993000079A1; DE69228814T2; AU2240592A; CZ289293A3; SK149093A3; PT100638B; PH31673A; PT100638A; ATE178206T1; IL102344A; EP0591378A4; IL102344A0; EP0591378A1

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka prípravku zabraňujúceho vypadávaniu vlasov, na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov, prevencie alebo redukcie chemoterapiou indukovanej alopécie, ktorý obsahuje vitamín D₃ alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg v množstve postačujúcom na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov alebo prevencie, alebo redukcie chemoterapiou indukovanej alopécie.

Doterajší stav techniky

Alopécia je bežný a stresujúci vedľajší účinok mnohých chemoterapeutických činidiel a nejestvuje pre ňu v súčasnosti žiadna účinná ochrana. V štúdii za posledné obdobie tridsaťpäť zo štyridsiatich Šiestich pacientov, u ktorých sa aplikovala chemoterapia, považovalo alopéciu za dôležitejšiu ako zvracanie (Tierney a spol., B. J. Cancer, 62: 527 až 528, 1990).

V poslednom období, pri použití modelu mladých krýs prihlasovatelia demonštrovali, že ImuVert, modifikátor biologickej odozvy pripravený z baktérií Serratia marcescens, chráni zvieratá pred alopéciou vyvolanou cytozín-arabinozidom (ARA-C) alebo adriamycínom (Hussein a spol., Science 249: 1564-1566, 1990). V nasledujúcich štúdiách sa pozorovala podobná ochrana ARA-C-vyvolanou alopéciou pri rekombinantnom interleukíne-1 (IL-l)beta (Jimenez a spol., FASEB J. 1991).

Predložený vynález poskytuje prípravok zabraňujúci vypadávaniu vlasov, na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov, prevencie alebo redukcie chemoterapiou indukovanej alopécie, ktorý obsahuje vitamín D₃ alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg v množstve postačujúcom na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov alebo prevencie, alebo redukcie chemoterapiou indukovanej alopécie. Tento prípravok je teda vhodný tak k dosiahnutiu stimulácie rastu vlasov, ako aj k nezávislému spôsobu prevencie alebo liečby chemoterapiou vyvolanej alopécie. Pri tomto spôsobe sa môže tiež použiť rastový faktor, akým je epidermálny rastový faktor (EGF) alebo fibroblastový rastový faktor (FGF). Treba poznamenať, že pokiaľ je prihlasovateľom známe, ImuVert nebol známy ani ako stimulujúci produkciu EGF alebo FGF ani nebolo o ňom uvažované na stimuláciu takejto produkcie.

Podľa predloženého vynálezu prostriedok obsahuje vitamín D₃ alebo jeho metabolity. Tento vitamín je absorbovaný po užívaní olejov z rybacej pečene alebo ožarovaných kvasiniek. Rastlinné a živočíšne zdroje obsahujú iba neaktívne prekurzory vitamínu D, 7-dehydrocholesterol alebo ergostrerol. 7-Dehydrocholesterol sa ukladá v pokožke a môže sa transformovať na vitamín D₃ slnečným žiarením. Pri užívaní alebo tvorbe ultrafialovým žiarením v pokožke sa však vitamín D₃ transformoval na aktívne metabolity. Vitamín D₃ sa konvertuje na 25-hydroxycholekalciferol pečeňovými enzýmami. Potom sa v ľadvinách tvoria dve zlúčeniny 1,25-dihydroxycholekalciferol a 24,25-dihydroxycholekalciferol. Aktívne metabolity vitamínu D majú dôležitú úlohu pri absorpcii vápnika z intestinálneho traktu, ukladanie v kostiach a resorpciu z kostí.

1,25-Dihydroxyvitamín D₃, aktívny metabolit vitamínu D₃, ako bolo stanovené, zvyšuje EGF receptory pri bunkách rakoviny prsníka (Falette a spol., Molec. and Celí. Endocrinol., 63 (1-2): 189-198, 1989) a pri bunkovej línii získanej z „calvaria krýs“ (Petchkovich a spol., J. Biol. Chem., 262 (28), 13424-13428, 1987). Ale pokiaľ je pri hlasovateľom známe, vplyv vitamínu D₃ alebo jeho mctabolitov na alopéciu nebol doteraz uvedený alebo zvažovaný.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je prípravok, zabraňujúci vypadávaniu vlasov, ktorý obsahuje vitamín D₃ alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg, v množstve dostačujúcom na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov alebo prevenciu, alebo redukciu chemoterapiou indukovanej alopécie. Výhodne tento prípravok obsahuje 1,25-dihydroxy-vitamín D₃ alebo l,25-dihydroxy-16-én-23-ín-cholkalciferol.

Ďalej sa opisuje tento vynález v širších súvislostiach. Prípravok podľa tohto vynálezu je zvlášť vhodný na prevenciu alebo liečbu alopécie u pacientov liečených chemoterapeuticky zahrňujúcimi cyklovo špecifické činidlá (ako je cytozín arabinozid (ARA-C)) a cyklovo nešpecifické činidlá (ako cytoxán), individuálne alebo v kombinácii.

