CZ280874B6

CZ280874B6 - Přípravek pro prevenci nebo redukci chemoterapií indukované alopecie

Info

Publication number: CZ280874B6
Application number: CS932892A
Authority: CZ
Inventors: Joaquin J. Jimenuz; Adel A. Yunis
Original assignee: University Of Miami
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1996-04-17
Also published as: DE69228814T2; IL102344A0; AU667675B2; EP0591378B1; ATE178206T1; JPH06509072A; HUT66153A; EP0591378A4; AU2240592A; WO1993000079A1; EP0591378A1; IE922088A1; SK279673B6; PH31673A; CA2112496A1; CZ289293A3; SK149093A3; PT100638A; IL102344A; PT100638B

Abstract

Přípravek pro prevenci nebo redukci chemoterapií indukované alopecie, spočívající v tom, že obsahuje vitamín D.sub.3 .n.nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog a proteinový růstový faktor tj.: a proteinový růstový faktor v množství dostačujícím pro dosažení uvedené prevence nebo redukce. Přípravek je rovněž vhodný pro použití při stimulaci růstu vlasů.ŕ

Description

Přípravek, zabraňující vypadávání vlasů

Oblast techniky

Tento vynález se týká přípravku, zabraňujícího vypadávání vlasů, pro dosažení stimulace růstu vlasů, prevence nebo redukce chemoterapií indukované alopecie, který obsahuje vitamin D₃ nebo je analog, derivát nebo strukturní analog, v množství, dostačujícím pro dosažení stimulace růstu vlasů nebo prevence, nebo redukce chemoterapií indukované alopecie.

Dosavadní stav techniky

Alopecie je běžný a stresující vedlejší účinek mnoha chemoterapeutických prostředků a není pro něj v současnosti žádná účinná ochrana. Ve studii z poslední doby 35 ze 46 pacientů, u kterých byla aplikována chemoterapie, považovalo alopecii za důležitější než zvracení (Tierny a kol., B. J. Cancer 62., 527-528 /1990/).

V poslední době za použití mladých krys původci tohoto patentu doložili, že ImuVert, modifikátor biologické odezvy, připravený z bakterií Serratia marcescens, chrání zvířata před alopecií, vyvolanou cytosin-arabinosidem (ARA-C) nebo adriamycinem (Hussein a kol., Science 249, 1564-1566 /1990/). V následujících studiích byla pozorována podobná ochrana ARA-C-způsobené alopecie z rekombinantního interleukinu-1 (ILK-1) β (Jimenez a kol., FASEB J. /1991/).

Tento vynález poskytuje přípravek, zabraňující vypadávání vlasů, pro dosažení stimulace růstu vlasů nebo prevence, nebo redukce chemoterapií indukované alopecie, který obsahuje vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog, v množství, dostačujícím pro dosažení stimulace růstu vlasů nebo prevence, nebo redukce chemoterapií indukované alopecie. Tento přípravek je tedy vhodný jak k dosažení stimulace růstu vlasů, tak k nezávislému způsobu prevence nebo léčby chemoterapií vyvolané alopecie. Při tomto způsobu se může také používat růstového faktoru, jako je epidermální růstový faktor (EGF) nebo fibroblastový růstový faktor (FGF). Je třeba konstatovat, že ImuVert nebyl znám ani jako látka, stimulující produkci EGF nebo FGF, ani o něm nebylo uvažováno jako o látce, vhodné pro stimulaci takové produkce.

Podle tohoto vynálezu prostředek obsahuje vitamin D₃ nebo jeho metabolity. Tento vitamin je absorbován po užívání olejů z rybích jater nebo ozařovaných kvasinek. Rostlinné nebo živočišné zdroje obsahují pouze neaktivní prekurzory, 7-dehydrocholesterol nebo ergosterol. 7-Dehydrocholesterol je ukládán v pokožce a může být na vitamin D₃ převeden slunečním zářením. Při užívání nebo tvorbě ultrafialovým zářením v pokožce se však vitamin D₃transformuje na aktivní metabolity. Vitamin D₃ se převádí na 25-hydroxycholekalciferol jaterní enzymy. Potom se v ledvinách tvoří dvě sloučeniny, 1,25-dihydroxycholekalciferol a 24,25-dihydroxycholekalciferol. Aktivní metabolity vitaminu D hrají důle

-1CZ 280874 B6 žitou roli v absorbci vápníku z intestinálního traktu, ukládání v kostech a reabsorpci z kostí.

,'25-Dihydroxyvitamin D-j, aktivní metabolit vitaminu D₃, jak bylo zjištěno, zvyšuje EGF receptory buněk rakoviny prsu (Falette a kol., Molec. and Cell. Endocrinol. 63(1-2), 189-198 /1989/), a u buněčné linie, získané z krysí kalvárie (Petchskovich a kol., J. Biol. Chem. 262(28) , 13424-13428 /1987/). Avšak pokud je původcům tohoto vynálezu známo, vliv vitaminu D₃ nebo jeho metabolitů na alopecii nebyl dosud uveden nebo uvažován.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je přípravek, zabraňující vypadávání vlasů, který obsahuje vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog, v množství dostačujícím pro dosažení stimulace růstu vlasů nebo prevence, nebo redukce chemoterapií indukované alopecie. Výhodné tento přípravek obsahuje 1,25-dihydroxyvitamin D₃ nebo 1,25-dihydroxy-16-en-23-in-cholkalciferol.

