SK158599A3 - Grapevine leafroll virus (type 2) proteins and their uses - Google Patents

Description

Táto žiadosť si nárokuje úžitok U.S. Provisional Patent Application (provizórnej patentovej žiadosti) číslo série 60/047,194 podanej 20. mája 1997. Táto práca bola podporená U. S. Department of Agriculture Cooperative Grant č. 58-23499-01. Vláda USA môže mať určité nároky na tento vynález.

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka proteinov vírusu zvinutky viniča, molekúl DNA kódujúcich tieto proteíny a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Vo svete najrozšírenejšie ovocie, hrozno (Vitis sp.) je pestované na všetkých kontinentoch okrem Antarktídy. Hlavné centrá produkcie hrozna sú v európskych krajinách (Taliansko, Španielsko a Francúzsko), ktoré predstavujú približne 70 % svetovej produkcie hrozna (Mullins a spol. Biology of the Grapevine, Cambridge, U.K.: University Press (1992)). Spojené štáty s 300 000 hektármi viníc, sú ôsmym najväčším producentom hrozna na svete. Hoci hrozno má široké použitie, hlavná časť produkcie hrozna (~ 80 %) sa používa pre výrobu vína. Oproti obilninám, väčšina viníc používa tradičné kultivary, ktoré pretrvávajú po storočia vegetatívnym rozmnožovaním. Vela dôležitých vírusov viniča a vírusom podobných chorôb, ako je zvinutka viniča, vrásčitosť dreva a Rupestries, je prenášaných a šírených používaním infikovaného rozmnožovaného materiálu. Preto rozmnožovanie certifikovaných, bezvírusových materiálov, je jedným a najdôležitejším spôsobom kontroly chorôb. Tradičné pestovanie viniča rezistentného voči chorobám je ťažké z dôvodu vysoko heterozygotnej povahy množenia viniča, a z dôvodu polygénneho charakteru dedičnosti. Okrem toho uvedenie nových kultivarov môže byť zakázané zvykom alebo zákonom. Súčasný vývoj biotechnológie umožnil zavedenie špeciálnych vlastností, ako je rezistencia voči ochoreniu, do existujúcich kultivarov bez zmeny ich ovocinárskych vlastností.

Mnohé rastlinné patogény, ako huby, baktérie, fytoplazmy, vírusy a nematody môžu infikovať vinič a výsledné choroby môžu spôsobiť významnú stratu produkcie (Pearson a spol., Compendium of Grape Diseases, American Phytopatological Society Press (1988)). Medzi týmito ochoreniami vírusové ochorenia predstavujú hlavnú prekážku výnosného pestovania viniča. Bolo izolovaných a charakterizovaných asi 34 vírusov viniča. Hlavné vírusové ochorenia viniča sú rozdelené do skupín: (1) degenerácia viniča spôsobená nepovírusom listu, inými európskymi nepovírusmi a americkými nepovírusmi, (2) komplexom zvinutky a (3) komplexom vrásčitosti dreva (Martelli, vyd., Graft Transmissible Diseases of Grapevines, Handbook for Detection and Diagnosis, FAO, UN, Rome, Italy (1993)) .

Spomedzi vírusových ochorení je vo svete najrozšírenejším komplex zvinutky viniča. Podľa Goheena („Grape Leafroll v Frazier a spol., vyd., Virus Diseases of Small Fruits and Grapevines (A Handbook), University of California, Division of Agricultural Sciences, Berkley, Calif, USA, str. 209-212 (1970) („Goheen (1970)), ochorenie zvinutka viniča bolo popísané už v roku 1850 v nemeckej a francúzskej literatúre. Avšak vírusová povaha ochorenia bola po prvýkrát dokázaná Scheu-om (Scheu, „Die Rollkrankheit des Rebstockes (Leafroll of grapevine), D.D. Weinbau 14:222-358 (1935) („Scheu (1935)))· V roku 1946 Harmon a Snyder (Harmon a spol., „Investigations and Occurence, Transmission, Spread and Effect of „White Fruit Colour in the Emperor Grape, Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 74:190-194 (1946)) stanovili vírusový charakter White Emperor disease v Kalifornii. Toto bolo neskôr potvrdené Goheen-om a spol. (Goheen a spol. „Leafroll (White Emperor Disease) of Grapes in California, Phytopathology, 48:51-54 (1958) („Goheen (1958))), a potvrdilo sa, že ochorenia zvinutka viniča a White Emperor disease boli tie isté a zachoval sa len názov „zvinutka viniča.

Zvinutka viniča je závažné vírusové ochorenie viniča a vyskytuje sa všade, kde sa pestuje vinič. Velké rozšírenie ochorenia umožnilo množenie chorých rastlín viniča. Choroba pôsobí na všetky pestované odrody koreňov Vitis. Hoci ochorenie nie je smrteľné, spôsobuje stratu úrody a pokles v obsahu cukru. Scheu stanovil v roku 1936, že 80 % všetkých viničov rastúcich v Nemecku je infikovaných (Scheu, Mein Winzerbuch, Berlín: Reichsnahrstand-Verlags (1936)). V mnohých kalifornských viniciach výskyt zvinutky viniča (založený na štúdii symptómov uskutočnenej v 1959) súhlasí s Scheu-ovým pôvodným pozorovaním vo viniciach Nemecka (Goheen a spol., „Studies of Grape Leafroll in California, Amer. J. Enol. Vitie., 10:7884 (1959)). Súčasný stav chorobnosti na zvinutku viniča sa nezdá byť lepši (Goheen, „Diseases Caused by Viruses and Viruslike Agents, The American Pathophysiological Society, St. Paul, Minnesota:APS Press, 1:47-54 (1988) („Goheen (1988)). Goheen tiež stanovil, že ochorenie spôsobuje ročnú stratu asi 5 až 20 % z celkovej ročnej úrody hrozna (Goheen (1970) a Goheen (1988)). Množstvo cukru v jednotlivých strapcoch infikovaného viniča predstavuje len asi 1/2 až 1/3 množstva cukru z neinfikovaného viniča (Goheen (1958)).

Symptómy ochorenia zvinutky viniča sa významne líšia v závislosti od kultivaru, prostredia a ročného obdobia. U tmavých odrôd je na jeseň najčastejšie stočenie listov do vnútra a medzicievne sčervenanie zrelých listov; tieto symptómy sa nevyskytujú na jar, alebo v skorom lete. U svetlých odrôd sú však symptómy menej zjavné, listy sú zvyčajne skrútené do vnútra a súčasne je prítomná medzicievna chloróza. Avšak vela kultivarov nevykazuje žiadne symptómy. V takom prípade je choroba zvyčajne diagnostikovaná pomocou indikátora indexu dreva, použitím Vitis vivifera cv. Carbernet Franc (Goheen (1988)).

Aj keď Scheu dokázal, že zvinutka viniča je prenosná štepom, predpokladala sa vírusová etiológia ochorenia (Scheu (1935)). Z viničov napadnutých ochorením zvinutky viniča bolo izolovaných niekoľko typov vírusových častíc. Sú to častice podobné potyvírusu (Tanne a spol., „Purification and Characterization of a Virus Associated with the Grapevine Leafroll Disease, Phytopathology, -67:442-447 (1977)), častice podobné izometrickým vírusom (Castellano a spol., „Virus-like Particles and Ulatrastructural Modification in the Phloem of Leafroll-affected Grapevines, Vitis, 22:23-29 (1983)) („Castellano (1983)) a Nambera a spol. „A Small Spherical Virus Associated with the Ajinashika Disease of Koshu Grapevine, Ann. Phytopathol. Soc. Japan, 45:70-73 (1979)), a častice podobné klosterovírusom (Namba, „Grapevine Leafroll Virus, a Possible Member of Closteroviruses, Ann. Phytopathol. Soc. Japan 45:497-502 (1979)). V súčasnosti však dlhé flexibilné klosterovírusy veľkosti od 1 400 do 2 200 nm boli konzistentnejšie spojené s ochorením zvinutky viniča (Obrázok 1) (Castellano (1983), Faoro a spol., „Association of a Possible Closterovirus with Grapevine Leafroll in Northern Italy,

Riv. Patol. Veg., Ser IV, 17 :183-189 (1981), Gugerli a spol., „L'enroulement de la vigne: mise en évidence de particules virales et développement d'une méthode immuno-enzymatique pour le diagnostic rapide (Grapevine Leafroll: Presence of Virus Particle and Development of an Immuno-enzyme method for Diagnosis and Detection), Rev. Suisse Viticult. Ärboricult. Hort., 16:299-304 (1984) („Gugerli (1984)), Hu a spol., „Characterization of Closterovirusis-like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. Phytopathol., 128:114 (1990) („Hu (1990)), Milne a spol., „Closterovirus-like Particles of Two Types Associated with Diseased Grapevines, Phytopathol. Z., 110:360-368 (1984), Zee a spol., „Cytopathology of Leafroll-diseased Grapevines and the Purification and Serology of Associated Closteroviruslike Particles, Phytopathology, 77:1427-1434 (1987) („Zee (1987)) a Zimmermann a spol., „Characterization and Serological Detection of Four Closteroviruses-like Particles Associated with Leafroll Disease on Grapevine, J. Phytopathol., 130:205-218 (1980) („Zimmermann (1990)). Tieto klosterovirusy sa vzťahujú k vírusom spojeným so zvinutkou viniča („GLRaV). Z viničov napadnutých ochorením zvinutka viniča (Tabulka 1) bolo izolovaných najmenej šesť sérologicky rozdielnych typov GLRaV (GLRaV 1 až 6) (Boscia a spol., „Nomenclature of Grapevine Leafroll-associated Putative Closteroviruses, Vitis, 34:171175 (1995) („Boscia (1995)) a (Martelli, „Leafroll, str. 37-44 v Martelli, vyd., Graft Transmissible Diseases of Grapevines, Handbook for the Detection and Diagnosis, FAO, Rome, Italy, (1993) („Martelli I)).Prvých päť typov bolo potvrdených na 10^th Meeting of the International Council for the Study of Virus and Virus Diseases of the Grapevine) („ICVG) (Volos, Grécko, 1990).

Tabuľka 1

Typ	dĺžka častice (nm)	Povrchový proteín Mr (xlO3)	Citácia
GLRaV-l	1 400-2 200	39	Gugerli (1984)
GLRaV-2	1 400-1 800	26	Gugerli (1984)
GLRaV-3	1 400-2 200	43	Zee (1987)
GLRaV-4	1 400-2 200	36	Hu (1990)
GLRaV-5	1 400-2 200	36	Zimmermann (1990)
GLRaV-6	1 400-2 200	36	Gugerli (1993)

Použitím monoklonálnych protilátok však pôvodný GLRaV II popísaný v Gugerli (1984) bolo zistené, že je zmesou najmenej dvoch zložiek, Ha a Ilb (Gugerli a spol., „Grapevine Leafroll Associated Virus II Analyzed by Monoclonal Antibodies, ll^th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine, Montreux, Switzerland, str. 23-24 (1993) („Gugerli (1993))). Nedávny výskum pomocou porovnávacích sérologických stanovení (Boscia (1995)) ukázal, že Ilb zložka cv. Chasselas 8/22 je rovnaká ako GLRaV-2 izolát z Francie (Zimmermann (1990)), ktorý tiež obsahuje izoláty klosterovírusov spojených s ochorením vrásčitého dreva viniča z Talianska (GCBaV-BA) (Boscia (1995)) a zo Spojených štátov (GCBaV-NY) (Namba a spol., „Purification and Properties of Closterovirus-like Particles Associated with Grapevine Corky Bark Disease, Phytopathology, 81:964970 (1991) („Namba (1991))). Zložka Ha cv.Chasselas 8/22 bola provizórne nazvaná vírus 6 spojený so zvinutkou viniča (GLRaV-6). Okrem toho antisérum voči CA-5 izolátu z GLRaV-2 pripravené Bosciom a spol., (Boscia a spol., „Characterization of Grape Leafroll Associated Closterovirus (GLRaV) Serotype II and Comparison with GLRaV Serotype III, Phytopa7 thology, 80:117 (1990)) ukázalo, že obsahuje proti-látky voči obidvom GLRaV-2 a GLRaV-1, s prevahou protilátky voči GLRaV-1 (Boscia (1995)).

Virióny GLRaV-2 sú ohybné, filamentné častice dlhé asi 1 400 až 1 800 nm (Gugerli a spol., „Ľenroulement de la Vigne: Mise en Evidence de Particles Virales et Development d'une Methode Immuno-enzymatique Pour le Diagnostic Rapide (Grapevine Leafroll: Presence of Virus Particles and Development of an Immuno-enzyme Method for Diagnosis and Detect i on), Rev. Suisse Viticult. Arboricult. Horticult. 16:299304 (1984)). Z tkanív infikovaných GLRaV-2 bola konštantné izolovaná dvojvláknitá RNA (dsRNA) veľkosti približne 15 kb (Goszcynski a spol., „Detection of Two Strains of Grapevine Leafroll-Associated Virus 2, Vitis 35:133-35 (1996)). Povrchový proteín z GLRaV-2 je asi 22~26 kDa (Zimmermann a spol., „Characterization and Serological Detection of Four Closterovirus-like Particles Associated with Leafroll Disease on Grapevine, J. Phytopathology 130:205-18 (1990); Gugerli a Ramel, Rozšírené abstrakty: „Grapevine Leafroll Associated Virus II Analyzed by Monoclonal Antibodies, ll^th ICVG at Montreux, Švajčiarsko, Gugerli, vyd., Federal Agricultural Research Station of Changins, CH-1260, Nyon, Švajčiarsko, str. 23-24 (1993); Boscia a spol., „Nomenclature of Grapevine Leafroll-Associated Putative Closteroviruses, Vitis 34:17175 (1995)), ktorý je značne menší ako iné povrchové proteíny z GLRaV (35~43 kDa) (Zee a spol., „Cytopathology of LeafrollDiseased Grapevines and the Purification and Serology of Associated Closterovirus Like Particles, Phytopathology 77:1427-34 (1987); Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-Like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. of Phytopathology 128:1-14 (1990); Ling a spol., „The Coat Protein Gene of Grapevine Leafroll Associated Closterovirus-3: Cloning, Nucleotide Sequencing and Expression in Transgenic Plants, Árch, of Virology 142:1101-16 (1997)). GLRaV-2 bol na základe morfológie a cytopatológie klasifikovaný ako člen rodu Closterovirus (Martelli, Circular of ICTV-Plant Virus Subcommittee Study Group on Closterolike Viruses (1996)), jeho molekulárne a biochemické vlastnosti nie sú dobre charakterizované.

Zo skupiny klosterovírusov bolo nedávno sekvenovaných niekoľko vírusov. Čiastočné alebo úplné genómové sekvencie pre vírus žltnutia repy (Agranovsky a spol., „Nucleotide Sequence of the 3'-Terminál Half of Beet Yellows Closterovirus RNA Genome (Jnique Arrangement of Eight Virus Genes, J. General Virology 72:15-24 (1991); Agranovski a spol., „Beet Yellows Closterovirus: Complete Genome Structure and Identification of a Papain-like Thiol Protease, Virology 198:31124 (1994), zakrpatený vírus žltnutia repy (BYSV) (Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996)), vírus citrus tristeza (CTV) (Pappu a spol. „Nucleotide Sequence and Organization of Eight 3'0pen Reading Frames of the Citrus Tristeza Closterovirus Genome, Virology 199:35-46 (1994); Karasev a spol., „Complete Sequence of the Citrus Tristeza Virus RNA Genome, Virology 208:511-20 (1950)), vírus infekčného žltnutia šalátu (LIYV) (Klaassen a spol., „Partial Characterization of the Lettuce Infectious Yellows Virus Genomic RNAs, Identification of the Coat Protein Gene and Comparison of its Amino Acid Sequence With Those of Other Filamentous RNA Plánt Viruses, J. General Virology 75:152533 (1994); Klaassen a spol. „Genome Structure and Phylogene9 tie Analysis of Lettuce Infectious Yellows Vírus, a WhiteflyTransmitted, Bipartite Closterovirus, Virology 208:99-110 (1995)), vírus malej višne (LChV) (Keim a Jelkmann, „Genome Analysis of the 3'-Terminál Part of the Little Cherry Disease Associated dsRNA Reveals a Monopartite Clostero-Like Vírus, Árch. Virology 141:1437-51 (1996); Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of Little Cherry Virus, a Mealybug-Transmissible Closterovirus, J. General Virology 78:2067-71 (1997) a GLRaV-3 (Ling a spol., „Nucleotide Sequence of the 3' Terminál Two-Thirds of the Grapevine Leafroll Associated Virus-3 Genome Reveals a Typical Monopartite Closterovirus, J. Gen. Virology 79(5):12891301 (1998) odhalili niekoľko spoločných znakov klosterovírusov, ako je prítomnosť HSP70 chaperónového proteínu tepelného šoku a duplikátu génu pre povrchový protein (Agranovsky „Principles of Molecular Organization, Expression, and Evolution of Closteroviruses: Over the Barriers, Adv. in Virus Res. 47:119-218 (1996); Dolja a spol. „Molecular Biology and Evolution of Closteroviruses: Sophisticated Build-up of Large RNA Genomes, Annual Rev. Phytopathology 32:261-85 (1994); Boyko a spol., „Coat Protein Gene Duplication in a Filamentous RNA Virus of Plants, Proc. Natl. Äcad. Sci. USA 89:9156-60 (1992)). Charakterizácia organizácie genómu v GLRaV by poskytla molekulárnu informáciu o sérologicky rozdielnych klosterovírusoch, ktoré spôsobujú u viniča podobné symptómy ako zvinutka viniča.

Z viničov bolo izolovaných niekoľko kratších klosterovírusov (veľkosť častice dĺžky 800 nm). Zistilo sa, že jeden z nich, nazývaný vírus A viniča („GVA) je tiež spojený, i keď nedôsledne, s chorobou zvinutky viniča (Agran a spol., „Occurance of Grapevine Virus A (GVA) and Other Closteroviru10 ses in Tunisian Grapevines Affected by Leafroll Disease, Vitis, 29:43-48 (1990), Conti a spol., „Closterovirus Associated with Leafroll and Stem Pitting in Grapevine, Phytopathol. Mediterr., 24:110-113 (1985) a Conti a spol., „A Closterovirus from Stem-pitting-diseased Grapevine, Phytopathology, 70:394-399)). Etiológia GVA nie je v skutočnosti známa; zdá sa však, že je dôsledne spojená s vrásčitosťou dreva sensu lato (Rosciglione a spol., „Maladies de ľenroulement et du bois strié de la vigne: analyse microscopique et sérologique (Leafroll and Stem Pitting of Grapevine: Microscopical and Serological Analysis), Rev. Suisse Vitie Arboric. Hortic., 18:207-211 (1986) („Rosciglione (1986)) a Zimmermann (1990)) . Z viničov napadnutých vrásčitosťou dreva bol izolovaný a charakterizovaný iný klosterovírus (dlhý 800 nm) nazvaný vírus B viniča („GVB) (Boscia a spol., „Properties of a Filamentous Virus Isolated from Grapevines Affected by Corky Bark, Árch, Virol., 130:109-120 (1993) a Namba (1991)).

Ako predpokladá Martelli I, symptómy zvinutky viniča môžu byť indukované viacerými ako jedným vírusom, alebo môžu byť jednoducho všeobecnou fyziologickou odpoveďou rastliny na napadnutie floému vírusmi. V posledných 15 rokoch sa nahromadili dôkazy, ktoré silne podporujú myšlienku, že zvinutka viniča je spôsobená jedným (alebo komplexom) z dlhých klosterovírusov (dĺžka častice 1 400 až 2 200 nm).

Zvinutka viniča je prenášaná kontaminovanými štepmi a koreňovými odnožami. Ukázalo sa však, že podľa pôdnych podmienok je veľa druhov hmyzu z rodu Pseudococus (mealybug) nosičom zvinutky viniča (Engelbrecht a spol., „Transmission of Grapevine Leafroll Disease and Associated Closteroviruses by the Vine Mealybug Planococcus-fieus, Phytophylactica,

22:341-346 (1990), Rosciglione a spol., „Transmission of Grapevine Leafroll Disease and an Associated Closterovirus to Healthy Grapevine by the Mealybug Planococcus ficus, (Abstrakt), Phytoparasitica, 17:63-63, (1989) a Tanne „Evidence for the Transmission by Mealybugs to Healthy Grapevines of a Closter-like Particle Associated with Grapevine Leafroll Disease, Phytoparasitica, 16:288 (1988). V rôznych častiach sveta je prírodné šírenie zvinutky viniča hmyzím nosičom rýchle. Na Novom Zélande pozorovania v troch vinohradoch ukázali, že počet infikovaných viničov sa skoro zdvojnásobil v priebehu jedného roka (Jordán a spol., „Spread of Grapevine Leafroll and its Associated Virus in New Zealand Vineyards, ll^th Meeting of the International Council for the Study of

Viruses and Virus Diseases of the Grapevine, Montreux, Švajčiarsko, str. 113-114 (1993)). Jeden vinohrad bol na 90 % infikovaný po piatich rokoch od prvého pozorovania GLRa-3. Prevalenia zvinutky viniča vo svete môže vzrásť, nakolko chemická kontrola hmyzu (mealybugs) sa stáva ťažšou v dôsledku nedostupnosti účinných insekticídov.

Z pohľadu vážneho rizika postihnutia vinohradov vírusom zvinutky viniča a absenciou jej účinného liečenia, existuje naďalej potreba prevencie tohoto ochorenia. Tento vynález chce prekonať tento nedostatok v odbore.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka izolovaného proteínu alebo polypeptidu, ktorý sa zhoduje s proteínom alebo polypeptidom vírusu zvinutky viniča (typ 2) . Sú tiež uvedené kódujúce molekuly RNA a DNA, buď v izolovanej forme alebo inkorporované do expresného systému, hostiteľskej bunky, transgénneho štepu, koreňovej odnože kultivaru Vitis alebo citrus, alebo transgénnej rastliny Nicotiana alebo rastliny repy.

Iné hľadisko tohoto vynálezu sa týka spôsobu prenosu rezistencie voči vírusu zvinutky viniča (typ 2) do štepu alebo koreňových odnoží kultivarov Zifcis, alebo rastlín Nicotiana ich transformáciou pomocou molekuly DNA, ktorá kóduje protein alebo polypeptid zhodný s proteínom alebo polypeptidom vírusu zvinutky viniča (typ 2) . Iné hľadiská tohoto vynálezu sa týkajú spôsobu prenosu rezistencie voči vírusu žltnutia repy do rastlín repy a spôsob prenosu rezistencie voči tristeza vírusu do štepu alebo koreňových odnoží kultivarov citrusu, transformáciou rastlín alebo kultivarov pomocou molekuly DNA, ktorá kóduje protein alebo polypeptid zhodný s proteínom alebo polypeptidom vírusu zvinutky viniča (typ 2).

Tento vynález sa tiež týka protilátky alebo jej väzobnej časti alebo sondy, ktorá rozpoznáva protein alebo polypeptid.

Transgénne obmeny bežných obchodných kultivarov viniča a koreňov viniča, ktoré sú rezistentné voči vírusu zvinutky viniča, umožňujú viac kompletnú kontrolu vírusu pri zachovaní znakov odrôd špecifických kultivarov. Okrem toho tieto obmeny umožňujú kontrolu GLRaV-2 prenášaného buď kontaminovanými štepmi alebo koreňovými odnožami alebo doteraz necharakterizovaným hmyzím nosičom. Čo sa týka posledného spôsobu prenosu, tento vynález obmedzuje zvýšené používanie pesticídov, ktoré sťažilo chemickú kontrolu hmyzu. Tento vynález je užitočný z hľadiska ochrany životného prostredia a hospodárnosti pestovania viniča a výroby vína.

Popis obrázkov

Obrázky IA a 1B zaznamenávajú porovnanie profilu dvojvláknitej RNA (dsRNA) (Obrázok IA) z GLRaV-2 a Northern analýzou jej hybridizácie (Obrázok 1B). Obrázok IA: dráha M, lambda Hind III DNA marker; a dráha 1, dsRNA vzorka v 1 % agarózovom géli zafarbená etidium bromidom. Obrázok 1B je Nortern hybridizácia dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti izolovanej z GLRaV-2 so sondou pripravenou ³²P [a-dATP] označeným inzertom cDNA z GLRaV-2 špecifickou cDNA klónu TC1. Dráha 1, dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti z GLRaV-2. Dráha 2, celková RNA extrahovaná zo zdravého viniča.

Obrázok 2 zaznamenáva organizáciu genómu v GLRaV-2 a jeho sekvenčnú stratégiu. Rámčeky predstavujú ORF kódované predpokladanými sekvenciami aminokyselín z GLRaV-2, očíslované čiary predstavujú nukleotidové súradnice so začiatkom na 5' zakončení RNA v kilobázach (kb) . Čiary pod GLRaV-2 RNA genómu predstavujú cDNA klóny použité pre stanovenie nukleotidových sekvencii.

Obrázok 3A až 3D zaznamenáva porovnanie medzi ORFla/ORFlb z GLRaV-2 a BYV. Obrázok 3A až 3D ukazuje konzervatívne domény dvoch proteáz podobných papaínu (P-PRO), metyltransferázu (MT/MTR), helikázu (HEL) a RNA-závislú RNA polymerázu (RdRP). Výkričníky vyznačujú predpokladané katalytické zvyšky proteáz podobných papaínu; čiary naznačujú predpokladané miesta štiepenia. Konzervatívne motívy MT, HEL a RdRP domén sú zvýraznené čiarami nad ktorými sú príslušné písmená. Usporiadanie bolo vypracované pomocou programu MegAlign v DNASTAR.

Obrázky 4A a 4B zaznamenávajú zloženie nukleotidov (Obrázok 4A) a predpokladanú sekvenciu aminokyselín (Obrázok 4B) v ORFla/ORFlb prekrývajúcich sa oblastí v GLRaV-2, BYV, BYST a CTV. Rovnaké nukleotidy a aminokyseliny sú súhlasné. GLRaV2 predpoladané +1 miesto rámcového posunu (TAGC) a jeho príslušné miesta v BYV (TAGC) a BYSV (TAGC) a CTV (CGGC) v nukleotide a sekvenciách aminokyselín sú zvýraznené podčiarknutím.

Obrázok 5 zaznamenáva usporiadanie sekvencie aminokyselín proteínu HSP70 z GLRaV-2 a BYV. Konzervatívne motívy (A až H) sú označené čiarami, nad ktorými sú príslušné písmená. Usporiadanie bolo možné pomocou programu MegAli z DNASTAR.

Obrázok 6A je porovnanie povrchového proteínu (CP) a duplikátu povrchového proteínu (CPd) z GLRaV-2 s inými klosterovírusmi. Aminokyselinová sekvencia CP a CPd z GLRaV-2 je uvedená spolu s CP a CPd z BYV, BYSV a CTV. Konzervatívne zvyšky aminokyselín sú zvýraznené a je vyznačená zhoda. Sekvenčné usporiadanie a fylogenetický strom boli skonštruované pomocou Clustal Method v programe MegAlign z DNASTAR. Obrázok 6B je provizórny fylogenetický strom CP a CPd z GLRaV-2, BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV a GLRaV-3. Pre uľahčenie usporiadania bolo použitých len 250 aminokyselín z C-zakončenia CP a CPd z LIYV, LChV a GLRaV-3. Stupnica pod fylogenetickým stromom predstavuje vzdialenosť medzi sekvenciami. Jednotky znamenajú počet substitúcií.

Obrázok 7 zaznamenáva porovnanie organizácie genómu z GLRaV-2, BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV a GLRaV-3. P-Pro, proteázy podobné papaínu; MT/MTR, metyltransferáza, HEL, helikáza; RdRP, RNA-závislá RNA polymeráza; HSP70, protein tepelného šoku 70; CP, povrchový protein; CPd, duplikát povrchového proteínu.

Obrázok 8 je provizórny fylogenetický strom, ktorý zaznamenáva vzťah medzi RdRP z GLRaV-2 a príslušnými BYV, BYSV, CTV a LIYV. Fylogenetický strom bol skonštruovaný pomocou Clustal metódy programu MagAlign v DNASTAR.

Obrázok 9 zaznamenáva usporiadanie sekvencie aminokyselín HSP90 proteínu z GLRaV-2 vzhľadom k iným klosterovírusom, BYS, BYSV a CTV, Najviac konzervatívne motívy (I až II) sú označené výraznými čiarami a príslušnými písmenami.

Obrázok 10 zaznamenáva usporiadanie sekvencie nukleotidu v 3'koncovej nepreloženej (untranslated) oblasti z GLRaV-2 vzhľadom ku klosterovírusom BYV (Agranovsky a spol., „Beet Yellows Closteroviruses: Complete Genome Structure and Identification of Papain-like Thiol Protease, Virology 198:311-24 (1994), uvedené v citáciách), BYSV (Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996), uvedené v citáciách), a CTV (Karasev a spol., „Complete Sequence of the Citrus Tristeza Virus RNA Genome, Virology 208:511-20 (1995) , uvedené v citáciách) . Ukázané sú súhlasné sekvencie a je vyznačená vzdialenosť k 3'-zakončeniu. Komplementárna oblasť schopná tvorby „vlasovej štruktúry je podčiarknutá.

Obrázky 11A a 11B sú genetické mapy transformačných vektorov pGA482GG/EPT8CP-GLRaV-2 a pGA482G/EPT8CP-GLRaV-2. Ako je ukázané na obrázkoch 11A a 11B, expresná kazeta rastliny (EPT8CP-GLRaV-2), ktorá obsahuje 35S-zvýrazňovač dvojitého mozaikového vírusu karfiolu (CaMV), CaMV 35S-promótor, 5' počiatočnú sekvenciu RNA4 alfalfa mozaikového vírusu (ALMV), gén povrchového proteínu z GLRaV-2 (CP-GLRaV-2) a CaMV 35S 3' nepreloženej oblasti ako zakončenie, bola klónovaná do transformačného vektora pomocou EcoR I reštrikčného miesta. CP z GLRaV-2 bol klónovaný do rastlinného expresného vektora pomocou Nco I reštrikčného miesta.

Obrázok 12 je PCR analýza DNA molekúl extrahovaných z listov pokusných transgénnych rastlín použitím špecifických primérov CP génu z GLRaV-2 a NPT II génu. Gély farbené etidium bromidom ukazujú 720 bp amplifikovaný fragment DNA pre NPT II gén a 653 bp fragment DNA pre celú kódujúcu sekvenciu CP génu. Dráha 1, Ol74/Hae III DNA Marker; dráhy 2 až 6, transgénne rastliny z rôznych línií; dráha 7, cp gén z GLRaV2 ako pozitívnej kontroly; dráha 8, NPT II gén ako pozitívna kontrola.

Obrázok 13 zaznamenáva porovnanie rezistentných (tri rastliny vpravo) a citlivých (tri rastliny vľavo) transgénnych rastlín Nicotiana benthamiana. Rastliny sú 48 dní po inokulácii GLRaV-2.