Ďalšie predmety a výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje fotografiu 10 krýs z pokusu I, tabuľka I (pozri ďalej). Všetky krysy dostávali ARA-C 50 mg/kg počas 7 dní. Päť kiýs v hornej časti dostalo roztok pufra s. c. Päť krýs v dolnej časti dostalo myšací EGF 2 pg s. c. denne počas 7 dní.

Obr. 2 je fotografia 6 krýs z pokusu III, tabuľka I (pozri ďalej). Všetky krysy dostávali ARA-C 50 mg/kg počas 7 dní. Tri krysy v hornej časti dostali roztok pufra s. c. Tri krysy v dolnej časti dostávali rHU-EGF 2 pg s. c. denne počas 7 dní

Obr. 3 je fotografia 4 krýs z pokusu s topicky podaným myšacím EGF (pozri ďalej). Všetky krysy dostávali ARA-C 50 mg/kg počas 7 dní. Dve krysy naľavo dostávali myšací EGF 10 pg v DMSO denne počas 7 dní topicky natretím medzi lopatky na ploche 1 cm². Dve krysy napravo dostali topicky roztok pufra.

Obr. 4 je fotografia 12 krýs z ARA-C-aFGF pokusu (pozri ďalej). Šesť krýs v hornej časti dostalo roztok pufra s. c. Šesť krýs v dolnej časti dostávalo aFGF 2 pg s. c. denne počas 7 dní.

Obr. 5 je fotografia 8 krýs ošetrených kombináciou chemoterapie s cytoxánom a adriamycínom. Štyri krysy v hornej časti boli okrem toho ošetrené myšacím EGF. Štyri krysy v dolnej časti boli ošetrené roztokom pufra.

Obr. 6 je fotografia 10 krýs ošetrených VP-16. Všetky krysy dostávali 1,5 mg/kg VP-16 počas 3 dní i. p. Päť krýs v hornej časti dostávalo roztok puf’ra počas 4 dní pred ošetrením. Päť krýs v dolnej časti dostávalo vitamín D₃, 50 pg/deň počas 4 dní pred ošetrením.

Obr. 7 je fotografia 6 krýs ošetrených kombinačnou chemoterapiou cytoxánom a adriamycínom (25 mg/kg

i. p. x 1 deň a 2,5mg/kg i. p. x 3 dni). Krysy v hornej časti dostávali roztok pufra počas 4 dní pred ošetrením. Tri krysy v dolnej časti dostávali vitamín D₃, 50 pg/deň počas 4 dní pred ošetrením.

Obr. 8 (A-C). V každom pokuse boli krysy vo veku päť dní náhodne rozdelené na skupiny s rovnakým počtom. Pokusná skupina krýs (horná skupina) dostávala 0,2 pg 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ v 0,15 ml absolútneho etanolu denne na hlavu a krk počas 5 dní. Kontrolné krysy (dolná skupina) boli podobne ošetrené s 0,15 ml absolútneho etanolu.

Jeden deň po poslednom topickom ošetrení boli krysy z

SK 279673 Β6 obr. 8A ošetrené cytoxánom (CTX), krysy z obr. 8B etopozidom (VP-16) a krysy z obr. 8C pomocou CTX + adriamycínu (ADM).

Obr. 9. Dvadsať krýs vo veku päť dní bolo náhodne rozdelených na dve skupiny vždy po 10 krysách. Pokusná skupina krýs (horná skupina) dostávala 0,1 pg 1,25(OH)2D₃ v 0,1 ml absolútneho etanolu iba na hlavu počas 5 dní. Kontrolné krysy (dolná skupina) boli podobne ošetrené s 0,1 ml absolútneho etanolu. Jeden deň po poslednej topickcj aplikácii boli všetky laysy ošetrené VP-16 režimom.

Obr. 10. Trinásť krýs vo veku 9 dní bolo náhodne rozdelených na dve skupiny. Pokusných 7 krýs (horná skupina) dostávalo 1 pg RO 23-7553 v 0,2 ml absolútneho etanolu denne topicky na krk a chrbát počas 6 dní. Kontrolných 6 krýs (dolná skupina) bolo podobne ošetrených s 0,2 ml absolútneho etanolu. Jeden deň po poslednom ošetrení boli všetky krysy ošetrované VP-16 režimom.

Obr. 11 znázorňuje vplyv 1,25-dihydroxyvitamínu D₃na rast vlasov.

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka spôsobu prevencie alebo zníženia alopécie, predovšetkým u pacientov, ktorí sú podrobovaní chemoterapii. Prihlasovatelia uvádzajú, že rastový faktor, ako je EGF a vitamín D₃ sa javia ako látky, ktoré robia vlasové folikuly odolnými proti toxickému účinku chemoterapeutických činidiel a zabraňujú tak strácaniu vlasov.

V jednom uskutočnení predloženého spôsobu sa rastový faktor podáva pacientovi, ktorý sa podrobuje chemoterapii, v množstve postačujúcom na prevenciu alebo redukciu straty vlasov, ktorá je bežne s takýmto liečebným režimom spojená.