Dále se popisuje tento vynález v širších souvislostech.

Přípravek podle tohoto vynálezu je zvláště vhodný k prevenci nebo léčbě alopecie u pacientů, léčených chemoterapeutiky, zahrnujícími cyklově specifické prostředky (jako je cytosin-arabinosid (ARA-C) a cyklově nespecifické prostředky (jako je Cytoxan), individuálně nebo v kombinaci.

Další objekty a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 představuje fotografii 10 krys z pokusu I, tabulka (viz dále). Všechny krysy dostávaly ARA-C 50 mg/kg po 7 dní. Pět krys v horní části dostalo roztok pufru s.c. Pět krys ve spodní části dostalo myší EGF 2 μg s.c. denně po 7 dní.

Obr. 2 je fotografie 6 krys z pokusu III, tabulka I (viz dále). Všechny krysy dostávaly ARA-C 50 mg/kg po 7 dní. Tři krysy nahoře dostaly roztok pufru s.c. Tři krysy dole dostávaly rHU-EGF μg s.c. denně po 7 dní.

Obr. 3 je fotografie 4 krys z pokusu s topicky podaným myším EGF (viz dále). Všechny krysy dostávaly ARA-C 50 mg/kg po 7 dní. Dvě krysy nalevo dostávaly myší EGF 10 μg v DMSO denně po 7 dnů topicky natřením mezi lopatky v ploše 1 cm². Dvě krysy napravo dostaly topicky roztok pufru.

Obr. 4 je fotografie 12 krys z ARA-C-aFGF pokusu (viz dále). Šest krys v horní části dostalo roztok pufru s.c. Šest krys ve spodní části dostávalo aFGF 2 μg s.c. denně po 7 dní.

Obr. 5 je fotografie 8 krys, ošetřených kombinací chemoterapie s cytoxanem a adriamycinem. Čtyři krysy v horní části byly

-2CZ 280874 B6 navíc ošetřeny myším EGF. Čtyři krysy ve spodní části byly ošetřeny roztokem pufru.

Obr. 6 je fotografie 10 krys, ošetřených VP-16. Všechny krysy dostávaly 1,5 mg/kg VP-16 po 3 dny i.p. Pět krys v horní části dostávalo roztok pufru po čtyři dny před ošetřením. Pět krys ve spodní části dostávalo vitamin D₃ 50 μg/den po 4 dny před ošetřením.

Obr. 7 je fotografie 6 krys, ošetřených kombinační terapií Cytoxanem a adriamycinem (25 mg/kg i.p. x 1 den a 2,5 mg/kg i.p. x 3 dny). Krysy v horní části dostávaly roztok pufru po čtyři dny před ošetřením. Tři krysy ve spodní části dostávaly vitamin D₃50 μg/den po čtyři dny před ošetřením.

Obr.8 (A-C). V každém pokuse byly pět dnů staré krysy náhodně rozděleny na skupiny o stejném počtu. Pokusná skupina krys (horní skupina) dostávala 0,2 μg 1,25-dihydroxyvitaminu D₃v 0,15 ml absolutního ethanolu denně na hlavu a krk po 5 dní. Kontrolní krysy (spodní skupiny) byly podobně ošetřeny 0,15 ml absolutního ethanolu. Jeden den po posledním topickém ošetření byly krysy z obr. 8A ošetřeny cytoxanem (CTX), krysy z obr. 8B etoposidem (VP-16) a krysy z obr. 8C pomocí CTX + adriamycinu (ADM).

Obr. 9. Dvacet pět dnů staré krysy byly náhodně rozděleny na dvě skupiny vždy po 10 krysách. Pokusná skupina krys (horní skupina) dostávala 0,1 μg 1,25(OH)2D₃ v 0,1 ml absolutního ethanolu pouze na hlavu po 5 dní. Kontrolní krysy (spodní skupina) byly podobně ošetřeny 0,1 ml absolutního ethanolu. Jeden den po poslední topické aplikaci byly všechny krysy ošetřeny VP-16 režimem.

Obr. 10. Třináct 9 dní starých krys bylo náhodně rozděleno na dvě skupiny. Pokusných 7 krys (horní skupina) dostávalo 1 μg RO 23-7553 v 0,2 ml absolutního ethanolu denně topicky na krk a záda po 6 dní. Kontrolních 6 krys (spodní skupina) bylo podobně ošetřeno 0,2 ml absolutního ethanolu. Jeden den po pošledním ošetření byly všechny krysy ošetřovány VP-16 režimem.

Obr. 11 znázorňuje vliv 1,25-dihydroxyvitaminu D₃ na růst vlasů.

