SK21295A3 - Pharmaceutical composition for hiv-infection treatment - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka farmaceutického prostriedku na liečenie HlV infekcie, spôsobu jeho prípravy a jeho použitia. Podrobnejšie Ba tento vynález týka spôsobu inhibovania replikácie HIV v bunkách typu monocyt/makrofág, pri ktorom sa používa interleukín-4.

Ľfot eraJ st ay-tecimi to

Vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV) bol pôvodne identifikovaný ako etiologické činidlo získaného syndrómu imunitnej nedostatočnosti (AIDS) v roku 1983. 0 funkcii a Štruktúre tohto vírusu je dnes známe veľa. Bolo tiež zistené, že HIV je nesený T pomocnými lýmfocytmi a bunkami monocytových/makrofágových línií (Ho a kol.: New. Engl. J. Med.321 (24). 1621 (1989)). Priemerný interval medzi infikovaním HIV a nástupom AIDS je približne 8 až 11 rokov (Lifson a kol.: J. Infec. Dis. 158. 1360 /1980/). Táto dlhá inkubačná doba poukazuje na to, že replikácia HIV je čiastočne chránená faktormi hostiteľa.

V patogenézii AIDS-u významnú úlohu majú jednojadrové fagocyty. Tieto bunky sú medzi prvými, ktoré bú infikované HIV. Sú tiež hlavnými zásobníkmi vírusu v centrálnom nervovom systéme. Pľúcach a lymfatických uzlinách, potenciálnymi vektormi Šírenia vírusu do rôznych tkanív infikovaného pacienta a medzi jednotlivcami a hlavnými regulačnými bunkami, ktoré regulujú priebeh a intenzitu postupu ochorenia (Gendelman a kol.: AIDS 2« 475 /1989/). Hostiteľské faktory, ako je interferón (IFN), ktoré ovplyvňujú vírusovú replikáciu v jednojadrovom fagocyte, sú pravdepodobne hlavnými prvkami pri riadení obmedzeného rastu vírusu a oneskorení ochorenia HIV.

Skutočnosť, že makrofágy sú hlavným zásobníkom vírusu v centrálnom nervovom systéme, pľúcach a lymfatických uzlinách poukazuje na to, že liečenie, ktoré inhibuje vírusovú replikáciu v týchto príslušných bunkách, môže dopad na potiaže vírusu a postup ochorenia mať hlavný

CGendelman a spol.: J.Immunol. 145 2669 (1990).].

Interleukin-4 (IL-4) je objasňujú veľa vlastností rady lýmfokin, ktorého vlastnosti lymfokinov indukovaným imunitným rozpoznávaním CPaul: Blood 77 (9). 1859 (1991).].

IL-4 je zodpovedný najmä za produkciu IgE v myšiach, ako odpovedi na rôzne dráždivé činidlá, -ktoré vykazujú zapnutie Ig triedy na expresiu tejto Ig triedy CFinkelman a spol.: Ann. Rev. Immunol. g, 303 (1990).]. 11-4 bol pôvodne popísaný na základe svojej schopnosti zvyšovať DNA syntézu vyčistenými odpočívajúcimi myšacími B lymfocytmi, stimulovanými antiIgM protilátkami CHoward a spol.: J. Exp. Immunol. 155, 914 (1982).].

Bolo tiež ukázané, že IL-4 pôsobí na odpočívajúce B bunky pri indukovaní expresie MHC molekúl triedy II [Noelle a spol. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 6149 (1984).] a pri zvyšovaní nasledujúcej odpovedi týchto buniek na antiIgM protilátky CRabin a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2935 (1985); Oliver a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2465 (1985).].

Ľudský IL-4 je glykoproteŕn, ktorý existuje vo for— mách s molekulovými hmotnosťami medzi 15 000 a 19 000. Boli získané cDNA, kódujúce ako myšací, tak aj ľudský IL-4 CLee a spol.: viď hore; Noma a spol.: viď hore; Yokota a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83. 5894 (1986).].

IL-4 má silné účinky na T lymfocyty aj na B bunky. Odpočívajúce T bunky, na ktoré bolo pôsobené IL-4, prežívajú v kultúre bez delenia CHu-Li a spol.: J. Exp. Med. 165. 157 (1987).]. 11-4 pôsobí tiež rôznymi spôsobmi na ne-lymfatické hematopoézne bunky. Bolo zistené, že inhibuje rast makro* fágov CMcInnes a spol.: J. Exp. Med. 167, 598 (1988); Jansen a spol.: J. Exp. Med. 170. 577 (1989).] a zvyšuje ich cytotoxickú aktivitu na niektoré nádorové bunky CCrawford a pol.: J. Immunol. 139. 135 (1987),].