Rastové faktory vhodné na použitie v predloženom spôsobe zahrnujú EGF, FGF, transformačné rastové faktory (TGF) a od doštičiek odvodený rastový faktor (platelet derived growth factor - PDGF). Rastové faktory sa môžu získať z prirodzených zdrojov (napríklad ľudského tkaniva alebo tkaniva hlodavcov), preferuje sa však rekombinantná príprava, ktorá môže produkovať veľké množstvá pri relatívne nízkych nákladoch. Rovnako sa môžu použiť chemicky syntetizované faktory. Použitie časti alebo derivátov rastových faktorov, ako je EGF a FGF, je taktiež možné, pokiaľ je možné s týmito časťami alebo derivátmi dosahovať rovnaké výsledky ako so samotným faktorom.

V inom uskutočnení predloženého vynálezu sa vitamín D alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny variant (napríklad l,25-dihydroxy-16-én-23-in-cholekalciferol, 1 a-hydroxyvitamín D₃, 1 α-24-dihydroxyvitamín D₃, MC 903 atď.) podáva teplokrvnému živočíchovi, napríklad človeku, v množstve postačujúcom na zabránenie alebo prevenciu straty vlasov, alebo stimuláciu rastu vlasov. Strata vlasov, ktorú je možné liečiť alebo jej zabrániť, použitím vitamínu D₃, môže byť vyvolaná chemoterapiou alebo inak, napríklad plešatosťou u mužov. Príklady vitamínu D₃, metabolitov vhodných na použitie v predloženom spôsobe zahrnujú, ale nie sú nimi obmedzené, 1,25-dihydroxyvitamín D₃ a l,25-dihydroxy-16-én-23-in-cholekalciferol.

Prípravky vhodné na použitie v nárokovanom spôsobe obsahujú ako aktívne činidlo rastový faktor, vitamín D₃ (alebo jeho metabolit, alebo analóg) alebo kombináciu oboch. Tieto prípravky môžu byť formulované kombináciou aktívneho činidla spolu s farmaceutický prijateľným vehikulom (nosičom, riedidlom alebo prísadou), v množstve postačujúcom na vyvolanie preventívneho účinku pri podaní podľa vhodne zvoleného liečebného protokolu. Prípravok môže byť v jednotkovej dávkovej forme.

I keď predložený spôsob nie je obmedzený určitým spôsobom účinku, predpokladá sa, že vitamín D₃ chráni proti alopécii zvýšením receptorov pre EGF v hladine vlasových folikúl. V súlade s tým sa dá pri podaní kombinácie rastového faktora a vitamínu D₃ očakávať dosiahnutie väčšej ochrany.

Prípravky vhodné na použitie v spôsobe, ktorého sa vynález týka, môžu byť vo forme vhodnej na topické podanie. Prípravok môže mať formu roztoku, lotionu (kozmetickej kvapaliny), krému, gélu alebo masti. Ak sa prípravok podáva injekčné, má výhodne formu roztoku. Použité vehikulum, bez ohľadu na formu prípravku, môže byť inertné alebo môže samo mať výhodný fyziologický alebo farmaceutický účinok.

V prípravku môžu byť obsiahnuté rôzne aditíva. Z tohto hľadiska je v súlade i zahrnutie činidla, ktoré stimuluje produkciu pacientovho rastového faktora, do prípravku. Zahrnutie činidiel zvyšujúcich penetráciu do prípravkov vhodných na topické podanie, ako je DMSO alebo etanol, je výhodné. V prípravkoch môžu byť rovnako obsiahnuté stabilizátory, predlžujúce čas životnosti, bez ohľadu na spôsob, akým je prípravok formulovaný.

Odborníkom bude zrejmé, že je možné použiť rozličné kombinácie rastového faktora a/alebo vitamínu D₃. Odborník rovnako ľahko stanoví optimálne koncentrácie.

Ako bolo uvedené, spôsob, ktorého sa vynález týka, môže zahrnovať buď topickú aplikáciu aktívneho činidla (rastového faktora a/alebo vitamínu D₃, alebo jeho metabolitov) alebo injekčné podanie. Množstvo aktívneho činidla a frekvencia podania sa môžu meniť v závislosti od jednotlivého prípadu a odborníci ich môžu ľahko optimalizovať. Napríklad môže sa pripraviť roztok 2 až 100 μg/ml 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ v absolútnom etanole a aplikovať 3 až 5 ml tohto roztoku priamo na pokožku hlavy v rôznych bodoch kvapkadlom a potom sa pokožka hlavy masíruje počas 3 až 5 minút, aby sa dosiahlo rozdelenie. Ak sa používa chemoterapia, podáva sa toto ošetrenie výhodne jeden alebo dvakrát denne so začatím 5 až 8 dní pred začiatkom chemoterapie a pokračuje sa v ňom počas celého obdobia trvania chemoterapie. Rovnako sem patrí možnosť, že aktívne činidlo sa môže podávať v podstate súčasne s alebo po podaní chemoterapeutického činidla.