Předložený vynález se obecně týká způsobu prevence nebo zmenšení alopecie, zvláště u pacientů, kteří jsou podrobováni chemoterapii. Přihlašovatelé uvádějí, že růstový faktor jako EGF a vitamin D₃ se jeví jako látky, které činí vlasové folikuly odolné k toxickému účinku chemoterapeutických činidel a zabraňují tak zrátě vlasů.

V jednom provedení předloženého způsobu se růstový faktor podává pacientovi, který se podrobuje chemoterapii, v množství dostačujícím pro prevenci nebo redukci ztráty vlasů, která je běžně s takovým léčebným režimem spojena.

Růstové faktory, vhodné pro použití v předloženém způsobu, zahrnují EGF, FGF, transformační růstové faktory (TGF) a od de

-3CZ 280874 B6 stiček odvozený růstový faktor (platelet derived growth factor - PDGF). Růstové faktory mohou být získány z přírodních zdrojů (například lidské tkáně nebo tkáně hlodavců), preferována je však rekombinantní příprava, která může produkovat velká množství při relativně nízkých nákladech. Mohou rovněž být použity chemicky syntetizované faktory. Použití částí nebo derivátů růstových faktorů, jako je EGF a FGF, je také možné, pokud je možno s těmito částmi nebo deriváty dosahovat stejných výsledků, jako se samotným faktorem.

V jiném provedení předloženého vynálezu se vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní varianta (například 1,25-dihydroxy-16-en-23-in-chlolekalciferol; 1 α-hydroxyvitamin D₃, 1 a-24-dihydroxyvitamin D₃, MC 903 atd.) podává teplokrevnému živočichovi, například člověku, v množství, postačujícím pro zabránění nebo prevenci ztráty vlasů nebo stimulaci růstu vlasů. Ztráta vlasů, kterou lze léčit nebo jí zabránit použitím vitaminu D₃, může být vyvolána chemoterapií nebo jinak, například plešatostí u mužů. Příkladvy vitaminu D₃, metabolitů, vhodných pro použití v předloženém způsobu, zahrnují, ale nejsou jimi omezeny, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a 1,25-dihydroxy-16-en-23-in-cholekalciferol.

Přípravky vhodné pro použití v nárokovaném způsobu obsahují jako aktivní činidlo - růstový faktor, vitamin D₃ (nebo jeho metabolit nebo analog) nebo kombinaci obou. Tyto přípravky mohou být formulovány kombinací aktivního činidla spolu s farmaceuticky přijatelným vehikulem (nosičem, ředidlem nebo přísadou), v množství, dostačující k vyvolání preventivního účinku při podání podle vhodné zvoleného léčebného protokolu. Přípravek může být v jednotkové dávkové formě.

I když předložený způsob není omezen určitým způsobem působení, předpokládá se, že vitamin D₃ chrání vůči alopecii zvýšením receptorů pro EGF v hladině vlasových folikul. V souladu s tím lze u podání kombinace růstového faktoru a vitaminu D₃ očekávat dosažení větší ochrany.

Přípravky, vhodné pro použití ve způsobu, kterého se vynález týká, mohou být ve formě vhodné pro topické podání. Přípravek tak může mít formu roztoku, lotionu, krému, gelu nebo masti. Jestliže se přípravek podává injekčně, má výhodně formu roztoku. Použité vehikulum, bez ohledu na formu přípravku, může být inertní nebo může samo vykazovat výhodný fyziologický nebo farmaceutický účinek.

V přípravku mohou být obsažena různá aditiva. Z tohoto hlediska je v souladu i zahrnutí činidla, které stimuluje produkci pacientova růstového faktoru, do přípravku. Zahrnutí činidel, zvyšujících penetraci, do přípravků, vhodných pro topické podání, jako je DMSO nebo ethanol, je výhodné. V přípravcích mohou být rovněž obsaženy stabilizátory, prodlužující dobu životnosti, bez ohledu na způsob, jakým je přípravek formulován.

-4CZ 280874 B6

Odborníkům bude zřejmé, že je možno použít různé koncentrace růstového faktoru a/nebo vitaminu D₃. Odborník rovněž snadno stanoví optimální koncentrace.

Jak bylo uvedeno výše, způsob, kterého se vynález týká, může zahrnovat buď topickou aplikaci aktivního činidla (růstového faktoru a/nebo vitaminu D₃ nebo jeho metabolitu), nebo injekční podání. Množství aktivního činidla a frekvence podání se mohou měnit v závislosti na jednotlivém případu a mohou být odborníky snadno optimalizovány. Například může být připraven roztok 2-100 μ9/ιη1 1,25-dihydroxyvitaminu D₃ v absolutním ethanolu a aplikováno 3-5 ml tohoto roztoku přímo na kůži hlavy v různých bodech kapátkem a potom se pokožka hlavy masíruje po 3 až 5 minut pro dosažení rozdělení. Je-li užita chemoterapie, podává se toto ošetření výhodně jednou nebo dvakrát denně se započetím 5-8 dnů před počátkem chemoterapie a pokračuje se v něm po celou dobu trvání chemoterapie. Rovněž sem spadá možnost, že aktivní činidlo může být podáváno v podstatě současně s nebo po podání chemoterapeutického činidla.