Obrázok 14 je Northern blot analýza transgénnych rastlín Nicotiana benthamiana. Časť z 10 g celkovej RNA extrahovanej z pokusných transgénnych rastlín bola denaturovaná a nanesená na 1 % agarózový gél s obsahom formaldehydu. Rozdelené RNA boli prenesené na Gene Screen Plus membránu a hybridizované ³²P-označenou DNA sondou obsahujúcou 3' jednu tretinu génovej sekvencie CP. Dráhy 1, 3 a 4 zaznamenávajú netransformované kontrolné rastliny bez expresie RNA. Zostávajúce dráhy sú pre transgénne rastliny z rôznych línií: dráha 2, 14 až 17 a 22 až 27 sú rastliny s vysokou expresiou RNA, ktoré sú citlivé na GLRaV-2; ostatné pruhy predstavujú rastliny s nedetekovatelnou alebo nízkou expresiou RNA, ktoré sú rezistentné voči GLRaV-2.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález sa týka izolovaných molekúl DNA, ktoré kódujú proteíny alebo polypeptidy vírusu zvinutky viniča (typ 2). Bola sekvenovaná podstatná časť genómu vírusu zvinutky viniča (typ 2) („GLRaV-2). V genóme je vela čítacích rámcov („ORFs) a 3' neprepísaná oblasť („UTR), každá obsahuje molekuly DNA v súhlase s týmto vynálezom. Molekula DNA, ktorá tvorí podstatnú časť genómu GLRaV-2 obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ.ID.No 1:

Molekula DNA, ktorá tvorí podstatnú časť genómu GLRaV-2 má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.l:

TAAACATTGC GAGAGAACCC CATTAGCGTC TCCGGGGTGA ACTTGGGAAG GTCTGCCGCC 60

GCTCAGGTTA TTTATTTCGG CAGTTTCACG CAGCCCTTCG CGTTGTATCC GCGCCAAGAG 120

AGCGCGATCG TAAAAACGCA ACTTCCACCG GTCAGTGTAG TGAAGGTGGA GTGCGTAGCT 180

GCGGAGGTAG CTCCCGACAG GGGCGTGGTC GACAAGAAAC CTACGTCTGT TGGCGTTCCC 240

CCGCAGCGCG GTGTGCTTTC TTTTCCGACG GTGGTTCGGA ACCGCGGCGA CGTGATAATC 300

ACAGGGGTGG TGCATGAAGC CCTGAAGAAA ATTAAAGACG GGCTCTTACG CTTCCGCGTA 360

GGCGGTGACA TGCGTTTTTC GAGATTTTTC TCATCGAACT ACGGCTGCAG ATTCGTCGCG 420

AGCGTGCGTA CGAACACTAC AGTTTGGCTA AATTGCACGA AAGCGAGTGG TGAGAAATTC 480

TCACTCGCCG CCGCGTGCAC GGCGGATTAC GTGGCGATGC TGCGTTATGT GTGTGGCGGG 540

AAATTTCCAC TCGTCCTCAT GAGTAGAGTT ATTTACCCGG ATGGGCGCTG TTACTTGGCC 600

CATATGAGGT ATTTGTGCGC CTTTTACTGT CGCCCGTTTA GAGAGTCGGA TTATGCCCTC 660

GGAATGTGGC CTACGGTGGC GCGTCTCAGG GCATGCGTTG AGAAGAACTT CGGTGTCGAA 720

GCTTGTGGCA TAGCTCTTCG TGGCTATTAC ACCTCTCGCA ATGTTTATCA CTGTGATTAT 780

GACTCTGCTT ATGTAAAATA TTTTAGAAAC CTTTCCGGCC GCATTGGCGG TGGTTCGTTC 840

GATCCGACAT CTTTAACCTC CGTAATAACG GTGAAGATTA GCGGTCTTCC AGGTGGTCTT 900

CCTAAAAATA TAGCGTTTGG TGCCTTCCTG TGCGATATAC GTTACGTCGA ACCGGTAGAC 960

TCGGGCGGCA TTCAATCGAG CGTTAAGACG AAACGTGAAG ATGCGCACCG AACCGTAGAG 1020

GAACGGGCGG CCGGCGGATC GGTCGAGCAA CCGCGACAAA AGAGGATAGA TGAGAAAGGT 1080

TGCGGCAGAG TTCCTAGTGG AGGTTTTTCG CATCTCCTGG TCGGCAACCT TAACGAAGTT 1140

AGGAGGAAGG TAGCTGCCGG ACTTCTACGC TTTCGCGTTG GCGGTGATAT GGATTTTCAT 1200

CGCTCGTTCT CCACCCAAGT GGGCCACCGC TTGCTGGTGT GGCGCCGCTC GAGCCGGAGC 1260

GTGTGCCTTG AACTTTACTC ACCATCTAAA AACTTTTTGC GTTACGATGT CTTGCCCTGT 1320

TCTGGAGACT ATGCAGCGAT GTTTTCTTTC GCGGCGGGCG GCCGTTTCCC TTTAGTTTTG 1380

ATGACTAGAA TTAGATACCC GAACGGGTTT TGTTACTTGG CTCACTGCCG GTACGCGTGC 1440

GCGTTTCTCT TAAGGGGTTT TGATCCGAAG CGTTTCGACA TCGGTGCTTT CCCCACCGCG 1500

GCCAAGCTCA GAAACCGTAT GGTTTCGGAG CTTGGTGAAA GAAGTTTAGG TTTGAACTTG 1560

TACGGCGCAT ATACGTCACG CGGCGTCTTT CACTGCGATT ATGACGCTAA GTTTATAAAG 1620

GATTTGCGTC	TTATGTCAGC	AGTTATAGCT	GGAAAGGACG	GGGTGGAAGA	GGTGGTACCT	1680
TCTGACATAA	CTCCTGCCAT	GAAGCAGAAA	ACGATCGAAG	CCGTGTATGA	TAGATTATAT	1740
GGCGGCACTG	ACTCGTTGCT	GAAACTGAGC	ATCGAGAAAG	ACTTAATCGA	TTTCAAAAAT	1800
GACGTGCAGA	GTTTGAAGAA	AGATCGGCCG	ATTGTCAAAG	TGCCCTTTTA	CATGTCGGAA	1860
GCAACACAGA	ATTCGCTGAC	GCGTTTCTAC	CCTCAGTTCG	AACTTAAGTT	TTCGCACTCC	1920
TCGCATTCAG	ATCATCCCGC	CGCCGCCGCT	TCTAGACTGC	TGGAAAATGA	AACGTTAGTG	1980
CGCTTATGTG	GTAATAGCGT	TTCAGATATT	GGAGGTTGTC	CTCTTTTCCA	TTTGCATTCC	2040
AAGACGCAAA	GACGGGTTCA	CGTATGTAGG	CCTGTGTTGG	ATGGCAAGGA	TGCGCAGCGT	2100
CGCGTGGTGC	GTGATTTGCA	GTATTCCAAC	GTGCGTTTGG	GAGACGATGA	TAAAATTTTG	2160
GAAGGGCCAC	GCAATATCGA	CATTTGCCAC	TATCCTCTGG	GCGCGTGTGA	CCACGAAAGT	2220
AGTGCTATGA	TGATGGTGCA	GGTGTATGAC	GCGTCCCTTT	ATGAGATATG	TGGCGCCATG	2280
ATCAAGAAGA	AAAGCCGCAT	AACGTACTTA	ACCATGGTCA	CGCCCGGCGA	GTTTCTTGAG	2340
GGACGCGAAT	GCGTCTACAT	GGAGTCGTTA	GACTGTGAGA	TTGAAGTTGA	TGTGCACGCG	2400
GACGTCGTAA	TGTACAAATT	CGGTAGTTCT	TGCTATTCGC	ACAAGCTTTC	AATCATCAAG	2460
GACATCATGA	CCACTCCGTA	CTTGACACTA	GGTGGTTTTC	TATTCAGCGT	GGAGATGTAT	2520
GAGGTGCGTA	TGGGCGTGAA	TTACTTCAAG	ATTACGAAGT	CCGAAGTATC	GCCTAGCATT	2580
AGCTGCACCA	AGCTCCTGAG	ATACCGAAGA	GCTAATAGTG	ACGTGGTTAA	AGTTAAACTT	2640
CCACGTTTCG	ATAAGAAACG	TCGCATGTGT	CTGCCTGGGT	ATGACACCAT	ATACCTAGAT	2700
TCGAAGTTTG	TGAGTCGCGT	TTTCGATTAT	GTCGTGTGTA	ATTGCTCTGC	CGTGAACTCA	2760
AAAACTTTCG	AGTGGGTGTG	GAGTTTCATT	AAGTCTAGTA	AGTCGAGGGT	GATTATTAGC	2820
GGTAAAATAA	TTCACAAGGA	TGTGAATTTG	GACCTCAAGT	ACGTCGAGAG	TTTCGCCGCG	2880
GTTATGTTGG	CCTCTGGCGT	GCGCAGTAGA	CTAGCGTCCG	AGTACCTTGC	TAAGAACCTT	2940
AGTCATTTTT	CGGGAGATTG	CTCCTTTATT	GAAGCCACGT	CTTTCGTGTT	GCGTGAGAAA	3000
ATCAGAAACA	TGACTCTGAA	TTTTAACGAA	AGACTTTTAC	AGTTAGTGAA	GCGCGTTGCC	3060
TTTGCGACCT	TGGACGTGAG	TTTTCTAGAT	TTAGATTCAA	CTCTTGAATC	AATAACTGAT	3120
TTTGCCGAGT	GTAAGGTAGC	GATTGAACTC	GACGAGTTGG	GTTGCTTGAG	AGCGGAGGCC	3180
GAGAATGAAA	AAATCAGGAA	TCTGGCGGGA	GATTCGATTG	CGGCTAAACT	CGCGAGCGAG	3240
ATAGTGGTCG	ATATTGACTC	TAAGCCTTCA	CCGAAGCAGG	TGGGTAATTC	GTCATCCGAA	3300
AACGCCGATA	AGCGGGAAGT	TCAGAGGCCC	GGTTTGCGTG	GTGGTTCTAG	AAACGGGGTT	3360
GTTGGGGAGT	TCCTTCACTT	CGTCGTGGAT	TCTGCCTTGC	GTCTTTTCAA	ATACGCGACG	3420

GATCAACAAC	GGATCAAGTC	TTACGTGCGT	TTCTTGGACT	CGGCGGTCTC	ATTCTTGGAT	3480
TACAACTACG	ATAATCTATC	GTTTATACTG	CGAGTGCTTT	CGGAAGGTTA	TTCGTGTATG	3540
TTCGCGTTTT	TGGCGAATCG	CGGCGACTTA	TCTAGTCGTG	TCCGTAGCGC	GGTGTGTGCT	3600
GTGAAAGAAG	TTGCTACCTC	ATGCGCGAAC	GCGXGCGTTT	CTAAAGCCAA	GGTTATGATT	3660
ACCTTCGCAG	CGGCCGTGTG	TGCTATGATG	TTTAATAGCT	GCGGTTTTTC	AGGCGACGGT	3720
CGGGAGTATA	AATCGTATAT	ACATCGTTAC	ACGCAAGTAT	TGTTTGACAC	TATCTTTTTT	3780
GAGGACAGCA	GTTACCTACC	CATAGAAGTT	CTGAGTTCGG	CGATATGCGG	TGCTATCGTC	3840
ACACTTTTCT	CCTCGGGCTC	CTCCATAAGT	TTAAACGCCT	TCTTACTTCA	AATTACCAAA	3900
GGATTCTCCC	TAGAGGTTGT	CGTCCGGAAT	GTTGTGCGAG	TCACGCATGG	TTTGAGCACC	3960
ACAGCGACCG	ACGGCGTCAT	ACGTGGGGTT	TTCTCCCAAA	TTGTGTCTCA	CTTACTTGTT	4020
GGAAATACGG	GTAATGTGGC	TTACCAGTCA	GCTTTCATTG	CCGGGGTGGT	GCCTCTTTTA	4080
GTTAAAAAGT	GTGTGAGCTT	AATCTTCATC	TTGCGTGAAG	ATACTTATTC	CGGTTTTATT	4140
AAGCACGGAA	TCAGTGAATT	CTCTTTCCTT	AGTAGTATTC	TGAAGTTCTT	GAAGGGTAAG	4200
CTTGTGGACG	AGTTGAAATC	GATTATTCAA	GGGGTTTTTG	ATTCCAACAA	GCACGTGTTT	4260
AAAGAAGCTA	CTCAGGAAGC	GATTCGTACG	ACGGTCATGC	AAGTGCCTGT	CGCTGTAGTG	4320
GATGCCCTTA	AGAGCGCCGC	GGGAAAAATT	TATAACAATT	TTACTAGTCG	ACGTACCTTT	4380
GGTAAGGATG	AAGGCTCCTC	TAGCGACGGC	GCATGTGAAG	AGTATTTCTC	ATGCGACGAA	4440
GGTGAAGGTC	CGGGTCTGAA	AGGGGGTTCC	AGCTATGGCT	TCTCAATTTT	AGCGTTCTTT	4500
TCACGCATTA	TGTGGGGAGC	TCGTCGGCTT	ATTGTTAAGG	TGAAGCATGA	GTGTTTTGGG	4560
AAACTTTTTG	AATTTCTATC	GCTCAAGCTT	CACGAATTCA	GGACTCGCGT	TTTTGGGAAG	4620
AATAGAACGG	ACGTGGGAGT	TTACGATTTT	TTGCCCACGG	GCATCGTGGA	AACGCTCTCA	4680
TCGATAGAAG	AGTGCGACCA	AATTGAAGAA	CTTCTCGGCG	ACGACCTGAA	AGGTGACAAG	4740
GATGCTTCGT	TGACCGATAT	GAATTACTTT	GAGTTCTCAG	AAGACTTCTT	AGCCTCTATC	4800
GAGGAGCCGC	CTTTCGCTGG	ATTGCGAGGA	GGTAGCAAGA	ACATCGCGAT	TTTGGCGATT	4860
TTGGAATACG	CGCATAATTT	GTTTCGCATT	GTCGCAAGCA	ATGGTTCGAA	ACGACCTTTA	4920
TTTCTTGCTT	TCGCCGAACT	CTCAAGCGCC	CTTATCGAGA	AATTTAAGGA	GTTTTTCCCT	4980
CGTAAGAGCC	AGCTCGTCGC	TATCGTGCGC	GAGTATACTC	AGAGATTCCT	CCGAAGTCGC	5040
ATGCGTGCGT	TGGGTTTGAA	TAACGAGTTC	GTGGTAAAAT	CTTTCGCCGA	TTTGCTACCC	5100
GCATTAATGA	AGCGGAAGGT	TTCAGGTTGG	TTCTTAGCTA	GTGTTTATCG	CCCACTTAGA	5160
GGTTTCTCAT	ATATGTGTGT	TTCAGCGGAG	CGACGTGAAA	AGTTTTTTGC	TCTCGTGTGT	5220

TTAATCGGGT	TAAGTCTCCC	TTTCTTCGTG	CGCATCGTAG	GAGCGAAAGC	GTGCGAAGAA	5280
CTCGTGTCCT	CAGCGCGTCG	CTTTTATGAG	CGTATTAAAA	TTTTTCTAAG	GCAGAAGTAT	5340
GTCTCTCTTT	CTAATTTCTT	TTGTCACTTG	TTTAGCTCTG	ACGTTGATGA	CAGTTCCGCA	5400
TCTGCAGGGT	TGAAAGGTGG	TGCGTCGCGA	ATGACGCTCT	TCCACCTTCT	GGTTCGCCTT	5460
GCTAGTGCCC	TCCTATCGTT	AGGGTGGGAA	GGGTTAAAGC	TACTCTTATC	GCACCACAAC	5520
TTGTTATTTT	TGTGTTTTGC	ATTGGTTGAC	GATGTGAACG	TCCTTATCAA	AGTTCTTGGG	5580
GGTCTTTCTT	TCTTTGTGCA	ACCAATCTTT	TCCTTGTTTG	CGGCGATGCT	TCTACAACCG	5640
GACAGGTTTG	TGGAGTATTC	CGAGAAACTT	GTTACAGCGT	TTGAATTTTT	CTTAAAATGT	5700
TCGCCTCGCG	CGCCTGCACT	ACTCAAAGGG	TTTTTTGAGT	GCGTGGCGAA	CAGCACTGTG	5760
TCAAAAACCG	TTCGAAGACT	TCTTCGCTGT	TTCGGAAGA TGCTCAAACT TCGAAAAGGG	5820
CGAGGGTTGC	GTGCGGATGG	TAGGGGZCTC	CATCGGCAGA	AAGCCGTACC	CGTCATACCT	5880
TCTAATCGGG	TCGTGACCGA	CGGGGTTGAA	AGACTTTCGG	TAAAGATGCA	AGGACTTGAA	5940
GCGTTGCGTA	CCGAATTGAG	AATCTTAGAA	GATTTAGATT	CTGCCGTGAT	CGAAAAACTC	6000
AATAGACGCA	GAAATCGTGA	CACTAATGAC	GACGAATTTA	CGCGCCCTGC	TCATGAGCAG	6060
ATGCAAGAAG	TCACCACTTT	CTGTTCGAAA	GCCAACTCTG	CTGGTTTGGC	CCTGGAAAGG	6120
GCAGTGCTTG	TGGAAGACGC	TATAAAGTCG	GAGAAACTTT	CTAAGACGGT	TAATGAGATG	6180
GTGAGGAAAG	GGAGTACCAC	GAGCGAAGAA	GTGGCCGTCG	CTTTGTCGGA	CGATGAAGCC	6240
GTGGAAGAAA	TCTCTGTTGC	TGACGAGCGA	GACGATTCGC	CTAAGACAGT	CAGGATAAGC	6300
GAATACCTAA	ATAGGTTAAA	GTGAAGCTTC	GAATTCCCGA	AGCCTATTGT	TGTGGACGAC	6360
AACAAGGATA	CCGGGGGTCT	AACGAACGCC	GTGAGGGAGT	TTTATTATAT	GCAAGAACTT	6420
GCTCTTTTCG	AAATCCACAG	CAAACTGTGC	ACCTACTACG	ATCAACTGCG	CATAGTCAAC	6480
TTCGATCGTT	CCGTAGCACC	ATGCAGCGAA	GATGCTCAGC	TGTACGTACG	GAAGAACGGC	6540
TCAACGATAG	TGCAGGGTAA	AGAGGTACGT	TTGCACATTA	AGGATTTCCA	CGATCACGAT	6600
CACGACAACC	TCGCGTTCTT	GGCGAGTAAT	TTGTTCTTAG	CCGGCTACCC	CTTTTCAAGG	6660
CACGACAACC	TCGCGTTCTT	GGCGAGTAAT	TTGTTCTTAG	CCGGCTACCC	CTTTTCAAGG	6720
AGCTTCGTCT	TCACGAATTC	GTCGGTCGAT	ATTCTCCTCT	ACGAAGCTCC	ACCCGGAGGT	6780
GGTAAGACGA	CGACGCTGAT	TGACTCGTTC	TTGAAGGTCT	TCAAGAAAGG	TGAGGTTTCC	6840
ACCATGATCT	TAACCGCCAA	CAAAAGTTCG	CAGGTTGAGA	TCCTAAAGAA	AGTGGAGAAG	6900
GAAGTGTCTA	ACATTGAATG	CCAGAAACGT	AAAGACAAAA	GATCTCCGAA	AAAGAGCATT	6960
TACACCATCG	ACGCTTATTT	AATGCATCAC	CGTGGTTGTG	ATGCAGACGT	TCTTTTCATC	7020

GATGAGTGTT	TCATGGTTCA	TGCGGGTAGC	CTACTAGCTT	GCATTGAGTT	CACGAGGTGT	7080
CATAAAGTAA	TGATCTTCGG	GGATAGCCGG	CAGATTCACT	ACATTGAAAG	GAACGAATTG	7140
GACAAGTGTT	TGTATGGGGA	TCTCGACAGG	TTCGTGGACC	TGCAGTGTCG	GGTTTATGGT	7200
AATATTTCGT	ACCGTTGTCC	ATGGGATGTG	TGCGCTTGGT	TAAGCACAGT	GTATGGCAAC	7260
CTAATCGCCA	CCGTGAAGGG	TGAAAGCGAA	GGTAAGAGCA	GCATGCGCAT	TAACGAAATT	7320
AATTCAGTCG	ACGATTTAGT	CCCCGACGTG	GGTTCCACGT	TTCTGTGTAT	GCTTCAGTCG	7380
GAGAAGTTGG	AAATCAGCAA	GCACTTTATT	CGCAAGGGTT	TGACTAAACT	TAACGTTCTA	7440
ACGGTGCATG	AGGCGCAAGG	TGAGACGTAT	GCGCGTGTGA	ACCTTGTGCG	ACTTAAGTTT	7500
GAGGAGGATG	AACCCTTTAA	ATCTATCAGG	CACATAACCG	TCGCTCTTTC	TCGTCACACC	7560
GACAGCTTAA	CTTATAACGT	CTTAGCTGCT	CGTCGAGGTG	ACGCCACTTG	CGATGCCATC	7620
CAGAAGGCTG	CGGAATTGGT	GAACAAGTTT	CGCGTTTTTC	CTACATCTTT	TGGTGGTAGT	7680
GTTATCAATC	TCAACGTGAA	GAAGGACGTG	GAAGATAACA	GTAGGTGCAA	GGTTCGTCG	7740
GCACCATTGA	GCGTAATCAA	CGACTTTTTG	AACGAAGTTA	ATCCCGGTAC	TGCGGTGATT	7800
GATTTTGGTG	ATTTGTCCGC	GGACTTCAGT	ACTGGGCCTT	TTGAGTGCGG	TGCCAGCGGT	7860
ATTGTGGTGC	GGGACAACAT	CTCCTCCAGC	AACATCACTG	ATCACGATAA	GCAGCGTGTT	7920
TAGCGTAGTT	CGGTCGCAGG	CGATTCCGCG	TAGAAAACCT	TCTCTACAAG	AAAATTTGTA	7980
TTCGTTTGAA	GCGCGGAATT	ATAACTTCTC	GACTTGCGAC	CGTAACACAT	CTGCTTCAAT	8040
GTTCGGAGAG	GCTATGGCGA	TGAACTGTCT	TCGTCGTTGC	TTCGACCTAG	ATGCCTTTTC	8100
GTCCCTGCGT	GATGATGTGA	TTAGTATCAC	ACGTTCAGGC	ATCGAACAAT	GGCTGGAGAA	8160
ACGTACTCCT	AGTCAGATTA	AAGCATTAAT	GAAGGATGTT	GAATCGCCTT	TGGAAATTGA	8220
CGATGAAATT	TGTCGTTTTA	AGTTGATGGT	GAAGCGTGAC	GCTAAGGTGA	AGTTAGACTC	8280
TTCTTGTTTA	ACTAAACACA	GCGCCGCTCA	AAATATCATG	TTTCATCGCA	AGAGCATTAA	8340
TGCTATCTTC	TCTCCTATCT	TTAATGAGGT	GAAAAACCGA	ATAATGTGCT	GTCTTAAGCC	8400
TAACATAAAG	TTTTTTACGG	AGATGACTAA	CAGGGATTTT	GCTTCTGTTG	TCAGCAACAT	8460
GCTTGGTGAC	GACGATGTGT	ACCATATAGG	TGAAGTTGAT	TTCTCAAAGT	ACGACAAGTC	8520
TCAAGATGCT	TTCGTGAAGG	CTTTTGAAGA	AGTAATGTAT	AAGGAACTCG	GTGTTGATGA	8580
AGAGTTGCTG	GCTATCTGGA	TGTGCGGCGA	GCGGTTATCG	ATAGCTAACA	CTCTCGATGG	8640
TCAGTTGTCC	TTCACGATCG	AGAATCAAAG	GAAGTCGGGA	GCTTCGAACA	CTTGGATTGG	8700
TAACTCTCTC	GTCACTTTGG	GTATTTTAAG	TCTTTACTAC	GACGTTAGAA	ATTTCGAGGC	8760
GTTGTACATC	TCGGGCGATC	ATTCTTTAAT	TTTTTCTCGC	AGCGAGATTT	CGAATTATGC	8820

CGACGACATA TGCACTGACA TGGGTTTTGA GACAAAATTT ATGTCCCCAA GTGTCCCGTA	8880
CTTTTGTTCT AAATTTGTTG TTATGTGTGG TCATAAGACG TTTTTTGTTC CCGACCCGTA	8940
CAAGCTTTTT GTCAAGTTGG GAGCAGTCAA AGAGGATGTT TCAATGGATT TCCTTTTCGA	9000
GACTTTTACC TCCTTTAAAG ACTTAACCTC CGATTTTAAC GACGAGCGCT TAATTCAAAA	9060
GCTCGCTGAA CTTGTGGCTT TAAAATATGA GGTTCAAACC GGAACACCA CCTTGGCGTT	9120
AAGTGTGATA CATTGTTTGC GTTCGAATTT CCTCTCGTTT AGCAAGTTAT ATCCTCGCGT	9180
GAAGGGATGG CAGGTTTTTT ACACGTCGGT TAAGAAAGCG CTTCTCAAGA GTGGGTGTTC	9240
TCTCTTCGAC AGTTTCATGA CCCCTTTTGG TCAGGCTGTC ATGGTTTGGG ATGATGAGTA	9300
GCGCTAACTT GTGCGCAGTT TCTTTGTTCG TGACATACAC CTTGTGTGTC ACCGTGCGTT	9360
TATAATGAAT CAGGTTTTGC AGTTTGAATG TTTGTTTCTG CTGAATCTCG CGGTTTTTGC	9240
TGTGACTTTC ATTTTCATTC TTCTGGTCTT CCGCGTGATT AAGTCTTTTC GCCAGAAGGG	9480
TCACGAAGCA CCTGTTCCCG TTGTTCGTGG CGGGGGTTTT TCAACCGTAG TGTAGTCAAA	9540
AGACGCGCAT ATGGTAGTTT TCGGTTTGGA CTTTGGCACC ACATTCTCTA CGGTGTGTGT	9600
GTACAAGGAT GGACGAGTTT TTTCATTCAA GCAGAATAAT TCGGCGTACA TCCCCACTTA	9660
CCTCTATCTC TTCTCCGATT CTAACCACAT GACTTTGGT TACGAGGCCG AATCACTGAT	9720
GAGTAATCTG AAAGTTAAAG GTTCGTTTTA TAGAGATTTA AAACGTTGGG TGGGTTGCGA	9780
TTCGAGTAAC CTCGACGCGT ACCTTGACCG TTTAAAACCT CATTACTCGG TCCGCTTGGT	9840
TAAGATCGGC TCTGGCTTGA ACGAAACTGT TTCAATTGGA AACTTCGGGG GCACTGTTAA	9900
GTCTGAGGCT CATCTGCCAG GGTTGATAGC TCTCTTTATT AAGGCTGTCA TTAGTTGCGC	9960
GGAGGGCGCG TTTGCGTGCA CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA	10020
TAGCGTTCAA AGGAATTTCA CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA	10080
TATGATCAAT GAACCTTCAG CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC	10140
CGCAAATTTG GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA	10200
CCGCAACAAT ACTTTTGTTG TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA	10260
TGTTGATCGT GCGTTTCTCA CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC	10320
TTTGGATATC TCGAATCTGA AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC	10380
TTTGAGAGGT GTCGATGGAA GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC	10440
GGTGATGCTC CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA	10500
TGCTAAGAGT ATGAATGAGA GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC	10560
TTCATATCTT CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG ATCGTATCTT	10620

AAGAGTTTCG	GATCCTCGGG	CTGCCGTGGC	CGTCGGTTGC	GCATTATATT	CTTCATGCCT	10680
CTCAGGATCT	GGGGGGTTGC	TACTGATCGA	CTGTGCAGCT	CACACTGTCG	CTATAGCGGA	10740
CAGAAGTTGT	CATCAAATCA	TTTGCGCTCC	AGCGGGGGCA	CCGATCCCCT	TTTCAGGAAG	10800
CATGCCTTTG	TACTTAGCCA	GGGTCAACAA	GAACTCGCAG	CGTGAAGTCG	CCGTGTTTGA	10860
AGGGGAGTAC	GTTAAGTGCC	CTAAGAACAG	AAAGATCTGT	GGAGCAAATA	TAAGATTTTT	10920
TGATATAGGA	GTGACGGGTG	ATTCGTACGC	ACCCGTTACC	TTCTATATGG	ATTTCTCCAT	10980
TTCAAGCGTA	GGAGCCGTTT	CATTCGTGGT	GAGAGGTCCT	GAGGGTAAGC	AAGTGTCACT	11040
CACTGGAACT	CCAGCGTATA	ACTTTTCGTC	TGTGGCTCTC	GGATCACGCA	GTGTCCGAGA	11100
ATTGCATATT	AGTTTAAATA	ATAAAGTTTT	TCTCGGTTTG	CTTCTACATA	GAAAGGCGGA	11160
TCGACGAATA	CTTTTCACTA	AGGATGAAGC	GATTCGATAC	GCCGATTCAA	TTGATATCGC	11220
GGATGTGCTA	AAGGAATATA	AAAGTTACGC	GGCCAGTGCC	TTACCACCAG	ACGAGGATGT	11280
CGAATTACTC	CTGGGAAAGT	CTGTTCAAAA	AGTTTTACGG	GGAAGCAGAC	TGGAAGAAAT	11340
ACCTCTCTAG	GAGCATAGCA	GCACACTCAA	GTGAAATTAA	AACTCTACCA	GACATTCGAT	11400
TGTACGGCGG	TAGGGTTGTA	AAGAAGTCCG	AATTCGAATC	AGCACTTCCT	AATTCTTTTG	11460
AACAGGAATT	AGGACTGTTC	ATACTGAGCG	AACGGGAAGT	GGGATGGAGC	AAATTATGCG	11520
GAATAACGGT	GGAAGAAGCA	GCATACGATC	TTACGAATCC	CAAGGCTTAT	AAATTCACTG	11580
CCGAGACATG	TAGCCCGGAT	GTAAAAGGTG	AAGGACAAAA	ATACTCTATG	GAAGACGTGA	11640
TGAATTTCAT	GCGTTTATCA	AATCTGGATG	TTAACGACAA	GATGCTGACG	GAACAGTGTT	11700
GGTCGCTGTC	CAATTCATGC	GGTGAATTGA	TCAACCCAGA	CGACAAAGGG	CGATTCGTGG	11760
CTCTCACCTT	TAAGGACAGA	GACACAGCTG	ATGACACGGG	TGCCGCCAAC	TGTTAATGTC	11820
GCGTGGGCGA	CRATCTAGTT	TACGCTATGT	CCCTGTTTGA	GCAGAGGACC	CAAAAATCGC	11880
AGTCTGGCAA	CATCTCTCTG	TACGAAAAGT	ACTGTGAATA	CATCAGGACC	TACTTAGGGA	11940
GTACAGACCT	CTTCTTCACA	GCGCCGGACA	GGATTCCGTT	ACTTACGGGC	ATCCTATACG	12000
ATTTTTGTAA	GGAATACAAC	GTTTTCTACT	CGTCATATAA	GAGAAACGTC	GATAATTTCA	12060
GATTCTTCTT	GGCGAATTAT	ATGCCTTTGA	TATCTGACGT	CTTTGTCTTC	CAGTGGGTAA	12120
AACCCGCGCC	GGATGTTCGG	CTGCTTTTTG	AGTTAAGTGC	AGCGGAACTA	ACGCTGGAGG	12180
TTCCCACACT	GAGTTTGATA	GATTCTCAAG	TTGTGGTAGG	TCATATCTTA	AGATACGTAG	12240
AATCCTACAC	ATCAGATCCA	GCCATCGACG	CGTTAGAAGA	CAAACTGGAA	GCGATACTGA	12300
AAAGTAGCAA	TCCCCGTCTA	TCGACAGCGC	AACTATGGGT	TGGTTTCTTT	TGTTACTATG	12360
GTGAGTTTCG	TACGGCTCAA	AGTAGAGTAG	TGCAAAGACC	AGGCGTATAC	AAAACACCTG	12420

ACTCAGTGGG	TGGATTTGAA	ATAAACATGA	AAGATGTTGA	GAAATTCTTC	GATAAACTTC	12480
AGAGAGAATT	GCCTAATGTA	TCTTTGCGGC	GTCAGTTTAA	CGGAGCTAGA	GCGCATGAGG	12540
CTTTCAAAAT	ATTTAAAAAC	GGAAATATAA	GTTTCAGACC	TATATCGCGT	TTAAACGTGC	12600
CTAGAGAGTT	CTGGTATCTG	AACATAGACT	ACTTCAGGCA	CGCGAATAGG	TCCGGGTTAA	12660
CCGAAGAAGA	AATACTCATC	CTAAACAACA	TAAGCGTTGA	TGTTAGGAAG	TTATGCGCTG	12720
AGAGAGCGTG	CAATACCCTA	CCTAGCGCGC	AGCGCTTTAG	TAAAAATCAT	AAGAGTAATA	12780
TACAATCATC	ACGCCAAGAG	CGGAGGATTA	AAGACCCATT	GGTAGTCCTG	AAAGACACTT	12840
TATATGAGTT	CCAACACAAG	CGTGCCGGTT	GGGGGTCTCG	AAGCACTCGA	GACCTCGGGA	12900
GTCGTGCTGA	CCACGCGAAA	GGAAGCGGTT	GATAAGTTTT	TTAATGAACT	AAAAAACGAA	12960
AATTACTCAT	CAGTTGACAG	CAGCCGATTA	AGCGATTCGG	AAGTAAAAGA	AGTGTTAGAG	13020
AAAAGTAAAG	AAAGTTTCAA	AAGCGAACTG	GCCTCCACTG	ACGAGCACTT	CGTCTACCAC	13080
ATTATATTTT	TCTTAATCCG	ATGTGCTAAG	ATATCGACAA	GTGAAAAGGT	GAAGTACGTT	13140
GGTAGTCATA	CGTACGTGGT	CGACGGAAAA	ACGTACACCG	TTCTTGACGC	TTGGGTATTC	13200
AACATGATGA	AAAGTCTCAC	GAAGAAGTAC	AAACGAGTGA	ATGGTCTGCG	TGCGTTCTGT	13260
TGCGCGTGCG	AAGATCTATA	TCTAACCGTC	GCACCAATAA	TGTCAGAACG	CTTTAAGACT	13320
AAAGCCGTAG	GGATGAAAGG	TTTGCCTGTT	GGAAAGGAAT	ACTTAGGCGC	CGACTTTCTT	13380
TCGGGAACTA	GCAAACTGAT	GAGCGCTCAC	GACAGGGCGG	TCTCCATCGT	TGCAGCGAAA	13340
AACGCTGTCG	ATCGTAGCGC	TTTCACGGGT	GGGGAGAGAA	AGATAGTTAG	TTTGTATGAT	13500
CTAGGGAGGT	ACTAAGCACG	GTGTGCTATA	GTGCGTGCTA	TAATAATAAA	CACTAGTGCT	13560
TAAGTCGCGC	AGAAGAAAAC	GCTATGGAGT	TGATGTCCGA	CAGCAACCTT	AGCAACCTGG	13620
TGATAACCGA	CGCCTCTAGT	CTAAATGGTG	TCGACAAGAA	GCTTTTATCT	GCTGAAGTTG	13680
AAAAAATGTT	GGTGCAGAAA	GGGGCTCCTA	ACGAGGGTAT	AGAAGTGGTG	TTCGGTCTAC	13740
TCCTTTACGC	ACTCGCGGCA	AGAACCACGT	CTCCTAAGGT	TCAGCGCGCA	GATTCAGACG	13800
TTATATTTTC	AAATAGTTTC	G GAGAGAG GA	ATGTGGTAGT	AACAGAGGGT	GACCTTAAGA	13860
AGGTACTCGA	CGGGTGTGCG	CCTCTCACTA	GGTTCACTAA	TAAACTTAGA	ACGTTCGGTC	13920
GTACTTTCAC	TGAGGCTTAC	GTTGACTTTT	GTATCGCGTA	TAAGCACAAA	TTACCCCAAC	13980
TCAACGCCGC	GGCGGAATTG	GGGATTCCAG	CTGAAGATTC	CTACTTAGCT	GCAGATTTTC	14040
TGGGTACTTG	CCCGAAGCTC	TCTGAATTAC	AGCAAAGTAG	GAAGATGTTC	GCGAGTATGT	14100
ACGCTCTAAA	AACTGAAGGT	GGAGTGGTAA	ATACACCAGT	GAGCAATCTG	CGTCAGCTAG	14160
GTAGAAGGGA	AGTTATGTAA	TGGAAGATTA	CGAAGAAAAA	TCCGAATCGC	TCATACTGCT	14220

ACGCACGAAT	CTGAACACTA	TGCTTTTAGT	GGTCAAGTCC	GATGCTAGTG	TAGAGCTGCC	14280
TAAACTACTA	ATTTGCGGTT	ACTTACGAGT	GTCAGGACGT	GGGGAGGTGA	CGTGTTGCAA	14340
CCGTGAGGAA	TTAACAAGAG	ATTTTGAGGG	CAATCATCAT	ACGGTGATCC	GTTCTAGAAT	14400
CATACAATAT	GACAGCGAGT	CTGCTTTTGA	GGAATTCAAC	AACTCTGATT	GCGTAGTGAA	14460
GTTTTTCCTA	GAGACTGGTA	GTGTCTTTTG	GTTTTTCCTT	CGAAGTGAAA	CCAAAGGTAG	14520
AGCGGTGCGA	CATTTGCGCA	CCTTCTTCGA	AGCTAACAAT	TTCTTCTTTG	GATCGCATTG	14580
CGGTACCATG	GAGTATTGTT	TGAAGCAGGT	ACTAACTGAA	ACTGAATCTA	TAATCGATTC	14640
TTTTTGCGAA	GAAAGAAATC	GTTAAGATGA	GGGTTATAGT	GTCTCCTTAT	GAAGCTGAAG	14700
ACATTCTGAA	AAGATCGACT	GACATGTTAC	GAAACATAGA	GAGTGGGGTC	TTGAGCACTA	14760
AAGAATGTAT	CAAGGCATTC	TCGACGATAA	CGCGAGACCT	ACATTGTGCG	AAGGCTTCCT	14820
ACCAGTGGGG	TGTTGACACT	GGGTTATATC	AGCGTAATTG	CGCTGAAAAA	CGTTTAATTG	14880
ACACGGTGGA	GTCAAACATA	CGGTTGGCTC	AACCTCTCGT	GCGTGAAAAA	GTGGCGGTTC	14940
ATTTTTGTAA	GGATGAACCA	AAAGAGCTAG	TAGCATTCAT	CACGCGAAAG	TACGTGGAAC	15000
TCACGGGCGT	GGGAGTGAGA	GAAGCGGTGA	AGAGGGAAAT	GCGCTCTCTT	ACCAAAACAG	15060
TTTTAAATAA	AATGTCTTTG	GAAATGGCGT	TTTACATGTC	ACCACGAGCG	TGGAAAAACG	15120
CTGAATGGTT	AGAACTAAAA	TTTTCACCTG	TGAAAATCTT	TAGAGATCTG	CTATTAGACG	15180
TGGAAACGCT	CAACGAATTG	TGCGCCGAAG	ATGATGTTCA	CGTCGACAAA	GTAAATGAGA	15240
ATGGGGACGA	AAATCACGAC	CTCGAACTCC	AAGACGAATG	TTAAACATTG	GTTAAGTTTA	15300
ACGAAAATGA	TTAGTAAATA	ATAAATCGAA	CGTGGGTGTA	TCTACCTGAC	GTATCAACTT	15360
AAGCTGTTAC	TGAGTAATTA	AACCAACAAG	TGTTGGTGTA	ATGTGTATGT	TGATGTAGAG	15420
AAAAATCCGT	TTGTAGAACG	GTGTTTTTCT	CTTCTTTATT	TTTAAAAAAA	AAATAAAAAA	15480
AAAAAAAAAA	AAGCGGCCGC					15500