Spôsob, ktorého sa predložený vynález týka, je uvedený v nasledujúcich príkladoch ako účinný, ak sa podáva liečivo špecifické pre bunkový cyklus, ARA-C ako chemoterapeutické činidlo a ak sa podáva kombinácia adriamycínu (špecifický pre bunkový cyklus) a cytoxánu (nešpecifický pre bunkový cyklus). Predpokladá sa však, že použitie predloženého spôsobu môže zabrániť strate vlasov, ku ktorej príde pri ošetrení inými chemoterapeutickými činidlami. Ďalej sa predpokladá, že rastový faktor a/alebo vitamín D₃ sa môžu použiť na prevenciu alebo spomalenie straty vlasov pri samčej plešatosti, pokiaľ sa použijú správnym spôsobom, výhodne pri prvom náznaku plešatosti, napríklad jedenkrát denne alebo každý ďalší deň na ohrozenú plochu pokožky hlavy.

Preventívny účinok proti alopécii pozorovaný prihlasovateľmi je celkom neočakávaný. Rastové faktory, ako je EGF, sú považované za stimulátory rastu buniek kože. V súlade s tým by sa pri týchto činidlách očakávalo, že indukujú vstup vlasovej folikuly do bunkového cyklu a robia tak folikulu citlivejšou proti chemoterapeutickým činidlám, predovšetkým proti liečivám špecifickým pre bunkový cyklus, ako je ARA-C. Podanie rastových faktorov pacientom, ktorí sú pod chemoterapiou, by sa teda skôr dalo pokladať za zhoršujúce stratu vlasov. Napriek tomu bol dosiahnutý opačný účinok. Tieto pozorovania, ktoré boli zaznamenané s EGF a FGF sú nové a v literatúre neboli ani naznačené, ani uvedené. Podobne nejestvujú zmienky o tom, že by úloha vitamínu D₃ v tele mohla poskytnúť takúto vynikajúcu ochranu proti plešatosti, vyvolanej chemoterapeuticky alebo inak.

Nasledujúce neobmedzujúce príklady opisujú podrobnejšie niektoré aspekty vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce experimentálne detaily sa týkajú ďalej uvedených príkladov I až IV.

Krysy Spraque Dawley boli zakúpené od Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Cytosar-U (ARA-C) bol od Upjohn Company, Kalamazoo, MI. EGF receptorovej čistoty z myšacích submaxilárnych žliaz, ľudský rekombinantný EGF, dimetylsulfoxid a vitamín D₃ boli získané od Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO. aFGF bol získaný od AMGEN Corp., Thousand Oaks, CA.

Všetky krysy z každého pokusu boli ošetrené pomocou ARA-C 50 mg/kg intraperitoneálne (i. p.) denne počas 7 dní. Pre subkutánne (s. c.) injekcie boli pripravené EGF a FGF v PBS 1 % BSA.

Alopécia sa vždy zaznamenávala v 12. dni pokusu a hodnotila ako bolo uvedené (Hussein a spol., Science 249: 1564 - 1566,1990, Jimenez a spol., FASEB J, 1991).

Pre topické ošetrenie bol myšací EGF pripravený nasledovne: Jedna fľaštička EGF (100 pg) sa rozpustila v 0,2 ml PBS 1 % BSA a 0,12 ml tohto roztoku sa pridalo k 0,48 DMSO. Tri hodiny pred ARA-C injekciou sa 0,1 ml EGF-DMSO zmesi aplikovalo na každú krysu na 1 cm²plochy medzi lopatkami s použitím gumového aplikátora. Krysy sa potom udržiavali oddelene počas troch hodín, potom sa ošetrená plocha starostlivo umyla mydlom a vodou a vysušila. Ošetrenie sa uskutočňovalo počas 7 dní. Kontrolné zvieratá sa podobne ošetrovali pri použití DMSO bez EGF.

Príklad I

Ochranný vplyv EGF

Pre test schopnosti myšacieho EGF chrániť ARA-C vyvolanú alopéciu, sa uskutočnili dva oddelené pokusy. V pokuse I sa dvadsaťdva krýs vo veku 7 dní náhodne rozdelilo do dvoch skupín po jedenástich krysách. Okrem ARA-C, skupina I dostala 2 pg myšacieho EGF s. c. na chrbát a medzi dve zadné nohy 3 hodiny pred ARA-C injekciami, denne počas 7 dní. Skupina II dostala podobne roztok pufra a slúžila ako kontrola. Desať z jedenástich krýs v skupine II malo prakticky vyvinutú celkovú alopéciu tela a jedna krysa stratila viac ako 50 % srsti. Naopak, v skupine I nemalo 5 krýs žiadnu detegovateľnú stratu srsti a 6 krýs malo miernu stratu srsti (tabuľka I, pokus I (obr. 1)). V pokuse II bolo dvanásť krýs vo veku 7 dní náhodne rozdelených na dve skupiny, vždy po 6 krysách. Okrem ARA-C, skupina I dostala myšací EGF 1 pg s. c. denne počas 7 dní. Skupina II dostala pufer s. c. Všetkých 6 krýs v skupine II malo vyvinutú stredne ťažkú až ťažkú alopéciu, zatiaľ čo v skupine I nemala jedna krysa žiadnu detegovateľnú stratu srsti a 5 krýs malo len minimálnu stratu srsti (tabuľka I, pokus II).