Způsob, kterého se předložený vynálezu týká, je uveden v následujících příkladech jako účinný, jestliže se podává léčivo, specifické pro buněčný cyklus, ARA-C jako chemoterapeutické činidlo a jestliže se podává kombinace adriamycinu (specifický pro buněčný cyklus) a cytoxanu (nespecifický pro buněčný cyklus). Předpokládá se vsak že použití předloženého způsobu může zabránit ztrátě vlasů, ke které dojde při ošetření jinými chemoterapeutickými činidly. Dále se předpokládá, že růstový faktor a/nebo vitamin D₃ mohou být použity pro prevenci nebo zpomalení ztráty vlasů u samčí plešatosti, pokud se použijí řízeným způsobem, výhodně při první známce plešatosti, například jednou denně nebo každý další den na ohroženou plochu pokožky hlavy.

Preventivní účinek vůči alopecii, pozorovaný přihlašovateli, je zcela neočekávaný. Růstové faktory, jako je EGF, jsou považovány za stimulanty růstu buněk kůže. V souladu s tím by se u těchto činidel očekávalo, že indukují vstup vlasové folikuly do buněčného cyklu a činí tak folikulu citlivější k chemickým činidlům, zejména léčivům, specifickým pro buněčný cyklus, jako je ARA-C. Podání růstových faktorů pacientům, kteří jsou pod chemoterapií, by tedy spíše bylo pokládáno za zhoršující ztrátu vlasů. Nicméně bylo dosaženo opačného účinku. Tato pozororováni, která byla zaznamenána s EGF a FGF, jsou nová a v literatuře nebyla ani naznačena ani uvedena. Podobně není zmínek o tom, že by úloha vitaminu D₃ v těle mohla poskytnout takovou vynikající ochranu vůči plešatosti, indukované chemoterapeuticky nebo jinak.

Následující neomezující příklady popisují detailněji některé aspekty vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující experimentální detaily se týkají dále uvedených příkladů I až IV.

Krysy Sprague Dawley byly zakoupeny od Charles River Labora

-5CZ 280874 B6 tories, Wilmington, MA. Cytosar-U (ARA-C) byl od Upjoh Company, Kalamazoo, MI. EGF receptorové nečistoty z myších submaxillárních žláz, lidský rekombinantní EGF, dimethylsulfoxid (DMSO) a vitamin Dg byly získány od Sigma Chemical Co., St.Louis, MO. aFGF byl získán od AMGEN Corp., Thousand Oaks, CA.

Všechny krysy z každého pokusu byly ošetřeny pomocí ARA-C 50 mg/kg intraperitoneálně (i.p.) denně po 7 dní. Pro subkutánní (s.c.) injekce byly připraveny EGF a FGF v PBS 1 % BSA. Alopecie byla vždy zaznamenávána ve 12 dni pokusu a hodnocena, jak bylo uvedeno dříve (Hussein a spol., Science, 249:1564-1566, 1990; Jimenez a spol., FASEB J., 1991).

Pro topické ošetření byl myší EGF připraven následovně: Jedna lahvička EGF (100 μg) byla rozpuštěna v 0,2 ml PBS 1 % BSA a 0,12 ml tohoto roztoku bylo přidáno k 0,48 DMSO. Tři hodiny před ARA-C injekcí bylo 0,1 ml EGF-DMSO směsi aplikováno na každou krysu na 1 cm² plochy mezi lopatkami za použití gumového aplikátoru. Krysy byly pak udržovány odděleně po dobu tři hodin, potom byla ošetřená plocha pečlivě omyta mýdlem a vodou a sušena. Ošetření bylo prováděno po 7 dní. Kontrolní zvířata byla podobně ošetřena za použití DMSO bez EGF.

Přiklad I

Ochranný vliv EGF

Pro test schopnosti myšího EGF chránit před ARA-C vyvolanou alopecií byly provedeny dva oddělené pokusy. V pokusu I bylo dvacetdva sedm dní starých krys náhodně rozděleno do dvou skupin po jedenácti krysách. Navíc k ARA-C, skupina I dostala 2 μg myšího EGF s.c. na zádech mezi dvě zadní nohy 3 hodiny před ARA-C injekcemi denně po 7 dní. Skupina II dostala podobně roztok pufru a slouží jako kontrola. Deset z jedenácti krys ve skupinách II mělo prakticky vyvinutou celkovou alopecii těla a jedna krysa ztratila více než 50 % chlupů. Naopak, ve skupině I nemělo 5 krys žádnou detegovatelnou ztrátu chlupů a 6 krys mělo mírnou ztrátu chlupů (tabulka I, pokus I (obr. 1)). V pokusu II bylo dvanáct 7 dní starých krys náhodné rozděleno na dvě skupiny vždy po 6 krysách. Navíc k ARA-C, skupina I dostala myší EGF 1 μg s.c. denně po 7 dní. Skupina II dostala pufr s.c. Všech 6 krys ve skupině II mělo vyvinutou středně těžkou až těžkou alopecii, zatímco ve skupině I neměla jedna krysa žádnou detegovatelnou ztrátu chlupů a 5 krys vykazovalo jen minimální ztrátu chlupů (tabulka I, pokus II) .

