CZ38095A3 - Pharmaceutical preparation for treating hiv infection, process of its preparation, il-4 and its use - Google Patents

Description

Tento vynález se týká farmaceutického prostředku pro léčení HIV infekce a způsobu jeho výroby, interleukinu-4 (IL-4) a jeho použití. Podrobněji se tento vynález týká způsobu inhibování replikace HIV v buňkách typu monocyt/makrofág, při němž se používá interleukin-4.

Dosavadní stav techniky

Virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) byl původně identifikován jako etiologické činidlo získaného syndromu imunitní nedostatečnosti (AIDS) v roce 1983. 0 struktuře a funkci tohoto viru je dnes známo mnoho. Bylo také ukázáno, že HIV je nesen T pomocnými lymfocyty a buňkami monocytových/makrofAgových linií [Ho a spol.: New Engl. J. Med. 321 (24). 1621 (1989).]. Průměrný interval mezi infikováním HIV a nástupem AIDS je přibližně 8 až 11 let [Lifson a spol.^: J. Infec. Dis.

158. 1360 (1980).]. Tato dlouhá inkubační doba ukazuje na to, že replikace HIV je alespoň částečně bráněna faktory host-itele.

V pathogenesi AIDSu hraji prominentní roli jednojaderné fagocyty. Tyto buňky jsou mezi prvními, které jsou infikovány HIV. Jsou také hlavními zásobníky viru v centrálním nervovém systému, plicích a lymfatických uzlinách, potenciální vektory pro šíření viru do různých tkání infikovaného pacienta a mezi jednotlivci a hlavními regulačními buňkami, které regulují průběh a intenzitu postupu onemocnění [Gendelman a spol. = AIDS 3, 475 (1989).]. Hostitelské faktory, jako je interferon (IFN), které ovlivňují virovou replikaci v jednojadernéra fagocytu, jsou pravděpodobně hlavními prvky při řízení omezeného růstu viru a zpoždění onemocnění HIV.

Skutečnost, že makrofágy jsou hlavním zásobníkem viru v centrálním nervovém systému, plicích a lymfatických uzlinách, ukazuje na to, že léčení, které inhibuje virovou replikaci v těchto příslušných buňkách, může mít hlavní dopad na obtíže viru a postup onemocnění [Gendelman a spol.: J. Immunol. 145.

2669 (1990).].

Interleukin-4 (IL-4) je lymfokin, které má vlastnosti, které objasňují mnohé vlastnosti řady lymfokinů indukovaným imunitním rozpoznáváním [Paul: Blood 77 (9) . 1859 (1991).]. IL-4 je hlavně odpovědný za produkci IgE v myších jako odpovědi na různá dráždivá činidla, která vykazují zapnutí Ig třídy na expresi této Ig třídy [Finkelman a spol.: Ann. Rev. Immunol. 8, 303 (1990) .]. IL-4 byl původně popsán na základě své schopnosti zvyšovat DNA syntézu vyčištěnými odpočívajícími myšími B lymfocyty stimulovanými anti-IgM protilátkami [Howard a spol.: J. Exp. Immunol. 155. 914 (1982).].

Bylo také ukázáno, že IL-4 působí na odpočívající B buňky při indukování exprese MHC molekul třídy II [Noelle a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81. 6149 (1984).] a při zvyšování následující odpovědi těchto buněk na anti-IgM protilátky [Rabin a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 2935 (1985); Oliver a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 2465 (1985).].

Lidský IL-4 je glykoprotein, který existuje ve formách s molekulovými hmotnostmi mezi 15 000 a 19 000. Byly získány cDNA kódující jak myší tak lidský IL-4 [Lee a spol.: viz výše; Noma a spol.: viz výše; Yokota a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5894 (1986).].

IL-4 má silné účinky na T lymofocyty i na B buňky. Odpočívající T buňky, na které bylo působeno IL-4, přežívají v kultuře bez dělení [Hu-Li a spol.: J. Exp. Med. 165, 157 (1987).]. IL-4 působí také různými způsoby na ne-lymfatické hematopoezní buňky. Bylo ukázáno, že inhibuje růst makrofágů [Mclnnes a spol.: J. Exp. Med. 167. 598 (1988); Jansen a spol.: J. Exp. Med. 170. 577 (1989).] a zvyšuje jejich cytotoxickou aktivitu na některé nádorové buňky [Cravford a spol.: J. Immunol. 139. 135 (1987).1.