V ďalšom pokuse bol použitý rHu-EGF. Dvanásť krýs vo veku 7 dní bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín po 6 krysách. Okrem ARA-C, skupina I dostávala rHu-EGF 2 pg s. c. do boku denne počas 7 dní. Skupina II dostávala pufer s. c. Všetkých 6 krýs v skupine II malo vyvinutú úplnú alopéciu celého tela, pričom v skupine I nemala žiadna z krýs celkovú telesnú alopéciu, jedna krysa nemala žiadnu detegovateľnú stratu srsti, štyri krysy mali miernu alopéciu a jedna krysa strednú alopéciu (tabuľka I, pokus III (obrázok 2)).

Tabuľka I

Vznik alopécie na krysách ošetrených pomocou ARA-C. Vplyv myšacieho EGF a rHu-EGF.

	alopécia*
	0	1+	2+	Λ
	pokus I
ARA-C	0	0	1	10
ARA-C + myšací EGF 2 pg	5	6	0	0
	pokus II
ARA-C	0	0	3	3
ARA-C + myšací EGF 1 pg	1	5	0	0
	pokus III
ARA-C	0	0	0	6
ARA-C + rHu-EGF 2 pg	1	4	1	0

Pre všetky pokusy sa použili krysy vo veku sedem dní. Všetky krysy dostávali ARA-C 50 mg/kg x 7 dní i. p. v 0,1 ml. Myšací EGF a rHu-EGF v PBS 1 % BSA sa podávali 3 hodiny pred ARA-C jedenkrát denne v 0,1 ml s. c. x 7 dní. Kontroly dostali PBS 1 % BSA 0,1 ml s. c. x 7 dní. Hodnoty sa zaznamenali na 12. deň.

nedetegovateľná alopécia

1+ miera alopécie definovaná ako strata menej ako 50 % srsti 2+ stredne ťažká alopécia so stratou viac ako 50 % srsti 3+ úplná alebo temer úplná (90 %) strata srsti.

V ďalšom pokuse sa dvanásť krýs vo veku 7 dní náhodne rozdelilo do dvoch skupín po šiestich krysách. Skupina I dostávala okrem ARA-C myšací EGF 10 pg v DMSO denne počas 7 dní topicky potretím bavlneným aplikátorom medzi ramennými lopatkami na ploche 1 cm². Skupina II dostávala topicky kontrolný roztok. V skupine II sa na všetkých šiestich krysách vyvinula alopécia celého tela. V skupine I sa vyvinula na všetkých krysách alopécia celého tela s výnimkou miesta, kde bol topicky aplikovaný EGF (obr. 3).

Príklad II

Ochranný vplyv aFGF

Štrnásť krýs vo veku sedem dní bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín. Všetky krysy dostávali ARA-C 50mg/kg/deň počas sedem dní. Ďalej skupina I dostávala aFGF 2 pg s. c. na temeno hlavy počas sedem dní. Skupina II dostávala injekcie pufra a slúžila ako kontrola. Alopécia sa zaznamenala na 12. deň pokusu. Všetky krysy v skupine II mali vyvinutú alopéciu celého tela. Naopak, všetky krysy v skupine I boli lokálne chránené na mieste injekcie (obr. 4).

Príkladní

Ochrana pred alopéciou vyvolanou cytoxánom/adriamycínom

Osem krýs Sprague Dawley vo veku štyroch dní bolo rozdelených do dvoch skupín po 4 krysách. Skupina I dostávala EGF 2 pg s. c. na hlavu denne počas 7 dní. Skupina II dostávala injekcie pufra a slúžila ako kontrola. Jeden deň po ukončení EGF injekcií alebo injekcií pufra dostali všetky krysy cytoxán 25 mg/kg i. p. počas 1 dňa a adriamycín 2,5 mg/kg i. p. počas 3 dní. V skupine II mali všetky krysy 3+ alopéciu na hlave a ploche chrbta. Naopak, v skupine I mala jedna krysa miernu alopéciu, jedna krysa minimálnu alopéciu a dve krysy nedetegovateľnú alopéciu na hlave a chrbte (obr. 5).

Príklad IV

Ochranný vplyv vitamínu D₃

Dvanásť krýs vo veku 7 dni bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín. Skupina I bola denne ošetrovaná pufrom 0,1 ml s. c. počas 4 dní. Druhá skupina bola denne ošetrovaná vitamínom D₃, 50 pg s. c. na hlavu počas 4 dní. Po ukončení ošetrovania pufrom alebo vitamínom D₃ dostávali všetky krysy 1,5 mg/kg i. p. VP-16 (etopozid) denne počas troch dní. Všetky krysy v skupine I mali vyvinutú alopéciu celého tela, zatiaľ čo krysy v skupine II boli chránené (obr. 6 predstavuje 4 krysy z každej skupiny).