V dalším pokuse byl použit rHU-EGF. Dvanáct 7 dní starých krys bylo náhodně rozděleno do dvou skupin po 6 krysách. Navíc k ARA-C, skupina I dostávala rHu-EGF 2 μg s.c. do boku denně po 7 dni. Skupina II dostávala pufr s.c. Všech 6 krys ve skupině II mělo vyvinutou úplnou alopecii celého těla, zatímco ve skupině I neměla žádná z krys celkovou tělesnou alopecii, jedna krysa neměla žádnou detegovatelnou ztrátu chlupů, čtyři krysy měly mírnou alopecii a jedna krysa střední alopecii (tabulka I, pokus III, (obrázek 2)).

-6CZ 280874 B6

Tabulka I

Vznik alopecie u krys, ošetřených Vliv myšího EGF a rHU-EGF.	pomocí	ARA-C.
			alopecie^x
		0	1+	2+	3+
			pokus	I
ARA-C		0	0	1	10
ARA-C	+ myší EFG 2 μg	5	6	0	0
			pokus	II
ARA-C		0	0	3	3
ARA-C	+ myší EGF 1 μg	1	5	0	0
			pokus	III
ARA-C		0	0	0	6
ARA-C	+ rHU-EGF 2 μg	1	4	1	0

Pro všechny pokusy byly použity sedm dní staré krysy. Všechny dostávaly ARA-C 50 mg/kg x 7 dní i.p. v 0,1 ml. Myší EGF a rHU-EGF v PBS 1 % BSA byly podány 3 hodiny před ARA-C jednou denně v 0,1 ml s.c. x 7 dní. Kontroly dostaly PBS 1 % BSA 0,1 ml s.c. x 7 dní. Hodnoty byly zaznamenány 12 den.

nedetegovatelná alopecie,

1+ mírná alopecie, definovaná jako ztráta méně než 50 % chlupů, 2+ středně těžká alopecie se ztrátou více než 50 % chlupů, 3+ úplná nebo téměř úplná (90 %) ztráta chlupů.

V dalším pokuse bylo dvanáct 7 dní starých krys náhodně rozděleno do dvou skupin po šesti krysách. Skupina I dostávala navíc k ARA-C myší-EGF 10 μg v DMSO denně po 7 dní topicky potřením bavlněným smotkem mezi ramenní lopatky na plochu 1 cm². Skupina II dostávala topicky kontrolní roztok. Ve skupině II se u všech šesti krys vyvinula alopecie celého těla. Ve skupině I se vyvinula u všech krys alopecie celého těla s výjimkou místa, kde byl topicky aplikován EGF (obr. 3).

Příklad II

Ochranný vliv aFGF

Čtrnáct sedm dní starých krys bylo náhodně rozděleno do dvou skupin. Všechny krysy dostávaly ARA-C 50 mg/kg/den po sedm dní. Dále skupina I dostávala aFGF 2 μg s.c. na temeno hlavy po sedm dní. Skupina II dostávala injekce pufru a slouží jako kontrola. Alopecie byla zaznamenána 12. den pokusu. Všechny krysy ve skupině II měly vyvinutou alopecii celého těla. Naopak, všechny krysy ve skupině I byly lokálně chráněny na místě injekce (obr. 4).

Příklad III

Ochrana před alopecii, indukovanou cytoxanem/adriamycinem

-7CZ 280874 B6

Osm čtyři dny starých krys Sprague Dawley bylo náhodně rozděleno do dvou skupin po 4 krysách. Skupina I dostávala EGF 2 μg s.c. na hlavu denně po 7 dní. Skupina II dostávala injekce pufru a sloužila jako kontrola. Jeden den po ukončení EGF injekcí nebo injekcí pufru dostaly všechny krysy cytoxan 25 mg/kg i.p. po 1 den a adriamycin 2,5 mg/kg i.p. po 3 dny. Ve skupině II měly všechny krysy 3+ alopecii na hlavě a ploše zad. Naopak ve skupině I měla jedna krysa mírnou alopecii, jedna krysa minimální alopecii a dvě krysy nedetegovatelnou alopecii na hlavě a zádech (obr. 5).

Přiklad IV

Ochranný vliv vitaminu D₃

Dvanáct 7 dnů starých krys bylo náhodně rozděleno do dvou skupin. Skupina I byla denně ošetřována pufrem 0,1 ml s.c. po čtyři dny. Druhá skupina byla denně ošetřována vitaminem D₃, 50 μg s.c. na hlavu po čtyři dny. Po ukončení ošetřování pufrem nebo vitaminem D₃ dostávaly všechny krysy 1,5 mg/kg i.p. VP-16 (etoposid) denně po tři dny. Všechny krysy ve skupině I měly vyvinutou alopecii celého těla, zatímco krysy ve skupině II byly chráněny (obr. 6 představuje 4 krysy z každé skupiny).