Dosiaľ známe spôsoby liečenia HIV infekcie, ktoré používajú AZT, ddl a ddC, nie sú veľmi účinné. Preto sú potrebné lepšie spôsoby na liečenie HIV infekcie.

Podstata vynálezu

Uvedený vynález spľňa túto potrebu, lebo poskytuje účinnejší spôsob liečenia. Poskytuje liečenie HIV infekcie tak, že pacientovi, ktorý je infikovaný HIV, sa podáva terapeuticky efektívne množstvo IL-4.

Vynález možno lepšie pochopiť odkazom na pripojený obrázok 1, ktorý je grafickým znázornením inhibície replikácie HIV v monocytoch účinkom rôznych dávok IL-4.

Všetky citácie sú uvedené ako odkazy.

Vynález sa týka liečenia HIV infekcie a všetkých stavov, pochádzajúcich od tejto infekcie, ako je AIDS. Stavy, ktoré môžu byť liečené spôsobmi podľa tohoto vynálezu, sú definované tak, že zahrňujú stavy a úrovne choroby, ktoré sa prejavujú nasledovnými kritériami: (1) séropozitivi ta na vírus HIV (a/alebo HIV protilátky) alebo prítomnosť intracelulárnych vírusových častíc, ktoré môžu byť identifikované mikroskopickým vyhodnotením izolátmi leukocytových buniek, (2) chronická lymfodenopatia, ako je bežne chápaná odborníkmi, (3) počet T-pomocných buniek v krvi menší ako 400/mm^, (4) preukázateľná čiastočná porucha pri oneskorenej hypersenzitívnej odpovedi a (5) úplné zlyhanie odpovede pri teste oneskorenej hypersenzitivi ty kože a/alebo výskyt sooru.

pacientoch, ktorí spľňajú horeuvedené kritériá, sa hovorí ako o pacientoch s pokročilou AIDS klasifikáciou vtedy, ak okrem horeuvedeného sú citliví na príležitostné infekcie, ako je kryptokoková meningitída, histopíazmúza, tuberkulóza, toxoplazmóza alebo PCP (zápal pľúc Pneumocystis carinii) [Redfield a spol.: HIV infekcia: klinický obraz, The Science of AIDS, viď hore, str. 63 až 73.1.

Horeuvedené príznaky sú ilustráciou špecifických vybraných kritérií, ktoré sa používajú pri stanovení kandidátov pre navrhnutý spôsob liečenia. Účinnosť liečenia môže byť vyhodnocovaná sledovaním zmenšenia uvedených príznakov ochorenia. Inhibícia vírusovej replikácie môže byť sledovaná meraním hladín reverznej transkriptázy v supernatantoch izolátov infikovaných buniek, ktoré sú predpoveďou postupu ochorenia. Je dobre známe, že akútna fáza infekcie sa prejavuje vysokými titrami vírusových častíc v sére CCoombs a spol. : New Engl. J. Med. 321 (24), 1626 (1989).].

Pojem HIV tak, ako sa používa v tomto vynáleze, znamená ako HIV-1, tak HIV-2.

Ako je uvedené, spôsoby podľa tohoto vynálezu inhibujú replikáciu HIV v bunkách typu monocyt/makrofág, Môžu však byť účinné na vírusové replikácie v iných typoch buniek. Môžu byť účinné tiež na imunitný systém alebo na iné systémy. Porozumenie presnému mechanizmu (presným mechanizmom), ktorým (ktorými) môže IL-4 pôsobiť, nie je pre tento vynález podstatné.

IL-4 je komerčne dostupný z rôznych zdrojov, ako je Genzyme Corporation, Cambridge, Ma., alebo sa môže pripraviť známymi spôsobmi, s použitím prírodných zdrojov alebo technológií rekombinácie DNA CSheehan a spol.: Immunol. 142, 884 (1989) a Starneš a spol.: J. Immunol. 145. 4185 (1990).].

Pre identifikovanie DNA kódujúcu IL-4 v génomových, alebo cDNA knihovniach pripravených štandardnými spôsobmi, môžu sa použiť tiež zmesi oligonukleotidovýc’h sond, ktoré sú založené na známych IL-4 nukleotidových sekvenciách. Takto identifikované DNA sa môžu vyštipnúť z knihovne štiepením reštrikčnou endonukleázou alebo sa môžu pripraviť pomocou príslušných primerov a spôsobom polymérazovej reťazovej reakcie (PCR) CSaiki a spol.: Science 239. 487 (1988).1, môžu byť sekvenované a exprimované v eukaryotickom expresnom , systéme alebo (po delecii intrónu štandardnými spôsobmi, ak je to potrebné) v prokaryotickom alebo eukaryotickom expresnom systéme. Ako cDNA, tak aj génomové DNA knihovne môžu byť analyzované aplikáciou štandardných spôsobov klonovania, namiesto použitia oligonukleotidových sond alebo PCR. Takto vyrobený IL-4 sa potom deteguje známymi spôsobmi, ako sú imunochemické spôsoby alebo bioanalýzy.