V iných pokusoch krysy vopred ošetrené vitamínom D₃mali vynikajúcu ochranu proti alopécii spôsobenej etopozidom, cytoxánom, cytarabínom a kombináciou cytoxánu a adriamycínu (obr. 7). Výsledky sú zosumarizované v tabuľke II.

Tabuľka II

Ochrana pred alopéciou vyvolanou chemoterapiou, predchádzajúcim ošetrením s vitamínom D₃

Testované liečivo spôsobujúce alopéciu	celkový počet pokusov	celkový počet zvierat	ochrana pred alopéciou
etopozid (VP-16)	2	22	áno*
cytoxán (CTX)	7	89	áno*
cytarabín (ARA-C)	1	8	áno*
adriamycín + CTX kombinácia	6	n	áno*

Chemoterapeutické činidlá boli podávané nasledovne: VP-16 1,5 mg/kg i. p. denne počas 3 dní, cytoxán 32,5 mg/kg ako jediná injekcia, ARA-C 50 mg/kg i. p. denne počas 7 dní, kombinácia (adriamycín 2,5 mg/kg i. p. denne počas 3 dni plus cytoxán 25 mg/kg ako jedna injekcia). Vitamín D₃bol podávaný v 50 pg denných dávkach i. p. alebo s. c. 4 dni pred chemoterapiou.

* V týchto pokusoch bola ochrana pred alopéciou indukovanou chemoterapiou pozorovaná jednotne na všetkých zvieratách ošetrených vitamínom D₃.

V iných pokusoch bol 1,25-dihydroxyvitamín D₃ aplikovaný topicky (0,5 pg denne) v 50 % etanole alebo DMSO a rovnako nastala ochrana krýs pred alopéciou vyvolanou VP-16.

Príklad V

Ochranný vplyv predchádzajúceho ošetrenia pomocou vitamínu D₃

Topická aplikácia 1,25-dihydroxyvitamínu D₃

1,25-Dihydroxyvitamín D₃ sa rozpustil v absolútnom etanole a aplikoval topicky aplikátorom. Kontrolné zvieratá boli podobne ošetrené rovnakým množstvom etanolu. Zvieratá sa udržiavali oddelene počas troch hodín a potom bola ošetrená plocha starostlivo umytá mydlom a vodou a vysušená. Ošetrenie sa uskutočňovalo denne počnúc 5. dňom po narodení a končiac desiatym dňom.

Chemoterapia:

Všetky chemoterapie sa podávali i. p. a začali vo veku jedenásť dní. CTX, 35 mg/kg, sa podával iba jeden deň. VP-16, 1,5 mg/kg sa podával počas troch dní. Pri kombinácii CTX a ADM sa CTX podával jeden deň v dávke 25 mg/kg a ADM tri dni v dávke 2,5 mg/kg. V týchto dávkach ani CTX ani ADM samotný nevyvolávali alopéciu. Alopécia bola zaznamenaná na desiaty deň od začiatku terapie.

Uskutočnili sa celkom 4 pokusy. V prvom pokuse sa hodnotila ochrana pred alopéciou vyvolanou cytoxánom. Pokusná skupina bola vopred ošetrená s 0,2 pg 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ v 0,15 ml absolútneho etanolu, ap likovaného topicky na hlavu a krk a kontrolná skupina dostávala 0,15 ml alkoholu. Na všetkých 10 krysách v kontrolnej skupine sa vyvinula úplná alopécia. Naopak, všetky zvieratá v pokusnej skupine boli chránené (obr. 8A). Druhý pokus sa uskutočnil za podobných podmienok na preskúmanie ochrany pred VP-16 vyvolanou alopéciou. Na všetkých 10 krysách v kontrolnej skupine sa vyvinula alopécia celého tela. Naopak všetky krysy v experimentálnej skupine boli chránené (obr. 8B). Tretí pokus bol navrhnutý na preskúmanie ochrany pred alopéciou vyvolanou kombináciou cytoxán - adriamycín. V každej skupine bolo 11 krýs. Šesť krýs v kontrolnej skupine malo vyvinutú alopéciu na hlave a na krku a 5 krýs vyvinutú alopéciu celého tela. Naopak všetky krysy v pokusnej skupine boli chránené (obr. 8C). Vo štvrtom pokuse bola podobne skúšaná ochrana pred alopéciou vyvolanou VP-16 s tým rozdielom, že dávka 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ bola znížená na 0,1 pg v 0,1 ml absolútneho etanolu aplikovaného topicky iba na povrch hlavy. Všetkých 10 krýs v kontrolnej skupine malo vyvinutú úplnú alopéciu. Naopak všetky krysy v experimentálnej skupine boli chránené predovšetkým na mieste aplikácie 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ (obr. 9).

Je pozoruhodné, že ochrana vyvolaná s 0,2 pg 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ nebola obmedzená na miesto aplikácie, ale zahrnovala celé telo, čo potvrdzuje systémovú absorpciu. Ak dávka bola znížená na 0,1 pg aplikovaných iba na povrch hlavy, bola ochrana pred alopéciou vyvolanou VP-16 menej všeobecná a viac obmedzená na miesto aplikácie.