Iná molekula DNA podľa tohoto vynálezu (GLRaV-2 ORFla) obsahuje nukleotidy 4-7923 zo SEQ.ID.No.l a verí sa, že kóduje polypeorvín vírusu závitky viniča s obsahom konzervatívnych znakov domén pre papaínu podobné proteázy, metyltransferázu a helikázu. Táto molekula DNA obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá SEQ.ID.No.2:

ACATTGCGAG AGAACCCCT TAGCGTCTCC GGGGTGAACT TGGGAAGGTC TGCCGCCGCT 60

CAGGTTATTT ATTTCGGCAG TTTCACGCAG CCCTTCGCGT TGTATCCGCG CCAAGAGAGC

120

GCGATCGTAA AAACGCAACT TCCACCGGTC AGTGTAGTA AGGTGGAGTG CGTAGCTGCG 180

GAGGTAGCTC CCGACAGGGG CGTGGTCGAC AAGAAACCTA CGTCTGTTGG CGTTCCCCCG 240

CAGCGCGGTG TGCTTTCTTT TCCGACGGTG GTTCGGAACC GCGGCGACGT GATAATCACA 300

GGGGTGGTGC ATGAAGCCCT GAAGAAAATT AAAGACGGGC TCTTACGCTT CCGCGTAGGC 360

GGTGACATGC GTTTTTCGAG ATTTTTCTCA TCGAACTACG GCTGCAGATT CGTCGCGAGC 420

GTGCGTACGA ACACTACAGT TTGGCTAAAT TGCACGAAAG CGAGTGGTGA GAAATTCTCA 480

CTCGCCGCCG CGTGCACGGC GGATTACGTG GCGATGCTGC GTTATGTGTG TGGCGGGAAA 540

TTTCCACTCG TCCTCATGAG TAGAGTTATT TACCCGGATG GGCGCTGTTA CTTGGCCCAT 600

ARGAGGTATT TGTGCGCCTT TTACTGTCGC CCGTTTAGAG AGTCGGATTA TGCCCTCGGA 660

ATGTGGCCTA CGGTGGCGCG TCTCAGGGCA TGCGTTGAGA AGAACTTCGG TGTCGAAGCT 720

TGTGGCATAG CTCTTCGTGG CTATTACACC TCTCGCAATG TTTATCACTG TGATTATGAC 780

TCTGCTTATG TAAAATATTT TAGAAACCTT TCCGGCCGCA TTGGCGGTGG TTCGTTCGAT 840

CCGACATCTT TAACCTCCGT AATAACGGTG AAGATTAGCG GTCTTCCAGG TGGTCTTCCT 900

AAAAATATAG CGTTTGGTGC CTTCCTGTGC GATATACGTT ACGTCGAACC GGTAGACTCG 960

GGCGGCATTC AATCGAGCGT TAAGACGAAA CGTGAAGATG CGCACCGAAC CGTAGAGGAA 1020

CGGGCGGCCG GCGGATCCGT CGAGCAACCG CGACAAAAGA GGATAGATGA GAAAGGTTGC 1080

GGCAGAGTTC CTAGTGGAGG TTTTTCGCAT CTCCTGGTCG GCAACCTTAA CGAAGTTAGG 1140

AGGAAGGTAG CTGCCGGACT TCTACGCTTT CGCGTTGGCG GTGATATGGA TTTTCATCGC 1200

TCGTTCTCCA CCCAAGCGGG CCACCGCTTG CTGGTGTGGC GCCGCTCGAG CCGGAGCGTG 1260

TGCCTTGAAC TTTACTCACC ATCTAAAAAC TTTTTGCGTT ACGATGTCTT GCCCTGTTCT 1320

GGAGACTATG CAGCGATGTT TTCTTTCGCG GCGGGCGGCC GTTTCCCTTT AGTTTTGATG 1380

ACTAGAATTA GATACCCGAA CGGGTTTTGT TACTTGGCTC ACTGCCGGTA CGCGTGCGCG 1440

TTTCTCTTAA GGGGTTTTGA TCCGAAGCGT TTCGACATCG GTGCTTTCCC CACCGCGGCC 1500

AAGCTCAGAA ACCGTATGGT TTCGGAGCTT GGTGAAAGAA GTTTAGGTTT GAACTTGTAC 1560

GGCGCATATA CGTCACGCGG CGTCTTTCAC TGCGATTATG ACGCTAAGTT TATAAAGGAT 1620

TTGCGTCTTA TGTCAGCAGT TATAGCTGGA AAGGACGGGG TGGAAGAGGT GGTACCTTCT 1680

GACATAACTC CTGCCATGAA GCAGAAAACG ATCGAAGCCG TGTATGATAG ATTATATGGC 1740

GGCACTGACT CGTTGCTGAA ACTGAGCATC GAGAAAGACT TAATCGATTT CAAAAATGAC 1800

GTGCAGAGTT	TGAAGAAAGA	TCGGCCGATT	GTCAAAGTGC	CCTTTTACAT	GTCGGAAGCA	1860
ACACAGAATT	CGCTGACGCG	TTTCTACCCT	CAGTTCGAAC	TTAAGTTTTC	GCACTCCTCG	1920
CATTCAGATC	ATCCCGCCGC	CGCCGCTTCT	AGACTGCTGG	AAAATGAAAC	GTTAGTGCGC	1980
TTATGTGGTA	ATAGCGTTTC	AGATATTGGA	GGTTGTCCTC	TTTTCCATTT	GCATTCCAAG	2040
ACGCAAAGAC	GGGTTCACGT	ATGTAGGCCT	GTGTTGGATG	GCAAGGATGC	GCAGCGTCGC	2100
GTGGTGCGTG	ATTTGCAGTA	TTCCAACGTG	CGTTTGGGAG	ACGATGATAA	aattttggaa	2160
GGGCCACGCA	ATATCGACAT	TTGCCACTAT	CCTCTGGGCG	CGTGTGACCA	CGAAAGTAGT	2220
GCTATGATGA	TGGTGCAGGT	GTATGACGCG	TCCCTTTATG	AGATATGTGG	CGCCATGATC	2280
AAGAAGAAAA	GCCGCATAAC	GTACTTAACC	ATGGTCACGC	CCGGCGAGTT	TCTTGACGGA	2340
CGCGAATGCG	TCTACATGGA	GTCGTTAGAC	TGTGAGATTG	AAGTTGATGT	GCACGCGGAC	2400
GTCGTAATGT	ACAAATTCGG	TAGTTCTTGC	TATTCGCACA	AGCTTTCAAT	CATCAAGGAC	2460
ATCATGACCA	CTCCGTACTT	GACACTAGGT	GGTTTTCTAT	TCAGCGTGGA	GATGTATGAG	2520
GTGCGTATGG	GCGTGAATTA	CTTCAAGATT	ACGAAGTCCG	AAGTATCGCC	TAGCATTAGC	2580
TGCACCAAGC	TCCTGAGATA	CCGAAGAGCT	AATAGTGACG	TGGTTAAAGT	TAAACTTCCA	2640
CGTTTCGATA	AGAAACGTCG	CATGTGTCTG	CCTGGGTATG	ACACCATATA	CCTAGATTCG	2700
AAGTTTGTGA	GTCGCGTTTT	CGATTATGTC	GTGTGTAATT	GCTCTGCCGT	GAACTCAAAA	2760
ACTTTCGAGT	GGGTGTGGAG	TTTCATTAAG	TCTAGTAAGT	CGAGGGTGAT	TATTAGCGGT	2820
AAAATAATTC	ACAAGGATGT	GAATTTGGAC	CTCAAGTACG	TCGAGAGTTT	CGCCGCGGTT	2880
ATGTTGGCCT	CTGGCGTGCG	CAGTAGACTA	GCGTCCGAGT	ACCTTGCTAA	GAACCTTAGT	2940
CATTTTTCGG	GAGATTGCTC	CTTTATTGAA	GCCACGTCTT	TCGTGTTGCG	TGAGAAAATC	3000
AGAAACATGA	CTCTGAATTT	TAACGAAAGA	CTTTTACAGT	TAGTGAAGCG	CGTTGCCTTT	3060
GCGACCTTGG	ACGTGAGTTT	TCTAGATTTA	GATTCAACTC	TTGAATCAAT	AACTGATTTT	3120
GCCGAGTGTA	AGGTAGCGAT	TGAACTCGAC	GAGTTGGGTT	GCTTGAGAGC	GGAGGCCGAG	3180
AATGAAAAAA	TCAGGAATCT	GGCGGGAGAT	TCGATTGCGG	CTAAACTCGC	GAGCGAGATA	3240
GTGGTCGATA	TTGACTCTAA	GCCTTCACCG	AAGCAGGTGG	GTAATTCGTC	ATCCGAAAAC	3300
GCCGATAAGC	GGGAAGTTCA	GAGGCCCGGT	TTGCGTGGTG	GTTCTAGAAA	CGGGGTTGTT	3360
GGGGAGTTCC	TTCACTTCGT	CGTGGATTCT	GCCTTGCGTC	TTTTCAAATA	CGCGACGGAT	3420
CAACAACGGA	TCAAGTCTTA	CGTGCGTTTC	TTGGACTCGG	CGGTCTCATT	CTTGGATTAC	3480

AACTACGATA	ATCTATCGTT	TATACTGCGA GTGCTTTCGG AAGGTTATTC	GTGTATGTTC	3540
GCGTTTTTGG	CGAATCGCGG	CGACTTATCT AGTCGTGTCC GTAGCGCGGT	GTGTGCTGTG	3600
AAAGAAGTTG	CTACCTCATG	CGCGAACGCG AGCGTTTCTA AAGCCAAGGT	TATGATTACC	3660
TTCGCAGCGG	CCGTGTGTGC	TATGATGTTT AATAGCTGCG GTTTTTCAGG	CGACGGTCGG	3720
GAGTATAAAT	CGTATATACA	TCGTTACACG CAAGTATTGT TTGACACTAT	CTTTTTTGAG	3780
GACAGCAGTT	ACCTACCCAT	AGAAGTTCTG AGTTCGGCGA TATGCGGTGC	TATCGTCACA	3840
CTTTTCTCCT	CGGGCTCGTC	CATAAGTTTA AACGCCTTCT TACTTCAAAT	TACCAAAGGA	3900
TTCTCCCTAG	AGGTTGTCGT	CCGGAATGTT TGTCGAGTCA CGCATGGTTT	GAGCACCACA	3960
GCGACCGACG	GCGTCATACG	TGGGGTTTTC TCCCAAATTG TGTCTCACTT	ACTTGTTGGA	4020
AATACGGGTA	ATGTGGCTTA	CCAGTCAGCT TTCATTGCCG GGGTGGTGCC	TCTTTTAGTT	4080
AAAAAGTGTG	TGAGCTTAAT	CTTCATCTTG CGTGAAGATA CTTATTCCGG	TTTTATTAAT	4140
CACGGAATCA	GTGAATTCTC	TTTCCTTAGT AGTATTCTGA AGTTCTTGAA	GGGTAAGCTT	4200
GTGGACGAGT	TGAAATCGAT	TATTCAAGGG GTTTTTGATT CCAACAAGCA	CGTGTTTAAA	4260
GAAGCTACTC	AGGAAGCGAT	TCGTACGACG GTCATGCAAG TGCCTGTCGC	TGTAGTGGAT	4320
GCCCTTAAGA	GCGCCGCGGG	AAAAATTTAT AACAATTTTA CTAGTCGACG	TACCTTTGGT	4380
AAGGATGAAG	GCTCCTCTAG	CGACGGCGCA TGTGAAGAGT ATTTCTCATG	GGACGAAGGT	4440
GAAGGTCCGG	GTGTGAAAGG	GGGTTCCAGC TATGGCTTCT CAATTTTAGC	gttcttttca	4500
CGCATTATGT	GGGGAGCTCG	TCGGCTTATT GTTAAGGTGA AGCATGAGTG	TTTTGGGAAA	4560
CTTTTTGAAT	TTCTATCGCT	CAAGCTTCAC GAATTCAGGA CTCGCGTTTT	TGGGAAGAAT	4620
AGAACGGACG	TGGGAGTTTA	CGATTTTTG AAAACGGGCA TCGTGGAAAC GCTCTCATCG	4680
ATAGAAGAGT	GCGACCAAAT	TGAAGAACTT CTCGGCGACG ACCTGAAAGG	TGACAAGGAT	4740
GCTTCGTTGA	CCGATATGAA	TTACTTTGAG TTCTCAGAAG ACTTCTTAGC	ATATATCGAG	4800
GAGCCGCCTT	TCGCTGAATT	GCGAGGAGGT AGCAAGAACA TCGCGATTTT	GGCGATTTTG	4860
GAATACGCGC	ATAATTTGTT	TCGCATTGTC GCAAGCAAGT GTTCGAAACG	ACCTTTATTT	4920
CTTGCTTTCG	CCGAACTCTC	AAGCGCCCTT ATCGAGAAAT TTAAGGAGGT	TTTCCCTCGT	4980
AAGAGCCAGC	TCGTCGCTAT	CGTGCGCGAG TATACTCAGA GATTCCTCCG	AAGTCGCATG	5040
CGTGCGTTGG	GTTTGAATAA	CGAGTTCGTG GTAAAATCTT TCGCCGATTT	GCTACCCGCA	5100
TTAATGAAGC	GGAAGGTTTC	AGGTTCGTTC TTAGCTAGTG TTTATCGCCC	ACTTAGAGGT	5160

TTCTCATATA	TGTGTGTTTC	AGCGGAGCGA	CGTGAAAAGT	TTTTTGCTCT	CGTGZGTTTA	5220
ATCGGGTTAA	GTCTCCCTTT	CTTCGTGCGC	ATCGTAGGAG	CGAAAGCGTG	CGAAGAACTC	5280
GTGTCCTCAG	CGCGTCGCTT	TTATGAGCGT	ATTAAAATTT	TTCTAAGGCA	GAAGTATGTC	5340
TCTCTTTCTA	ATTTCTTTTG	TCACTTGTTT	AGCTCTGACG	TTGATGACAG	TTCCGCATCT	5400
GCAGGGTTGA	AAGGTGGTGC	GTCGCGAATG	ACGCTCTTCC	ACCTTCTGGT	TCGCCTTGCT	5460
AGTGCCCTCC	TATCGTTAGG	GTGGGAAGGG	TTAAAGCTAC	TCTTATCGCA	CCACAACTTG	5520
TTATTTTTGT	GTTTTGCATT	GGTTGACGAT	GTGAACGTCC	TTATCAAAGT	TCTTGGGGGT	5580
CTTTCTTTCT	TTGTGCAACC	AATCTTTTCC	TTGTTTGCGG	CGATGCTTCT	ACAACCGGAC	5640
AGGTTTGTGG	AGTATTCCGA	GAAACTTGTT	ACAGCGTTTG	AATTTTTCTT	AAAATGTTCG	5700
CCTCGCGCGC	CTGCACTACT	CAAAGGGTTT	TTTGAGTGCG	TGGCGAACAG	CACTGTGTCA	5760
AAAACCGTTC	GAAGACTTCT	TCGCTGTTTC	GTGAAGATGC	TCAAACTTCG	AAAAGGGCGA	5820
GGGTTGCGTG	CGGATGGTAG	GGGTCTCCAT	CGGCAGAAAG	CCGTACCCGT	CATACCTTCT	5880
AATCGGGTCG	TGACCGACGG	GGTTGAAAGA	CTTTCGGTAA	AGATGCAAGG	AGTTGAAGCG	5940
TTGCGTACCG	AATTGAGAAT	CTTAGAAGAT	TTAGATTCTG	CCGTGATCGA	AAAACTCAAT	6000
AGACGCAGAA	ATCGTGACAC	TAATGACGAC	GAATTTACGC	GCCCTGCTCA	TGAGCAGATG	6060
CAAGAAGTCA	CCACTTTCTG	TTCGAAAGCC	AACTCTGCTG	GTTTGGCCCT	GGAAAGGGCA	6120
GTGCTTGTGG	AAGACGCTAT	AAAGTCGGAG	AAACTTTCTA	AGACGGTTAA	TGAGATGGTG	6180
AGGAAAGGGA	GTACCACCAG	CGAAGAAGTG	GCCGTCGCTT	TGTCGGACGA	TGAAGCCGTG	6240
GAAGAAATCT	CTGTTGCTGA	CGAGCGAGAC	GATTCGCCTA	AGACAGTCAG	GATAAGCGAA	6300
TACCTAAATA	GGTTAAACTC	AAGCTTCGAA	TTCCCGAAGC	CTATTGTTGT	GGACGACAAC	6360
AAGGATACCG	GGGGTCTAAC	GAACGCCGTG	AGGGAGTTTT	ATTATATGCA	AGAACTTGCT	6240
CTTTTCGAAA	TCCACAGCAA	ACTGTGCACC	TACTACGATC	AACTGCGCAT	ATGCAACTTC	6480
GATCGTTCCG	TAGCACCATG	CAGCGAAGAT	GCTCAGCTGT	ACGTACGGAA	GAACGGCTCA	6540
ACGATAGTGC	AGGGTAAAGA	GGTACGTTTG	CACATTAAGG	ATTTCCACGA	TCACGATTTC	6600
CTGTTTGACG	GAAAAATTTC	TATTAACAAG	CGGCGGCGAG	GCGGAAATGT	TTTATATCAC	6660
GACAACCTCG	CGTTCTTGGC	GAGTAATTTG	TTCTTAGCCG	GCTACCCCTT	TTCAAGGAGC	6720
TTCGTCTTCA	CGAATTCGTC	GGTCGATATT	CTCCTCTACG	AAGCTCCACC	CGGAGGTGGT	6780
AAGACGACGA	CGCTGATTGA	CTCGTTCTTG	AAGGTCTTCA	AGAAAGGTGA	GGTTTCCACC	6840

ATGATCTTAA CCGCCAACAA AAGTTCGCAG GTTGAGATCC TAAAGAAAGT GGAGAAGGAA 6900

GTGTCTAACA TTGAATGCCA GAAACGTAAA GACAAAAGAT CTCCGAAAAA GAGCATTTAC 6960

ACCATCGACG CTTATTTAAT GCATCACCGT GGTTGTGATG CAGACGTTCT TTTCATCGAT 7020

GAGTGTTTCA TGGTTCATGC GGGTAGCGTA CTAGCTTGCA TTGAGTTCAC GAGGTGTCAT 7080

AAAGTAATGA TCTTCGGGGA TAGCCGGCAG ATTCACTACA TTGAAAGGAA CGAATTGGAC 7140

AAGTGTTTGT ATGGGGATCT CGACAGGTTC GTGGACCTGC AGTGTCGGGT TTATGGTAAT 7200

ATTTCGTACC GTTGTCCATG GGATGTGTGC GCTTGGTTAA GCACAGTGTA TGGCAACCTA 7260

ATCGCCACCG TGAAGGGTGA AAGCGAAGGT AAGAGCAGCA TGCGCATTAA CGAAATTAAT 7320

TCAGTCGACG ATTTAGTCCC CGACGTGGGT TCCACGTTTC TGTGTATGCT TCAGTCGGAG 7380

AAGTTGGAAA TCAGCAAGCA CTTTATTCGC AAGGGTTTGA CTAAACTTAA CGTTCTAACG 7440

GTGCATGAGG CGCAAGGTGA GACGTATGCG CGTGTGAACC TTGTGCGACT TAAGTTTCAG 7500

GAGGATGAAC CCTTTAAATC TATCAGGCAC ATAACCGTCG CTCTTTCTCG TCACACCGAC 7560

AGCTTAACTT ATAACGTCTT AGCTGCTCGT CGAGGTGACG CCACTTGCGA TGCCATCCAG 7620

AAGGCTGCGG AATTGGTGAA CAAGTTTCGC GTTTTTCCTA CATCTTTTGG TGGTAGTGTT 7680

ATCAATCTCA ACGTGAAGAA GGACGTGGAA GATAACAGTA GGTGCAAGGC TTCGTCGGCA 7740

CCATTGAGCG TAATCAACGA CTTTTTGAAC GAAGTTAATC CCGGTACTGC GGTGATTGAT 7800

TTTGGTGATT TGTCCGCGGA CTTCAGTACT GGGCCTTTTG AGTGCGGTGC CAGCGGTATT 7860

GTGGTGCGGG ACAACATCTC CTCCAGCAAC ATCACTGATC ACGATAAGCA GCGTGTTTAG 7920

Velký polyproteín (papaínu podobné proteázy, metyl transferáza a helikáza) majú nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ.ID.No.3:

Thr 1

Leu

Arg

Glu

Asn 5

Pro

íle

Ser

Val

Ser 10

Gly

Val

Asn

Leu

Gly 15

Arg

Ser

Ala

Ala

Ala 20

Gin

Val

íle

Tyr

Phe 25

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin 30

Pro

Phe

Ala

Leu

Tyr 35

Pro

Arg

Gin

Glu

Ser 40

Ala

íle

Val

Lys

Thr 45

Gin

Leu

Pro

Pro

Val 50

Ser

Val

Val

Lys

Val 55

Glu

Cys

Val

Ala

Ala 60

Glu

Val

Ala

Pro

Asp 65

Arg

Gly

Val

Val

Asp 70

Lys

Lys

Pro

Thr

Ser 75

Val

Gly

Val

Pro

Pro 80

Gin

Arg

Gly

Val

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Val

Val

Arg

Asn

Arg

Gly

Asp

85

90

95

Val

íle

íle

Thr

Gly

Val

Val

His

Glu

Ala

Leu

Lys

Lys

íle

Lys

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Leu

Arg

Phe

Arg

Val

Gly

Gly

Asp

Met

Arg

Phe

Ser

Arg

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Ser

Asn

Tyr

Gly

Cys

Arg

Phe

Val

Ala

Ser

Val

Arg

Thr

Asn

130

135

140

Thr

Thr

Val

Trp

Leu

Asn

Cys

Thr

Lys

Ala

Ser

Gly

Glu

Lys

Phe

Ser

145

150

155

160

Leu

Ala

Ala

Ala

Cys

Thr

Ala

Asp

Tyr

Val

Ala

Met

Leu

Arg

Tyr

Val

165

170

175

Cys

Gly

Gly

Lys

Phe

Pro

Leu

Val

Leu

Met

Ser

Arg

Val

íle

Tyr

Pro

180

185

190

Asp

Gly

Arg

Cys

Tyr

Leu

Ala

His

Met

Arg

Tyr

Leu

Cys

Ala

Phe

Tyr

195

200

205

Cys

Arg

Pro

Phe

Arg

Glu

Ser

Asp

Tyr

Ala

Leu

Gly

Met

Trp

Pro

Thr

210

215

220

Val

Ala

Arg

Leu

Arg

Ala

Cys

Val

Glu

Lys

Asn

Phe

Gly

Val

Glu

Ala

225

230

235

240

Cys

Gly

íle

Ala

Leu

Arg

Gly

Tyr

Tyr

Thr

Ser

Arg

Asn

Val

Tyr

His

245

250

255

Cys

Asp

Tyr

Asp

Ser

Ala

Tyr

Val

Lys

Tyr

Phe

Arg

Asn

Leu

Ser

Gly

260

265

270

Arg

íle

Gly

Gly

Gly

Ser

Phe

Asp

Pro

Thr

Ser

Leu

Thr

Ser

Val

íle

275

280

285

Thr

Val

Lys

íle

Ser

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly

Leu

Pro

Lys

Asn

íle

Ala

290

295

300

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

Cys

Asp

íle

Arg

Tyr

Val

Glu

Pro

Val

Asp

Ser

305

310

315

320

Gly

Gly

íle

Gin

Ser

Ser

Val

Lys

Thr

Lys

Arg

Glu

Asp

Ala

His

Arg

325

330

335

Thr

Val

Glu

Glu

Arg

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Val

Glu

Gin

Pro

Arg

Gin

340

345

350

Lys

Arg

íle

Asp

Glu

Lys

Gly

Cys

Gly

Arg

Val

Pro

Ser

Gly

Gly

Phe

355

360

365

Ser

His

Leu

Leu

Val

Gly

Asn

Leu

Asn

Glu

Val

Arg

Arg

Lys

Val

Ala

370

375

380

Ala

Gly

Leu

Leu

Arg

Phe

Arg

Val

Gly

Gly

Asp

Met

Asp

Phe

His

Arg

385

390

395

400

Ser

Phe

Ser

Thr

Gin 405

Ala

Gly

His

Arg

Leu 410

Leu

Val

Trp

Arg

Arg 415

Ser

Ser

Arg

Ser

Val 420

Cys

Leu

Glu

Leu

Tyr 425

Ser

Pro

Ser

Lys

Asn 430

Phe

Leu

Arg

Tyr

Asp 435

Val

Leu

Pro

Cys

Ser 440

Gly

Asp

Tyr

Ala

Ala 445

Met

Phe

Ser

Phe

Ala 450

Ala

Gly

Gly

Arg

Phe 455

Pro

Leu

Val

Leu

Met 460

Thr

Arg

íle

Arg

Tyr 465

Pro

Asn

Gly

Phe

Cys 470

Tyr

Leu

Ala

His

Cys 475

Arg

Tyr

Ala

Cys

Ala 480

Phe

Leu

Leu

Arg

Gly 485

Phe

Asp

Pro

Lys

Arg 490

Phe

Asp

íle

Gly

Ala 495

Phe

Pro

Thr

Ala

Ala 500

Lys

Leu

Arg

Asn

Arg

Met 505

Val

Ser

Glu

Leu

Gly 510

Glu

Arg

Ser

Leu

Gly

Leu

Asn

Leu

Tyr

Gly

Ala

Tyr

Thr

Ser

Arg

Gly

Val

515 520 525

Phe

His 530

Cys

Asp

Tyr

Asp

Ala 535

Lys

Phe

íle

Lys

Asp 540

Leu

Arg

Leu

Met

Ser 545

Ala

Val

íle

Ala

Gly 550

Lys

Asp

Gly

Val

Glu 555

Glu

Val

Val

Pro

Ser 560

Asp

íle

Thr

Pro

Ala 565

Met

Lys

Gin

Lys

Thr 570

íle

Glu

Ala

Val

Tyr 575

Asp

Arg

Leu

Tyr

Gly 580

Gly

Thr

Asp

Ser

Leu 585

Leu

Lys

Leu

Ser

íle 590

Glu

Lys

Asp

Leu

íle 595

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp 600

Val

Gin

Ser

Leu

Lys 605

Lys

Asp

Arg

Pro

íle 610

Val

Lys

Val

Pro

Phe 615

Tyr

Met

Ser

Glu

Ala 620

Thr

Gin

Asn

Ser

Leu 625

Thr

Arg

Phe

Tyr

Pro 630

Gin

Phe

Glu

Leu

Lys 635

Phe

Ser

His

Ser

Ser 640

His

Ser

Asp

His

Pro 645

Ala

Ala

Ala

Ala

Ser 650

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn 655

Glu

Thr

Leu

Val

Arg 660

Leu

Cys

Gly

Asn

Ser 665

Val

Ser

Asp

íle

Gly 670

Gly

Cys

Pro

Leu

Phe 675

His

Leu

His

Ser

Lys 680

Thr

Gin

Arg

Arg

Val 685

His

Val

Cys

Arg

Pro 690

Val

Leu

Asp

Gly

Lys 695

Asp

Ala

Gin

Arg

Arg 700

Val

Val

Arg

Asp

Leu 705

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val 710

Arg

Leu

Gly

Asp

Asp

Asp 715

Lys

íle

Leu

Glu 720

Gly

Pro

Arg

Asn

íle 725

Asp

íle

Cys

His

Tyr 730

Pro

Leu

Gly

Ala

Cys 735

Asp

His

Glu

Ser

Ser 740

Ala

Met

Met

Met

Val 745

Gin

Val

Tyr

Asp

Ala 750

Ser

Leu

Tyr

Glu

íle 755

Cys

Gly

Ala

Met

íle 760

Lys

Lys

Lys

Ser

Arg 765

íle

Thr

Tyr

Leu

Thr 770

Met

Val

Thr

Pro

Gly 775

Glu

Phe

Leu

Asp

Gly 780

Arg

Glu

Cys

Val

Tyr 785

Met

Glu

Ser

Leu

Asp 790

Cys

Glu

íle

Glu

Val 795

Asp

Val

His

Ala

Asp 800

Val

Val

Met

Tyr

Lys 805

Phe

Gly

Ser

Ser

Cys 810

Tyr

Ser

His

Lys

Leu 815

Ser

íle

íle

Lys

Asp 820

íle

Met

Thr

Thr

Pro 825

Tyr

Leu

Thr

Leu

Gly 830

Gly

Phe

Leu

Phe

Ser 835

Val

Glu

Met

Tyr

Glu 840

Val

Arg

Met

Gly

Val 845

Asn

Tyr

Phe

Lys

íle 850

Thr

Lys

Ser

Glu

Val 855

Ser

Pro

Ser

íle

Ser 860

Cys

Thr

Lys

Leu

Leu 865

Arg

Tyr

Arg

Arg

Ala 870

Asn

Ser

Asp

Val

Val 875

Lys

Val

Lys

Leu

Pro 880

Arg

Phe

Asp

Lys

Lys 885

Arg

Arg

Met

Cys

Leu 890

Pro

Gly

Tyr

Asp

Thr 895

íle

Tyr

Leu

Asp

Ser 900

Lys

Phe

Val

Ser

Arg 905

Val

Phe

Asp

Tyr

Val 910

Val

Cys

Asn

Cys

Ser 915

Ala

Val

Asn

Ser

Lys 920

Thr

Phe

Glu

Trp

Val 925

Trp

Ser

Phe

íle

Lys 930

Ser

Ser

Lys

Ser

Arg 935

Val

íle

íle

Ser

Gly 940

Lys

íle

íle

His

Lys 945

Asp

Val

Asn

Leu

Asp 950

Leu

Lys

Tyr

Val

Glu 955

Ser

Phe

Ala

Ala

Val 960

Met

Leu

Ala

Ser

Gly 965

Val

Arg

Ser

Arg

Leu 970

Ala

Ser

Glu

Tyr

Leu 975

Ala

Lys

Asn

Leu

Ser 980

His

Phe

Ser

Gly

Asp 985

Cys

Ser

Phe

íle

Glu 990

Ala

Thr

Ser

Phe

Val 995

Leu

Arg

Glu

Lys

íle Arg 1000

Asn

Met

Thr

Leu Asn 1005

Phe

Asn

Glu

Arg

Leu

Leu

Gin

Leu

Val

Lys

Arg

Val

Ala

Phe

Ala

Thr

Leu

Asp

1010 1015 1020

Val Ser Phe Leu Asp Leu Asp Ser Thr Leu Glu Ser íle Thr Asp Phe 1025 1030 1035 1040

Ala Glu	Cys	Lys	Val Ala 1045	íle	Glu	Leu Asp Glu 1050	Leu	Gly	Cys	Leu Arg 1055
Ala Glu	Ala	Glu	Asn Glu	Lys	íle	Arg Asn Leu	Ala	Gly	Asp	Ser íle
		1060			1065			1070
Ala Ala	Lys	Leu	Ala Ser	Glu	íle	Val Val Asp	íle	Asp	Ser	Lys Pro
	1075			1080		1085
Ser Pro	Lys	Gin	Val Gly	Asn	Ser	Ser Ser Glu	Asn	Ala	Asp	Lys Arg
1090			1095		1100
Glu Val	Gin	Arg	Pro Gly	Leu	Arg	Gly Gly Ser	Arg	Asn	Gly	Val Val
1105			1110		1115			1120
Gly Glu	Phe	Leu	His Phe	Val	Val	Asp Ser Ala	Leu	Arg	Leu	Phe Lys
			1125			1130				1135
Tyr Ala	Thr	Asp	Gin Gin	Arg	íle	Lys Ser Tyr	Val	Arg	Phe	Leu Asp
		1140			1145			1150
Ser Ala	Val	Ser	Phe Leu	Asp	Tyr	Asn Tyr Asp	Asn	Leu	Ser	Phe íle
	1155			1160		1165
Leu Arg	Val	Leu	Ser Glu	Gly	Tyr	Ser Cys Met	Phe	Ala	Phe	Leu Ala
1170			1175		1180
Asn Arg	Gly	Asp	Leu Ser	Ser	Arg	Val Arg Ser	Ala	Val	Cys	Ala Val
1185			1190		1195			1200
Lys Glu	Val	Ala	Thr Ser	Cys	Ala	Asn Ala Ser	Val	Ser	Lys	Ala Lys
			1205			1210				1215
Val Met	íle	Thr	Phe Ala	Ala	Ala	Val Cys Ala	Met	Met	Phe	Asn Ser
		1220			1225			1230
Cys Gly	Phe	Ser	Gly Asp	Gly	Arg	Glu Tyr Lys	Ser	Tyr	íle	His Arg
	1235			1240		1245
Tyr Thr	Gin	Val	Leu Phe	Asp	Thr	íle Phe Phe	Glu	Asp	Ser	Ser Tyr
1250			1255		1260
Leu Pro	íle	Glu	Val Leu	Ser	Ser	Ala íle Cys	Gly	Ala	íle	Val Thr
1265			1270		1275			1280
Leu Phe	Ser	Ser	Gly Ser	Ser	íle	Ser Leu Asn	Ala	Phe	Leu	Leu Gin
			1285			1290				1295
íle Thr	Lys	Gly	Phe Ser	Leu	Glu	Val Val Val	Arg	Asn	Val	Val Arg
		1300			1305			1310
Val Thr	His	Gly	Leu Ser	Thr	Thr	Ala Thr Asp	Gly	Val	íle	Arg Gly
	1315			1320		1325
Val Phe	Ser	Gin	íle Val	Ser	His	Leu Leu Val	Gly	Asn	Thr	Gly Asn
1330			1335		1340

Val Ala Tyr Gin Ser Ala Phe íle Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Val 1345 1350 1355 1360