V j iných pokusech byly krysy předem ošetřeny vitaminem D₃a toto ošetření vykazovalo vynikající ochranu vůči alopecii, způsobené etoposidem, cytoxanem, cytarabinem a kombinací cytoxanu a adriamycinu (obr. 7). Výsledky jsou shrnuty v tabulce II dále.

Tabulka II

Ochrana před alopecii, indukovanou chemoterapií, předchozím ošetřením vitaminem D₃

Testované léčivo působící alopecii	celkový počet pokusů	celkový počet zvířat	ochrana alopecii
etoposid (VP-16)	2	22	ano^x
cytoxan (CTX)	7	89	ano*
cytarabin(ARA-C)	1	8	ano^x
adriamycin+CTX	6	77	ano^x

kombinace

Chemoterapeutická činidla byla podávána následovně: VP-16 1,5 mg/kg i.p. denně po 3 dny, cytoxan 32,5 mg/kg jako jediná injekce, ARA-C 50 mg/kg i.p. denně po 7 dní, kombinace (adriamycin 2,5 mg/kg i.p. denně po 3 dny plus cytoxan 25 mg/kg jako jedna ijekce). Vitamin D₃ byl podáván v 50 μg denních dávkách i.p. nebo s.c. 4 dny před chemoterapií.

^XV těchto pokusech byla ochrana před alopecii indukovanou chemoterapií pozorována jednotně u všech zvířat, ošetřených vitaminem

-8CZ 280874 B6

V jiných pokusech byl 1,25-dihydroxyvitamin D₃ aplikován topicky (0,5 μ9 denně) v 50% ethanolu nebo DMSO a rovněž došlo k ochraně krys před alopecií, indukovanou VP-16.

Příklad V

Ochranný vliv předchozího ošetření pomocí vitaminu D₃

Topická aplikace 1,25-dihydroxyvitaminu D₃:

1,25-Dihydroxyvitamin D₃ byl rozpuštěn v absolutním ethanolu a aplikován topicky aplikátorem. Kontrolní zvířata byla podobně ošetřena stejným množstvím ethanolu. Zvířata pak byla udržována odděleně po tři hodiny a pak byla ošetřená plocha pečlivě omyta mýdlem a vodou a usušena. Ošetření bylo prováděno denně, počínaje 5. dnem po narození a konče desátým dnem.

Chemoterapie:

Všechny chemoterapie byly poskytovány i.p. a započaty v jedenáctém dni stáří. CTX, 35 mg/kg, byl podáván pouze jeden den. VP-16, 1,5 mg/kg byl podáván po tři dny. Při kombinaci CTX a ADM byl CTX podáván jeden den v dávce 25 mg/kg a ADM tři dny v dávce 2,5 mg/kg. V těchto dávkách ani CTX ani ADM samotný nevyvolává alopecii. Alopecie byla zaznamenána desátý den od počátku terapie.

Byly provedeny celkem 4 pokusy. V prvním pokuse byla hodnocena ochrana před alopecií, indukovanou cytoxanem. Pokusná skupina byla předem ošetřena 0,2 μg 1,25-dihydroxyvitaminu D₃v 0,15 ml absolutního ethanolu, aplikovaného topicky na hlavu a krk, a kontrolní skupina dostávala 0,15 ml alkoholu. U všech 10 krys v kontrolní skupině se vyvinula úplná alopecie. Naopak, všechny zvířata v pokusné skupině byla chráněna (obr. 8A). Druhý pokus byl proveden za podobných podmínek na zkoušku ochrany před VP-16 indukovanou alopecií. U všech 10 krys v kontrolní skupině se vyvinula alopecie celého těla. Naopak všechny krysy v experimentální skupině byly chráněny (obr. 8B). Třetí pokus byl označen jako zkouška ochrany před alopecií, indukovanou kombinací cytoxan-adriamycin. V každé skupině bylo 11 krys. Šest krys v kontrolní skupině mělo vyvinutou alopecii na hlavě a krku a 5 krys vyvinutou alopecii celého těla. Naopak všechny krysy v pokusné skupině byly chráněny (obr. 8C). Ve čtvrtém pokusu byla podobně zkoušena ochrana před VP-16 indukovanou alopecií s tím rozdílem, že dávka 1,25-dihydroxyvitaminu D₃ byla snížena na 0,1 μυ v 0,1 ml absolutního ethanolu, aplikovaného topicky pouze na povrch hlavy. Všech 10 krys v kontrolní skupině mělo vyvinutou úplnou alopecii. Naopak všechny krysy v experimentální skupině byly chráněny zejména na místě aplikace 1,25-dihydroxyvitaminu D₃(obr. 9).