Príklad VI

Ochrana pred alopéciou vyvolanou VP-16 topickou aplikáciou RO 23-7553

RO 23-7553 (1,25-dihydroxy-16-én-23-in-cholekalciferol) sa rozpustil v absolútnom etanole a aplikoval topicky pomocou aplikátora. Kontrolné zvieratá boli rovnakým spôsobom ošetrené rovnakým množstvom etanolu. Zvieratá sa potom udržiavali oddelene počas troch hodín, potom sa ošetrená plocha starostlivo umyla mydlom a vodou a vysušila. Ošetrenie sa uskutočňovalo denne počnúc deviatym dňom od narodenia a končiac štrnástym dňom.

Na pätnásty deň dostali všetky zvieratá VP-16, 1,5 mg/kg i. p. počas troch dní. Alopécia bola zaznamenávaná na dvadsiaty piaty deň.

Trinásť krýs bolo náhodne rozdelených do dvoch skupín. Pokusná skupina 7 krýs, kontrolná skupina 6 krýs. Pokusná skupina bola vopred ošetrená s 1 pg RO 23-7553 v 0,2 ml absolútneho etanolu, aplikovaného topicky na krk a chrbát a kontrolná skupina dostala 0,2 ml etanolu. Všetkých šesť krýs v kontrolnej skupine malo vyvinutú úplnú alopéciu na krku a chrbte. Naopak všetky zvieratá v pokusnej skupine boli chránené (obr. 10). Je potrebné uviesť, že ak sa začne s chemoterapiou vo veku 14 dní, nie je plocha hlavy celkom bez ochlpenia.

Príklad VII

Stimulácia rastu vlasov vitamínom D₃

Počas uskutočňovania opísaných štúdií ochrany pred alopéciou vyvolanou chemoterapiou pomocou vitamínu D₃a jeho aktívneho analógu, 1,25-dihydroxyvitamínu D₃, je potrebné uviesť, že krysy ošetrené 1,25-dihydroxyvitamínom D₃ nie sú chránené iba pred alopéciou vyvolanou chemoterapiou, ale tieto krysy mali lepšie pokrytie srsťou a dlhšiu srsť na ošetrenej ploche. Tieto stanovenia vyvolali ďalšie pokusy stimulácie rastu vlasov 1,25-dihydroxyvitamínom D₃.

Chrbty devätnástich krýs Sprague Dawley vo veku 25 dní sa oholili a krysy boli náhodne rozdelené do dvoch skupín.

Skupina I (kontrolné krysy, 10) dostávala 0,1 ml etanolu aplikovaného topicky jedenkrát denne na oholenú plochu počas 14 dní.

Skupina II (kalcitriol, 9 krýs) dostávala 50 ng 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ v 0,1 ml etanolu aplikovaného topicky jedenkrát denne na oholenú plochu počas 14 dní.

Rast srsti bol hodnotený na 15 deň znovuoholením plochy 6 cm x 6 cm a zvážením. Rozdiely medzi týmito dvoma skupinami boli vysoko štatisticky významné. P. hodnota 0,003 (pozri tabuľka III a obr. 11).

Tabuľka III

Stimulácia rastu srsti krýs kalcitriolom

Hmotnosť srsti v mg
kontrola	kalcitriol
98	202
131	143
72	150
84	253
102	130
144	177
115	140
129	147
125	135
130
priemer s. e. m.	priemer s. e. m.
113±8	164 ± 13

Vzhľadom na uvedené údaje, vykazujúcim stimuláciu rastu srsti pomocou 1,23-dihydroxyvitamínu D₃ podávaného kryse topicky, sa predpokladá, že 1,25-dihydroxyvitamín D₃ sa môže použiť ako stimulant rastu srsti v prípadoch alopécie akéhokoľvek pôvodu. Ďalej tieto údaje potvrdzujú, že vitamín D₃ a jeho metabolity je/sú nevyhnutné pre optimálny rast vlasov a môžu sa preto použiť na zabránenie straty vlasov, akéhokoľvek pôvodu, vrátane plešatosti.

Príklad VIII

Prípravky

Ďalej sú uvedené štyri prípravky, ktoré obsahujú 1,25-dihydroxyvitamín D₃ ako aktívnu zložku a spôsoby ich výroby.

1. Topický roztok

Zložky	% (hmotn./hmotn.)
1,25-dihydroxyvitamín D₃	0,0002-0,10
propylénglykol	10,00
propylénglykol
dikaprylát/dikaprát“	30,00
butylátovaný hydroxytoluén (BHT)	0,05
butylátovaný hydroxyanizol (BHA)	0,05
etylalkohol q. s. do	100,00

^aMôže byť nahradený nasledujúcimi materiálmi: (1) triglyceridy so stredným reťazcom, (2) dimetylizosorbitol, (3) polyetylénglykoly, (4) etoxydiglykol.

Spôsob prípravy

i. Navážia sa príslušné množstvá propylénglykoldikaprylátu/dikaprátu, etylalkoholu, propylénglykolu do zásobníka z nerezovej ocele.

ii. Rozpustí sa BHT a BHA v roztoku zo stupňa i).

iii. Pridá sa 1,25-dihydroxyvitamin D₃ do zmesi zo stupňa ii. a mieša sa do rozpustenia.