Lys	Lys Cys Val Ser 1365	Leu	íle Phe íle Leu Arg 1370	Glu Asp Thr Tyr 1375	Ser 1
Gly	Phe íle Lys His 1380	Gly	íle Ser Glu Phe 1385	Ser	Phe Leu Ser Ser 1390	íle
Leu	Lys Phe Leu Lys 1395	Gly	Lys Leu Val Asp 1400	Glu	Leu Lys Ser íle 1405	íle
Gin	Gly Val Phe Asp 1410	Ser	Asn Lys His Val 1415	Phe	Lys Glu Ala Thr 1420	Gin
Glu	Ala íle Arg Thr	Thr	Val Met Gin Val	Pro	Val Ala Val Val	Asp
1425	1430	1435	1440
Ala	Leu Lys Ser Ala	Ala	Gly Lys íle Tyr	Asn	Asn Phe Thr Ser	Arg
	1445	1450	1455
Arg	Thr Phe Gly Lys 1460	Asp	Glu Gly Ser Ser 1465	Ser	Asp Gly Ala Cys 1470	Glu
Glu	Tyr Phe Ser Cys 1475	Asp	Glu Gly Glu Gly 1480	Pro	Gly Leu Lys Gly 1485	Gly
Ser	Ser Tyr Gly Phe 1490	Ser	íle Leu Ala Phe 1495	Phe	Ser Arg íle Met 1500	Trp
Gly	Ala Arg Arg Leu	íle	Val Lys Val Lys	His	Glu Cys Phe Gly	Lys
1505	1510	1515	1520
Leu	Phe Glu Phe Leu	Ser	Leu Lys Leu His	Glu	Phe Arg Thr Arg	Val
	1525	1530	1535
Phe	Gly Lys Asn Arg 1540	Thr	Asp Val Gly Val 1545	Tyr	Asp Phe Leu Pro 1550	Thr
Gly	íle Val Glu Thr 1555	Leu	Ser Ser íle Glu 1560	Glu	Cys Asp Gin íle 1565	Glu
Glu	Leu Leu Gly Asp 1570	Asp	Leu Lys Gly Asp 1575	Lys	Asp Ala Ser Leu 1580	Thr
Asp	Met Asn Tyr Phe	Glu	Phe Ser Glu Asp	Phe	Leu Ala Ser íle	Glu
1585	1590	1595	1600
Glu	Pro Pro Phe Ala	Gly	Leu Arg Gly Gly	Ser	Lys Asn íle Ala	íle
	1605	1610	1615
Leu	Ala íle Leu Glu 1620	Tyr	Ala His Asn Leu 1625	Phe	Arg íle Val Ala 1630	Ser
Lys	Cys Ser Lys Arg 1635	Pro	Leu Phe Leu Ala 1640	Phe	Ala Glu Leu Ser 1645	Ser
Ala	Leu íle Glu Lys 1650	Phe	Lys Glu Val Phe 1655	Pro	Arg Lys Ser Gin 1660	Leu
Val	Ala íle Val Arg	Glu	Tyr Thr Gin Arg	Phe	Leu Arg Ser Arg	Met
1665	1670	1675	1680

Arg Ala Leu Gly Leu Asn Asn Glu	Phe Val Val 1690	Lys	Ser	Phe Ala Asp 1695
	1685
Leu	Leu Pro Ala Leu Met Lys Arg	Lys Val Ser	Gly	Ser	Phe Leu Ala
	1700	1705			1710
Ser	Val Tyr Arg Pro Leu Arg Gly	Phe Ser Tyr	Met	Cys	Val Ser Ala
	1715 1720		1725
Glu	Arg Arg Glu Lys Phe Phe Ala	Leu Val Cys	Leu	íle	Gly Leu Ser
	1730 1735		1740
Leu	Pro Phe Phe Val Arg íle Val	Gly Ala Lys	Ala	Cys	Glu Glu Leu
1745 1750	1755		1760
Val	Ser Ser Ala Arg Arg Phe Tyr	Glu Arg íle	Lys	íle	Phe Leu Arg
	1765	1770			1775
Gin	Lys Tyr Val Ser Leu Ser Asn	Phe Phe Cys	His	Leu	Phe Ser Ser
	1780	1785			1790
Asp	Val Asp Asp Ser Ser Ala Ser	Ala Gly Leu	Lys	Gly	Gly Ala Ser
	1795 1800		1805
Arg	Met Thr Leu Phe His Leu Leu	Val Arg Leu	Ala	Ser	Ala Leu Leu
	1810 1815		1820
Ser	Leu Gly Trp Glu Gly Leu Lys	Leu Leu Leu	Ser	His	His Asn Leu
1825 1830	1835		1840
Leu	Phe Leu Cys Phe Ala Leu Val	Asp Asp Val	Asn	Val	Leu íle Lys
	1845	1850			1855
Val	Leu Gly Gly Leu Ser Phe Phe	Val Gin Pro	íle	Phe	Ser Leu Phe
	1860	1865			1870
Ala	Ala Met Leu Leu Gin Pro Asp	Arg Phe Val	Glu	Tyr	Ser Glu Lys
	1875 1880		1885
Leu	Val Thr Ala Phe Glu Phe Phe	Leu Lys Cys	Ser	Pro	Arg Ala Pro
	1890 1895		1900
Ala	Leu Leu Lys Gly Phe Phe Glu	Cys Val Ala	Asn	Ser	Thr Val Ser
1905 1910	1915		1920
Lys	Thr Val Arg Arg Leu Leu Arg	Cys Phe Val	Lys	Met	Leu Lys Leu
	1925	1930			1935
Arg	Lys Gly Arg Gly Leu Arg Ala	Asp Gly Arg	Gly	Leu	His Arg Gin
	1940	1945			1950
Lys	Ala Val Pro Val íle Pro Ser	Asn Arg Val	Val	Thr	Asp Gly Val
	1955 1960		1965
Glu	Arg Leu Ser Val Lys Met Gin	Gly Val Glu	Ala	Leu	Arg Thr Glu

1970 1975 1980

Leu Arg íle Leu Glu Asp Leu Asp Ser Ala Val íle Glu Lys Leu Asn 1985 1990 1995 2000

Arg	Arg	Arg Asn	Arg Asp Thr Asn Asp Asp Glu	Phe	Thr	Arg Pro Ala 2015
2005	2010
His	Glu	Gin Met	Gin Glu	Val Thr Thr Phe Cys	Ser	Lys	Ala Asn Ser
		2020	2025			2030
Ala	Gly	Leu Ala	Leu Glu	Arg Ala Val Leu Val	Glu	Asp	Ala íle Lys
			2035	2040			2045
Ser	Glu	Lys Leu	Ser Lys	Thr Val Asn Glu Met	Val	Arg	Lys Gly Ser
	2050		2055	2060
Thr	Thr	Ser Glu	Glu Val	Ala Val Ala Leu Ser	Asp	Asp	Glu Ala Val
2065		2070 2075		2080
Glu	Glu	íle Ser	Val Ala	Asp Glu Arg Asp Asp	Ser	Pro	Lys Thr Val
			2085	2090			2095
Arg	íle	Ser Glu	Tyr Leu	Asn Arg Leu Asn Ser	Ser	Phe	Glu Phe Pro
		2100	2105			2110
Lys	Pro	íle Val	Val Asp	Asp Asn Lys Asp Thr	Gly	Gly	Leu Thr Asn
		2115		2120		2125
Ala	Val	Arg Glu	Phe Tyr	Tyr Met Gin Glu Leu	Ala	Leu	Phe Glu íle
	2130		2135	2140
His	Ser	Lys Leu	Cys Thr	Tyr Tyr Asp Gin Leu	Arg	íle	Val Asn Phe
2145		2150 2155		2160
Asp	Arg	Ser Val	Ala Pro	Cys Ser Glu Asp Ala	Gin	Leu	Tyr Val Arg
			2165	2170			2175
Lys	Asn	Gly Ser	Thr íle	Val Gin Gly Lys Glu	Val	Arg	Leu His íle
		2180	2185			2190
Lys	Asp	Phe His	Asp His	Asp Phe Leu Phe Asp	Gly	Lys	íle Ser íle
		2195		2200		2205
Asn	Lys	Arg Arg	Arg Gly	Gly Asn Val Leu Tyr	His	Asp	Asn Leu Ala
	2210		2215	2220
Phe	Leu	Ala Ser	Asn Leu	Phe Leu Ala Gly Tyr	Pro	Phe	Ser Arg Ser
2225		2230 2235		2240
Phe	Val	Phe Thr	Asn Ser	Ser Val Asp íle Leu	Leu	Tyr	Glu Ala Pro
			2245	2250			2255
Pro	Gly	Gly Gly	Lys Thr	Thr Thr Leu íle Asp	Ser	Phe	Leu Lys Val
		2260	2265			2270
Phe	Lys	Lys Gly	Glu Val	Ser Thr Met íle Leu	Thr	Ala	Asn Lys Ser
		2275		2280		2285
Ser	Gin	Val Glu	íle Leu	Lys Lys Val Glu Lys	Glu	Val	Ser Asn íle
	2290		2295	2300
Glu	Cys	Gin Lys	Arg Lys	Asp Lys Arg Ser Pro	Lys	Lys	Ser íle Tyr
2305		231C	) 2315		2320

Thr	íle	Asp	Ala Tyr Leu 2325	Met	His	His Arg Gly Cys Asp Ala Asp Val
2330	2335
Leu	Phe	íle	Asp Glu Cys	Phe	Met	Val His Ala Gly	Ser Val Leu Ala
			2340			2345	2350
Cys	íle	Glu	Phe Thr Arg	Cys	His	Lys Val Met íle	Phe Gly Asp Ser
		2355		2360	2365
Arg	Gin	íle	His Tyr íle	Glu	Arg	Asn Glu Leu Asp	Lys Cys Leu Tyr
	2370		2375	2380
Gly	Asp	Leu	Asp Arg Phe	Val	Asp	Leu Gin Cys Arg	Val Tyr Gly Asn
2385		2390		2395	2400
íle	Ser	Tyr	Arg Cys Pro	Trp	Asn	Val Cys Ala Trp	Leu Ser Thr Val
			2405			2410	2415
Tyr	Gly	Asn	Leu íle Ala	Thr	Val	Lys Gly Glu Ser	Glu Gly Lys Ser
			2420			2425	2430
Ser	Met	Arg	íle Asn Glu	íle	Asn	Ser Val Asp Asp	Leu Val Pro Asp
		2435		2440	2445
Val	Gly	Ser	Thr Phe Leu	Cys	Met	Leu Gin Ser Glu	Lys Leu Glu íle
	2450		2455	2460
Ser	Lys	His	Phe íle Arg	Lys	Gly	Leu Thr Lys Leu	Asn Val Leu Thr
2465		2470		2475	2480
Val	His	Glu	Ala Gin Gly	Glu	Thr	Tyr Ala Arg Val	Asn Leu Val Arg
			2485			2490	2495
Leu	Lys	Phe	Gin Glu Asp	Glu	Pro	Phe Lys Ser íle	Arg His íle Thr
			2500			2505	2510
Val	Ala	Leu	Ser Arg His	Thr	Asp	Ser Leu Thr Tyr	Asn Val Leu Ala
		2515		2520	2525
Ala	Arg	Arg	Gly Asp Ala	Thr	Cys	Asp Ala íle Gin	Lys Ala Ala Glu
	2530		2535	2540
Leu	Val	Asn	Lys Phe Arg	Val	Phe	Pro Thr Ser Phe	Gly Gly Ser Val
2545		2550		2555	2560
íle	Asn	Leu	Asn Val Lys	Lys	Asp	Val Glu Asp Asn	Ser Arg Cys Lys
			2565			2570	2575
Ala	Ser	Ser	Ala Pro Leu	Ser	Val	íle Asn Asp Phe	Leu Asn Glu Val
			2580			2585	2590
Asn	Pro	Gly	Thr Ala Val	íle	Asp	Phe Gly Asp Leu	Ser Ala Asp Phe
		2595		2600	2605
Ser	Thr	Gly	Pro Phe Glu	Cys	Gly Ala Ser Gly íle	Val Val Arg Asp

2610 2615 2620

Asn íle Ser Ser Ser Asn íle Thr Asp His Asp Lys Gin Arg Val 2625 2630 2635 a má molekulovú hmotnosť od 290 až 300 kDa, výhodne 294 kDa.

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 OFRlb)obsahuje nukleotidy 7922-9301 v SEQ.ID.No.l a kóduje RNA-závislú RNA polymerázu (RdRP) vírusu RNA zvinutky viniča. Táto molekula DNA obsahuje nasledujúcu sekvenciu nukleotidov,SEQ.ID.No.4:

AGCGTAGTTC

TCGTTTGAAG

TTCGGAGAGG

TCCCTGCGTG

CGTACTCCTA

GATGAAATTT

TCTTGTTTAA

GCTATCTTCT

AACATAAAGT

CTTGGTGACG

CAAGATGCTT

GAGTTGCTGG

CAGTTGTCCT

AACTCTCTCG

TTGTACATCT

GACGACATAT

TTTTGTTCTA

AAGCTTTTTG

ACTTTTACCT

CTCGCTGAAC

AGTGTGATAC

AAGGGATGGC

CTCTTCGACA

GGTCGCAGGC	GATTCCGCGT	AGAAAACCTT	CTCTACAAGA	AAATTTGTAT	60
CGCGGAATTA	TAACTTCTCG	ACTTGCGACC	GTAACACATC	TGCTTCAATG	120
CTATGGCGAT	GAACTGTCTT	CGTCGTTGCT	TCGACCTAGA	TGCCTTTTCG	180
ATGATGTGAT	TAGTATCACA	CGTTCAGGCA	TCGAACAATG	GCTGGAGAAA	240
CTCAGATTAA	AGCATTAATG	AAGGATGTTG	AATCGCCTTT	GGAAATTGAC	300
GTCGTTTTAA	GTTGATGGTG	AAGCGTGACG	CTAAGGTGAA	GTTAGACTCT	360
CTAAACACAG	CGCCGCTCAA	AATATCATGT	TTCATCGCAA	GAGCATTAAT	420
CTCCTATCTT	TAATGAGGTG	AAAAACCGAA	TAATGTGCTG	TCTTAAGCCT	480
TTTTTACGGA	GATGACTAAC	AGGGATTTTG	CTTCTGTTGT	CAGCAACATG	540
ACGATGTGTA	CCATATAGGT	GAAGTTGATT	TCTCAAAGTA	CGACAAGTCT	600
TCGTGAAGGC	TTTTGAAGAA	GTAATGTATA	AGGAACTCGG	TGTTGATGAA	660
CTATCTGGAT	GTGCGGCGAG	CGGTTATCGA	TAGCTAACAC	TCTCGATGGT	720
TCACGATCGA	GAATCAAAGG	AAGTCGGGAG	CTTCGAACAC	TTGGATTGGT	780
TCACTTTGGG	TATTTTAAGT	CTTTACTACG	ACGTTAGAAA	TTTCGAGGCG	840
CGGGCGATGA	TTCTTTAATT	TTTTCTCGCA	GCGAGATTTC	GAATTATGCC	900
GCACTGACAT	GGGTTTTGAG	ACAAAATTTA	TGTCCCCAAG	TGTCCCGTAC	960
AATTTGTTGT	TATGTGTGGT	CATAAGACGT	TTTTTGTTCC	CGACCCGTAC	1020
TCAAGTTGGG	AGCAGTCAAA	GAGGATGTTT	CAATGGATTT	CCTTTTCGAG	1080
CCTTTAAAGA	CTTAACCTCC	GATTTTAACG	ACGAGCGCTT	AATTCAAAAG	1140
TTGTGGCTTT	AAAATATGAG	GTTCAAACCG	GCAACACCAC	CTTGGCGTTA	1200
ATTGTTTGCG	TTCGAATTTC	CTCTCGTTTA	GCAAGTTATA	TCCTCGCGTG	1260
AGGTTTTTTA	CACGTCGGTT	AAGAAAGCGC	TTCTCAAGAG	TGGGTGTTCT	1320
GTTTCATGAC	CCCTTTTGGT	CAGGCTGTCA	TGGTTTGGGA	TGATGAGTAG	1380

RNA - závislá RNA polymeráza má nasledujúcu sekvenciu ami nokyselín SEQ.ID.No.5:

Ser 1

Val

Val

Arg

Ser 5

Gin

Ala

íle

Pro

Arg 10

Arg

Lys

Pro

Ser

Leu 15

Gin

Glu

Asn

Leu

Tyr 20

Ser

Phe

Glu

Ala

Arg 25

Asn

Tyr

Asn

Phe

Ser 30

Thr

Cys

Asp

Arg

Asn 35

Thr

Ser

Ala

Ser

Met 40

Phe

Gly

Glu

Ala

Met 45

Ala

Met

Asn

Cys

Leu 50

Arg

Arg

Cys

Phe

Asp 55

Leu

Asp

Ala

Phe

Ser 60

Ser

Leu

Arg

Asp

Asp 65

Val

íle

Ser

íle

Thr 70

Arg

Ser

Gly

íle

Glu 75

Gin

Trp

Leu

Glu

Lys 80

Arg

Thr

Pro

Ser

Gin 85

íle

Lys

Ala

Leu

Met 90

Lys

Asp

Val

Glu

Ser 95

Pro

Leu

Glu

íle

Asp 100

Asp

Glu

íle

Cys

Arg 105

Phe

Lys

Leu

Met

Val 110

Lys

Arg

Asp

Ala

Lys 115

Val

Lys

Leu

Asp

Ser 120

Ser

Cys

Leu

Thr

Lys 125

His

Ser

Ala

Ala

Gin 130

Asn

íle

Met

Phe

His 135

Arg

Lys

Ser

íle

Asn 140

Ala

íle

Phe

Ser

Pro 145

íle

Phe

Asn

Glu

Val 150

Lys

Asn

Arg

íle

Met 155

Cys

Cys

Leu

Lys

Pro 160

Asn

íle

Lys

Phe

Phe 165

Thr

Glu

Met

Thr

Asn 170

Arg

Asp

Phe

Ala

Ser 175

Val

Val

Ser

Asn

Met 180

Leu

Gly

Asp

Asp

Asp 185

Val

Tyr

His

íle

Gly 190

Glu

Val

Asp

Phe

Ser 195

Lys

Tyr

Asp

Lys

Ser 200

Gin

Asp

Ala

Phe

Val 205

Lys

Ala

Phe

Glu

Glu 210

Val

Met

Tyr

Lys

Glu 215

Leu

Gly

Val

Asp

Glu 220

Glu

Leu

Leu

Ala

íle 225

Trp

Met

Cys

Gly

Glu 230

Arg

Leu

Ser

íle

Ala 235

Asn

Thr

Leu

Asp

Gly 240

Gin

Leu

Ser

Phe

Thr 245

íle

Glu

Asn

Gin

Arg 250

Lys

Ser

Gly

Ala

Ser 255

Asn

Thr

Trp

íle

Gly

Asn

Ser

Leu

Val

Thr

Leu

Gly

íle

Leu

Ser

Leu

Tyr

260 265 270

Tyr Asp Val Arg Asn Phe Glu Ala Leu Tyr íle Ser Gly Asp Asp Ser 275 280 285

Leu

íle 290

Phe Ser

Arg Ser

Glu íle 295

Ser Asn

Tyr Ala Asp 300

Asp íle Cys

Thr

Asp

Met

Gly

Phe

Glu

Thr

Lys

Phe

Met

Ser

Pro

Ser

Val

Pro

Tyr

305

310

315

320

Phe

Cys

Ser

Lys

Phe

Val

Val

Met

Cys

Gly

His

Lys

Thr

Phe

Phe

Val

325

330

335

Pro

Asp

Pro

Tyr

Lys

Leu

Phe

Val

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Lys

Glu

Asp

340

345

350

Val

Ser

Met

Asp

Phe

Leu

Phe

Glu

Thr

Phe

Thr

Ser

Phe

Lys

Asp

Leu

355

360

365

Thr

Ser

Asp

Phe

Asn

Asp

Glu

Arg

Leu

íle

Gin

Lys

Leu

Ala

Glu

Leu

370

375

380

Val

Ala

Leu

Lys

Tyr

Glu

Val

Gin

Thr

Gly

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Leu

385

390

395

400

Ser

Val

íle

His

Cys

Leu

Arg

Ser

Asn

Phe

Leu

Ser

Phe

Ser

Lys

Leu

405

410

415

Tyr

Pro

Arg

Val

Lys

Gly

Trp

Gin

Val

Phe

Tyr

Thr

Ser

Val

Lys

Lys

420

425

430

Ala

Leu

Leu

Lys

Ser

Gly

Cys

Ser

Leu

Phe

Asp

Ser

Phe

Met

Thr

Pro

435

440

445

Phe

Gly

Gin

Ala

Val

Met

Val

Trp

Asp

Asp

Glu

450

455

a má molekulovú hmotnosť od 50 do 54 kDa, výhodne 52 kDa.

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 ORF2) obsahuje nukleotidy 9365-9535 v SEQ.ID.No.l a kóduje malý hydrofóbny proteín alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA obsahuje nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.6:

ATGAATCAGG TTTTGCAGTT TGAATGTTTG TTTCTGCTGA ATCTCGCGGT TTTTGCTGTG 60

ACTTTCATTT TCATTCTTCT GGTCTTCCGC GTGATTAAGT CTTTTCGCCA GAAGGGTCAC 120

GAAGCACCTG TTCCCGTTGT TCGTGGCGGG GGTTTTTCAA CCGTAGTGTA G 171

Malý hydrofóbny proteín alebo polypeptid má nasledujúcu

sekvenciu	aminokyselín	SEQ.ID.No.7:
Met Asn Gin	Val Leu Gin Phe	Glu Cys Leu Phe	Leu	Leu	Asn	Leu	Ala
1	5	10				15
Val Phe Ala	Val Thr Phe íle	Phe íle Leu Leu	Val	Phe	Arg	Val	íle
	20	25			30

Lys Ser Phe Arg Gin Lys Gly His Glu Ala Pro Val Pro Val Val Arg 35 40 45

Gly Gly Gly Phe Ser Thr Val Val 50 55 a má molekulovú hmotnosť od 5 do 7 kDa, výhodne 6 kDa.

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 ORF3) obsahuje nukleotidy 9551-11350 v SEQ.ID.No.l a kóduje proteín tepelného šoku 70 vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.8:

ATGGTAGTTT

GGACGAGTTT

TTCTCCGATT

AAAGTTAAAG

CTCGACGCGT

TCTGGCTTGA

CATCTGCCAG

TTTGCGTGCA

AGGAATTTCA

GAACCTTCAG

GCTGTTTACG

ACTTTTGTTG

GCGTTTCTCA

TCGAATCTGA

GTCGATGGAA

CCCTACGTGA

ATGAATGAGA

CCTGGCCTGG

GATCCTCGGG

GGGGGGTTGC

CATCAAATCA

TACTTAGCCA

TCGGTTTGGA CTTTGGCACC ACATTCTCTA CGGTGTGTGT GTACAAGGAT	60
TTTCATTCAA GCAGAATAAT TCGGCGTACA TCCCCACTTA CCTCTATCTC	120
CTAACCACAT GACTTTTGGT TACGAGGCCG AATCACTGAT GAGTAATCTG	180
GTTCGTTTTA TAGAGATTTA AAACGTTGGG TGGGTTGCGA TTCGAGTAAC	240
ACCTTGACCG TTTAAAACCT CATTACTCGG TCCGCTTGGT TAAGATCGGC	300
ACGAAACTGT TTCAATTGGA AACTTGGGG GCACTGTTAA GTCTGAGGCT	360
GGTTGATAGC TCTCTTTATT AAGGCTGTCA TTAGTTGCGC GGAGGGCGCG	420
CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA TAGCGTTCAA	480
CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA TATGATCAAT	540
CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC CGCAAATTTG	600
ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA CCGCAACAAT	660
TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA TGTTGATCGT	720
CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC TTTGGATATC	780
AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC TTTGAGAGGT	840
GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC GGTGATGCTC	900
ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA TGCTAAGAGT	960
GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC TTCATATCTT	1020
CAGACGTACT AACGAAGCAT GAGAGCGTTG ATCGTATCTT AAGAGTTTCG	1080
CTGCCGTGGC CGTCGGTTGC GCATTATATT CTTCATGCCT CTCAGGATCT	1140
TACTGATCGA CTGTGCAGCT CACACTGTCG CTATAGCGGA CAGAAGTTGT	1200
TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAGGAAG CATGCCTTTG	1260
GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG CCGTGTTTGA AGGGGAGTAC	1320

GTTAAGTGCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTT TGATATAGGA 1380

GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT TTCAAGCGTA 1440

GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC AAGTGTCACT CACTGGAACT 1500

CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA ATTGCATATT 1560

AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA GAAAGGCGGA TCGACGAATA 1620

CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGATTCAA TTGATATCGC GGATGTGCTA 1680

AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCAGTGCC TTACCACCAG ACGAGGATGT CGAATTACTC 1740

CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC TGGAAGAAT ACCTCTCTAG 1800

Verí sa, že proteín tepelného šoku 70 má funkciu chaperónového proteínu a má nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ.ID.No.9:

Met 1

Val

Val

Phe

Gly 5

Leu

Asp

Phe

Gly

Thr 10

Thr

Phe

Ser

Thr

Val 15

Cys

Val

Tyr

Lys

Asp 20

Gly

Arg

Val

Phe

Ser 25

Phe

Lys

Gin

Asn

Asn 30

Ser

Ala

Tyr

íle

Pro 35

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Leu 40

Phe

Ser

Asp

Ser

Asn 45

His

Met

Thr

Phe

Gly 50

Tyr

Glu

Ala

Glu

Ser 55

Leu

Met

Ser

Asn

Leu 60

Lys

Val

Lys

Gly

Ser 65

Phe

Tyr

Arg

Asp

Leu 70

Lys

Arg

Trp

Val

Gly 75

Cys

Asp

Ser

Ser

Asn 80

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu 85

Asp

Arg

Leu

Lys

Pro 90

His

Tyr

Ser

Val

Arg 95

Leu

Val

Lys

íle

Gly 100

Ser

Gly

Leu

Asn

Glu 105

Thr

Val

Ser

íle

Gly 110

Asn

Phe

Gly

Gly

Thr Val 115

Lys

Ser

Glu

Ala 120

His

Leu

Pro

Gly

Leu 125

íle

Ala

Leu

Phe

íle 130

Lys

Ala

Val

íle

Ser 135

Cys

Ala

Glu

Gly

Ala 140

Phe

Ala

Cys

Thr

Cys 145

Thr

Gly

Val

íle

Cys 150

ser

Val

Pro

Ala

Asn 155

Tyr

Asp

Ser

Val

Gin 160

Arg

Asn

Phe

Thr

Asp 165

Gin

Cys

Val

Ser

Leu 170

Ser

Gly

Tyr

Gin

Cys 175

Val

Tyr

Met

íle

Asn

Glu

Pro

Ser

Ala

Ala

Ala

Leu

Ser

Ala

Cys

Asn

Ser

180 185 190 íle Gly Lys Lys Ser Ala Asn Leu Ala Val Tyr Asp Phe Gly Gly Gly 195 200 205

Thr

Phe 210

Asp

Val

Ser

íle

íle 215

Ser

Tyr

Arg

Asn

Asn 220

Thr

Phe

Val

Val

Arg 225

Ala

Ser

Gly

Gly

Asp 230

Leu

Asn

Leu

Gly

Gly 235

Arg

Asp

Val

Asp

Arg 240

Ala

Phe

Leu

Thr

His 245

Leu

Phe

Ser

Leu

Thr 250

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp 255

Leu

Thr

Leu

Asp

íle 260

Ser

Asn

Leu

Lys

Glu 265

Ser

Leu

Ser

Lys

Thr 270

Asp

Ala

Glu

íle

Val 275

Tyr

Thr

Leu

Arg

Gly 280

Val

Asp

Gly

Arg

Lys 285

Glu

Asp

Val

Arg

Val 290

Asn

Lys

Asn

íle

Leu 295

Thr

Ser

Val

Met

Leu 300

Pro

Tyr

Val

Asn

Arg 305

Thr

Leu

Lys

íle

Leu 310

Glu

Ser

Thr

Leu

Lys 315

Ser

Tyr

Ala

Lys

Ser 320

Met

Asn

Glu

Ser

Ala 325

Arg

Val

Lys

Cys

Asp 330

Leu

Val

Leu

íle

Gly 335

Gly

Ser

Ser

Tyr

Leu 340

Pro

Gly

Leu

Ala

Asp 345

Val

Leu

Thr

Lys

His 350

Gin

Ser

Val

Asp

Arg 355

íle

Leu

Arg

Val

Ser 360

Asp

Pro

Arg

Ala

Ala 365

Val

Ala

Val

Gly

Cys

Ala

Leu

Tyr

Ser

Ser

Cys

Leu

Ser

Gly

Ser

Gly

Gly

Leu

Leu

370 375 380

Leu 385

íle

Asp

Cys

Ala

Ala 390

His

Thr

Val

Ala

íle 395

Ala

Asp

Arg

Ser

Cys 400

His

Gin

íle

íle

Cys 405

Ala

Pro

Ala

Gly

Ala 410

Pro

íle

Pro

Phe

Ser 415

Gly

Ser

Met

Pro

Leu 420

Tyr

Leu

Ala

Arg

Val 425

Asn

Lys

Asn

Ser

Gin 430

Arg

Glu

Val

Ala

Val 435

Phe

Glu

Gly

Glu

Tyr 440

Val

Lys

Cys

Pro

Lys 445

Asn

Arg

Lys

íle

Cys 450

Gly

Ala

Asn

íle

Arg 455

Phe

Phe

Asp

íle

Gly 460

Val

Thr

Gly

Asp

Ser 465

Tyr

Ala

Pro

Val

Thr 470

Phe

Tyr

Met

Asp

Phe 475

Ser

íle

Ser

Ser

Val 480

Gly

Ala

Val

Ser

Phe 485

Val

Val

Arg

Gly

Pro 490

Glu

Gly

Lys

Gin

Val 495

Ser

Leu

Thr

Gly

Thr 500

Pro

Ala

Tyr

Asn

Phe 505

Ser

Ser

Val

Ala

Leu 510

Gly

Ser

Arg Ser Val Arg Glu Leu His íle Ser Leu Asn Asn Lys Val Phe Leu 515 520 525

Gly Leu Leu Leu His Arg Lys Ala Asp Arg Arg íle Leu Phe Thr Lys 530 535 540

Asp Glu Ala íle Arg Tyr Ala Asp Ser íle Asp íle Ala Asp Val Leu

545 550 555 560

Lys Glu Tyr Lys Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Pro Pro Asp Glu Asp

565 570 575

Val Glu Leu Leu Leu Gly Lys Ser Val Gin Lys Val Leu Arg Gly Ser 580 585 590 a má molekulovú hmotnosť od 63 do 67 kDa, výhodne 65 kDa.