Je pozoruhodné, že ochrana, vyvolaná 0,2 μg 1,25-dihydroxyvitaminu D₃, nebyla omezena na místo aplikace, ale zahrnula celé tělo, což potvrzuje systemickou absorpci. Jestliže dávka byla snížena na 0,1 μg, aplikovaný pouze na povrch hlavy, byla ochrana

-9CZ 280874 B6 před VP-16 indukovanou alopecií méně obecná a více omezena na místo aplikace.

Příklad VI

Ochrana před VP-16 vyvolanou alopecií topickou aplikací RO 23-7553

RO 23-7553 (1,25-dihydroxy-16-en-23-in-cholekalciferol) byl rozpuštěn v absolutním ethanolu a aplikován topicky pomocí aplikátoru. Kontrolní zvířata byla stejným způsobem ošetřena stejným množstvím ethanolu. Zvířata byla pak udržována odděleně po dobu tří hodin, potom byla ošetřená plocha pečlivé omyta mýdlem a vodou a sušena. Ošetření bylo prováděno denně, počínaje devátým dnem od narození a ukončeno čtrnáctý den.

Patnáctý den dostala všechna zvířata VP-16, 1,5 mg/kg i.p. po 3 dny. Alopecie byla zaznamenávána dvacátý pátý den.

Třináct krys bylo náhodně rozděleno do dvou skupin. Pokusná skupina 7 krys, kontrolní skupina 6 krys. Pokusná skupina byla předem ošetřena 1 μg RO 23-7553 v 0,2 ml absolutního ethanolu, aplikovaného topicky na krk a záda, a kontrolní skupina dostala 0,2 ml ethanolu. Všech šest krys v kontrolní skupině mělo vyvinutou úplnou alopecií na krku a zádech. Naopak všechna zvířata v pokusné skupině byla chráněna (obr. 10). Je nutno uvést, že jestliže se začne s chemoterapií ve stáří 14 dnů, není plocha hlavy zcela bez ochlupení.

Příklad VII

Stimulace růstu vlasů vitaminem D₃

Během provádění výše popsaných studií ochrany před alopecií, vyvolanou chemoterapií, pomocí vitaminu D₃ a jeho aktivního analogu, 1,25-dihydroxyvitaminu D₃, je nutno uvést, že krysy ošetřené 1,25-dihydroxyvitaminem D₃, nejsou pouze chráněny před chemoterapií vyvolanou alopecií, ale tyto krysy měly lepší pokrytí srsti a delší srst na ošetřené ploše. Tato zjištění vyvolala další pokusy stimulace růstu vlasů 1,25-dihydroxyvitaminem D₃.

Hřbety devatenácti 25 dnů starých krys Sprague Dawley byly oholeny a krysy byly náhodně rozděleny do dvou skupin.

Skupina I (kontrolní ksysy 10) dostávala 0,1 ml ethanolu, aplikovaného topicky jednou denně na oholenou plochu po 14 dní.

Skupina II (kalcitriol 9 krys) dostávala 50 mg 1,25-dihydroxyvitaminu D₃ v 0,1 ml ethanolu, aplikovaného topicky jednou denně na oholenou plochu po 14 dní.

Růst srsti byl hodnocen znovu oholením plochy 6 cm x 6 cm a zvážením. Rozdíly mezi těmito dvěma skupinami byly vysoce statisticky významné. P. hodnota 0,003 (viz tabulka III a obr. 11).

-10CZ 280874 B6

Tabulka III

Stimulace růstu

srsti u krys kalcitriolem
Hmotnost	srsti v mg
kontrola	kalcitriol
98	202
131	143
72	150
84	253
102	130
144	177
115	140
129	147
125	135
130
průměr s.e.m	průměr s.e.m.
113 ± 8	164 ± 13

Vzhledem k uvedeným údajům, ukazujícím stimulaci růstu srsti pomocí 1,23-dihydroxyvitaminu D₃, podávaného kryse topicky, se předpokládá, že 1,25-dihydroxyvitamin D₃ může být použit jako stimulant růstu srsti v případech alopecie jakéhokoliv původu. Dále tyto údaje potvrzují, že vitamin D₃ a jeho metabolity je/jsou nezbytné pro optimální růst vlasů a mohou být použity pro zabráněni ztrátě vlasů jakéhokoliv původu, včetně mužské plešatosti .

Příklad VIII

Přípravky

Dále jsou uvedeny čtyři přípravky, které obsahují 1,25-dihydrovitamin D₃ jako aktivní složku a způsoby jejich výroby.

1. Topický roztok % (hmotn./hmotn.)

Složky

1,25-dihydroxyvitamin D₃propylenglykol propylenglykol dikaprylát/dikaprát³butylátový hydroxytoluen (BHT) butylátovaný hydroxyanisol (BHA) ethylenalkohol, absolutní q.s. do

0,0002-0,10 10,00 30,00 0,05 0,05 100,00

^aMůže být nahrazen následujícími materiály: (1) triglyceridy o středním řetězci, 2) dimethylisosorbitem, 3) polyethylenglykoly, 4) ethoxydiglykolem.