Ako IL-4, sa výhodne používa ľudský rekombinantný IL-

4. Výhodné je tiež používanie glykosylovaného IL-4 (napr. rekombinantného IL-4 produkovaného v eukaryotickom expresnom systéme).

V niektorých uskutočneniach podľa vynálezu, sa IL-4 podáva v kombinácii s jedným alebo viacerými činidlami, □ ktorých je známe, že sú účinné proti HIV, ako je 3’-azido2’, 3’-dideoxytymidín (AZT), 2’, 3’-dideoxycytidín (ddc) alebo 2', 3’-dideoxyinozín (ddl).

Farmaceutické prostriedky pre použitie podľa vynálezu sa môžu dodávať v lyofilizovanej -forme a potom sa môžu pripravovať pre použitie bezprostredne pred použitím vo farmaceutický prijateľnom nosičovi, ako je fosforečnanom puferovaný solný roztok alebo akékoľvek iné, dobre známe nosiče. Farmaceutické prostriedky podľa tohoto vynálezu sa môžu podávať injekčné, priamo do krvného obehu intravenózne alebo intravenóznym (i.v.) tekutým roztokom, ako je Ringerov laktát. Medzi parenterálne prostriedky, ktoré sa môžu používať, patria sterilné roztoky alebo suspenzie. Tieto prípravky sa môžu pripravovať s konvenčnými farmaceutický prijateľnými riedidlami a prísadami, ako sú stabilizátory a nosiče. Roztoky, ktoré sa podávajú, môžu sa pripravovať pre použitie z lyofylizovaných tabletiek, ktoré môžu obsahovať tiež napr.

ochranné činidlá, pufery a dispergačné činidlá. Tieto prípravky sa výhodne podávajú intravenóznou injekciou.

Podľa tohoto vynálezu sa pacientom, ktorí potrebujú liečenie HIV infekcie, podáva efektívne množstvo IL-4, aby sa dosiahlo horeuvedených výsledkov. Môže sa podávať denná dávka 0,001 pgna kg telesnej hmotnosti až 50 pg/kg telesnej hmotnosti. Výhodnejšia denná dávka je v rozpätí od 0,01 pg/ kg telesnej hmotnosti do 10 pg/kg telesnej hmotnosti. Najvýhodnejšia denná dávka je v rozpätí od 0,05 pg/kg telesnej hmotnosti do 2 pg/kg telesnej hmotnosti. Presné množstvo IL4, ktoré sa podáva, bude stanovené ošetrujúcim lekárom, ktorý vezme do úvahy etiologiu a priebeh choroby, stav pacienta, vek a ďalšie faktory.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tento vynález je ilustrovaný nasledovnými, neobmedzenými príkladmi.

Spôsoby a materiály

Monocyty boli izolované z periférnych krvných jednojadrových buniek (PBMC) darcov séronegatívnych na HIV a hepatitídu B po leukaperezii a vyčistené protiprúdovou odstredivou elutriaciou jednojadrových frakcií krvných buniek, bohatých na leukocyty. Bunkové suspenzie obsahovali viac, ako 98 monocytDV, podľa kritéria bunkovej morfológie na Wrightom zafarbených cytonáteroch granulárnou peroxidázou a nešpecifickou esterázou. Monocyty boli kultivované ako adheretné bunkové monovrstvy (7,5.10”⁵/24 mm bunkového tkaniva na jamku) v 0,5 ml DMEM (označenie 78-176AJ, Gibco, Br and Island, NY) doplnenom 10 7. teplom deakti vovaného A+ ľudského séra, 50 pg/ml gentamicínu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a 1000 Jednotiek (j.) na ml rekombinantného ľudského stimulačného faktora makrofágovej kolónie (M-CSF) (Cetus Corp., Emeryville, Ka.). PBMC, izolované z úplnej krvi odstreďovaním hustotným gradientom Ficol1-diatrizoátu (Phai— macia LKB, Piscataway, NJ., sa kultivujú na 1.10⁶ živých buniek/ml v médiu RPMI 1640 (Gibco) s 5 pg/ml fytohemaglutinínu (PHA) (Sigma), 10 Z hmotnostných vyčisteného ľudského IL-2 (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, Md.) a 15 Z hmotnostných teplom deaktivovaného plodového teľacieho séra (FCS) (Sterile Systems, Logan, Ut.).