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 ORF4) obsahuje nukleotidy 11277-12932 v SEQ.ID.No.l a kóduje predpokladaný proteín tepelného šoku 90 vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.10:

ATGTCGAATT ACTCCTGGGA AAGTCTGTTC AAAAAGTTTT ACGGGGAAGC AGACTGGAAG 60

AAATACCTCT CTAGGAGCAT AGCAGCACAC TCAAGTGAAA TTAAAACTCT ACCAGACATT 120

CGATTGTACG GCGGTAGGGT TGTAAAGAAG TCCGAATTCG AATCAGCACT TCCTAATTCT 180

TTTGAACAGG AATTAGGACT GTTCATACTG AGCGAACGGG AAGTGGGATG GAGCAAATTA 240

TGCGGAATAA CGGTGGAAGA AGCAGCATAC GATCTTACGA ATCCCAAGGC TTATAAATTC 300

ACTGCCGAGA CATGTAGCCC GGATGTAAAA GGTGAAGGAC AAAAATACTC TATGGAAGAC 360

GTGATGAATT TCATGCGTTT ATCAAATCTG GATGTTAACG ACAAGATGCT GACGGAACAG 420

TGTTGGTCGC TGTCCAATTC ATGCGGTGAA TTGATCAACC CAGACGACAA AGGGCGATTC 480

GTGGCTCTCA CCTTTAAGGA CAGAGACACA GCTGATGACA CGGGTGCCGC CAACGTGGAA 540

TGTCGCGTGG GCGACTATCT AGTTTACGCT ATGTCCCTGT TTGAGCAGAG GACCCAAAAA 600

TCGCAGTCTG GCAACATCTC TCTGTACGAA AAGTACTGTG AATACATCAG GACCTACTTA 660

GGGAGTACAG ACCTGTTCTT CACAGCGCCG GACAGGATTC CGTTACTTAC GGGCATCCTA 720

TACGATTTTT GTAAGGAATA CAACGTTTTC TACTCGTCAT ATAAGAGAAA CGTCGATAAT 780

TTCAGATTCT TCTTGGCGAA TTATATGCCT TTGATATCTG ACGTCTTTGT CTTCCAGTGG 840

GTAAAACCCG CGCCGGATGT TCGGCTGCTT TTTGAGTTAA GTGCAGCGGA ACTAACGCTG 900

GAGGTTCCCA GACTGAGTTT GATAGATTCT CAAGTTGTGG TAGGTCATAT CTTAAGATAC 960

GTAGAATCCT ACACATCAGA TCCAGCCATC GACGCGTTAG AAGACAAACT GGAAGCGATA 1020

CTGAAAAGTA GCAATCCCCG TCTATCGACA GCGCAACTAT GGGTTGGTTT CTTTTGTTAC 1080

TATGGTGAGT TTCGTACGGC TCAAAGTAGA GTAGTGCAAA GACCAGGCGT ATACAAAACA 1140

CCTGACTCAG TGGGTGGATT TGAAATAAAC ATGAAAGATG TTGAGAAATT CTTCGATAAA 1200

CTTCAGAGAG AATTGCCTAA TGTATCTTTG CGGCGTCAGT TTAACGGAGC TAGAGCGCAT 1260

GAGGCTTTCA AAATATTTAA AAACGGAAAT ATAAGTTTCA GACCTATATC GCGTTTAAAC 1320

GTGCCTAGAG AGTTCTGGTA TCTGAACATA GACTACTTCA GGCACGCGAA TAGGTCCGGG 1380

TTAACCGAAG AAGAAATACT CATCCTAAAC AACATAAGCG TTGATGTTAG GAAGTTATGC 1440

GCTGAGAGAG CGTGCAATAC CCTACCTAGC GCGAAGCGCT TTAGTAAAAA TCATAAGAGT 1500

AATATACAAT CATCACGCCA AGAGCGGAGG ATTAAAGACC CATTGGTAGT CCTGAAAGAC 1560

ACTTTATATG AGTTCCAACA CAAGCGTGCC GGTTGGGGGT CTCGAAGCAC TCGAGACCTC 1620

GGGAGTCGTG CTGACCACGC GAAAGGAAGC GGTTGA 1656

Proteín tepelného šoku selín SEQ.ID.No.il:

má nasledujúcu sekvenciu aminoky-

Met 1

Ser

Asn

Tyr

Ser 5

Trp

Glu

Ser

Leu

Phe 10

Lys

Lys

Phe

Tyr

Gly 15

Glu

Ala

Asp

Trp

Lys 20

Lys

Tyr

Leu

Ser

Arg 25

Ser

íle

Ala

Ala

His 30

Ser

Ser

Glu

íle

Lys 35

Thr

Leu

Pro

Asp

íle 40

Arg

Leu

Tyr

Gly

Gly 45

Arg

Val

Val

Lys

Lys 50

Ser

Glu

Phe

Glu

Ser 55

Ala

Leu

Pro

Asn

Ser 60

Phe

Glu

Gin

Glu

Leu 65

Gly

Leu

Phe

íle

Leu 70

Ser

Glu

Arg

Glu

Val 75

Gly

Trp

Ser

Lys

Leu 80

Cys

Gly

íle

Thr

Val 85

Glu

Glu

Ala

Ala

Tyr 90

Asp

Leu

Thr

Asn

Pro 95

Lys

Ala

Tyr

Lys

Phe 100

Thr

Ala

Glu

Thr

Cys 105

Ser

Pro

Asp

Val

Lys 110

Gly

Glu

Gly

Gin

Lys 115

Tyr

Ser

Met

Glu

Asp 120

Val

Met

Asn

Phe

Met 125

Arg

Leu

Ser

Asn

Leu 130

Asp

Val

Asn

Asp

Lys 135

Met

Leu

Thr

Glu

Gin 140

Cys

Trp

Ser

Leu

Ser 145

Asn

Ser

Cys

Gly

Glu 150

Leu

íle

Asn

Pro

Asp 155

Asp

Lys

Gly

Arg

Phe 160

Val

Ala

Leu

Thr

Phe 165

Lys

Asp

Arg

Asp

Thr 170

Ala

Asp

Asp

Thr

Gly 175

Ala

Ala

Asn

Val

Glu 180

Cys

Arg

Val

Gly

Asp 185

Tyr

Leu

Val

Tyr

Ala 190

Met

Ser

Leu	Phe	Glu 195	Gin	Arg	Thr	Gin
Tyr	Glu 210	Lys	Tyr	Cys	Glu	Tyr 215
Leu 225	Phe	Phe	Thr	Ala	Pro 230	Asp
Tyr	Asp	Phe	Cys	Lys 245	Glu	Tyr
Asn	Val	Asp	Asn 260	Phe	Arg	Phe
Ser	Asp	Val 275	Phe	Val	Phe	Gin
Leu	Leu 290	Phe	Glu	Leu	Ser	Ala 295
Leu 305	Ser	Leu	íle	Asp	Ser 310	Gin
Val	Glu	Ser	Tyr	Thr 325	Ser	Asp
Leu	Glu	Ala	íle	Leu	Lys	Ser

340

Leu	Trp	Val 355	Gly	Phe	Phe	Cys
Ser	Arg 370	Val	Val	Gin	Arg	Pro 375
Gly 385	Gly	Phe	Glu	íle	Asn 390	Met
Leu	Gin	Arg	Glu	Leu 405	Pro	Asn
Ala	Arg	Ala	His 420	Glu	Ala	Phe
Phe	Arg	Pro 435	íle	Ser	Arg	Leu
Asn	íle 450	Asp	Tyr	Phe	Arg	His 455
Glu 4 65	íle	Leu	íle	Leu	Asn 470	Asn
Ala	Glu	Arg	Ala	Cys	Asn	Thr

Lys 200	Ser	Gin	Ser	Gly	Asn 205	íle	Ser	Leu
íle	Arg	Thr	Tyr	Leu 220	Gly	Ser	Thr	Asp
Arg	íle	Pro	Leu 235	Leu	Thr	Gly	íle	Leu 240
Asn	Val	Phe 250	Tyr	Ser	Ser	Tyr	Lys 255	Arg
Phe	Leu 265	Ala	Asn	Tyr	Met	Pro 270	Leu	íle
Trp 280	Val	Lys	Pro	Ala	Pro 285	Asp	Val	Arg
Ala	Glu	Leu	Thr	Leu 300	Glu	Val	Pro	Thr
Val	Val	Val	Gly 315	His	íle	Leu	Arg	Tyr 320
Pro	Ala	íle 330	Asp	Ala	Leu	Glu	Asp 335	Lys
Ser	Asn 345	Pro	Arg	Leu	Ser	Thr 350	Ala	Gin
Tyr 360	Tyr	Gly	Glu	Phe	Arg 365	Thr	Ala	Gin
Gly	Val	Tyr	Lys	Thr 380	Pro	Asp	Ser	Val
Lys	Asp	Val	Glu 395	Lys	Phe	Phe	Asp	Lys 400
Val	Ser	Leu 410	Arg	Arg	Gin	Phe	Asn 415	Gly
Lys	íle 425	Phe	Lys	Asn	Gly	Asn 430	íle	Ser
Asn 440	Val	Pro	Arg	Glu	Phe 445	Trp	Tyr	Leu
Ala	Asn	Arg	Ser	Gly 460	Leu	Thr	Glu	Glu
íle	Ser	Val	Asp 475	Val	Arg	Lys	Leu	Cys 480
Leu	Pro	Ser	Ala	Lys	Arg	Phe	Ser	Lys

490 495

Asn His Lys Ser Asn íle Gin Ser Ser Arg Gin Glu Arg Arg íle Lys 500 505 510

485

Asp

Pro

Leu

Val

Val

Leu

Lys

Asp

Thr Leu

Tyr

Glu

Phe

Gin

His

Lys

515

520

525

Arg

Ala

Gly

trp

Gly

Ser

Arg

Ser

Thr Arg

Asp

Leu

Gly

Ser

Arg

Ala

530

535

540

Asp

His

ala

Lys

Gly

Ser

Gly

545 550 a má molekulovú hmotnosť od 61 do 65 kDa, výhodne 63 kDa.

Ešte iná takáto molekula DNA podlá tohoto vynálezu (GLRaV-2 ORF5) má nukleotidy 12844-13515 v SEQ.ID.No.l a kóduje divergentný povrchový proteín. Táto molekula DNA má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.12:

ATGAGTTCCA ACACAAGCGT GCCGGTTGGG GGTCTCGAAG CACTCGAGAC CTCGGGAGTC 60

GTGCTGACCA CGCGAAAGGA AGCGGTTGAT AAGTTTTTTA ATGAACTAAA AAACGAAAAT 120

TACTCATCAG TTGACAGCAG CCGATTAAGC GATTCGGAAG TAAAAGAAGT GTTAGAGAAA 180

AGTAAAGAAA GTTTCAAAAG CGAACTGGCC TCCACTGACG AGCACTTCGT CTACCACATT 240

ATATTTTTCT TAATCCGATG TGCTAAGATA TCGACAAGTG AAAAGGTGAA GTACGTTGGT 300

AGTCATACGT ACGTGGTCGA CGGAAAAACG TACACCGTTC TTGACGCTTG GGTATTCAAC 360

ATGATGAAAA GTCTCACGAA GAAGTACAAA CGAGTGAATG GTCTGCGTGC GTTCTGTTGC 420

GCGTGCGAAG ATCTATATCT AACCGTCGCA CCAATAATGT CAGAACGCTT TAAGACTAAA 480

GCCGTAGGGA TGAAAGGTTT GCCTGTTGGA AAGGAATACT TAGGCGCCGA CTTTCTTTCG 540

GGAACTAGCA AACTGATGAG CGATCACGAC AGGGCGGTCT CCATCGTTGC AGCGAAAAAC 600

GCTGTCGATC GTAGCGCTTT CACGGGTGGG GAGAGAAAGA TAGTTAGTTT GTATGATCTA 660

GGGAGGTACT AA 672

Divergentný povrchový proteín má nasledujúcu sekvenciu ami-

nokyselín	zodpovedajúcu	SEQ.ID.No.13:
Met Ser Ser 1	Asn Thr Ser Val 5	Pro Val Gly Gly Leu Glu Ala Leu Glu 10 15
Thr Ser Gly	Val Val Leu Thr 20	Thr Arg Lys Glu Ala Val Asp Lys Phe 25 30
Phe Asn Glu 35	Leu Lys Asn Glu	Asn Tyr Ser Ser Val Asp Ser Ser Arg 40 45
Leu Ser Asp 50	Ser Glu Val Lys 55	Glu Val Leu Glu Lys ser Lys Glu Ser 60

Phe Lys 65	Ser Glu Leu Ala Ser Thr Asp Glu His	Phe	Val Tyr His	íle 80
70	75
íle Phe	Phe Leu íle Arg Cys Ala Lys íle 85 90	Ser	Thr	Ser Glu Lys 95	Val
Lys Tyr	Val Gly Ser His Thr Tyr Val Val 100 105	Asp	Gly	Lys Thr Tyr 110	Thr
Val Leu	Asp Ala Trp Val Phe Asn Met Met 115 120	Lys	Ser	Leu Thr Lys 125	Lys
Tyr Lys 130	Arg Val Asn Gly Leu Arg Ala Phe 135	Cys	Cys 140	Ala Cys Glu	Asp
Leu Tyr 145	Leu Thr Val Ala Pro íle Met Ser 150	Glu 155	Arg	Phe Lys Thr	Lys 160
Ala Val	Gly Met Lys Gly Leu Pro Val Gly 165 170	Lys	Glu	Tyr Leu Gly 175	Ala
Asp Phe	Leu Ser Gly Thr Ser Lys Leu Met 180 185	Ser	Asp	His Asp Arg 190	Ala
Val Ser	íle Val Ala Ala Lys Asn Ala Val 195 200	Asp	Arg	Ser Ala Phe 205	Thr
Gly Gly 210	Glu Arg Lys íle Val Ser Leu Tyr 215	Asp	Leu 220	Gly Arg Tyr
a má molekulovú hmotnosť od 23 do	27	kDa, výhodne	25 kDa

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 ORF6) obsahuje nukleotidy 13584-14180 v SEQ.ID.No.l a kóduje povrchový proteín vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA obsahuje nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.14:

ATGGAGTTGA TGTCCGACAG CAACCTTAGC AACCTGGTGA TAACCGACGC CTCTAGTCTA 60

AATGGTGTCG ACAAGAAGCT TTTATCTGCT GAAGTTGAAA AAATGTTGGT GCAGAAAGGG 120

ACCACGTCTC CTAAGGTTCA GCGCGCAGAT TCAGACGTTA TATTTTCAAA TAGTTTCGGA 180

ACCACGTCTC CTAAGGTTCA GCGCGCAGAT TCAGACGTTA TATTTTCAAA TAGTTTCGGA 240

GAGAGGAATG TGGTAGTAAC AGAGGGTGAC CTTAAGAAGG TACTCGACGG GTGTGCGCCT 300

CTCACTAGGT TCACTAATAA ACTTAGAACG TTCGGTCGTA CTTTCACTGA GGCTTACGTT 360

GACTTTTGTA TCGCGTATAA GCACAAATTA CCCCAACTCA ACGCCGCGGC GGAATTGGGG 420

ATTCCAGCTG AAGATTCGTA CTTAGCTGCA GATTTTCTGG GTACTTGCCC GAAGCTCTCT 480

GAATTACAGC AAAGTAGGAA GATGTTCGCG AGRATGTACG CTCTAAAAAC TGAAGGTGGA 540

GTGGTAAATA CACCAGTGAG CAATCTGCGT CAGCTAGGTA GAAGGGAAGT TATGTAA

597

Povrchový protein má nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ.ID.No.15:

Met 1

Glu

Leu

Met

Ser 5

Asp

Ser

Asn

Leu

Ser 10

Asn

Leu

Val

íle

Thr 15

Asp

Ala

Ser

Ser

Leu 20

Asn

Gly

Val

Asp

Lys 25

Lys

Leu

Leu

Ser

Ala 30

Glu

Val

Glu

Lys

Met 35

Leu

Val

Gin

Lys

Gly 40

Ala

Pro

Asn

Glu

Gly 45

íle

Glu

Val

Val

Phe 50

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr 55

Ala

Leu

Ala

Ala

Arg 60

Thr

Thr

Ser

Pro

Lys 65

Val

Gin

Arg

Ala

Asp 70

Ser

Asp

Val

íle

Phe 75

Ser

Asn

Ser

Phe

Gly 80

Glu

Arg

Asn

Val

Val 85

Val

Thr

Glu

Gly

Asp 90

Leu

Lys

Lys

Val

Leu 95

Asp

Gly

Cys

Ala

Pro 100

Leu

Thr

Arg

Phe

Thr 105

Asn

Lys

Leu

Arg

Thr 110

Phe

Gly

Arg

Thr

Phe 115

Thr

Glu

Ala

Tyr

Val 120

Asp

Phe

Cys

íle

Ala 125

Tyr

Lys

His

Lys

Leu 130

Pro

Gin

Leu

Asn

Ala 135

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly 140

íle

Pro

Ala

Glu

Asp 145

Ser

Tyr

Leu

Ala

Ala 150

Asp

Phe

Leu

Gly

Thr 155

Cys

Pro

Lys

Leu

Ser 160

Glu

Leu

Gin

Gin

Ser 165

Arg

Lys

Met

Phe

Ala 170

Ser

Met

Tyr

Ala

Leu 175

Lys

Thr

Glu

Gly

Gly 180

Val

Val

Asn

Thr

Pro 185

Val

Ser

Asn

Leu

Arg 190

Gin

Leu

Gly Arg Arg Glu Val Met 195 a má molekulovú hmotnosť od 20 až 24 kDa, výhodne 22 kDa.

Iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 ORF7) obsahuje nukleotidy 14180-14665 v SEQ.ID.No.l a kóduje druhý protein alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ.ID.No.16:

ATGGAAGATT	ACGAAGAAAA	ATCCGAATCG	CTCATACTGC	TACGCACGAA	TCTGAACACT	60
ATGCTTTTAG	TGGTCAAGTC	CGATGCTAGT	GTAGAGCTGC	CTAAACTACT	AATTTGCGGT	120
TACTTACGAG	TGTCAGGACG	TGGGGAGGTG	ACGTGTTGCA	ACCGTGAGGA	ATTAACAAGA	180

GATTTTGAGG	GCAATCATCA	TACGGTGATC	CGTTCTAGAA	TCATACAATA	TGACAGCGAG	240
TCTGCTTTTG	AGGAATTCAA	CAACTCTGAT	TGCGTAGTGA	AGTTTTTCCT	AGAGACTGGT	300
AGTGTCTTTT	GGTTTTTCCT	TCGAAGTGAA	ACCAAAGGTA	GAGCGGTGCG	ACATTTGCGC	360
ACCTTCTTCG	AAGCTAACAA	TTTCTTCTTT	GGATCGCATT	GCGGTACCAT	GGAGTATTGT	420
TTGAAGCAGG	TACTAACTGA	AACTGAATCT	ATAATCGATT	CTTTTTGCGA	AGAAAGAAAT	480
CGTTAA						486

Druhý nedefinovaný proteín alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča má predpokladanú nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ.ID.No.17:

Met 1

Glu

Asp

Tyr

Glu 5

Glu

Lys

Ser

Glu

Ser 10

Leu

íle

Leu

Leu

Arg 15

Thr

Asn

Leu

Asn

Thr 20

Met

Leu

Leu

Val

Val 25

Lys

Ser

Asp

Ala

Ser 30

Val

Glu

Leu

Pro

Lys 35

Leu

Leu

íle

Cys

Gly 40

Tyr

Leu

Arg

Val

Ser 45

Gly

Arg

Gly

Glu

Val 50

Thr

Cys

Cys

Asn

Arg 55

Glu

Glu

Leu

Thr

Arg 60

Asp

Phe

Glu

Gly

Asn 65

His

His

Thr

Val

íle 70

Arg

Ser

Arg

íle

íle 75

Gin

Tyr

Asp

Ser

Glu 80

Ser

Ala

Phe

Glu

Glu 85

Phe

Asn

Asn

Ser

Asp 90

Cys

Val

Val

Lys

Phe 95

Phe

Leu

Glu

Thr

Gly 100

Ser

Val

Phe

Trp

Phe 105

Phe

Leu

Arg

Ser

Glu 110

Thr

Lys

Gly

Arg

Ala 115

Val

Arg

His

Leu

Arg 120

Thr

Phe

Phe

Glu

Ala 125

Asn

Asn

Phe

Phe

Phe 130

Gly

Ser

His

Cys

Gly 135

Thr

Met

Glu

Tyr

Cys 140

Leu

Lys

Gin

Val

Leu 145

Thr

Glu

Thr

Glu

Ser 150

íle

íle

Asp

Ser

Phe 155

Cys

Glu

Glu

Arg

Asn 160

Arg a má molekulovú hmotnosť od 17 až 21 kDa, výhodne 19 kDa.

Ešte iná takáto molekula DNA (GLRaV-2 0RF8) obsahuje nukleotidy 14667-15284 v SEQ.ID.No.l a kóduje tretí nedefi52 novaný protein alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča. Táto molekula DNA má nasledujúcu sekvenciu nukleotidov SEQ. ID.No.18:

ATGAGGGTTA	TAGTGTCTCC	TTATGAAGCT GAAGACATTC TGAAAAGATC GACTGACATG	60
TTACGAAACA	TAGACAGTGG	GGTCTTGAGC ACTAAAGAAT GTATCAAGGC ATTCTCGACG	120
ATAACGCGAG	ACCTACATTG	TGCGAAGGCT TCCTACCAGT GGGGTGTTGA CACTGGGTTA	180
TATCAGCGTA	ATTGCGCTGA	AAAACGTTTA ATTGACACGG TGGAGTCAAA CATACGGTTG	240
GCTCAACCTC	TCGTGCGTGA	AAAAGTGGCG GTTCATTTTT GTAAGGATGA ACCAAAAGAG	300
CTAGTAGCAT	TCATCACGCG	AAAGTACGTG GAACTCACGG CGTGGGAGT GAGAGAAGCCG	360
GTGAAGAGGG	AAATGCGCTC	TCTTACCAAA ACAGTTTTAA ATAAAATGTC TTTGGAAATG	420
GCGTTTTCA TGTCACCACG AGCGTGGAAA AACGCTGAAT GGTTAGAACT AAAATTTTCA	480
CCTGTGAAAA	TCTTTAGAGA	TCTGCTATTA GACGTGGAAA CGCTCAACGA ATTGTGCGCC	540
GAAGATGATG	TTCACGTCGA	CAAAGTAAAT GAGAATGGGG ACGAAAATCA CGACCTCGAA	600
CTCCAAGACG	AATGTTAA		618

Tretí nedefinovaný protein alebo polypeptid má predpokladanú nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ.ID.No.19:

Met Arg 1

Val

íle

Val 5

Ser Pro Tyr

Glu

Ala Glu Asp íle Leu Lys Arg

10

15

Ser

Thr

Asp

Met

Leu

Arg

Asn

íle

Asp

Ser

Gly

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

20

25

30

Glu

Cys

íle

Lys

Ala

Phe

Ser

Thr

íle

Thr

Arg

Asp

Leu

His

Cys

Ala

35

40

45

Lys

Ala

Ser

Tyr

Gin

Trp

Gly

Val

Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

Gin

Arg

Asn

50

55

60

Cys

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

íle

Asp

Thr

Val

Glu

Ser

Asn

íle

Arg

Leu

65

70

75

80

Ala

Gin

Pro

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Val

Ala

Val

His

Phe

Cys

Lys

Asp

85

90

95

Glu

Pro

Lys

Glu

Leu

Val

Ala

Phe

íle

Thr

Arg

Lys

Tyr

Val

Glu

Leu

100

105

110

Thr

Gly

Val

Gly

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Lys

Arg

Glu

Met

Arg

Ser

Leu

115

120

125

Thr Lys Thr Val Leu Asn Lys Met Ser Leu Glu Met Ala Phe Tyr Met 130 135 140

Thr

Lys

Thr

Val

Leu

Asn

Lys

Met

Ser

Leu

Glu

Met

Ala

Phe

Tyr

Met

130

135

140

Ser

Pro

Arg

Ala

Trp

Lys

Asn

Ala

Glu

Trp

Leu

Glu

Leu

Lys

Phe

Ser

145

150

155

160

Pro

Val

Lys

íle

Phe

Arg

Asp

Leu

Leu

Leu

Asp

Val

Glu

Thr

Leu

Asn

165

170

175

Glu

Leu

Cys

Ala

Glu

Asp

Asp

Val

His

Val

Asp

Lys

Val

Asn

Glu

Asn

180

185

190

Gly

Asp

Glu

Asn

His

Asp

Leu

Glu

Leu

Gin

Asp

Glu

Cys

195

200

205

a má molekulová hmotnosť od 22 do 26 kDa, výhodne 24 kDA.

Iná molekula DNA podlá tohoto vynálezu (GLRaV-2 3' UTR) obsahuje nukleotidy 15285 až 15500 zo SEQ.ID.No 1 a obsahuje obsahuje nasledovnú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ.ID.No. 23:

ACATTGGTTA AGTTTAACGA AAATGATTAG TAAATAATAA ATCGAACGTG GGTGTATCTA 60

CCTGACGTAT CAACTTAAGC TGTTACTGAG TAATTAAACC AACAAGTGTT GGTGTAATGT 120

GTATGTTGAT GTAGAGAAAA ATCCGTTTGT AGAACGGTGT TTTTCTCTTC TTTATTTTTA 180

AAAAAAAAAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC GGCCGC 216

Tento vynález tiež zahrňuje fragmenty molekúl DNA. Vhodné fragmenty schopné prenosu rezistencie voči zvinutke viniča do rastliny viniča sú vytvorené použitím príslušných reštrikčných miest, zistených pomocou sekvencie molekuly DNA, k: (i) inzertu interpozónu (Felley a spol., „Interposon Mutagenesis of Soil and Water Bacteria: a Family of DNA Fragments Designed for in vitro Insertion Mutagenesis of Gram-negative Bacteria, Gene, 52:147-15 (1987), uvedené v citáciách) tak, že môžu byť vytvorené neúplné formy polypeptidu alebo proteínu vírusu zvinutky viniča, ktorým chýbajú rôzne dlhé úseky na C-zakončení, alebo (ii) môžu byť deletované rôzne vnútorné časti proteínu. Podobne môže byť sekvencia použitá na amplifikáciu ktorejkoľvek časti kódujúcej oblasti tak, že môže byť klonovaná do vektora podporujúceho transkripčné a translačné signály.

Vhodné molekuly DNA sú tie, ktoré hybridizujú s DNA molekulou obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu najmenej 15 súvislých báz zo SEQ.ID.No. 1 za prísnych podmienok charakterizovaných hybridizačným pufrom s obsahom 0,9 M citrátu sodného („SSC) pri teplote 37 °C a pretrvávajúcou väzbou po premývaní s SSC pufrom pri 37 °C; a výhodne v hybridizačnom pufri s obsahom 20 % formamidu v 0,9 M soľnom/0,9 M SSC pufri pri teplote 42 °C a pretrvávajúcou väzbou po premývaní 0,2 x SSC pufrom pri teplote 42 °C.

Obmeny môžu byť tiež ľubovoľne modifikované, napríklad, delécia alebo pridanie nukleotidov ktoré majú minimálny vplyv na vlastnosti, sekundárnu štruktúru a hydropatickú povahu kódovaného polypeptidu. Napríklad, nukleotidy kódujúce polypeptid môžu byť konjugované so signálom (alebo počiatočnou) sekvenciou na N-zakončení proteínu, ktorý ko-translančne alebo post-translančne riadi prenos proteínu. Nukleotidová sekvencia môže byť tiež zmenená tak, že kódovaný polypeptid je konjugovaný s linkérom alebo inou sekvenciou pre ulahčenie syntézy, čistenia, alebo identifikáciu polypeptidu.

Proteín alebo polypeptid podľa tohoto vynálezu je výhodne pripravený konvenčnými technikami v čistej forme (výhodne najmenej asi 80 %, výhodnejšie 90 %, čistý). Typicky je proteín alebo polypeptid podľa tohoto vynálezu izolovaný lýzou a sonikáciou. Po premytí je lyzát resuspendovaný v Tris-HCl pufri. Počas dialýzy sa vytvorí z tohoto roztoku proteínov zrazenina. Roztok je centrifugovaný a potom je pelet premytý a resuspendovaný v Tris-HCl pufri. Proteíny sú rozdelené elektroforézou na SDS 12 % polyakrylamidovom géli.

Molekula DNA kódujúca proteín alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča (typ 2) podľa tohoto vynálezu môže byť vložená do buniek pomocou konvenčných rekombinančných postupov.

Všeobecne to predstavuje inzerciu molekuly DNA do expresného systému, ku ktorému je molekula DNA heterológna (t.zn. nie je normálne prítomná). Heterológna molekula DNA je vložená do expresného systému alebo vektoru vhodnou orientáciou a správnym čítacím rámcom. Vektor obsahuje potrebné prvky pre transkripciu a transláciu sekvencie inzertu kódujúceho protein.

U.S. Patent č. 4,237,224 Cohena a Boyera, ktorý je uvedený v citáciách, popisuje vytvorenie expresného systému vo forme rekombinantných plazmidov použitím reštrikčného štiepiaceho enzýmu a ligácie pomocou DNA ligázy. Tieto rekombinantné plazmidy sú potom vložené transformáciou a replikované v jednobunkových kultúrach prokaryotických organizmov alebo eukaryotických bunkách, ktoré rastú v kultúrach.

Rekombinanté gény môžu byť vložené tiež do vírusov, ako je vaccinia vírus. Rekombinantné vírusy môžu byť vytvorené transfekciou plazmidov do buniek infikovaných vírusom.

Vhodné vektory sú, ale nie sú vymedzené, nasledovné vírusové vektory ako lambda vektorový systém gtll, gt WES.tB, Charon 4 a plazmidové vektory ako pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKCIOl, SV 40, pBluescript II SK +/- alebo KS +/- (pozri „Stratagene Cloning Systems Katalóg (1993) zo Stratagene, La Jolla, Calif., uvedené v citáciách), pQE, pIH821, pGEX, pET série (pozri Studier a spol., „Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes, Gene Expression Technology zv. 185 (1990), uvedené v citáciách) a akékoľvek ich deriváty. Rekombinantné molekuly môžu byť vložené do buniek transformáciou, transdukciou, konjugáciou, mobilizáciou alebo elektroporáciou. Sekvencie DNA sú klónované do vektora použitím štandardných postupov v odbore, ako je popísané Maniatis om a spol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1982), uvedené v citáciách.

Pre expresiu sekvencie (sekvencii) kódujúcej protein môžu byť použité rôzne systémy hostiel-vektor. Po prvé, vektorový systém musí byť kompatibilný s použitou hostitelskou bunkou. Hostitel-vektorové systémy sú, ale nie sú vymedzené nasledujúcim vymenovaním: baktérie transformované bakteriofágovou DNA, plazmidovou DNA, alebo cosmid DNA; mikroorganizmy ako kvasinky obsahujúce kvasinkové vektory; cicavčie bunkové systémy infikované vírusom (napr. vaccina vírus, adenovírus, atdj ; bunkové systémy hmyzu infikované vírusom (napr. baculovirus) a rastlinné bunky infikované baktériou alebo transformované bombardovaním častíc („biolistic). Expresné prvky týchto vektorov sa líšia svojou silou a špecificitou. V závislosti na použitom systéme hostiel-vektor, môžu byť použité ktorékoľvek z velkého množstva vhodných transkripčných a translačných prvkov.

Rôzne genetické signály úpravy ich spracovania kontrolujú vela stupňov expresie génu (napr. transkripciu DNA a transláciu messenger RNA („mRNA)).

Transkripcia DNA je závislá na prítomnosti promótora, čo je sekvencia DNA, ktorá riadi väzbu RNA polymerázy a tak zahajuje syntézu mRNA. Sekvencie DNA eukaryotických promótorov sa líšia od prokaryotických promótorov. Okrem toho eukaryotické promótory a sprievodné genetické signály nemusia byť rozpoznané, alebo nemusia byť funkčné v prokaryotickom systéme a ďalej prokaryotické promótory nie sú rozpoznané a nie sú funkčné v eukaryotických bunkách.

Podobne translácia mRNA v prokaryontoch závisí na prítomnosti vhodných prokaryotických signálov, ktoré sú rozdielne ako signály eukaryontov. Účinná translácia mRNA v prokaryontoch si vyžaduje sekvenciu pre ribozomálne väzobné miesto, nazývané Shine-Dalgarno („SD) na mRNA. Táto sekvencia je krátka nukleotidová sekvencia na mRNA, ktorá sa nachádza pred štartovacím kodónom, zvyčajne AUG, ktorý kóduje metionín na aminokyselinovom zakončení proteínu. SD sekvencie sú komplementárne k 3'-zakončeniu 16S rRNA (ribozomálna RNA) a pravdepodobne podporujú väzbu mRNA na ribozómy pomocou vytvorenia duplexu s rRNA, čím sa umožní správna poloha ribozómu. Prehlad o spôsoboch maximálnej expresie génu uvádza Roberts a Lauer, Methods in Enzymology, 68:473 (1979), uvedené v citáciách.

Promótory sa líšia svojou „silou (t. zn. schopnosťou podporovať transkripciu). Pre účely expresie klónovaného génu je žiadúce použiť silné promótory, aby sa tak dosiahla vysoká úroveň transkripcie a preto expresia génu. V závislosti na použitom hostiteľskom bunkovom systéme môže byť použitý ktorýkoľvek z veľkého množstva vhodných promótorov. Napríklad, pri klónovaní E. coli, jej bakteriofágov, alebo plazmidov, môžu byť použité promótory ako T7 fágový promótor, lac promótor, trp promótor, recA promótor, ribozomálny RNA promótor, P_R a P_L promótory kolifágu lambda a iné, vrátane ale nie vymedzené na IacUV5, ompF, bla, lpp a podobne, ktoré riadia vysoký stupeň transkripcie susedných segmentov DNA. K transkripcii inzertovaného génu môže byť tiež použitý hybrid trplacUV5 (tac) promótor, alebo iné promótory E. coli vytvorené rekombinantnou DNA alebo inými postupmi syntézy DNA.

Môžu byť vybrané také kmene bakteriálnych hostitelských buniek a expresné vektory, ktoré inhibujú pôsobenie promótora pokiaľ nie je promótor špecificky indukovaný. Pre účinnú transkripciu inzertovanej DNA je potrebné v niektorých operónoch pridať špecifické inducery. Napríklad, lac operón je indukovaný pridaním laktózy alebo IPTG (izopropyltio-beta-Dgalaktozidu) . Rôzne iné operóny, ako trp, pro, atď. sú pod inou kontrolou.

Pre účinnú transkripciu a transláciu génu v prokaryotických bunkách sú tiež potrebné špecifické iniciačné signály. Tieto transkripčné a translačné iniciačné signály sa môžu líšiť svojou „silou čo sa hodnotí množstvom génovej špecifickej messenger RNA a množstvom syntetizovaného proteínu. DNA expresný vektor, ktorý obsahuje promótor, môže tiež obsahovať akúkoľvek kombináciu rôzne „silných transkripčných a/alebo translačných iniciačných signálov. Napríklad, účinná translácia v E. coli si pre poskytnutie väzobného miesta pre ribozóm vyžaduje Shine-Dalgarno („SD) sekvenciu asi 7 až 9 báz 5' k iniciačnému kodónu („ATG). Takže môže byť použitá akákoľvek kombinácia SD-ATG, taká, ktorá môže byť využitá ribozómami hostiteľskej bunky. Takéto kombinácie sú, ale nie sú vymedzené, SD-ATG kombinácia z cro génu alebo N gén colifágu lambda, alebo z E. coli tryptofán E, D, C, alebo A gény. Okrem toho môže byť použitá akákoľvek SD-ATG kombinácia vytvorená rekombinantnou DNA alebo inými postupmi zahrňujúcimi inkorporáciu syntetických nukleotidov.

Keď boli izolované molekuly DNA kódujúce rôzne proteíny alebo polypeptidy vírusu zvinutky viniča (typ 2) , ako je popísané vyššie, naklónované do expresného systému, sú tieto pripravené na inkorporáciu do hostiteľskej bunky. Takáto inkorporácia sa môže uskutočniť rôznymi formami transformácie uvedenými vyššie, v závislosti na vektor/hostitel bunkovom systéme. Vhodné hostiteľské bunky sú, ale nie sú vymedzené, baktérie, vírusy, kvasnice, cicavčie bunky, hmyz, rastlina a podobne.

Tento vynález sa tiež týka molekúl DNA, ktoré kódujú proteíny alebo polypeptidy vírusu zvinutky viniča (typ 2) popísaných vyššie. Transkripty môžu byť syntetizované použitím hostiteľských buniek podľa tohoto vynálezu ktorýmkoľvek kon59 venčným postupom. Translácia mRNA môže byť uskutočnená buď in vitro alebo in vivo. Bezbunkové systémy sú pšeničné klíčky alebo extrakty retikulocytov. Napríklad in vivo translácia môže byť uskutočnená mikroinjekciou do žabích oocytov.

Jedným hľadiskom tohoto vynálezu je použitie jednej alebo viac molekúl DNA, ktoré kódujú rôzne proteíny alebo polypeptidy vírusu zvinutky viniča (typ 2) pre transformáciu rastlín viniča tak, aby bola prenesená rezistencia voči zvinutke viniča do rastliny. Nie je známy mechanizmus, ktorým je rezistencia prenesená. Jeden predpokladaný mechanizmus je založený na tom, že transformovaná rastlina môže exprimovať proteín alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča (typ 2) a keď transformovaná rastlina je inokulovaná vírusom zvinutky viniča, ako GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6, alebo ich kombináciou, exprimovaný proteín alebo polypeptid zabráni translácii vírusovej DNA.

Z tohoto hľadiska predmetná molekula DNA inkorporovaná do rastliny môže byť podľa tohoto vynálezu konštitutívne exprimovaná. Expresia môže byť tiež regulovaná promótorom, ktorý je aktivovaný prítomnosťou vírusu zvinutky viniča. Pre tieto účely sú vhodné promótory exprimované génmi ako odpoveď na infiltráciu vírusu zvinutky viniča.

Izolované molekuly DNA podlá tohoto vynálezu môžu byť použité na prenos rezistencie voči vírusu zvinutky viniča do mnohých odrôd rastlín viniča. Molekuly DNA sú zvlášť dobre upravené pre prenos rezistencie do štepu alebo koreňovej odnože kultivarov Vitis. Štepy kultivarov, ktoré môžu byť ochránené sú bežné stolové alebo hrozienkové viniče ako Alden, Almeria, Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoise, Black Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell

Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emeerald Seedless, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Fláme sedless, Fláme Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Koshmishi, Loose Perlette, Malaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Fláme, Muscat Hamburg, New York Muškát, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless, Thomuscat. Môžu to byť tiež odrody používané pre výrobu vína ako Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon, Baco blane (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay, Chasselas dore, Chenin blane, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Fernao Pires, Flóra, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melón, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blane, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino, Pedro Ximenes, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet, SaintEmilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blane, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano, Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, White Riesling, Zinfandel. Kultivary koreňových odnoží, ktoré môžu byť ochránené sú Courderc 1202, Courderc 1613, Courderc 1616, Courderc 3309, Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x

R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B, Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14, Oppenheim 4 (SO4), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, SaintGeorge, Sált Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis california a Vitis girdiana.