-11CZ 280874 B6

Způsob přípravy

i. Naváží se se příslušné množství propylenglykoldikaprylátu/dikaprátu, ethylalkoholu, propylenglykolu do zásobníku z nerezové oceli.

ii. Rozpustí se BHT a BHA v roztoku iii. Přidá se 1,25-dihydroxyvitamin a míchá se do rozpuštění.

2. Pufrovaný topický roztok

Složka

1,25-dihydroxyvitamin D₃propylenglykol hydroxypropylcelulóza (Klucel MF) methylparaben butylátovaný hydroxytoluen (BHT) butylátovaný hydroxyanisol (BHA) hydrogenfosforečnan sodný dihydrogenfosforečnan sodný hydroxid sodný (q.s. na pH=7) ethylalkohol, 95% voda c.s. do

Způsob přípravy ze stupně i).

D₃ do směsi ze stupně ii) % hmotn./hmotn.

0,0002-0,10

50,00

0,50

0,20

0,05

0,43

0,70

0,04

30,00

100,00

i. Rozpustí se hydrogenfosforečnan sodný, dihydrogenfosforečnan sodný a hydroxid sodný ve vodě v zásobníku z nerezové oceli. Změří se pH roztoku. pH roztoku by mělo být 7,0, pokud není, upraví se pH.

ii. K roztoku ze stupně i) se přidá propylenglykol a ethylalkohol.

iii. Rozpustí se 1,25-dihydroxyvitamin D₃, methylparaben, BHT a BHA v roztoku ze stupně ii).

iv. V roztoku ze stupně iii) se rozpustí Klucel MF.

3. Olejem ve vodě pufrovaný topický lotion

Složky % hmotn./hmotn.

1,25-dihydroxyvitamin D₃cetylalkohol stearylalkohol sorbitanmonostearát glycerylmonostearát a polyoxyethylenstearát-směs (Arlacel 165)

Polysorbate 60 minerální olej propylenglykol butylátovaný hydroxyanisol propylparaben

0,0002-0,10

0,25

0,50

2,00

4,00

1,00

4,00

5,00

0,05

-12CZ 280874 B6 pufrovací činidlo q.s. na pH roztok sorbitolu edetát disodný methylparaben voda c.s. do

7,00

2,00

0,10

0,18 100,00

Způsob přípravy

i. Připraví se pufrovací roztok (pH 7,0) v zásobníku z nerezové oceli.

ii. V zásobníku z nerezové oceli se společně roztaví při 70 ^aC cetylalkohol, stearylalkohol, sorbitanmonostearát, Arlacel 165, Polysorbate 60, minerální olej, butylátovaný hydroxyanisol, propylparaben a 50% propylenglykol.

iv.

K roztoku ze stupně iii se přidá raben.

edetát disodný a methylpav.

D₃ v přibližně 40% propymateriálu ze stupně ii)

Rozpustí se 1,25-dihydroxyvitamin lenglykolu v kádince a přidá se k míchání. Zásobník se vymyje 10 % propylenglykolu a roztok přidá ke směsi ze stupně ii).

za se ví.

Stupeň v) se přidá ke stupni ’C, a homogenizuje se. Emulze tu.

iv, obě fáze jsou zahřátý na se ochladí na 200 m teplo4. Topický gel

Složky % hmotn./hmotn.

1,25-dihydroxyvitamin D₃butylátovaný hydroxytoluen butylátovaný hydroxyanisol hydroxypropylcelulóza ethylalkohol, 95% voda c.s. do (BHT) (BHA)

0,002 až 0,10

0,05

3,00

50,00

100,00

Způsob přípravy

Naváží se ethylalkohol a voda do zásobníku z nerezové oceli.

ii.

Rozpustí se stupně i.

1,25-dihydroxyvitamin

D₃, BHT a BHA v roztoku ze iii. Rozpustí se hydroxypropylcelulóza v roztoku ze stupně ii.

Reference v celém popise jsou zde uvedeny j ako odkazy.

Předložený vynález byl popsán a pochopení a odborníkovi bude zřejmé, změny bez vybočení z rozsahu vynálezu.

detailněj i že je možno pro zřejmost provést různé

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Přípravek zabraňující vypadávání vlasů, vyznačuj ící se tím, že obsahuje vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog, v množství, dostačujícím pro dosažení stimulace růstu vlasů nebo prevence, nebo redukce chemoterapií indukované alopecie.
2. Přípravek podle nároku 1, pro prevenci nebo redukci chemoterapií indukované alopecie, vyznačující se tím, že obsahuje vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog, v množství, dostačujícím pro dosažení uvedené prevence nebo redukce.
3. Přípravek podle nároku 1, pro stimulaci růstu vlasů, vyznačující se tím, že obsahuje vitamin D₃ nebo jeho analog, derivát nebo strukturní analog, v množství, dostačujícím pro dosažení uvedené stimulace.
4. Přípravek podle nároků laž 3, vyznačující se tím, že obsahuje 1,25-dihydroxyvitamin D₃ nebo 1,25-dihydroxy-16-en-23-in-cholkalciferol.