2. Pufrovaný topický roztok

Zložka	% hmotn./hmotn.
1,25-dihydroxyvitamín D₃	0,0002-0,10
propylénglykol	50,00
hydroxypropylcelulóza (Klucel MF)	0,50
metylparabén	0,20
butylátovaný hydroxytoluén (BHT)	0,05
butylátovaný hydroxyanizol (BHA)	0,05
hydrogénfosforečnan sodný	0,43
dihydrogénfosforečnan sodný	0,70
hydroxid sodný (q. s. na pH=7)	0,04
etylalkohol, 95 %	30,00
voda q. s. do	100,00

Spôsob prípravy

i. Rozpustí sa hydrogénfosforečnan sodný, dihydrogénfosforečnan sodný a hydroxid sodný vo vode v zásobníku z nerezovej ocele. Zmeria sa pH roztoku. pH roztoku by malo byť 7,0, ak nie je, upraví sa pH.

ii. K roztoku zo stupňa i. sa pridá propylénglykol a etylalkohol.

iii. Rozpustí sa 1,25-dihydroxyvitamínu D₃, metylparabén, BHT a BHA v roztoku zo stupňa ii.

iv. V roztoku zo stupňa iii. sa rozpustí Klucel MF.

3. Olej vo vode pufrovaný topický lotion

Zložky	% hmotn./hmotn.
1,25-dihydroxyvitamin D₃	0,0002-0,10
cetylalkohol	0,25
stearylalkohol	0,50
sorbitanmonostearát	2,00
glycerylmonostearát a	4,00
polyoxyetylénstearát - zmes
(Arlacel 165)
Polysorbate 60	1,00
minerálny olej	4,00
propylénglykol	5,00
butylátovaný hydroxyanizol	0,05
propylparabén	0,05
pufrovacie činidlo q. s. na pH	7,00
roztok sorbitolu	2,00
edetát disodný	0,10
metylparabén	0,18
voda q. s. do	100,00

Spôsob prípravy

i. Pripraví sa pufrovací roztok (pH 7,0) v zásobníku z nerezovej ocele.

ii. V zásobníku z nerezovej ocele sa spoločne roztaví pri teplote 70 °C cetylalkohol, stearylalkohol, sorbitanmonostearát, Arlacel 165, Polysorbate 60, minerálny olej, butylátovaný hydroxyanizol, propylparabén a 50 % propylénglykol.

iii. Ku stupňu i) sa pridá roztok sorbitolu a roztok sa zahreje na teplotu 70 °C.

iv. K roztoku zo stupňa iii) sa pridá edetát disodný a metylparabén.

v. Rozpustí sa 1,25-dihydroxyvitamínu D₃ v približne 40 % propylénglykolu v kadičke a pridá sa k materiálu zo stupňa ii) za miešania. Zásobník sa vymyje 10 % propylénglykolu a roztok sa pridá k zmesi zo stupňa ii).

SK 279673 Β6 vi. Stupeň v) sa pridá ku stupňu iv), obidve fázy sa zahrejú na teplotu 70 °C a homogenizujú. Emulzia sa ochladí na 200m teplotu.

4. Topický gél

Zložky	% hmotn./hmotn.
1,25-dihydoxyvitamin D₃	0,002-0,10
butylátovaný hydroxytoluén (BHT)	0,05
butylátovaný hydroxyanizol (BHA)	0,05
hydroxypropylcelulóza	3,00
etylalkohol, 95 %	50,00
voda q. s. do	100,00

Spôsob prípravy

i. Naváži sa etylalkohol a voda do zásobníka z nerezovej ocele.

ii. Rozpustí sa 1,25-dihydroxyvitaminu D₃, BHT a BHA v roztoku zo stupňa i).

iii. Rozpustí sa hydroxypropylcelulóza v roztoku zo stupňa ii). Referencie v celom opise sú tu uvedené ako odkazy.

Predložený vynález bol opísaný podrobnejšie, na ozrejmenie a pochopenie a odborníkovi bude zrejmé, že je možné vykonať rôzne zmeny bez toho, aby sa vybočilo z rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prípravok zabraňujúci vypadávaniu vlasov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vitamín D₃alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg, v množstve dostačujúcom na dosiahnutie stimulácie rastu vlasov alebo prevenciu, alebo redukciu chemoterapiou indukovanej alopécie.
2. Prípravok podľa nároku 1, na prevenciu alebo redukciu chemoterapiou indukovanej alopécie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vitamín D₃ alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg v množstve dostačujúcom na dosiahnutie uvedenej prevencie alebo redukcie.
3. Prípravok podľa nároku 1, na stimuláciu rastu vlasov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vitamín D₃ alebo jeho analóg, derivát alebo štruktúrny analóg v množstve dostačujúcom na dosiahnutie uvedenej stimulácie.
4. Prípravok podľa nárokov laž3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 1,25-dihydroxyvitamin D₃ alebo l,25-dihydroxy-16-én-23-ín-cholkalciferol.