Existuje velká podobnosť v hsp70-podobných sekvenčných oblastiach v GLRaV-2 a v iných klosterovírusoch, ako tristeza vírus a vírus žltnutia repy. GLRaV-2 hsp-70 podobný gén môže byť potom použitý pre vytvorenie transgénnych rastlín alebo kultivarov iných ako vinič, ako je citrus alebo cukrová repa, ktoré sú rezistentné voči iným klosterovírusom ako je zvinutka viniča, tristeza vírus a vírus žltnutia repy.

Vhodné citrusové kultivary sú citrón, limeta, pomaranč, grapefruit, ananás, tangerinka a podobne, ako Joppa, Maltaise Ovale, Parson (Parson Brown), Pera, Pineapple, Queen, Shamouti, Valencia, Tenerife, Imperiál Doblefina, Washington Sanguine, Moro, Sanguinello Moscato, Spanish Sanguinelli, Tarocco, Atwood, Australian, Bahia, Baiana, Cram, Dalmau, Eddy, Fisher, Frost Washington, Gillette, LengNavelina, Washington, Satsuma Mandarín, Dancy, Robinson, Ponkan, Duncan, Marsh, Pink Marsh, Ruby Red, Red Seedless, Smooth Seville, Orlando Tangelo, Eureka, Lisbon, Meyer Lemon, Rough Lemon, Sour Orange, Persian Lime, West India Lime, Bearss, Sweet Lime, Troyer Citrange, Citrus Trifoliata. Každý z týchto citrusových kultivarov je vhodný pre prípravu transgénnych citrusových rastlín rezistentných voči tristeza vírusu.

Ekonomicky výhodným druhom cukrovej repy je Beta vulgaris L., ktorá má štyri dôležité typy kultivarov: cukrová repa, stolová repa, kŕmna repa a Swiss chard. Každý z týchto repných kultivarov je vhodný pre prípravu transgénnych rast62 lín repy rezistentných voči vírusu žltnutia repy, ako je popísané vyššie.

Pretože je známe, že GLRaV-2 infikuje rastliny tabaku (napr. Nicotiana benthamiana), je tiež žiadúca príprava transgénnych tabakových rastlín, ktoré sú rezistentné voči vírusom zvinutky viniča, ako GLRaV-2.

Rastlinné tkanivo vhodné pre transformáciu je tkanivo listu, koreňové tkanivo, byl, zygotické a somatické embryá a tyčinky. Zvlášť je výhodné použiť embryo získané z kultúr tyčiniek.

Pri vhodných podmienkach, podľa tohoto vynálezu, môže byť použitý expresný systém na transformáciu prakticky ktoréhokoľvek rastlinného tkaniva. Tkanivové bunky transformované v súhlase s predkladaným vynálezom môžu rásť in vitro vo vhodnom médiu a prenášať rezistenciu voči vírusu zvinutky viniča. Transformované bunky môžu byť regenerované na celé rastliny tak, že proteín alebo polypeptid udeľuje rezistenciu voči vírusu zvinutky viniča intaktným transgénnym rastlinám. V každom prípade, rastlinné bunky transformované expresným systémom rekombinantnej DNA podľa predkladaného vynálezu rastú a exprimujú túto molekulu DNA a tvoria jeden z vyššie popísaných proteínov alebo polypeptidov vírusu zvinutky viniča, a tým prenášajú rezistenciu voči vírusu zvinutky viniča.

Pri príprave transgénnych rastlín, DNA konštrukt vo vyššie popísanom vektore, môže byť mikroinjekčne vložený priamo do rastliny pomocou mikropipiet na mechanický prenos rekombinantnej DNA. Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202:179-85 (1985), uvedené v citáciách. Genetický materiál môže byť tiež prenesený do rastlinnej bunky pomocou polyetylén glykolu. Krens a spol., Náture, 296:72-74 (1982), uvedené v citáciách.

Inou technológiou transformácie rastlín molekulami DNA v súhlase s týmto vynálezom je kontakt tkaniva takýchto rastlín s inokulom baktérií s transformovaným vektorom, ktorý obsahuje gén podlá tohoto vynálezu, a ktorý prenáša rezistenciu voči zvinutke viniča. Všeobecne tento postup pozostáva z inokulácie rastlinného tkaniva suspenziou baktérií a inkubácie tkaniva počas 48 až 72 hodín v regeneračnom médiu bez antibiotík pri teplote 15 až 38 °C.

Na transformáciu rastlinných buniek môžu byť použité baktérie z rodu Agrobacterium. Vhodné druhy takýchto baktérií sú Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes. Agrobacterium tumefaciens (napr. kmene C58, LBA4404, alebo EHA105) a sú zvlášť užitočné pre ich velmi dobrú schopnosť transformovať rastliny.

Heterológne genetické sekvencie môžu byť vložené do príslušných rastlinných buniek pomocou Ti plazmidu z A. tumefaciens alebo Ri plazmidu z A. rhizogenes. Ti alebo Ri plazmid je prenesený do rastlinných buniek infikovaním Agrobacterium a je stabilne integrovaný do rastlinného genómu. J. Schell, Science, 237:1176-83 (1987), uvedené v citáciách.

Po transformácii musia byť transformované bunky regenerované.

Regeneráciu rastliny z protoplastov v kultúre popisuje Evans a spol., Handbook of Plánt Celí Cultures, zv. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983); a Vasil I.R. (ed.), Celí Culture and Somatic Celí Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, zv. I, 1984 a zv. III (1986), ktoré sú uvedené v citáciách.

Je známe, že prakticky všetky rastliny môžu byť regenerované z bunkových kultúr alebo z tkanivových kultúr, vrátane ale nie vymedzené, všetky hlavné druhy cukrovej trstiny, cukrovej repy, bavlny, ovocných stromov a zeleniny.

Spôsoby regenerácie sa menia v závislosti na druhu rastlín, ale všeobecne najskôr sa pripraví suspenzia transformovaných protoplastov na Petriho miske. Vytvorí sa kalusové tkanivo a z kalusu môžu byť indukované výhonky, ktoré sú následne zakorenené. Alternatívne môže byť indukované vytvorenie embrya v kalusovom tkanive. Tieto embryá sa vyvíjajú ako prirodzené embryo pri tvorbe rastliny. Všeobecne kultivačné médium obsahuje rôzne aminokyseliny a hormóny, ako auxin a cytokiníny. Je tiež výhodné pridať do média kyselinu glutámovú a prolín. Účinnosť regenerácie bude závisieť na médiu, na genotype a histórii rastliny. Keď tieto tri premenné sú kontrolované, regenerácia je zvyčajne reprodukovateľná a opakovatelná.

Keď je expresná kazeta stabilne inkorporovaná do transgénnej rastliny, môže byť prenesená do iných rastlín pohlavným krížením. Môžu byť použité ktorékoľvek z mnohých štandardných spôsobov množenia, v závislosti na druhu, ktorý má byť krížený.

Po vytvorení transgénnej rastliny tohoto druhu, rastliny samotné môžu byť pestované bežným spôsobom tak, že konštrukt DNA je prítomný vo výsledných rastlinách. Alternatívne sa z transgénnych rastlín získajú transgénne semená. Tieto semená môžu byť zasiate do pôdy a pestované bežnými spôsobmi čím sa dopestujú transgénne rastliny.

Iný prístup pre transformáciu rastlinných buniek génom prenášajúcim rezistenciu voči patogénom je bombardovanie časticami (tiež známe ako biolistická transformácia) hostiteľskej bunky. Toto sa môže uskutočniť jedným alebo viacerými spôsobmi. Prvý spôsob predstavuje vyvolanie pohybu inertných alebo aktívnych častíc na bunkách. Tento spôsob je popísaný v U.S. Patentoch č. 4,945,050; 5,036,006 a 5,100,972 Sanforda a spol., a v Emerschad a spol., „Somatic Embryogenesis and

Plánt Development from Immature Zygotic Embryos of Seedless Grapes (Vitis vinifera), Plánt Celí Reports, 14:6-12 (1995) („Emerschad (1995)), ktoré sú uvedené v citáciách. Všeobecné tento postup je založený na privedení inertných alebo biologicky aktívnych častíc na bunky v podmienkach účinných pre penetráciu cez vonkajší povrch bunky a inkorporáciu do jej vnútra. Keď sa použijú inertné častice, vektor môže byť vložený do bunky pokrytím častíc vektorom obsahujúcim heterológnu DNA.

Alternatívne cieľová bunka môže byť obkolesená vektorom tak, že vektor je vnesený do bunky „vzbudenou časticou. Biologicky aktívne častice (napr. vysušené bakteriálne bunky obsahujúce vektor a heterológnu DNA), môžu byť tiež vnesené do buniek pohybom.

Po tom, ako je rastlinné tkanivo transformované, citrusové rastlinné tkanivo, rastlinné tkanivo repy alebo rastlinné tkanivo tabaku, podľa predkladaného vynálezu, je transformované tkanivo regenerované a je vytvorená transgénna rastlina. Všeobecne sa regenerácia uskutočňuje kultiváciou transformovaného tkaniva v médiu s obsahom vhodných rastových regulátorov a živín, čo umožní iniciáciu výhonkových meristémov. Pre selekciu vývoja transformovaných buniek a na zastavenie rastu Agrobacterium, sa pridajú do regeneračného média vhodné antibiotiká. Po iniciácii výhonkov sa výhonky ponechajú rásť a vytvoriť tkanivovú kultúru, ktorá je selektovaná podľa aktivity markera génu.

Molekuly DNA podľa tohoto vynálezu môžu byť schopné transkripcie na messenger RNA, ktorá hoci kóduje protein alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča (typ 2), nie je schopná translácie na protein. Toto je známe ako RNA-sprostredkovaná rezistencia. Keď štep alebo koreňová odnož kultivaru Vitis, alebo kultivar citrusu, repy alebo tabaku, je transformovaný takouto molekulou DNA, molekula DNA môže byť prepísaná v podmienkach účinných pre udržanie messenger RNA v rastlinnej bunke na nízkej čítacej úrovni. Výhodná je hustota čítania medzi 15 a 50 pri použití Hewlet ScanJet and Image Analysis Program.

Môže byť použitá časť jednej alebo viacerých molekúl DNA podlá tohoto vynálezu, rovnako ako iné molekuly DNA v transgénnej rastline viniča, citrusovej rastline, rastline repy alebo tabaku v súhlase s U.S. Patentovou žiadosťou číslo série č. 09/025,635, uvedenou v citáciách.

Proteín alebo polypeptid vírusu zvinutky viniča (typ 2) podlá tohoto vynálezu môže byť tiež použitý pri tvorbe protilátok alebo ich väzobných častí, alebo sond. Protilátky môžu byť monoklonálne alebo polyklonálne.

Tvorba monoklonálnych protilátok môže byť uskutočnená spôsobmi dobre známymi v odbore. V zásade spôsob predstavuje najprv získanie imúnnych buniek (lymfocytov) zo sleziny cicavca (napr. myši), ktorý bol vopred imunizovaný príslušným antigénom buď in vivo alebo in vitro. Lymfocyty sekretujúce antilátku sú potom fúzované s (myšími) myelómovými bunkami alebo transformovanými bunkami, ktoré sú schopné sa nekonečne replikovať v bunkovej kultúre, a tým tvoriť nesmrteľnú imunoglobulín-sekretujúcu bunkovú líniu. Výsledné fúzované bunky, alebo hybridómy, sú kultivované a výsledné kolónie sú testované pre produkciu príslušných monoklonálnych protilátok. Kolónie produkujúce takéto protilátky sú klónované a pre produkciu veľkých množstiev protilátok rastú buď in vivo alebo in vitro. Popis teoretického základu a praktických postupov pre fúziu takýchto buniek je uvedený v Kohler a Milstein, Náture, 256:495 (1975), uvedené v citáciách.

Cicavčie lymfocyty sú imunizované in vivo imunizáciou zvieraťa (napr. myši) proteínom alebo poplypeptidom podľa predkladaného vynálezu. Takéto imunizácie sú podľa potreby opakované v intervaloch niekoľkých týždňov tak, aby sa získalo dostatočné množstvo protilátok. Po poslednej dávke antigénu sú zvieratá usmrtené a odstráni sa slezina.

Fúzia s cicavčími myelómovými bunkami alebo inými partnermi schopnými nekonečnej replikácie v bunkových kultúrach je účinná štandardnými a dobre známymi postupmi, napríklad použitím polyetylén glykolu („PEG) alebo iných látok podporujúcich fúziu. (Pozri Milstein a Kohler, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976), uvedené v citáciách). Takouto nesmrtelnou bunkovou líniou je výhodne murine bunková línia, ale môže byť tiež odvodená od buniek iných cicavčích druhov, vrátane ale neobmedzene na potkany a ľudí, sú vybraté bunky, ktorým chýbajú enzýmy potrebné pre utilizáciu niektorých živín, ktoré sú schopné rýchleho rastu a majú dobrú schopnosť fúzie. Odborníci poznajú veľa takýchto bunkových línií a iné sú riadne popísané.

Postupy pre tvorbu polyklonálnych protilátok sú dobre známe. Typicky môžu byť takéto protilátky tvorené po subkutánnom podaní proteínu alebo polypeptidu podľa tohoto vynálezu New Zealand bielym králikom, ktorým bola vopred odobratá krv aby sa získalo sérum pred imunizáciou. Antigény môžu byť injikované v celkovom objeme 100 μΐ na jedno miesto, celkovo na šiestich miestach. Každý injikovaný materiál obsahuje syntetické povrchovo aktívne adjuvantné pluronické polyoly, alebo práškový akrylamidový gél s obsahom proteínu alebo polypeptidu po SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Králikom je odobratá krv po dvoch týždňoch a rovnaký antigén je opakovane podaný trikrát, každých šesť týždňov. Vzorka séra je odobratá 10 dní po každom podaní antigénu. Polyklonálne protilátky sú získané zo séra pomocou afinitnej chromatografie za použitia príslušného antigénu na vychytanie protilátky. Nakoniec sú králiky usmrtené intravenóznym podaním pentobarbitál v dávke 150 mg/kg. Tento postup a iné postupy pre prípravu polyklonálnych protilátok sú popísané v Harlow a spol., vyd., Antibodies: A Laboratory Manual (1988), uvedené v citáciách.

Okrem použitia celých protilátok, môžu byť použité väzobné časti týchto protilátok. Takéto väzobné časti sú Fab fragmenty, F(ab')2 fragmenty a Fv fragmenty. Tieto fragmenty protilátok môžu byť pripravené konvenčnými postupmi, ako proteolytická fragmentácia, ktorú popísal Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, New York: Academic Press, str. 98-118 (1983), uvedené v citáciách.

Tento vynález sa tiež týka sond nájdených buď v prírode alebo pripravených synteticky pomocou rekombinantnej DNA alebo inými biologickými postupmi. Vhodné sondy sú molekuly, ktoré sa viažu na antigény vírusu zvinutky viniča (typ 2) rozpoznávané monoklonálnymi protilátkami podlá tohoto vynálezu. Napríklad takýmito sondami môžu byť proteíny, peptidy, lektíny alebo nukleové kyseliny.

Protilátky alebo ich väzobné časti, alebo sondy môžu byť podané do štepu alebo koreňovej odnože kultivarov infikovaných vírusom zvinutky viniča. Alternatívne najmenej väzobné časti týchto protilátok môžu byť sekvenované a môže byť syntetizovaná kódujúca DNA. Molekula kódujúcej DNA môže byť použitá pre transformáciu rastlín spolu s promótorom, ktorý zahajuje expresiu kódovanej protilátky, keď je rastlina infikovaná vírusom zvinutky viniča. V každom prípade sa bude protilátka alebo jej väzobná časť, alebo sonda viazať na vírus a tým zabráni zvyčajnú odpoveď zvinutky.

Protilátky pripravené voči GLRaV-2 proteínom alebo polypeptidom podlá tohoto vynálezu, alebo väzobné časti týchto protilátok môžu byť použité pre detekciu vírusu zvinutky vo vzorke tkaniva, ako je tkanivo (napr. štep, alebo koreňová odnož) z rastliny viniča alebo rastliny tabaku. Protilátky alebo ich väzobné časti vhodné pre použitie pri detekcii sú tie, ktoré boli vytvorené voči helikáze, metyltransferáze a papaínu-podobnej proteáze, RNA-závislej RNA polymeráze, proteínu 70 tepelného šoku, proteínu 90 tepelného šoku, rozvetvenému povrchovému proteínu, alebo iným proteínom a polypeptidom v súhlase s týmto vynálezom. Zaznamená sa akákoľvek reakcia vzorky s protilátkou pomocou systému, ktorý indikuje prítomnosť vírusu zvinutky vo vzorke. Môžu byť použité rôzne systémy ako sú enzymatická imunosorbčná analýza, rádioimunoanalýza, analýza gélovo difúznej precipitačnej reakcie, fluorescenčná imunoanalýza, A imunoanalýza, alebo imunoelektroforetická analýza.

Vírus zvinutky viniča môže byť detekovaný v týchto vzorkách použitím nukleotidovej sekvencie molekuly DNA, alebo jej fragmentu, ktorý kóduje proteín alebo polypeptid podľa tohoto vynálezu. Nukleotidová sekvencia je potom sondou pri hybridizácii nukleovej kyseliny alebo pri detekcii amplifikácie génu (napr. použitím metódy polymerázovej reťazovej reakcie). Sondy nukleovej kyseliny podľa tohoto vynálezu môžu byť použité v ktoromkoľvek systéme pre hybridizáciu nukleovej kyseliny, vrátane ale nie obmedzené, Southern bloty (Southern, E.M., „Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis, J. Mol. Biol., 98:503-17 (1975), uvedené v citáciách), Northern bloty (Thomas, P.S., „Hybridiztion of Denaturated RNA and Small DNA Fragments Transferred to Nitrocellulose, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

77:5201-05 (1980), uvedené v citáciách) a „Colony bloty (Grunstein, M. a spol., „Colony Hybridization: A Method for the Isolation of Cloned cDNAs that Contain a Specific Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-65 (1975), uvedené v citáciách) . Sondy môžu byť tiež použité pri detekcii amplifikácie génu (napr. polymerázová reťazová reakcia). Erlich,

H. A. a spol., „Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction, Science 252:1643-51 (1991), uvedené v citáciách, Zaznamená sa akákolvek reakcia so sondou, ktorá naznačí prítomnosť vírusu zvinutky viniča vo vzorke. Detekcia je uľahčená tým, že sa označí sonda podľa tohoto vynálezu. Vhodným označením je rádioaktívna zlúčenina, fluorescenčná zlúčenina, chemiluminiscenčná zlúčenina, enzymatická zlúčenina a iné rovnocenné označenia nukleových kyselín.

V závislosti na cieli detekcie je možné použiť sondy s nukleotidovými sekvenciami, ktoré zodpovedajú konzervatívnym alebo variabilným oblastiam ORF alebo UTR. Napríklad, pre rozlíšenie vírusu zvinutky viniča od iných podobných vírusov (napr. klosterovírusov), je želateľné použiť sondy s obsahom nukleotidových sekvencii, ktoré zodpovedajú konzervatívnejším sekvenciám vo všetkých vírusoch zvinutky viniča. Pre rozlíšenie rôznych vírusov zvinutky viniča (napr. GLRaV-2 od GLRaVI, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5 a GLRaV-6) je želateľné použiť sondy obsahujúce nukleotidové sekvencie ktoré zodpovedajú sekvenciám menej konzervatívnym medzi rôznymi vírusmi zvinutky viniča.

Sondy nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA) podlá tohoto vynálezu budú hybridizovať s komplementárnou GLRaV-2 nukleovou kyselinou za určitých vymedzených podmienok. Vymedzené podmienky sú teplota asi o 50 ° C nižšia ako je bod topenia (T_m) pre špecifickú sekvenciu pri definovanej iónovej sile a pH. T_m je teplota (pri definovanej iónovej sile a pH), pri ktorej 50 % cielovej sekvencie hybridizuje s presne zhodnou sondou. T_m je závislá na roztoku a základnej zlúčenine sondy a môže byť vypočítaná pomocou nasledujúcej rovnice:

T_m = 79,8 °C + (18,5 x Log[Na+l]) + (58.4 °C x % [G+C])

- (820/#bp v duplexe)

- (0,5 x % formamidu)

Nešpecifická väzba môže byť tiež skontrolovaná použitím jedného z mnohých spôsobov ako napríklad blokovanie membrány roztokom s obsahom proteínov, pridaním heterológnej RNA, DNA a SDS do hybridizačného pufra a pôsobením RNázy. Podmienky premývania nie sú také prísne. Pri hybridizácii nukleovej kyseliny alebo pri detekcii amplifikácie génu sú podmienky prísne, tak ako je uvedené vyššie. Viac-menej, môžu byť tiež vybrané prísne podmienky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady ilustrujú podstatu tohoto vynálezu, ale nie sú mienené, že obmedzujú jeho ciel.

Príklad 1 - Northern hybridizácia

Špecificita vybraných klónov bola potvrdená Northern hybridizáciou. Northern hybridizácia bola uskutočnená po elektroforéze dsRNA z GLRaV-2 v 10 % agarózovom nedenaturačnom géli. Agarózový gél bol denaturovaný namočením do 50 mM NaOH s obsahom 0,4 M NaCl počas 30 minút a potom bol gél neutralizovaný 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) s obsahom 0,5 M NaCl počas ďalších 30 minút. RNA bola sendvičovo blotovaná na Genescreen™ plus membráne (Dupont NEN Research Product) v 10 x SSC pufri a hybridizovaná podlá pokynov výrobcu (Dupont, NEN) .

Príklad 2 - Sekvenovanie a počítačom riadená sekvenčná analýza nukleotidov a aminokyselín

Inzerty DNA boli sekvenované v pBluescript SK+ použitím univerzálnych primérov T3 a T7 pre terminálnu oblasť a ďalších oligonukleotidových primérov pre známu sekvenciu ich vnútornej oblasti. Čistenie plazmidovej DNA bolo uskutočnené modifikáciou postu precipitácie mini alkalickej-lýzy/PEG popísanej výrobcom (Applied Biosystems, Inc.). Nukleotidová sekvencia na oboch vláknach cDNA bola hodnotená ABI TaqDyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc) . Pre automatické sekvenovanie sa použil ABI373 Automated Sequencer (Applied Biosystems, Inc.) v Cornellovej univerzite, Geneva, NY.

Boli zostrojené nukleotidové sekvencie GLRaV-2 a boli analyzované EditSeq a SeqMan programami DNASTAR (Madison, WI). Sekvencie aminokyselín odvodené zo sekvencií nukleotidov a ich kódujúcich otvorených čítacích rámcov boli získané pomocou MapDraw programu. Použitím Clustal metódy programu MegAlin bolo získaných veľa sekvencií aminokyselín, identifikovali sa súhlasné sekvencie aminokyselín a vytvoril sa fylogenetický strom. Pomocou Entrez programu boli získané sekvencie nukleotidov a aminokyselín pre iné klosterovírusy; porovnanie sekvencií s nie nadbytočnými databázami bolo uskutočnené pomocou Blast programu z Národného strediska pre biotechnologické informácie (National Center for Biotechnology Information).

Príklad 3 - Izolácia dsRNA

Zdrojom pre izoláciu dsRNA a klonovanie cDNA bolo niekoľko viničov Vitis vinifera cv Pinot Noir pochádzajúcich z oblasti centrálnych viníc New Yorku infikovaných GLRaV-2.

dsRNA bola extrahovaná z tkaniva floému infikovaného viniča podľa metódy popísanej Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-Like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. Phytopathology 128:1-14 (1990), uvedené v citáciách. Čistenie dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti (asi 15 kb) sa uskutočnilo pomocou elektroforetického delenia celkovej dsRNA na 0,7 % agarózovom géli s nízkym bodom topenia a extrakciou fenol/chloroformom podľa metódy popísanej Sambrookom a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), uvedené v citáciách. Koncentrácia dsRNA bola stanovená meraním UV fluorescencie prúžku dsRNA po zafarbení etidium bromidom a porovnaní so známou koncentráciou DNA markeru.

Príklad 4 - Syntéza a klónovanie cDNA

Syntéza cDNA bola uskutočnená podľa metódy pôvodne popísanej Jelkmanom a spol., „Cloning of Four Plánt Viruses From Small Quantities of Double-Stranded RNA, Phytopathology 79:1250-53 (1989) a modifikovanej Lingom a spol., „The Coat Protein Gene of Grapevine Leafroll Associated Closterovirus3: Cloning, Nucleotide Sequencing and Expression in Transgenic Plants Árch. Virology 142:1101-16 (1997), obe uvedené v citáciách. Asi 100 ng dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti, prečistenej na agarózovom géli s nízkym bodom topenia, bolo denaturovaných v 20 mM hydroxide metylortuťnatom a inkubovaných pri laboratórnej teplote 10 minút s 350 ng náhodných primérov. Prvé vlákno cDNA bolo syntetizované pomocou reverznej transkriptázy vtáčieho myeloblastického vírusu (AMV). Druhé vlákno cDNA bolo získané pomocou RNAázy H a E. coli DNA polymerázy I. Dvoj vláknitá cDNA bola naslepo ukončená T4 DNA polymerázou a ligovaná s EcoR I adaptérmi. cDNA, ktorá mala na zakončení EcoR I adaptéry, bola aktivovaná kinázovou reakciou a ligovaná do Lambda ZAP II/EcoR I pripravených ramienok podľa návodu výrobcu (Stratagene). Rekombinantná DNA bola potom zvinutá in vitro do Gigapack® II extraktu (Stratagene). Zvinuté fágové častice boli amplifikované a titrované podľa návodu výrobcu.

Pre identifikáciu GLRaV-2 špecifických klónov boli použité dva druhy sond z knižnice. Jeden typ bol pripravený zo zosyntetizovanej cDNA, ktorá bola amplifikovaná PCR po ligácii so špecifickými EcoR I Uni-Amp™ adaptérmi (Clontech); a druhý typ DNA inzertov alebo produktov PCR bol už zo sekvenovaných klónov. Klóny z knižnice cDNA boli vybraté „colonylifting hybridizáciou na colony/plaque Screen membráne (NEN Research Product) so sondou popísanou vyššie. Sonda bola pripravená označením ³²P(a-dATP] použitím Klenow-ovho fragmentu DNA polymerázy I z E. coli. Prehybridizácia, hybridizácia a premývanie sa uskutočnili pri teplote 65 °C podľa návodu výrobcu (Dupont, NEN Research Product). Vybraté plaky boli premenené na rekombinantný pBluescript in vivo vystrihnutím podľa návodu výrobcu (Stratagene).

Pre získanie klónov predstavujúcich krajné 3'-zakončenie v GLRaV-2, dsRNA bola polyadenylovaná kvasnicovou poly(A) polymerázou. Použitím poly(A)-dsRNA ako templátu, bola cDNA amplifikovaná RT-PCR s oligo(dľ)18 a špecifickým primérom, CP1/T7R, ktorý je odvodený z klónu CP-1 a má nasledovnú nukleotidovú sekvenciu SEQ. ID. No. 20:

TGCTGGAGCT TGAGGTTCTG C 21

Výsledný produkt PCR (3'-PCR) bol klónovaný do TA vektora (Invitrogen) a bol sekvenovaný.

Ako ukazuje obrázok 1A, dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti približne 15 kb bola konzistentne identifikovaná z viničov infikovaných GLRaV-2, ale nie zo zdravých viničov. Okrem toho, v infikovanom tkanive bolo detekovaných niekolko dsRNA nízkej molekulovej hmotnosti. Výťažok dsRNA z GLRaV-2 bol 5 až 10 ng/15 g tkaniva floému, čo bolo oveľa menej ako výťažok z GLRaV-3 (Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-Like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. Phytopathology 128:1-14 (1990), uvedené v citáciách) . Pre syntézu cDNA, klónovanie a stanovenie Lambda/ZAP II cDNA knižnice bola použitá len dsRNA vysokej molekulovej hmotnosti, ktorá bola čistená na agarózovom géli s nízkym bodom topenia.

Pre vyhľadávanie cDNA knižnice boli použité dva druhy sond. Pôvodné klóny boli identifikované pomocou hybridizácie s Uni-Amp™ PCR-amplifikovanou cDNA ako sondou. Ako ukazuje obrázok 1B, špecificita týchto sond (napr. TC-1) v rozsahu velkosti 200 až 1 800 bp bola potvrdená Northern hybridizáciou s dsRNA z GLRaV-2. Okrem toho po hybridizácii so sondami z GLRaV-2 špecifických cDNA klónov alebo z PCR produktov bolo identifikovaných viac ako 400 rôznych klónov velkosti 800 až 7 500 bp. Na oboch reťazcoch bolo potom sekvenovaných viac ako 40 klónov (Obrázok 2).

Príklad 5 - Expresia povrchového proteínu v E. coli a imunoblot

Pre stanovenie, že ORF6 bol gén povrchového proteínu GLRaV-2, kompletná molekula ORF6 DNA bola subklónovaná z PCR produktu a inzertovaná do expresného vektora fúzneho proteínu pMAL-C2 (New England Biolabs, Inc.). Pre PCR reakciu boli po76 užité špecifické priméry CP-96F a CP-96R, ktoré obsahovali pre uľahčenie klónovania EcoR I a BamH miesta. CP-96F predstavuje štartovací kodón v CP a obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ. ID. No. 21:

CGGAATTCAC CATGGAGTTG ATGTCCGACA G 31

CP-96R obsahoval 66 nukleotidov v smere od stop kodónu v CP a obsahuje nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ. ID. No. 22:

AGCGGATCCA TGGCAGATTC GTGCGTAGCA GTA 33

Povrchový proteín bol exprimovaný ako proteín fúzovaný s proteínom viažucim maltózu (MBP) z E. coli pod kontrolou „tac promótora a potlačený „lacrepresorom. MBP-CP fúzny proteín bol indukovaný pridaním 0,3 mM izopropyl-B-D-tio-galaktopyranozidu (IPTG) a prečistený jednostupňovou afinitnou chromatografiou na kolóne podlá návodu výrobcu (New England, Biolabs, Inc.). MBP-CP fúzny proteín alebo povrchový proteín odštiepený z fúzneho proteínu bol testovaný reakciou so špecifickým antisérom z GLRaV-2 (láskavo poskytnuté Dr. Charlesom Greif-om z INRA, Colmar, Francúzsko) na Western blote podľa metódy popísanej Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-Like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. Phytopathology 128:1-14 (1990), uvedené v citáciách. Nerekombinantné plazmidy alebo neindukované bunky nereagovali s antisérom z GLRaV-2.

Príklad 6 - Analýza sekvencie a organizácia genómu v GLRaV-2

Celkovo bolo sekvenovaných 15 500 bp RNA genómu v GLRaV-2 a tieto boli uložené v GenBank (prístupové číslo AF039204). Zistilo sa, že asi 85 % z celkového genómu RNA bolo v dvoch rozdielnych klónoch. Sekvencia oblasti génu pre povrchový protein bola stanovená a potvrdená viacerými prekrývajúcimi klónmi. Organizácia genómu v GLRaV-2, zaznamenaná na Obrázku 2, obsahuje deväť otvorených čítacích rámcov (napr. ORFla, lb-8).

ORFla a ORFlb: Analýza sekvencie aminokyselín časti z Nzakončenia v GLRaV-2 ORFla kódovanom produkte ukázala dve predpokladané papaínu podobné proteázové domény, čo poukázalo na významnú podobnosť s papaínu-podobnou vedúcou proteázou v BYV (Agranovsky a spol., „Beet Yellows Closterovirus: Complete Genome Structure and Identification of Papain-Like Thiol Protease, Virology 198:311-24 (1994), uvedené v citáciách) . Toto umožnilo predpokladať katalytické zvyšky cysteínu a histidínu pre predpokladanú GLRaV-2 proteázu. Po porovnaní sekvencie papaínu podobnej proteázy z BYV so sekvenciou z GLRaV-2, miesto štiepenia na zvyškoch Gly-Gly (aminokyseliny 588 až 589) z BYV, zodpovedalo príslušnému alanínglycín (Ala-Gly) a Gly-Gly dipeptidu z GLRaV-2 (Obrázok 3A). Štiepenie na tomto mieste by vytvorilo vedúci protein a fragment C-zakončenia obsahujúci MT a HEL domény veľkosti 234 kDa (2 090 aminokyselín). Avšak oblasť domény papaínu podobnej proteázy v GLRaV-2 neukázala podobnosť s príslušnou oblasťou BYV. Okrem toho, bola prítomná variabilita vo zvyškoch nachádzajúcich sa na šiepiacej väzbe (Gly v BYV a Ala v GLRaV-2). Podobná rôznosť zvyšku štiepiaceho miesta v P-PRO doméne bola popísaná v LChV (Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of Little Cherry Virus, a Mealybug-Trasmissible Closterovirus, J. General Virology 78:2067-71 (1997), uvedené v citáciách).

Vyladávanie v databáze pre sekvenciu aminokyselín odvodených od ORFla/lb kódovaného proteínu poukázalo na významnú podobnosť s MT, HEL a PdRP doménami iných klosterovírusov. Oblasť za P-PRO štiepacim miestom vykazuje významnú podobnosť (57,4 % zhoda v 266 zvyškoch) s predpokladanou metyltransferázovou doménou v BYV a obsahovala všetky konzervatívne motívy, typické pozitívne rameno RNA vírusového typu I MT (Obrázok 3B) . Časť C-zakončenia v ORFla bola identifikovaná ako helikázová doména, ktorej sekvencia ukázala vysokú podobnosť (57,1 % zhoda v 315 zvyškoch) s helikázovou doménou v BYV a obsahovala sedem znakov konzervatívnych motívov pozitívneho ramena RNA vírusov pre Superrodinu I helikázy (Obrázok 3C) (Hodgman, „A New Superfamily of Replicative Proteins, Náture 333:22-23 (1988); Koonin a Dolja, „Evolution and Taxonomy of Positive-strand RNA Viruses: Implications of Comparative Analysis of Amino Acid Sequences, Crit. Rev, in Biochem. and Mol. Biol. 28:375-430 (1993), obe uvedené v citáciách).

ORFlb kódoval 460 aminokyselinový polypeptid s molekulovou hmotnosťou 52 486 Da, počítané z miesta rámcového posunu. Vyladávanie v databáze pre RdRP poukázalo na významnú podobnosť s RdRP doménami pozitívneho reťazca RNA vírusov. Porovnanie RdRP domén z GLRaV-2 a BYV poukázalo na prítomnosť osem konzervatívnych motívov v RdRP (Obrázok 3D).

Ako je ukázané na Obrázku 8, provizorný fylogenetický strom pre RdRP z GLRaV-2 vzhľadom k iným klosteroví rusom je v úzkom vzťahu k monopartitným klosterovírusom BYV, BYSV a CTV.