Použití AZT, ddl a ddC pro léčení HIV infekce neprokázalo vysokou účinnost. Existuje tedy potřeba lepších farmaceutických prostředků způsobů léčení HIV infekce.

Podstata vynálezu

Tento vynález splňuje tuto potřebu tím, že poskytuje tako vý farmaceutický prostředek, který obsahuje IL-4 a farmaceuticky přijatelný nosič. Připravuje se tak, že se smíchá IL-4 s farmaceutickým nosičem.

Tento vynález lze snadněji pochopit odkazem na připojený obrázek 1, který je grafickým znázorněním inhibice replikace HIV v monocytech účinkem různých dávek IL-4.

Všechny citace, které jsou zde uvedeny, jsou zde celé zahrnuty jako odkazy.

Tento vynález se týká použití IL-4 k léčení HIV infekce a všech stavů pocházejících od této infekce, jako je AIDS. IL-4 může být použit k léčení stavů, které jsou zde definovány tak, že zahrnují stavy a úrovně choroby projevující se následujícími kriterii¹ (1) seropositivita na virus HIV (a/nebo HIV protilátky) nebo přítomnost intracelulárních virových částic, které mohou být identifikovány mikroskopickým vyhodnocením isoláty leukocytových buněk, (2) chronická 1ymfodenopatie, jak je obvykle chápána odborníky, (3) počet T-pomocných buněk v krvi menší než 400/mm³, (4) prokazatelná částečná porucha při zpožděné hypersensitivní odpovědi a (5) úplné selhání odpovědi při testu zpožděné hypersensitivity kůže a/nebo výskyt sooru.

pacientech, kteří vyhovují shora uvedeným kriteriím, se mluví jako o pacientech s pokročilou “AIDS klasifikací tehdy, jestliže vedle shora uvedeného jsou citliví na příležitostné infekce, jako je kryptokoková meningitida, histoplasmosa, tuberkulosa, toxoplasmosa nebo PCP (zápal plic Pneumocystis carinii) [Redfield a spol.: HIV infekce: klinický obraz, The Science of AIDS, viz výše, str. 63 až 73.].

Shora uvedené příznaky jsou ilustrací specifických vybraných kriterií, která se používají při stanovení kandidáta pro navržený zpasob léčení. Účinnost léčení maže být vyhodnocována sledováním zmenšení shora uvedených příznaka onemocnění. Inhibice virové replikace maže být sledována měřením hladin reversní transkriptasy v supernatantech isoláta infikovaných buněk, která jeu předpovědí postupu onemocnění. Je dobře známo, že akutní fáze infekce se projevuje vysokými titry virových částic v seru [Coombs a spol.: New Engl. J. Med. 321 (24) . 1626 (1989).].

Pojem HIV tak, jak se používá v tomto vynálezu, znamená jak HIV-1 tak HIV-2.

Jak je zde uvedeno, zpasoby podle tohoto vynálezu inhibují replikaci HIV v buňkách typu monocyt/makrofág. Mohou však být účinné na virové replikace v jiných typech buněk. Mohou být účinné také na imunitní systém nebo na jiné systémy. Porozumění přesnému mechamismu (přesným mechanismem), kterým (kterými) maže IL-4 pasobit, není pro tento vynález podstatné.

IL-4 je komerčně dostupný z razných zdroja, jako je Genzyme Corporation, Cambridge, Ma., nebo se maže připravit známými zpasoby s použitím přírodních zdroja nebo technologií rekombinace DNA [Sheehan a spol.: Immunol. 142. 884 (1989) a Stárneš a spol.: J. Immunol. 145. 4185 (1990).].

Pro identifikování DNA kódující IL-4 v genomových nebo cDNA knihovnách připravených standardními zpasoby se mohou použít také směsi oligonukleotidových sond založené na známých IL-4 nukleotidových sekvencích. Takto identifikované DNA se mohou vyštípnout z knihovny štěpením restrikční endonukleasou ne5 bo se mohou, připravit pomocí příslušných primerů a způsobem polymerasové řetězové reakce (PCR) [Saiki a spol.· Science 239. 487 (1988).], mohou být sekvenovány a exprimovány v eukaryotickém expresním systému nebo (po deleci intronu standardními způsoby, jestliže je to nutné) v prokaryotickém nebo eukaryotickém expresním systému. Ovšem, že jak cDNA tak genomové DNA knihovny mohou být analyzovány aplikací standardních způsobů klonování místo použití oligonukleotidových sond nebo PCR. Takto vyrobený IL-4 se pak deteguje známými způsoby, jako jsou imunochemické způsoby nebo bioanalýzy.