Monocyty, na ktoré bolo pôsobené PHA/IL-2, boli vysstavené násobnej infekcii 0,01 ID^q tkanivovej kultúry cieľovou bunkou štyroch klinických kmeňov Hl V (GG, YU-2, SI*! a ADA), pôvodne izolovaných a pasážovaných v monocytoch (AIDS Research and Reference Reagent Program, AIDS Program, NAID, NIH). Monocyty, na ktoré bolo pôsobené M-CSF, boli kultivované ako adheretné monovrstvy 7 až 10 dni pred použitím, ako cieľové bunky. Všetky kultúry dostávali čerstvé médium každé 2 až 3 dni.

Pre stanovenie aktivity reverznej transkriptázy (RT) sa repli kované vzorky supernatantu kultivačnej kvapaliny pridajú k reakčnej zmesi NONIDET P-40^ťR) (Sigma), poly (rA) oligo (dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ.), ditiotreitolu (Pharmacia), MgC12 a Cec-^PJdTTP (400 Ci/mmol, Amersham Corp. , Arlington Heights, II.) na 24 hodín pri 37° C. Táto zmes sa nanesie na chromatografický papier, vysuší sa na vzduchu a premyje sa päťkrát v 0,3M NaCl s 0,03M citránom sodným (pH 7,4) a dvakrát v 95 Z (hmôt.) etanole. Papier sa vysuší a nastrihá a rádioaktivita sa odmeria kvapalinovou scintilačou spektroskopiou. Ako pozitívne kontroly pre RT aktivitu slúži HTLVIIIB.

Neinfikované alebo HIV infikované PBMC sa nechajú rásť na plastických substrátoch v prítomnosti IL-4 alebo bez IL-4. Prítomnosť HIV infekcie v kultúrach sa stanoví testonaním buniek na HIV asociovaný s plazmovou membránou a intravakuolárnu HIV. RT aktivita sa meria tiež ako je hore po- 8 písané v podieloch kvapaliny supernatantu kultúry.

Prekvapivo bolo zistené, že liečenie buniek infikovaných HIV pomocou IL-4 viedlo k zníženiu vírusovej replikácie^ ktoré záviselo od veľkosti dávky. Z obrázku 1, na ktorom Je ukázaná inhibícia vírusovej replikácie vidieť, ako zníženie výskytu rádioaktívne označenej RT v supernatantoch (cpm/ml. 10 ; cpm = počet impulzov za minútu) v kultúrach, ktoré boli liečené IL-4, pri porovnaní s neliečenými infikovanými kultúrami (kontrola). Hladiny RT boli merané v rôznych časoch v priebehu 21 dní inkubačnej periódy. Desať Jednotiek (j.)/ml IL-4 významne inhibuje RT aktivitu 21 dní po infekcii. Tento efekt bol stanovený ako zníženie merateľnej RT aktivity v supernatanoch kultúry.

Inhibičny vplyv IL-4 bol úplne reversibilny. Po odstránení IL-4 z kultivačného systému sa úroveň vírusovej replikácia (RT aktivita) zvýšila na úroveň, ktorú majú neliečené monocyty infikované HIV.

špecifickosť vplyvu IL-4 na vírusovú replikáciu bola potvrdená predbežným pôsobením monoklonálnych anti-IL-4 protilátok (dáta nie sú uvedené). V pokusoch s kultúrami, na ktoré bolo dopredu pôsobené anti-IL-4 protilátkami, sa nepozorovala inhibícia vírusovej replikácie. Bolo tiež spozorované, že substitúcia ľudského séra, ako zložky média za plodové teľacie sérum viedla k zníženiu proti vírusovej odpovede, možno preto, že plodové teľacie sérum obsahuje množstvo ďalších zložiek, ktoré sa nenachádzajú v ľudskom sére a o ktorých je známe, že regulujú expreši u génu HIV.

Možno pripraviť mnohé modifikácie^-a variácie tohoto vynálezu, bez odchýlenia od ducha a rozsahu vynálezu, ako je zrejmé odborníkom, špecifické uskutočnenia, ktoré sú popísané, sú uvedené len ako príklady. Tento vynález je obmedzený len pojmami pripojených nárokov.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostriedok na liečenie HIV infekcie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje IL-4 a farmaceutický prijateľný nosič.
2. 2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že IL-4 je ŕbkombinatným ľudským IL-4.
3. 3. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku na liečenie HIV infekcie, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zmieSanie IL-4 s farmaceutický prijateľným nosičom.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že IL-4 je rekombinantným ľudským IL-4.
5. 5. Použitie IL-4 na prípravu liečiva na liečenie HIV infekcie.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že IL-4 je rekombinantným ľudským IL-4.