Bolo navrhnuté, že v klosterovírusoch sa uplatňuje mechanizmus +1 rámcového posunu pri expresii ORFlb, ako veľkého fúzneho proteínu s ORFla (Agranovsky a spol., „Beet Yellows Closterovirus: Complete Genome Structure and Identification of a Papain-like Thiol Protease, Virology 198:311-24 (1994);

Karasev a spol., „Complete Sequence of the Citrus Tristeza Vírus RNA Genome, Virology 208:511-20 (1995); Klaasen a spol., „Genome Structure and Phylogenetic Analysis of Lettuce Infectious Yellows Virus, a Whitefly-Transmitted, Bipartite Closterovirus, Virology 208:99-110 (1995); Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996); Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of the Little Cherry Virus, a Mealybug-Transmissible Closterovirus, J. General Virology, 78:2067-71 (1997), všetky uvedené v citáciách) . Verí sa, že v prekrývajúcej ORFla/lb oblasti v BYV, prešmykovacia sekvencia GGGUUUA a dve vlasové štruktúry (slučka a pseudouzol), vytvárajú +1 rámcový posun (Agranovsky a spol., „Beet Yellows Closterovirus: Complete Genome Structure and Identification of Papain-like Thiol Protease, Virology 198:311-24 (1994), uvedené v citáciách). Žiadna z týchto štruktúr nie je konzervovaná v CTV a BYSV (Karasev a spol., „Complete Sequence of the Citrus Tristeza Virus RNA Genome Virology 208:511-20 (1995); Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996), obe uvedené v citáciách) v ktorých bola navrhnutá ribozomálna medzera na zakončení alebo vzácnom kodóne tak, aby vykonávali rovnakú funkciu. Porovnanie nukleotidovej sekvencie v oblasti C-zakončenia helikázy a oblasti N-zakončenia RdRP v GLRaV-2 s rovnakou oblasťou iných klosterovírusov ukázalo významnú podobnosť s BYV, BYSV a CTV. Ako je ukázané na Obrázku 4, terminačné UAG na konci C'-koncovej helikázy v GLRaV-2 súhlasí s koncovým UAG z BYV a BYSV a arginín GGG kodónom z CTV.

ORF2 kóduje malý proteín tvorený 171 bp (57 aminokyselín) molekulovej hmotnosti 6 297 Da. Podlá predpokladu, odvo80 dená sekvencia aminokyselín obsahuje oblasť nepolárnych aminokyselín a predpokladá sa, že tvoria transmembránový helix. Malý hydrofóbny analógny proteín je tiež prítomný v BYV, BYSV, CTV, LIYV a LChV (Agranovsky a spol., „Nucleotide sequence of the 3'-Terminál Half of Beet Yellows Closterovirus RNA Genome Unique Arrangement of Eight Virus Genes, J. General Virology 72:15-24 (1991); Karasev a spol., „Organization of the 3'Terminál Half of the Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses , Virology 221:199-207 (1996); Pappu a spol., „Nucleotide Sequence and Organization of Eight 3' Open Reading Frames of the Citrus Tristeza Closterovirus Genome, Virology 199:35-46 (1994); Klaasen a spol., „Partial Characterization of the Lettuce Infectious Yellows Virus Genomic RNAs, Identification of the Coat Protein Gene and Comparison of its Amino Acid Sequence With Those of Other Filamentous RNA Plánt Viruses, J. General Virology, 75:1525-33 (1994); Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of the Little Cherry Virus, a Mealybug-Transmissible Closterovirus, J. General Virology, 78:2067-71 (1997), všetky uvedené v citáciách).

ORF3 kóduje 600 aminokyselinový polypeptid molekulovej hmotnosti 65 111 Da, ktorý je homológny s HSP70 bunkovým proteínom tepelného šoku. V klosterovírusoch je HSP70 vysoko konzervatívny a je pravdepodobne zapojený do ATP aktivity a zúčastňuje sa interakcie proteín - proteín pre chaperónovú aktivitu (Agranovsky a spol., „The Beet Yellows Closterovirus p65 Homologue of HSP70 Chaperones has ATPase Activity Associated with its Conserved N-terminal Domain but Interact with Unfolded Protein Chains, J. General Virology 78:353-42 (1997); Agranovsky a spol., „Bacterial Expression and Some

Properties of the p65, a Homologue of Celí Heat Shock Protein HSP70 Encoded in RNA Genome of Beet Yellows Closterovirus, Doklady Akadémii Náuk 340:416-18 (1995); Karasev a spol., „HSP70-Related 65-kDa Protein of Beet Yellows Closterovirus is a Microtubule-Binding Protein, FEBS Letters 304:12-14 (1992), všetko uvedené v citáciách).

Ako zaznamenáva Obrázok 5, porovnanie úplného ORF3 z GLRaV-2 s HSP70 homológom z BYV ukázalo na prítomnosť ôsmych konzervatívnych motívov. Percento podobnosti HSP70 medzi GLRaV-2 a BYV, BYSV. CTV, LIYVa LChV je 47,8 %, 47,2 %, 38,6 %, 20,9 % a 17,7 %.

ORF4 kóduje 551 aminokyselinový proteín molekulovej hmotnosti 63 349 Da. Vyhladávanie v databáze pre proteínový produkt ORF4 nezistilo podobné proteíny s výnimkou jeho náprotivných proteínov v klosterovírusoch, BYV (P64), BYSV (P61), CTV (P61), LIYV (P59) a LChV (P61). Verí sa, že tento proteín je predpokladaný proteín tepelného šoku 90. Ako je ukázané na Obrázku 9, boli prítomné dva konzervatívne motívy v BYV (Agranovsky a spol., „Nucleotide Sequence of the 3'Terminál Half of Beet Yellows Closterovirus RNA Genome Unique Arrangement of Eight Virus Genes, J. General Virology, 72:15-24 (1991) a CTV (Pappu a spol., „Nucleotide Sequence and Organization of Eight 3'0pen Reading Frames of the Citrus Tristeza Closterovirus Genome, Virology 199:36-46 (1994), uvedené v citáciách) boli tiež identifikované v ORF4 z GLRaV-2.

ORF5 a ORF6 kódujú polypeptidy molekulovej hmotnosti 42 803 Da a 21 661 Da. Počiatočný kodón pre oba ORF má výhodné predpoklady pre transláciu. Na základe porovnania sekvencie s inými klosterovírusmi bol ORF6 identifikovaný ako gén pre povrchový proteín v GLRaV-2. Vypočítaná molekulová hmotnosť proteínového produktu ORF6 (21 662 Da) súhlasí s predtým stanovenou hmotnosťou 22~26 kDa na základe SDS-PAGE elektroforézy (Zimmermann a spol., „Characterization and Serological Detection of Four Closterovirus-like Particles Associated with Leafroll Disease on Grapevine, J. Phytopathology 130:205-18 (1990); Boscia a spol., „Nomenclature of Grapevine Leafroll-Associated Putative Closteroviruse, Vitis 34:171-75 (1995), uvedené v citáciách).

Predpokladaná sekvencia aminokyselín odvodená od ORF6 v GLRaV-2 bola vyhľadávaná v databáze a ukázala sa podobnosť s povrchovými proteínmi klosterovírusov, BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV a GLRaV-3. Na úrovni nukleotidov, najvyššie percento podobnosti bolo s povrchovým proteínom v BYSV (34,8 %); na úrovni aminokyselín najvyššie percento podobnosti bolo s povrchovými proteínmi v BYV (32,7 %) a BYSV (32,7 %) . Ako je ukázané na Obrázku 6A, orientácia sekvencie aminokyselín povrchového proteínu a duplikátu povrchového proteínu v GLRaV-2 vzhľadom k iným klosterovírusom ukázali, že v ORF5 a ORF6 z GLRaV-2 boli prítomné nezmenené aminokyselinové zvyšky (N. R. G. D.). Verí sa, že dva z týchto aminokyselinových zvyškov (R a D) sú zapojené do stabilizácie molekúl tvorbou soľných mostíkov a vhodným zložením naj konzervatívnejšej centrálnej oblasti povrchových proteínov všetkých filamentných rastlinných vírusov (Dolja a spol., „Phylogeny of Capsid Proteins of Rod-Shaped and Filamentous RNA Plánt Viruses Two Families With Distinct Patterns of Sequence and Probably Structure Conservation, Virology 184:79-86 (1981), uvedené v citáciách).

Identifikácia ORF6 ako génu pre povrchový proteín bola ďalej potvrdená Western blotom po expresii fúzneho proteínu skladajúceho sa z 22 kDa proteínu z ORF6 CP a 42 kDa proteínu viažuceho maltózu, tvoreného transformovanými E. coli tak, ako je popísané v Príklade 5 vyššie. Ako je zaznamenané na Obrázku 6B, predpokladaný fylogenetický strom pre povrchový proteín a duplikát povrchového proteínu v GLRaV-2 a pre iné klosterovírusy ukázalo, že GLRaV-2 je viac bližší k hmyzom prenášaným klosterovírusom (BYV, BYSV a CTV) (Candresse, „Closteroviruses and Clostero-like Elongated Plánt Viruses, Encyclopedia of Virology, str. 242-48, Webster and Granoff, vyd., Academic Press, New York (1994), uvedené v citáciách), ako ku klosterovírusom prenášaným whitefly (LIYV, muška z Aleyrodidae) alebo mealybug prenášaným klosterovírusom (rod Pseudococcus) (LChV a GLRaV-3) (Raine a spol., „Transmission of the Agent Causing Little Cherry Disease by the Apple Mealybug Phenacoccus aceris and the Dodder Cuscuta Lupuliformis, Canadian J. Plánt Pathology 8:6-11 (1986);, Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of Little Cherry Virus, a Mealybug-Transmissible Closterovirus, J. General Virology 78:2067-71 (1997); Rosciglione a Gugerli, „Transmission of Grapevine Leafroll Disease and an Associated Closterovirus to Healthy Grapevine by the Mealybug Planococcus ficus, Phytoparasitica 17:63 (1989); Engelbrecht a Kasdorf, „Transmission of Grapevine Leafroll Disease and Associated Closteroviruses by the Vine Mealybug Planococcusficus, Phytophlactica, 22:341-46 (1990); Cabaleiro a Segura, 1997; Petersen a Charles, „Transmission of Grapevine Leafroll-Associated Closteroviruses by Pseudococcus longispinus and P. calceolariae. Plánt Pathology 46:509-15 (1997), všetko uvedené v citáciách.

ORF7 kóduje 162 aminokyselinový polypeptid molekulovej hmotnosti 18 000 Da a ORF8 kóduje 206 aminokyselinový polypeptid molekulovej hmotnosti 23 659 Da. Vyhľadávanie v databáze pre polypeptidy kódované ORF7 a ORF8 neukázalo významnú podobnosť so žiadnymi proteínmi. Avšak tieto gény mali podobnú veľkosť a lokalizáciu ako gény zistené v sekvenciách iných klosterovírusov, BYV (P20, P21) , BYSV (P18, P22) , a LChV (P21, P27) (Obrázok 27) . Konzervatívne oblasti však neboli zistené v ORF7 alebo ORF8 a v čítacích rámcoch ORF7 a ORFV8 v BYV, BYSV a LChV.

3' terminálna nepreložená ( untranslated) oblasť (3'UTR) obsahuje 216 nukleotidov. Analýza sekvencie nukleotidov ukázala dlhý oligo(A) úsek v blízkosti zakončenia genómu v GLRaV-2, ktorý je podobný genómu zistenému v BYV a BYSV (Agranovsky a spol., „Nucleotide sequence of the 3'-Terminál Half of Beet Yellows Closterovirus RNA Genome Unique Arrangement of Eight Virus Genes, J. General Virology 72:15-24 (1991); Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implication for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996) uvedené v citáciách). Genóm v BYV je zakončený CCC, v BYSV a CTD je zakončený CC s dodatočnými G alebo A v dvojvláknitej replikačnej forme v BYSV (Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yellow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996) uvedené v citáciách) a CTV (Karasev a spol., „Complete Sequence of the Citrus Tristeza Virus RNA Genome, Virology 208:211-20 (1995), uvedené v citáciách). GLRaV-2 má CGC na 3' zakončení genómu. Nedávno bol identifikovaný konzervatívny cis-element v 3'-UTR v troch monopartitných klosterovírusoch, čo predstavuje hlavnú os a slučku štruktúry (Karasev a spol., 1996). Ako zaznamenáva Obrázok 10, porovnanie orientácie 3'-UTR sekvencie v GLRaV-2 s tými istými oblasťami v BYV, BYSV a CTV ukazuje na prítomnosť rovnakej konzervatívnej 60 nt oblasti. Napriek tomuto cis-elementu, konzervatívne sekvencie neboli nájdené v 3'UTR v GLRaV-2, BYV, BYSV a CTV.

Doposiaľ študované klosterovírusy (napr. BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV a GLRaV-3) majú zjavnú podobnosť v organizácii genómu, čo sa týka replikačných génov MT, HEL a RdRP s konzervatívnymi doménami a výnimočného usporiadania piatich génov pre klosterovírusy (Dolja a spol., „Molecular Biology and

Evolution of Closteroviruses: Sophisticated Built-up of Large RNA Genome s, Annual Rev. Photopathology 32:261-85 (1994); Agranovsky „Principles of Molecular Organization, Expression, and Evolution of Closteroviruses: Over the Barriers, Adv. in Virus Res. 47:119-218 (1996); Jelkmann a spol., „Complete Genome Structure and Phylogenetic Analysis of Little Cherry Virus, a Mealybug-Transmissible Closterovirus, J. General Virology 78:2067-71 (1997); Ling a spol., „Nucleotide Sequence of the 3' Terminál Two-Third of the Grapevine Leafroll Associated Virus-3 Genome Reveals a Typical Monopartite Closterovirus, J. General Virology 79(5):1289-1301 (1998), všetko uvedené v citáciách).

Vyššie uvedené údaje jasne ukazujú, že GLRaV-2 je klosterovírus. V genóme GLRaV-2 boli identifikované dve papaínu podobné proteázy a predpokladalo sa autoproteolytické štiepenie. Boli tiež identifikované proteíny spojené s replikáciou obsahujúce konzervatívne motívy MT, HEL a RdRP, ktoré sú fylogenetický v blízkom vzťahu k proteínom spojených s replikáciou v iných klosterovírusoch. V GLRaV-2 bolo tiež zachované výnimočné genetické usporiadanie, vrátane malého hydrofóbneho transmembránového proteínu, HSP70 homológu, HSP90 homológu, divergentného CP a CP. Okrem toho, vypočítaná molekulová hmotnosť (21 661 Da) povrchového proteínu (ORF6) v GLRaV-2 dobre súhlasí s molekulovou hmotnosťou iných klosterovírusov (22 až 28 kDa) (Martelli a Bar-Joseph, „Closteroviruses: Classification and Nomenclature of Víruse s , Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Francki a pol., vyd., Springer-Verlag Wein, New York, str. 345-47 (1991); Candresse a Martelli „Genus Closterovirus, v Virus Taxonomy, Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Murphy a spol., vyd.,

Springer-Verlag., NY, str. 461-63 (1995) uvedené v citáciách).

Dva ORF v smere nadol po vlákne v CP majú rovnakú veľkosť a umiestnenie ako v genóme BYV. Okrem toho, neprítomnosť poly(A) na 3' zakončení v GLRaV-2 tiež dobre súhlasí s inými klosterovírusmi. Uvažuje sa o tom, že podobne ako vo všetkých ostatných klosterovírusoch, sa expresia ORF1 uskutočňuje cez +1 ribozomálny rámcový posun a 3' proximálne ORF sú pravdepodobne exprimované cez tvorbu zhlukov subgenómových RNA. Keďže prešmykovacia sekvencia, os-slučka a pseudouzlova štruktúra obsiahnuté v rámcovom posune BYV chýbajú v GLRaV-2, +1 rámcový posun v GLRaV-2 môže byť ten istý ako sa predpokladá pre CTV (Karasev a spol., „Complete Sequence of the Tristeza Virus RNA Genome, Virology 208:211-20 (1995), uvedené v citáciách) a BYSV (Karasev a spol., „Organization of the 3'-Terminál Half of Beet Yelow Stunt Virus Genome and Implications for the Evolution of Closteroviruses, Virology 221:199-207 (1996), uvedené v citáciách).

GLRaV-2 je v bližšom vzťahu k monopartitným klosterovírusom BYV, BYSV a CTV ako ku GLRaV-3 (Obrázok 7) (Ling a spol., „Nucleotide Sequence of the 3' Terminál Two-Thirds of Grapevine Leafroll Associated Virus-3 Genome Reveals a Typical Monopartite Closterovirus, J. General Virology 79(5): 1289-1301 (1998), uvedené v citáciách), dokonca aj keď GLRaV3 spôsobuje podobné symptómy ako zvinutka viniča (Rosciglione a Gugerli, „Maladies de 1'Enroulement et du Bois Strie de la Vigne: Analyse Microscopique et Serologique (Leafroll and Stem Pitting of Grapevine: Microscopical and Serological Analysis), Rev. Suisse Viticult Arboricult Horticulture 18:207-11 (1986); Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-Like Particles Associated with Grapevine Leafroll Disease, J. Phytopathology 128:1-14 (1990), uvedené v citáciách).

Klosterovírusy tvoria rôznu skupinu s komplexnou a heterológnou organizáciou genómov. Doteraz je GLRaV-2 jediným klosterovírusom, ktorý má podobnú organizáciu genómu ako BYV, typický člen rodu Closterovirus. Okrem toho, genómová RNA v GLRaV-2 má približne rovnakú veľkosť ako genómová RNA v BYV; avšak prenosný vektor v GLRaV-2 nie je známy. Organizácia genómu v GLRaV-2 je bližšia ku klosterovírusom prenášaných hmyzom (BYV a CTV) ako ku „whitefly (LIYV) alebo ku klosterovírusom prenášaných „mealybug (LChV a GLRaV-3). Je teda možné, že GLRaV-2 je prenášaný hmyzom. Pokusy s GLRaV-2 prenášaným hmyzom by mali poskytnúť informáciu, ktorá by mohla pomôcť vyvinúť spôsoby pre ďalšiu kontrolu GLRaV-2.

Celkovo bolo klónovaných a sekvenovaných 15 500 nukleotidov čo je viac ako 95 % zo stanoveného genómu GLRaV-2. GLRaV-2 a GLRaV-3 (Ling a spol., „Nucleotide Sequence of the 3' Terminál Two-Thirds of the Grapevine Leafroll Associated Virus-3 Genome Reveals a Typical Monopartite Closterovirus, J. General Virology 79(5):1289-1301 (1998), uvedené v citáciách) sú prvé klosterovírusy spojené so zvinutkou viniča, ktoré boli temer úplne sekvenované. Vyššie uvedené údaje jasne potvrdzujú zaradenie GLRaV-2 do rodu Closterovirus. Okrem toho, informácia týkajúca sa genómu GLRaV-2 poskytne lepšie pochopenie GLRaV-2 a podobných vírusov a rozšíri základné vedomosti o skupine klosterovírusov.

Príklad 7 - Konštrukcia CP génu v GLRaV-2 v rastlinnom expresnom vektore

Viniče Vitis vinifera, cv Pinoi Noir z viníc centrálnej oblasti štátu New York, boli infikované GLRaV-2 a použité na izoláciu vírusu, z ktorého bol identifikovaný cp gén GLRaV-2. Na základe informácie o sekvencií, boli navrhnuté dva oligonukleotidové priméry. Primér so zmyslom CP-96F (SEQ. ID. No. 21) začína od ATG iniciačného kodónu génu pre povrchový protein a komplementárny primér CP-96R (SEQ. ID. No. 22) začína od 56 nukleotidov v smere nadol po vlákne od stop kodónu CP génu. Na uľahčenie klónovania je vložené na začiatok oboch primérov Nco I reštrikčné miesto (11 bp v SEQ. ID. No. 21 a 13 bp v SEQ. ID. No. 22). Gén pre povrchový proteín v GLRaV-2 bol amplifikovaný z dsRNA extrahovanej z GLRaV-2 infikovaných viničov použitím reverznej transkripčnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR). PCR-amplifikovaný CP produkt bol prečistený na agarózovom géli s nízkym bodom topenia, netrávený Nco I a klónovaný do expresného vektora pEPT8 tej istej rastliny po natrávení enzýmom (Obrázku 11) . Po vyhodnotení bola skontrolovaná orientácia rekombinantného konštruktu pomocou interného reštrikčného miesta CP génu a CP gén bol priamo sekvenovaný. Rekombinantný konštrukt translatovatelnej (sense) plnej dĺžky génu pre povrchový protein, pEPT8CP-GLRaV-2 sa podrobil ďalšiemu klónovaniu. Rastlinná expresná kazeta, ktorú tvoril 35S-zosilovač dvojitého mozaikového vírusu karfiolu (CaMV), CaMV 35S-promótor, 5' vedúca sekvencia alfalfa mozaikového vírusu (ALMV) RNA4, gén pre povrchový protein v GLRaV-2 (CP-GLRaV-2) a 3'nepreložená oblasť CaMV ako terminátor, bola rozstrihaná použitím EcoR I reštrikčného enzýmu, izolované na agarózovom géli s nízkym bodom topenia a klónované po pôsobení rovnakého reštrikčného enzýmu do binárneho vektora pGA482GG alebo pGA482G (derivát pGA482, (An a spol. „Binary Vectors, v Plánt Molecular Biology Manual, str. A3:1-19, Belvin a Schilperoot, vyd., Kinwer Academic Publishers, Dordrecht, Holandsko (1988), uvedené v citáciách) . Výsledné rekobinantné konštrukty sú pGA482GG/ EPT8CP-GLRaV-2 (uvedené na Obrázku 11A), ktoré obsahujú neomycín fosfotransferázu (npt II) a β-glukuronidázu (GUS) vo vnútornej oblasti T-DNA, a pGA482G/EPT8CP-GLRaV-2 (zaznamenané na Obrázku 11B) bez GUS. Tieto rekombinantné konštrukty boli samostatne vložené elektroporáciou do nevirulentného kmeňa Agrobacterium tumefaciens C58Z707. Agrobacterium tumefaciens obsahujúce vektor boli použité na infikovanie listových diskov napadnutých Nicotiana benthamiana postupom, ktorý popísal Horsch a spol., „A Simple and General Method for Transferring Genes into Plants, Science 277:1229-1231 (1985), uvedené v citáciách.

Príklad 8 - Analýza transgénnych rastlín Nicotiana benthamiana a CP génom v GLRaV-2

NPT II-ELISA: pre detekciu npt II enzýmu bola použitá imunosorbčná enzymatická analýza s dvojitou protilátkou sendvičového enzýmu pomocou kitu NPT II-ELISA (5' prime to 3' prime, Inc., Boulder, Co).

Nepriama ELISA: Boli použité polyklonálne protilátky voči GLRaV-2, ktoré boli pripravené z povrchového proteínu exprimovaného v E. coli. Platničky boli pokryté homogenátom vzoriek v extrakčnom pufri (1:10, hmotnosť/objem) (fosfátový soľný pufer s obsahom 0,05 % Tween 20 a 2 % polyvinyl pyrolidonu) a boli inkubované cez noc pri teplote 4 °C. Po premytí fosfátovým soľným pufrom s obsahom 0,05 % Tween 20 (PBST) boli platničky blokované blokovacím pufrom (fosfátový soľný pufer s obsahom 2 % BSA) a inkubované pri laboratórnej teplote 1 hodinu. Po premytí s PBST bol pridaný anti-GLRaV-2 IgG v koncentrácii 2 pg/ml. Po inkubácii počas 4 hodín pri teplote 30 °C boli platničky premyté PBST a bol pridaný kozí anti-králiči IgG konjugovaný s alkalickou fosfatázou (Sigma) v zriedení 1:10 000. Absorbancia bola meraná pri 405 nm na prístroji MicroELISA AutoReader. Okrem toho sa vykonala Western blot analýza podľa metódy popísanej Hu a spol., „Characterization of Closterovirus-like Particle Associated Grapevine Leafrol Disease, J. Phytophathology 128:1-14 (1990), uvedené v citáciách.

PCR analýza: Genómová DNA bola extrahovaná z listov predpokladaných transgénnych a netransgénnych rastlín podlá metódy popísanej Cheungom a spol., „A Simple and Rapid DNA Microextraction Method for Plants, Animal and Insect Suitable for RAPD and other PCR analysis, PCR Methods and Applications 3:69 (1966), uvedené v citáciách. Extrahovaná celková DNA bola templátom pre PCR reakciu. Pre PCR analýzu boli použité priméry CP-96F a CP-96R (SEQ. ID. No. 21 a 22) pre CP gén v GLRaV-2, rovnako ako npt II 5'- a 3'- priméry. PCR reakcia sa uskutočnila pri teplote 94 °C x 3 min pre jeden cyklus, po ktorom nasledovalo 30 cyklov pri teplote 94 °C x 1 min, pri teplote 50 °C x 1 min a pri teplote 72 °C x 2:30 min s dodatočným predĺžením 10 min pri teplote 72 °C. Produkt PCR bol analyzovaný na agarózovom géli.

Po transformácii sa získalo celkovo 42 kanamycín rezistentných línii (Ro) Nicotiana benthamiana, ktorých vzorky listov boli testované na aktivitu NPT II enzýmu. Medzi nimi bolo 37 línií NPT II pozitívnych, stanovené pomocou ELISA, čo predstavovalo asi 88 % zo všetkých transformovaných rastlín. Avšak medzi vybratými kanamycín rezistentnými rastlinami boli aj niektoré NPT II negatívne rastliny. Všetky transgénne rastliny boli samoopelené v skleníku a semená týchto transgénnych línií sa nechali vyklíčiť pre ďalšie analýzy.

Tvorba GLRaV-2 CP v transgénnych rastlinách bola detekovaná nepriamou ELISA pred inokuláciou a výsledky ukázali, že expresia génu GLRaV-2 CP nebola detekovatelná vo všetkých testovaných transgénnych rastlinách. Tento výsledok bol potom potvrdený Western blotom. Pomocou protilátky voči GLRaV-2 nebola detekovaná tvorba CP v transgénnych a netransgénnych, kontrolných rastlinách. Avšak proteín očakávanej veľkosti (~22 kDa) bol detekovaný v GLRaV-2 infikovaných pozitívnych kontrolných rastlinách. Tento výsledok súhlasil s výsledkom

ELISA. Prítomnosť CP génu z GLRaV-2 v transgénnych rastlinách bola detekovaná z celkovej genómovej DNA extrahovanej z tkaniva rastlín PCR analýzou (Obrázok 12) . Produkt DNA očakávanej velkosti (653 bp) bol amplifikovaný z dvadsiatich testovaných transgénnych línií, ale nie z netransgénnych rastlín. Výsledok naznačuje, že CP gén z GLRaV-2 bol prítomný v transgénnych líniách, čo bolo tiež potvrdené Northern blotom.

Príklad 9 - Ri a R2 transgénne rastliny Nicotiana banthamiana sú rezistentné voči GLRaV-2

Inokulácia transgénnych rastlín: Ako inokulum bol použitý GLRaV-2 izolát 94/970, ktorý bol pôvodne identifikovaný a prenesený z viniča do Nicotiana benthamiana v Južnej Afrike (Goszczynski a spol., „Detection of Two Strains of Grapevine Leafroll-Associated Virus 2, Vitis 35:133-35 (1996), uvedené v citáciách). CP gén z izolátu 94/970 bol sekvenovaný; a je identicky s CP génom použitým pri konštrukcii. Nicotiana benthamiana je pokusným hostitelom pre GLRaV-2. Infikovanie rastliny spôsobuje chlorózne a prípadne nekrotické lézie s nasledovným zosvetlením ciev. Zosvetlenie ciev predchádza nekróze ciev. Infikované rastliny môžu prípadne uhynúť, v smere od vrchu dole.

Vo vývojovom štádiu piatich až siedmich listov, boli dva najmladšie apikálne listy infikované GLRaV-2 izolátom 94/970. Inokulum bolo pripravené rozdrvením 1,0 g GLRaV-2 infikovaných tkanív listov z Nicotiana benthamiana v 5 ml fosfátového pufru (0,01 M K2HPO4, pH 7,0). Testované rastliny boli rozdrvené na prášok pomocou karbidu kremíka a bolo pridané pripravené inokulum. Súčasne boli inokulované netrasformované rastliny tak, ako je uvedené vyššie. U rastlín sa sledoval vývoj symptómov každý druhý deň počas 60 dní po inokulácii. Rezistentné R1 transgénne rastliny boli zdrojom R2 generácie, ktorá bola ďalej hodnotená.

Rastlinné potomstvá z 20 Ro línií boli počiatočné hodnotené pre rezistenciu voči GLRaV-2 po inokulácii GLRaV-2 izolátom 94/970. Semená transgénnych rastlín (NPT II pozitívne) a netransformovaných kontrolných rastlín boli inokulované GLRaV-2. Po inokulácii boli reakcie testovaných rastlín rozdelené do troch typov: vysoko citlivé (odpovedatelné) (t. zn. typické symptómy boli pozorované dva až štyri týždne po inokulácii) ; tolerantné (t. zn. žiadne symptómy sa nevyvinuli v skorom štádiu a typické symptómy sa ukázali štyri až osem týždňov po inokulácii); a rezistentné (t. zn. zostávajú asymptomatické osem týždňov po inokulácii). Na základe reakcie rastliny, rezistentné rastliny boli získané zo štrnástich rôznych línií (uvedené v tabulke nižšie). V rastlinách každej z týchto štrnástich línii nebol detekovaný žiaden vírus po 6 týždňoch od inokulácie pomocou ELISA. Naproti tomu GLRaV-2 bol detekovaný v symptomatických rastlinách pomocou nepriamej ELISA. V iných šiestich líniách bolo niekoľko rastlín s určitým posunom vo vývoji symptómov, všetky inokulované transgénne rastliny zahynuli po troch až šiestich týždňoch od inokulácie. Na základe počiatočných výsledkov, bolo vybratých pre ďalšie analýzy päť reprezentačných línií, tvorených troma rezistentnými líniami (1, 4 a 19) a dvoma citlivými líniami (12 a 13) .

Tabuľka 1

č. línie	č.	Reakcia HS	testovaných T	rastlín HR
línia 1	39	14	3	22
línia 2	36	7	6	23
línia 3	38	11	4	23
línia 4	31	4	5	22
línia 5	33	6	13	14
línia 6	36	4	16	16
línia 7	32	5	9	18
línia 8	37	22	9	6
línia 9	36	9	12	15
línia 10	14	13	1	0
línia 11	13	11	2	0
línia 12	17	16	1	0
línia 13	16	14	0	0
línia 14	17	17	0	0
línia 15	32	30	2	0
línia 16	33	6	13	14
línia 17	12	0	1	11
línia 19	15	0	0	15
línia 20	19	3	0	16
línia 21	14	1	3	10
kontrola	15	15	0	0
č. línie:	predstavuje	transgénne	línie a netransformované

kontroly;

č.: počet transgénnych a netransformovaných rastlín;

HS: vysoko citlivé, typické symptómy boli pozorované dva až štyri týždne po inokulácii;

T: tolerantné, symptómy boli pozorované päť až osem týždňov po inokulácii;

HR: rastliny bez symptómov po ôsmych týždňoch od inokulácie.

Tabuľka 2 nižšie zaznamenáva vývoj symptómov v transgénnych rastlinách v porovnaní s netransgénnymi rastlinami u piatich vybraných línií z rôznych pokusov. Netransgénne kontrolné rastliny boli infikované dva až šesť týždňov po inokulácii a vykazovali typické GLRaV-2 symptómy u Nicotiana benthamiana, vrátane chlorózy a lokálnych lézií s nasledovným zosvetlením ciev a cievnou nekrózou na listoch. Tri z testovaných línií (1, 4 a 19) vykazujú rezistenciu, ktorá sa prejavila buď neprítomnosťou alebo oddialením vývoja symptómov. Dve ďalšie línie, 12 a 13, vyvinuli symptómy temer súčasne ako netransformované kontrolné rastliny. Zhora nadol, listy infikovaných rastlín postupne žltli, slabli, vyschýnali a prípadne uhynuli celé rastliny. Nezávisle na tom, kedy sa infekcia vyskytla, prípadný výsledok bol rovnaký. Šesť týždňov po inokulácii uhynuli všetky netransgénne rastliny a citlivé rastliny. Niektoré tolerantné rastliny začali hynúť. Naproti tomu asymptomatické rastliny kvitli normálne a tvorili peľ tak, ako neinokulované zdravé kontrolné rastliny (Obrázok 13) .

Tabuľka 2

č. línie	č.	Reakcia HS	testovaných T	rastlín HR
línia 1	19	5	6	8
línia 4	15	9	1	5
línia 12	16	14	2	0
línia 13	18	13	5	0
línia 19	13	10	0	3
netransgénna	24	23	1	0

č. línie: predstavuje transgénne línie a netransformované kontroly;

č.: počet transgénnych a netransformovaných rastlín;

HS: vysoko citlivé, typické symptómy boli pozorované dva až štyri týždne po inokulácii;

T: tolerantné, symptómy boli pozorované päť až osem týždňov po inokulácii;

HR: rastliny bez symptómov po ôsmych týždňoch od inokulácie.

ELISA analýza pre testovanie GLRaV-2 replikácie v rastlinách bola uskutočnená 6 týždňov po inokulácii. Zvýšená hladina CP odrážala replikáciu vírusu. Výsledok ukázal, že absorbancia v symptomatických rastlinách dosiahla hodnotu (OD) 0,7 až 3,2, na rozdiel od hodnoty (OD) 0,10 až 0,13 pred inokuláciou. Naproti tomu GLRaV-2 nebol detekovaný v asymptomatických rastlinách, ktorých hodnota absorbancie bola rovnaká alebo skoro rovnaká ako pre zdravé netransformované kontrolné rastliny. Výsledky potvrdili, že vírus sa replikoval v symptomatických rastlinách, ale nie v asymptomatických rastlinách. Replikácia GLRaV-2 bola potlačená v asymptomatických rastlinách. Tento výsledok naznačuje, že na vzniku rezistencie sa zúčastňuje iný mechanizmus ako CP-sprostredkovaná rezistencia.

Tri R2 potomstvá odvodené od transgénnych rezistentných rastlín z línií 1, 4 a 19 rástli a bola v nich hodnotená stabilná transmisia a či je zachovaná rezistencia v R2 generácia. Tieto výsledky zaznamenáva Tabuľka 3 nižšie. NPT II analýza ukázala, že R2 potomstvá boli stále oddelené. Expresia CP v R2 potomstve bola stále nedetekovatelná. Po inokulácii všetky netransgénne rastliny boli infikované a vykazovali GLRaV-2 symptómy na listoch 24 dní po inokulácii. Naproti tomu inokulované transgénne R₂ potomstvo vykazovalo rozdielnu úroveň rezistencie v porovnaní s citlivými a vysoko rezistentnými rastlinami. Tolerantné a rezistentné rastliny sa prejavili oddialením vývoja symptómov a neprítomnosťou symptómov. 6 týždňov po inokulácii bol GLRaV-2 detekovaný v tolerantných symptomatických infikovaných rastlinách nepriamou ELISA; ale nie v asymptomatických rastlinách. Tento výsledok znamená, že replikácia vírusu bola potlačená v týchto rezistentných rastlinách, čo bolo potvrdené Western blotom. Tieto rezistentné rastliny zostali asymptomatickými osem týždňov po inokulácii, kvitli a tvorili peľ.