Jako IL-4 se s výhodou používá lidský rekombinantní IL-4. Výhodným je také používání glykosylovaného IL-4 (např. rekombinantního IL-4 produkovaného v eukaryotickém expresním systému).

se IL-4 používá v o nichž je známo, ',3'-dideoxythymi ',3'-dideoxyinosin

V některých provedeních podle vynálezu kombinací s jedním nebo více jinými činidly, že jsou účinné proti HIV, jako je 3’-azido-2 din (AZT), 2’,3'-dideoxycytidin (ddC) nebo 2 (ddl) .

Farmaceutické prostředky pro použití podle vynálezu se mohou dodávat v lyofi 1izované formě a potom se mohou připravovat pro použití bezprostředně před použitím ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jako je fosforečnanem pufrovaný solný roztok nebo jakékoliv jiné dobře známé nosiče. Farmacuetické prostředky podle tohoto vynálezu se mohou podávat injekčně přímo do krevního oběhu intravenosně nebo intravenosním (i.v.) kapacím roztokem, jako je Ringerův laktát. Mezi parenterální prostředky, které se mohou používat, patří sterilní roztoky nebo suspenze. Tyto přípravky se mohou připravovat s konvenčními farmaceuticky přijatelnými ředidly a přísadami, jako jsou stabilizátory a nosiče. Roztoky, které se podávají, se mohou připravovat pro použití z lyofylizovaných prášků, které mohou obsahovat také např. ochranná činidla, pufry a dispergáční činidla. Tyto přípravky se s výhodou podávají intravenosní injekcí.

Podle tohoto vynálezu se pacientům, kteří potřebují léčení HIV infekce, podává efektivní množství IL-4, aby se dosáhlo shora popsaných výsledků. Může se podávat denní dávka 0,001 μς na kg tělesné hmotnosti až 50 Mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodnější denní dávka je v rozmezí od 0,01 Mg/kg tělesné hmotnosti do 10 Mg/kg tělesné hmotnosti. Nejvýhodnější denní dávka je v rozmezí od 0,05 Mg/kg tělesné hmotnosti do 2 Mg/kg tělesné hmotnosti.

Přesné množství IL-4, které se podává, bude stanoveno ošetřujícím lékařem, který vezme v úvahu etiologii a průběh choroby, stav pacienta, věk a další faktory.

Příklady provedeni vynálezu

Tento vynález je ilustrován následujícími, neomezujícími příklady.

Způsoby a materiály

Monocyty byly isolovány z periferních krevních jedno jaderných buněk (PBMC) dárců seronegativních na HIV a hepatitidu B po leukapheresi a vyčištěny protiproudou odstředivou elutriací jednojaderných frakcí krevních buněk bohatých na leukocyty. Buněčné suspenze obsahovaly více než 98 % monocytů podle kriteria buněčné morfologie na Wrightem obarvených cytonátěrech granulární peroxidasou a nespecifickou esterasou. Monocyty byly kultivovány jako adheretní buněčné monovrstvy (7,5.10'⁵/24 mm buněčné tkáně na jamku) v 0,5 ml DMEM (označení 78-176AJ, Gibco, /

Grand Island, NY) doplněném 10 % teplem deaktivovaného A+ lidského sera, 50 μg/^al gentamicinu (Sigma Chemical Co., St.

Louis, Mo.) a 1000 jednotek (j.) na ml rekombinantního lidského stimulačního faktoru makrofágové kolonie (M-CSF) (Cetus Corp., Emeryville, Ka.). PBMC, isolované z úplné krve odstřeďováním hustotním gradientem Ficoll-diatrizoátu (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ., se kultivují na 1.10⁶ živých buněk/ml v mediu RPMI 1640 (Gibco) s 5 Mg/rol fytohemaglutininu (PHA) (Sigma), 10 % hmot. vyčištěného lidského IL-2 (Advanced Biotechnologies lne.,

Columbia, Md.) a 15 % hmot. teplem deaktivovaného plodového telecího sera (FCS) (Sterile Systems, Logan, Ut.).

Monocyty, na které bylo působeno PHA/IL-2, byly vystaveny násobné infekci 0,01 ID_S0 tkáňové kultury/cílovou buňku čtyř klinických kmenů HIV (GG, YU-2, SM a ADA) původně isolovaných a pasážovaných v monocytech (AIDS Research and Reference Reagent Program, AIDS Program, NAID, NIH). Monocyty, na které bylo působeno M-CSF, byly kultivovány jako adherentní monovrstvy 7 až 10 dnů před použitím jako cílové buňky. Všem kulturám bylo dáváno čerstvé medium každé 2 až 3 dny.

Pro stanovení aktivity reversní transkriptasy (RT) se replikované vzorky supernatantů kultivační kapaliny přidají k reakční směsi NONIDET P-40^<R) (Sigma), poly(rA) oligo(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ.), dithiothreitolu (Pharmacia), MgCl₂ a [a-³²PJdTTP (400 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, II.) na 24 h při 37 °C. Tato směs se nanese na chromatografický papír, vysuší se na vzduchu a promyje se pětkrát v 0,3M NaCl s 0,03M citranem sodným (pH 7,4) a dvakrát v 95 % (hmot.) ethanolu. Papír se vysuší a nastříhá a radioaktvita se změří kapalinovou scintilační spektroskopií. Jako positivní kontroly pro RT aktivitu slouží HTLVIIIB.

Neinfikované nebo HIV infikované PBMC se nechají růst na plastických substrátech v přítomnosti IL-4 nebo bez IL-4. Přítomnost HIV infekce v kulturách se stanoví testováním buněk na HIV asociovaný s plasmovou membránou a intravakuolární HIV. RT aktivita se měří také jak shora popsáno v podílech kapaliny supernatantu kultury.

Překvapivě bylo zjištěno, že léčení buněk infikovaných HIV pomocí IL-4 vedlo ke snížení virové replikace, které záviselo na velikosti dávky. To lze vidět z obrázku 1, na kterém je ukázána inhibice virové replikace jako snížení výskytu radioaktivně označené RT v supernatantech (cpm/ml.10'⁵; cpm = počet impulsů za minutu) v kulturách, které byly léčeny IL-4 při srovnání s neléčenými infikovanými kulturami (kontrola) . Hladiny RT byly měřeny v mnoha různých časech během 21 dnů inkubační periody.

Deset jednotek (j.)/ml IL-4 významně inhibuje RT aktivitu 21 dnů po infekci. Tento efekt byl stanoven jako snížení měřitelné

RT aktivity v supernatanech kultury.

Inhibiční vliv IL-4 byl plně reversibilní. Po odstranění IL-4 z kultivačního systému se úroveň virové replikace (RT aktivita) zvýšila na úroveň, kterou mají neléčené monocyty infikované HIV.

Specifičnost vlivu IL-4 na virovou replikaci byla potvrzena předběžným působením monoklonálních anti-IL-4 protilátek (data nejsou uvedena) . V pokusech s kulturami, na něž bylo předem působeno anti-IL-4 protilátkami, nebyla pozorována inhibice virové replikace. Bylo také pozorováno, že substituce lidského sera jako složky media za plodové telecí sérum vedla ke snížení protivirové odpovědi, možná proto, že plodové telecí sérum obsahuje četné další složky, které se nenacházejí v lidském seru a o kterých je známo, že regulují expresi genu HIV.

Lze připravit mnohé modifikace a variace tohoto vynálezu, aniž by se tyto odchýlily od duchu a rozsahu vynálezu, jak je zřejmé odborníkům. Specifická provedení, která jsou zde popsána, jsou zde jenom jako příklady. Tento vynález je omezen pouze pojmy připojených nároků.

Claims (7)

1. ZpÚsoď výroby faririaceutickeho prostředku pro ieúeni HIV infekce vyznačuj i c se t i m, že zanrnuje smícháni

   IL-4 s farmaceuticky přijatelným nosičem
2. 2. Způsob buď podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se jako IL-4 používá rekombinantní lidský IL-4.
3. 3. Farmaceutický prostředek pro léčeni HIV infekce, v y z n a C u j í c í se tím, že obsahuje IL-4 a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. 4. Farmaceutický prostředek Podle nároku 4, v y znač u jící se tím·, že =-~ jako IL—4 obsahuje rekomoinantní lidský IL-4,
5. 5. IL-4 pro použiti pro léčení HIV infekce.
6. 6. IL-4 podle nároku 5, kterým je rekombinantní lidský IL-4.
7. 7. Použití IL—4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro iéčení HIV infekce.

   S. Použití IL-4 podle nároku 7, kde IL-4 je rekombinantní lidský IL-4.