Tabuľka 3

č. línie	počet	NPT poz/neg	HS	Reakcia rastlín
T	HR
línia 1/22	12	12/20	3	3	6
línia 1/30	11	8/3	7	2	2
línia 1/31	11	10/1	6	3	2
línia 1/35	10	10/0	4	6	0
línia 1/41	8	7/1	2	2	4
línia 4/139	12	11/1	4	4	3
línia 4/149	10	7/3	4	5	1
línia 4/152	10	8/2	9	0	1
línia 4/174	9	8/1	4	0	4
línia 19/650	11	10/1	7	0	2
línia 19/657	12	12/0	6	2	4
línia 19/659	12	8/4	5	2	5
línia 19/660	10	8/2	3	6	1
netransform.	12	0/12	12	0	0
CK
HS: vysoko citlivé,	typické	symptómy	boli	pozorované dva až

štyri týždne po inokulácii;

T: tolerantné, symptómy boli pozorované päť až osem týždňov po inokulácii;

HR: rastliny zostávajú bez symptómov v ôsmom týždni od inokulácie.

Príklad 10 - Dôkaz SNA-sprostredkovanej ochrany v transgénnych rastlinách

Northern blot analýza: Celková RNA bola extrahovaná z listov pred inokuláciou podlá metódy popísanej Napoli a spol., Plánt Celí 2:279-89 (1990), uvedené v citáciách. Koncentrácia extrahovanej RNA bola meraná spektrofotometricky pri OD 260. Asi 10 g celkovej RNA bolo použitých pre každú vzorku. Použitá sonda bola 3'jedna tretina GLRaV-2 CP génu, ktorá bola označená ³²P(a-dATP) za použitia Klenow-ovho fragmentu DNA polymerázy I.

Následné použitie DNA zodpovedajúcej 3' jednej tretine CP génu ako sondy, po Northern hybridizácii ukázalo jeden prúžok RNA extrahovanej z citlivých rastlín R1 potomstva línií 5, 12 a 13. Nebol detekovaný žiaden alebo slabý signál v transgénnych rastlinách R1 potomstva línií 1, 4 a 19. Táto RNA nie je prítomná v netransformovaných, kontrolných rastlinách. Veľkosť hybridizačného signálu bola stanovená približne 0,9 kb nukleových kyselín, čo bola približne rovnaká veľkosť ako vypočítaná (Obrázok 14). V R2 potomstve línií 1, 4 a 19 bola úroveň rovnovážneho stavu expresie RNA nízka. Tieto údaje ukazujú, že citlivé rastliny z línií 12 a 13 majú vysokú hladinu mRNA a všetky transgénne rastliny z línií 1, 4 a 19 majú nízku hladinu mRNA.

Príklad 11 - Transformácia a analýza transgénneho viniča s CP génom z GLRaV-2

Rastlinný materiál: Boli použité zakorenené kultivary Couderc 3309 (3309C) [V. riparia x V. rupestris), Vitis riparia „Gloire de Montpellier (Gloire), Teleki 5C (5C) (V. berlandieri x V. riparia), Millardet et De Grasset 101-14 (101-14 MGT) (V. riparia x V. rupestris) a Richter 110 (HOR) (V. rupestris x V. berlandieri). Pôvodné embryogenické cali z

Gloire boli od Mozsar a Sule (Plánt Protection Inštitúte, Hungarian Academy of Science, Budapešť). Všetok ostatný rastlinný materiál pochádzal z viníc štátu New York, Agricultural Experiment Station, Geneva, NY. Zo zhlukov boli odobraté púčky a boli povrchovo sterilizované v 70 % etanole 1 až 2 minúty. Púčky (zo skleníka a póla) boli prenesené do 1 % hypochloridu sodného na 15 minút, potom opláchnuté trikrát sterilnou, dvakrát destilovanou vodou. Z kvetných púčkov boli aseptický odobraté tyčinky pomocou streomikroskopu. Peľ na mikroskopickom sklíčku pod krycím sklíčkom bol zafarbený acetokarmínom, čo umožnilo určiť cytologický stav. Toto sa uskutočňovalo pre to, aby sa stanovilo najvýhodnejšie štádium pre indukciu kalusu.

Somatická embryogenéza a regenerácia: V aseptických podmnienkach bolo 40 až 50 tyčiniek umiestnených na Petriho misku s priemerom 9 cm s obsahom MSE. Petriho misky boli inkubované pri 28 °C za tmy. Bol iniciovaný kalus a po 60 dňoch boli indukované embryá, ktoré boli pre diferenciáciu prenesené do HMG média bez hormónov. Embryá v torpédovom štádiu boli potom prenesené z HMG média do MGC média, čo umožnilo vývoj embryí. Kultúry boli udržiavané v tme pri teplote 26 až 28 °C a prenesené do čerstvého média v 3 až 4-týždňových intervaloch. Predĺžené embryá boli prenesené do zakoreňovacieho média v malých nádobkách (5 až 8 embryí v nádobke). Embryá rástli v miestnosti pre tkanivové kultúry pri teplote 25 °C a 16 hodinovom svetelnom režime (76:mol.s), čo umožňovalo tvorbu výhonku a koreňa. Po tom, ako rastliny vyvinuli korene, boli zasadené do zeme v sklenníku.

Transformácia: Použitý protokol pre transformáciu bol modifikovanou metódou pôvodne popísanou Scorza a spol., „Transformation of Grape (Vitis vinifera) Zygotic-derived Somatic Embryos and Regeneration of Transgenic Plants, Plánt

Celí Rpt. 14:589-92 (1995), uvedené v citáciách. Kultúry kmeňa Agrobacteriuia C58Z707 alebo LBA4404 rástli cez noc v LB médiu pri teplote 28 °C v inkubátore za pohybu. Baktérie boli centrifugované 5 minút pri 3 000 až 5 000 rpm a potom boli resuspendované v MS kvapalnom médiu (OD 1,0 pri A600 nm). Kalusy s embryami boli ponorené do bakteriálnej suspenzie na 15 až 30 minút, blotované za sucha a prenesené do HMG média s- alebo bez- acetosyringonu (100 μΜ). Embryonálne kalusy boli kultivované spolu s baktériami 48 hodín v tme pri teplote 28 °C. Potom bol rastlinný materiál premytý 2 až 3 krát MS kvapalinou s obsahom cefotaximu (300 mg/ml) a carbenicillinu (200 mg/ml). Pre selekciu transgénnych embryí bol materiál prenesený do HMG média s obsahom buď 20 alebo 4 0 mg/L kanamycínu, 300 mg/L cefotaximu a 200 mg/L carbenicillinu. Po spoločnej kultivácii môžu byť embryonálne kalusy prenesené do iniciačného MSE média s obsahom 25 mg/L kanamycínu a tých istých antibiotík, ako je uvedené vyššie. Všetok rastlinný materiál bol inkubovaný za pretrvávajúcej tmy pri teplote 28 °C. Po 3-mesačnom raste v selektívnom médiu boli embryá prenesené do HMG média alebo MGC média bez kanamycínu, čím sa podporil rast emryí. Embryá boli potom prenesené do zakoreňovacieho média bez antibiotík. Netransformované kalusy rástli v rovnakom médiu s- alebo bez-kanamycínu, čím sa potvrdila účinnosť selekcie kanamycínom.

Hoci vynález bol popísaný podrobne pre ilustračné účely, rozumie sa, že takéto podrobnosti sú výlučne len pre tieto účely a ich obmeny môžu byť uskutočnené odborníkmi bez toho, aby sa opustila myšlienka a ciel vynálezu, ktoré sú definované nasledujúcimi patentovými nárokmi.

100

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) ŽIADATEĽ: Cornell Research Foundation, Inc.

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Proteíny vírusu zvinutky viniča typu 2 a ich použitie (iii) POČET SEKVENCIÍ: 23 (iv) KONTAKTNÁ ADRESA:

(A) ADRESA: Nixon, Hargrave, Devans&Doyle LLP (B) ULICA: Clinton Square, P.O.Box 1051 (C) MESTO: Rochester (D) ŠTÁT: New York (E) KRAJINA: U.S.A.

(F) POŠTOVÉ SMEROVÉ ČÍSLO: 14603 (v) POČÍTAČOVÉ VYBAVENIE:

(A) TYP MÉDIA: flopy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, verzia #1,30 (vi) BEŽNÉ APLIKAČNÉ ÚDAJE:

(A) APLIKAČNÉ ČÍSLO:

(B) DÁTUM PODANIA:

(C) KLASIFIKÁCIA:

(vii) ÚDAJE O ŽIADOSTI:

t (A) ČÍSLO ŽIADOSTI: US 60/047 194 (B) DÁTUM PODANIA: 20. mája 1997 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Goldman Michael L.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 30 727 (C) REFERENČNÉ ČÍSLO: 19603/1632 (ix) TELEKOMUNIKAČNÁ INFORMÁCIA:

(A) TELEFÓN: (716) 263 1304 (B) FAX: (716) 263 1600

101 (2) Informácia pre SEQ.ID.No.l:

(i) (ii) (xi)

TAAACATTGC

GCTCAGGTTA

AGCGCGATCG

GCGGAGGTAG

CCGCAGCGCG

ACAGGGGTGG

GGCGGTGACA

AGCGTGCGTA

TCACTCGCCG

AAATTTCCAC

CATATGAGGT

GGAATGTGGC

GCTTGTGGCA

GACTCTGCTT

GATCCGACAT

CCTAAAAATA

TCGGGCGGCA

GAACGGGCGG

TGCGGCAGAG

AGGAGGAAGG

CGCTCGTTCT

GTGTGCCTTG

TCTGGAGACT

Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 500 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna Typ molekuly: cDNA

Popis sekvencie: SEQ.ID.No.: 1:

GAGAGAACCC	CATTAGCGTC	TCCGGGGTGA	ACTTGGGAAG	GTCTGCCGCC	60
TTTATTTCGG	CAGTTTCACG	CAGCCCTTCG	CGTTGTGTCC	GCGCCAAGAG	120
TAAAAACGCA	ACTTCCACCG	GTCAGTGTAG	TGAAGGTGGA	GTGCGTAGCT	180
CTCCCGACAG	GGGCGTGGTC	GACAAGAAAC	CTACGTCTGT	TGGCGTTCCC	240
GTGTGCTTTC	TTTTCCGACG	GTGGTTCGGA	ACCGCGGCGA	CGTGATAATC	300
TGCATGAAGC	CCTGAAGAAA	ATTAAAGACG	GGCTCTTACG	CTTCCGCGTA	360
TGCGTTTTTC	GAGATTTTTC	TCATCGAACT	ACGGCTGCAG	ATTCGTCGCG	420
CGAACACTAC	AGTTTGGCTA	AATTGCACGA	AAGCGAGTGG	TGAGAAATTC	480
CCGCGTGCAC	GGCGGATTAC	GTGGCGATGC	TGCGTTATGT	GTGTGGCGGG	540
TCGTCCTCAT	GAGTAGAGTT	ATTTACCCGG	ATGGGCGCTG	TTACTTGGCC	600
ATTTGTGCGC	CTTTTACTGT	CGCCCGTTTA	GAGAGTCGGA	TTATGCCCTC	660
CTACGGTGGC	GCGTCTCAGG	GCATGCGTTG	AGAAGAACTT	CGGTGTCGAA	720
TAGCTCTTCG	TGGCTATTAC	ACCTCTCGCA	ATGTTTATCA	CTGTGATTAT	780
ATGTAAAATA	TTTTAGAAAC	CTTTCCGGCC	GCATTGGCGG	TGGTTCGTTC	840
CTTTAACCTC	CGTAATAACG	GTGAAGATTA	GCGGTCTTCC	AGGTGGTCTT	900
TAGCGTTTGG	TGCCTTCCTG	TGCGATATAC	GTTACGTCGA	ACCGGTAGAC	960
TTCAATCGAG	CGTTAAGACG	AAACGTGAAG	ATGCGCACCG	AACCGTAGAG	1020
CCGGCGGATC	CGTCGAGCAA	CCGCGACAAA	AGAGGATAGA	TGAGAAAGGT	1080
TTCCTAGTGG	AGGTTTTTCG	CATCTCCTGG	TCGGCAACCT	TAACGAAGTT	1140
TAGCTGCCGG	ACTTCTACGC	TTTCGCGTTG	GCGGTGATAT	GGATTTTCAT	1200
CCACCCAAGC	GGGCCACCGC	TTGCTGGTGT	GGCGCCGCTC	GAGCCGGAGC	1260
AACTTTACTC	ACCATCTAAA	AACTTTTTGC	GTTACGATGT	CTTGCCCTGT	1320
ATGCAGCGAT	GTTTTCTTTC	GCGGCGGGCG	GCCGTTTCCC	TTTAGTTTTG	1380

102

ATGACTAGAA	TTAGATACCC	GAACGGGTTT	TGTTACTTGG	CTCACTGCCG	GTACGCGTGC	1440
GCGTTTCTCT	TAAGGGGTTT	TGATCCGAAG	CGTTTCGACA	TCGGTGCTTT	CCCCACCGCG	1500
GCCAAGCTCA	GAAACCGTAT	GGTTTCGGAG	CTTGGTGAAA	GAAGTTTAGG	TTTGAACTTG	1560
TACGGCGCAT	ATACGTCACG	CGGCGTCTTT	CACTGCGATT	ATGACGCTAA	GTTTATAAAG	1620
GATTTGCGTC	TTATGTCAGC	AGTTATAGCT	GGAAAGGACG	GGGTGGAAGA	GGTGGTACCT	1680
TCTGACATAA	CTCCTGCCAT	GAAGCAGAAA	ACGATCGAAG	CCGTGTATGA	TAGATTATAT	1740
GGCGGCACTG	ACTCGTTGCT	GAAACTGAGC	ATCGAGAAAG	ACTTAATCGA	TTTCAAAAAT	1800
GACGTGCAGA	GTTTGAAGAA	AGATCGGCCG	ATTGTCAAAG	TGCCCTTTTA	CATGTCGGAA	1860
GCAACACAGA	ATTCGCTGAC	GCGTTTCTAC	CCTCAGTTCG	AACTTAAGTT	TTCGCACTCC	1920
TCGCATTCAG	ATCATCCCGC	CGCCGCCGCT	TCTAGACTGC	TGGAAAATGA	AACGTTAGTG	1980
CGCTTATGTG	GTAATAGCGT	TTCAGATATT	GGAGGTTGTC	CTCTTTTCCA	TTTGCATTCC	2040
AAGACGCAAA	GACGGGTTCA	CGTATGTAGG	CCTGTGTTGG	ATGGCAAGGA	TGCGCAGCGT	2100
CGCGTGGTGC	GTGATTTGCA	GTATTCCAAC	GTGCGTTTGG	GAGACGATGA	TAAAATTTTG	2160
GAAGGGCCAC	GCAATATCGA	CATTTGCCAC	TATCCTCTGG	GCGCGTGTGA	CCACGAAAGT	2220
AGTGCTATGA	TGATGGTGCA	GGTGTATGAC	GCGTCCCTTT	ATGAGATATG	TGGCGCCATG	2280
ATCAAGAAGA	AAAGCCGCAT	AACGTACTTA	ACCATGGTCA	CGCCCGGCGA	GTTTCTTGAC	2340
GGACGCGAAT	GCGTCTACAT	GGAGTGGTTA	GACTGTGAGA	TTGAAGTTGA	TGTGCACGCG	2400
GACGTCGTAA	TGTACAAATT	CGGTAGTTCT	TGCTATTCGC	ACAAGCTTTC	AATCATCAAG	2460
GACATCATGA	CCACTCCGTA	CTTGACACTA	GGTGGTTTTC	TATTCAGCGT	GGAGATGTAT	2520
GAGGTGCGTA	TGGGCGTGAA	TTACTTCAAG	ATTACGAAGT	CCGAAGTATC	GCCTAGCATT	2580
AGCTGCACCA	AGCTCCTGAG	ATACCGAAGA	GCTAATAGTG	ACGTGGTTAA	AGTTAAACTT	2640
CCACGTTTCG	ATAAGAAACG	TCGCATGTGT	CTGCCTGGGT	ATGACACCAT	ATACCTAGAT	2700
TCGAAGTTTG	TGAGTCGCGT	TTTCGATTAT	GTCGTGTGTA	ATTGCTCTGC	CGTGAACTCA	2760
AAAACTTTCG	AGTGGGTGTG	GAGTTTCATT	AAGTCTAGTA	AGTCGAGGGT	GATTATTAGC	2820
GGTAAAATAA	TTCACAAGGA	TGTGAATTTG	GACCTCAAGT	ACGTCGAGAG	TTTCGCCGCG	2880
GTTATGTTGG	CCTCTGGCGT	GCGCAGTAGA	CTAGCGTCCG	AGTACCTTGC	TAAGAACCTT	2940
AGTCATTTTT	CGGGAGATTG	CTCCTTTATT	GAAGCCACGT	CTTTCGTGTT	GCGTGAGAAA	3000
ATCAGAAACA	TGACTCTGAA	TTTTAACGAA	AGACTTTTAC	AGTTAGTGAA	GCGCGTTGCC	3060
TTTGCGACCT	TGGACGTGAG	TTTTCTAGAT	TTAGATTCAA	CTCTTGAATC	AATAACTGAT	3120
TTTGCCGAGT	GTAAGGTAGC	GATTGAACTC	GACGAGTTGG	GTTGCTTGAG	AGCGGAGGCC	3180

103

GAGAATGAAA	AAATCAGGAA	TCTGGCGGGA	GATTCGATTG	CGGCTAAACT	CGCGAGCGAG	3240
ATAGTGGTCG	ATATTGACTC	TAAGCCTTCA	CCGAAGCAGG	TGGGTAATTC	GTCATCCGAA	3300
AACGCCGATA	AGCGGGAAGT	TCAGAGGCCC	GGTTTGCGTG	GTGGTTCTAG	AAACGGGGTT	3360
GTTGGGGAGT	TCCTTCACTT	CGTCGTGGAT	TCTGCCTTGC	GTCTTTTCAA	ATACGCGACG	3420
GATCAACAAC	GGATCAAGTC	TTACGTGCGT	TTCTTGGACT	CGGCGGTCTC	ATTCTTGGAT	3480
TACAACTACG	ATAATCTATC	GTTTATACTG	CGAGTGCTTT	CGGAAGGTTA	TTCGTGTATG	3540
TTCGCGTTTT	TGGCGAATCG	AGGCGACTTA	TCTAGTCGTG	TCCGTAGCGC	GGTGTGTGCT	3600
GTGAAAGAAG	TTGCTACCTC	ATGCGCGAAC	GCGAGCGTTT	CTAAAGCCAA	GGTTATGATT	3660
ACCTTCGCAG	CGGCCGTGTG	TGCTATGATG	TTTAATAGCT	GCGGTTTTTC	AGGCGACGGT	3720
CGGGAGTATA	AATCGTATAT	ACATCGTTAC	ACGCAACTAT	TGTTTGACAC	TATCTTTTTT	3780
GAGGACAGCA	CTTACCTACC	CATAGAAGTT	CTGAGTTCGG	CGATATGCGG	TGCTATCGTC	3840
ACACTTTTCT	CCTCGGGCTC	GTCCATAAGT	TTAAACGCCT	TCTTACTTCA	AATTACCAAA	3900
GGATTCTCCC	TAGAGGTTGT	CGTCCGGAAT	GTTGTGCGAG	TCACGCATGG	TTTGAGCACC	3960
ACAGCGACCG	ACGGCGTCAT	ACGTGGGGTT	TTCTCCCAAA	TTGTGTCTCA	CTTACTTGTT	4020
GGAAATACGG	GTAATGTGGC	TTACCAGTCA	GCTTTCATTG	CCGGGGTGGT	GCCTCTTTTA	4080
GTTAAAAAGT	GTGTGAGCTT	AATCTTCATC	TTGCGTGAAG	ATACTTATTC	CGGTTTTATT	4140
AAGCACGGAA	TCAGTGAATT	CTCTTTCCTT	AGTAGTATTC	TGAAGTTCTT	GAAGGGTAAG	4200
CTTGTGGACG	AGTTGAAATC	GATTATTCAA	GGGGTTTTTG	ATTCCAACAA	GCACGTGTTT	4260
AAAGAAGCTA	CTCAGGAAGC	GATTCGTACG	ACGGTCATGC	AAGTGCCTGT	CGCTGTAGTG	4320
GATGCCCTTA	AGAGCGCCGC	GGGAAAAATT	TATAACAATT	TTACTAGTCG	ACGTACCTTT	4380
GGTAAGGATG	AAGGCTCCTC	TAGCGACGGC	GCATGTGAAG	AGTATTTCTC	ATGCGACGAA	4440
GGTGAAGGTC	CGGGTCTGAA	AGGGGGTTCC	AGCTATGGCT	TCTCAATTTT	AGCGTTCTTT	4500
TCACGCATTA	TGTGGGGAGC	TCGTCGGCTT	ATTGTTAAGG	TGAAGCATGA	GTGTTTTGGG	4560
AAACTTTTTG	AATTTCTATC	GCTCAAGCTT	CACGAATTCA	GGACTCGCGT	TTTTGGGAAG	4620
AATAGAACGG	ACGTGGGAGT	TTACGATTTT	TTGCCCACGG	GCATCGTGGA	AACGCTCTCA	4680
TCGATAGAAG	AGTGCGACCA	AATTGAAGAA	CTTCTCGGCG	ACGACCTGAA	AGGTGACAAG	4740
GATGCTTCGT	TGACCGATAT	GAATTACTTT	GAGTTCTCAG	AAGACTTCTT	AGCCTCTATC	4800
GAGGAGCCGC	CTTTCGCTGG	ATTGCGAGGA	GGTAGCAAGA	ACATCGCGAT	TTTGGCGATT	4860
TTGGAATACG	CGCATAATTT	GTTTCGCATT	GTCGCAAGCA	AGTGTTCGAA	ACGACCTTTA	4920
TTTCTTGCTT	TCGCCGAACT	CTCAAGCGCC	CTTATCGAGA	AATTTAAGGA	GGTTTTCCCT	4980

104

CGTAAGAGCC	AGCTCGTCGC	TATCGTGCGC	GAGTATACTC	AGAGATTCCT	CCGAAGTCGC	5040
ATGCGTGCGT	TGGGTTTGAA	TAACGAGTTC	GTGGTAAAAT	CTTTCGCCGA	TTTGCTACCC	5100
GCATTAATGA	AGCGGAAGGT	TTCAGGTTCG	TTCTTAGCTA	GTGTTTATCG	CCCACTTAGA	5160
GGTTTCTCAT	ATATGTGTGT	TTCAGCGGAG	CGACGTGAAA	AGTTTTTTGC	TCTCGTGTGT	5220
TTAATCGGGT	TAAGTCTCCC	TTTCTTCGTG	CGCATCGTAG	GAGCGAAAGC	GTGCGAAGAA	5280
CTCGTGTCCT	CAGCGCGTCG	CTTTTATGAG	CGTATTAAAA	TTTTTCTAAG	GCAGAAGTAT	5340
GTCTCTCTTT	CTAATTTCTT	TTGTCACTTG	TTTAGCTCTG	ACGTTGATGA	GAGTTCCGCA	5400
TCTGCAGGGT	TGAAAGGTGG	TGCGTCGCGA	ATGACGCTCT	TCCACCTTCT	GGTTCGCCTT	5460
GCTAGTGCCC	TCCTATCGTT	AGGGTGGGAA	GGGTTAAAGC	TACTCTTATC	GCACCACAAC	5520
TTGTTATTTT	TGTGTTTTGC	ATTGGTTGAC	GATGTGAACG	TCCTTATCAA	AGTTCTTGGG	5580
GGTCTTTCTT	TCTTTGTGCA	ACCAATCTTT	TCCTTGTTTG	CGGCGATGCT	TCTACAACCG	5640
GACAGGTTTG	TGGAGTATTC	CGAGAAACTT	GTTACAGCGT	TTGAATTTTT	CTTAAAATGT	5700
TCGCCTCGCG	CGCCTGCACT	ACTCAAAGGG	TTTTTTGAGT	GCGTGGCGAA	CAGCACTGTG	5760
TCAAAAACCG	TTCGAAGACT	TCTTCGCTGT	TTCGTGAAGA	TGCTCAAACT	TCGAAAAGGG	5820
CGAGGGTTGC	GTGCGGATGG	TAGGGGTCTC	CATCGGCAGA	AAGCCGTACC	CGTCATACCT	5880
TCTAATCGGG	TCGTGACCGA	CGGGGTTGAA	AGACTTTCGG	TAAAGATGCA	AGGAGTTGAA	5940
GCGTTGCGTA	CCGAATTGAG	AATCTTAGAA	GATTTAGATT	CTGCCGTGAT	CGAAAAACTC	6000
AATAGACGCA	GAAATCGTGA	CACTAATGAC	GACGAATTTA	CGCGCCCTGC	TCATGAGCAG	6060
ATGCAAGAAG	TCACCACTTT	CTGTTCGAAA	GCCAACTCTG	CTGGTTTGGC	CCTGGAAAGG	6120
GCAGTGCTTG	TGGAAGACGC	TATAAAGTCG	GAGAAACTTT	CTAAGACGGT	TAATGAGATG	6180
GTGAGGAAAG	GGAGTACCAC	CAGCGAAGAA	GTGGCCGTCG	CTTTGTCGGA	CGATGAAGCC	6240
GTGGAAGAAA	TCTCTGTTGC	TGACGAGCGA	GACGATTCGC	CTAAGACAGT	CAGGATAAGC	6300
GAATACCTAA	ATAGGTTAAA	CTCAAGCTTC	GAATTCCCGA	AGCCTATTGT	TGTGGACGAC	6360
AACAAGGATA	CCGGGGGTCT	AACGAACGCC	GTGAGGGAGT	TTTATTATAT	GCAAGAACTT	6420
GCTCTTTTCG	AAATCCACAG	CAAACTGTGC	ACCTACTACG	ATCAACTGCG	CATAGTCAAC	6480
TTCGATCGTT	CCGTAGCACC	ATGCAGCGAA	GATGCTCAGC	TGTACGTACG	GAAGAACGGC	6540
TCAACGATAG	TGCAGGGTAA	AGAGGTACGT	TTGCACATTA	AGGATTTCCA	CGATCACGAT	6600
TTCCTGTTTG	ACGGAAAAAT	TTCTATTAAC	AAGCGGCGGC	GAGGCGGAAA	TGTTTTATAT	6660
CACGACAACC	TCGCGTTCTT	GGCGAGTAAT	TTGTTCTTAG	CCGGCTACCC	CTTTTCAAGG	6720
AGCTTCGTCT	TCACGAATTC	GTCGGTCGAT	ATTCTCCTCT	ACGAAGCTCC	ACCCGGAGGT	6780

105

GGTAAGACGA	CGACGCTGAT	TGACTCGTTC TTGAAGGTCT TCAAGAAAGG TGAGGTTTCC	6480
ACCATGATCT	TAACCGCCAA	CAAAAGTTCG CAGGTTGAGA TCCTAAAGAA AGTGGAGAAG	6900
GAAGTGTCTA	ACATTGAATG	CCAGAAAGT AAAGACAAAA GATCTCCGAA AAAGAGCATT	6960
TACACCATCG	ACGCTTATTT	AATGCATCAC CGTGGTTGTG ATGCAGACGT TCTTTTCACT	7020
GATGAGTGTT	TCATGGTTCA	TGCGGGTAGC GTACTAGCTT GCATTGAGTT CACGAGGTGT	7080
CATAAAGTAA	TGATCTTCGG	GGATAGCCGG CAGATTCACT ACATTGAAAG GAACGAATTG	7140
GACAAGTGTT	TGTATGGGGA	TCTCGACAGG TTCGTGGACC TGCAGTGTCG GGTTTATGGT	7200
AATATTTCGT	ACCGTTGTCC	ATGGGATGTG TGCGCTTGGT TAAGCACAGT GTATGGCAAC	7260
CTAATCGCCA	CCGTGAAGGG	TGAAAGCGAA GGTAAGAGCA GCATGCGCAT TAACGAAATT	7320
AATTCAGTCG	ACGATTTAGT	CCCCGACGTG GGTTCCACGT TTCTGTGTAT GCTTCAGTCG	7380
GAGAAGTTGG	AAATCAGCAA	GCACTTTATT CGCAAGGGTT TGACTAAACT TAACGTTCTA	7440
ACGGTGCATG	AGGCGCAAGG	TGAGACGTAT GCGCGTGTGA ACCTTGTGCG ACTTAAGTTT	7500
CAGGAGGATG	AACCCTTTAA	ATCTATCAGG CACATAACCG TCGCTCTTTC TCGTCACACC	7560
GACAGCTTAA	CTTATAACGT	CTTAGCTGCT CGTCGAGGTG ACGCCACTTG CGATGCCATC	7620
CAGAAGGCTG	CGGAATTGGT	GAACAAGTTT CGCGTTTTTC CTACATCTTT TGGTGGTAGT	7680
GTTATCAATC	TCAACGTGAA	GAAGGACGTG GAAGATAACA GTAGGTGCAA GGCTTCGTCG	7740
GCACCATTGA	GCGTAATCAA	CGACTTTTTG AACGAAGTTA ATCCCGGTAC TGCGGTGATT	7800
GATTTTGGTG	ATTTGTCCGC	GGACTTCAGT ACTGGGCCTT TTGAGTGCGG TGCCAGCGGT	7860
ATTGTGGTGC	GGGACAACAT	CTCCTCCAGC AACATCACTG ATCACGATAA GCAGCGTGTT	7920
TAGCGTAGTT	CGGTCGCAGG	CGATTCCGCG TAGAAAACCT TCTCTACAAG AAAATTTGTA	7980
TTCGTTTGAA	GCGCGGAATT	ATAACTTCTC GACTTGCGAC CGTAACACAT CTGCTTCAAT	8040
GTTCGGAGAG	GCTATGGCGA	TGAACTGTCT TCGTCGTTGC TTCGACCTAG ATGCCTTTTC	8100
GTCCCTGCGT	GATGATGTGA	TTAGTATCAC ACGTTCAGGC ATCGAACAAT GGCTGGAGAA	8160
ACGTACTCCT	AGTCAGATTA	AAGCATTAAT GAAGGATGTT GAATCGCCTT TGGAAATTGA	8220
CGATGAAATT	TGTCGTTTTA	AGTTGATGGT GAAGCGTGAC GCTAAGGTGA AGTTAGACTC	8280
TTCTTGTTTA	ACTAAACACA	GCGCCGCTCA AAATATCATG TTTCATCGCA AGAGCATTAA	8340
TGCTATCTTC	TCTCCTATCT	TTAATGAGGT GAAAAACCGA ATAATGTGCT GTCTTAAGCC	8400
TAACATAAAG	TTTTTTACGG	AGATGACTAA CAGGGATTTT GCTTCTGTTG TCAGCAACAT	8460
GCTTGGTGAC	GACGATGTGT	ACCATATAGG TGAAGTTGAT TTCTCAAAGT ACGACAAGTC	8520
TCAAGATGCT	TTCGTGAAGG	CTTTTGAAGA AGTAATGTAT AAGGAACTCG GTGTTGATGA	8580

106

AGAGTTGCTG	GCTATCTGGA	TGTGCGGCGA	GCGGTTATCG	ATAGCTAACA	CTCTCGATGG	8640
TCAGTTGTCC	TTCACGATCG	AGAATCAAAG	GAAGTCGGGA	GCTTCGAACA	CTTGGATTGG	8700
TAACTCTCTC	GTCACTTTGG	GTATTTTAAG	TCTTTACTAC	GACGTTAGAA	ATTTCGAGGC	8760
GTTGTACATC	TCGGGCGATG	ATTCTTTAAT	TTTTTCTCGC	AGCGAGATTT	CGAATTATGC	8820
CTTTTGTTCT	AAATTTGTTG	TTATGTGTGG	TCATAAGACG	TTTTTTGTTC	CCGACCCGTA	8940
CAAGCTTTTT	GTCAAGTTGG	GAGCAGTCAA	AGAGGATGTT	TCAATGGATT	TCCTTTTCGA	9000
GACTTTTACC	TCCTTTAAAG	ACTTAACCTC	CGATTTTAAC	GACGAGCGCT	TAATTCAAAA	9060
GCTCGCTGAA	CTTGTGGCTT	TAAAATATGA	GGTTCAAACC	GGCAACACCA	CCTTGGCGTT	9120
AAGTGTGATA	CATTGTTTGC	GTTCGAATTT	CCTCTCGTTT	AGCAAGTTAT	ATCCTCGCGT	9180
GAAGGGATGG	CAGGTTTTTT	ACACGTCGGT	TAAGAAAGCG	CTTCTCAAGA	GTGGGTGTTC	9240
TCTCTTCGAC	AGTTTCATGA	CCCCTTTTGG	TCAGGCTGTC	ATGGTTTGGG	ATGATGAGTA	9300
GCGCTAACTT	GCGCGCAGTT	TCTTTGTTCG	TGACATACAC	CTTGTGTGTC	ACCGTGCGTT	9360
TATAATGAAT	CAGGTTTTGC	AGTTTGAATG	TTTGTTTCTG	CTGAATCTCG	CGGTTTTTGC	9420
TGTGACTTTC	ATTTTCATTC	TTCTGGTCTT	CCGCGTGATT	AAGTCTTTTC	GCCAGAAGGG	9480
TCACGAAGCA	CCTGTTCCCG	TTGTTCGTGG	CGGGGGTTTT	TCAACCGTAG	TGTAGTCAAA	9540
AGACGCGCAT	ATGGTAGTTT	TCGGTTTGGA	CTTTGGCACC	ACATTCTCTA	CGGTGTGTGT	9600
GTACAAGGAT	GGACGAGTTT	TTTCATTCAA	GCAGAATAAT	TCGGCGTACA	TCCCCACTTA	9660
CCTCTATCTC	TTCTCCGATT	CTAACCACAT	GACTTTTGGT	TACGAGGCCG	AATCACTGAT	9720
GAGTAATCTG	AAAGTTAAAG	GTTCGTTTTA	TAGAGATTTA	AAACGTTGGG	TGGGTTGCGA	9780
TTCGAGTAAC	CTCGACGCGT	ACCTTGACCG	TTTAAAACCT	CATTACTCGG	TCCGCTTGGT	9840
TAAGATCGGC	TCTGGCTTGA	ACGAAACTGT	TTCAATTGGA	AACTTCGGGG	GCACTGTTAA	9900
GTCTGAGGCT	CATCTGCCAG	GGTTGAGAGC	TCTCTTTATT	AAGGCTGTCA	TTAGTTGCGC	9960
GGAGGGCGCG	TTTGCGTGCA	CTTGCACCGG	GGTTATTTGT	TCAGTACCTG	CCAATTATGA	10020
TAGCGTTCAA	AGGAATTTCA	CTGATCAGTG	TGTTTCACTC	AGCGGTTATC	AGTGCGTATA	10080
TATGATCAAT	GAACCTTCAG	CGGCTGCGCT	ATCTGCGTGT	AATTCGATTG	GAAAGAAGTC	10140
CGCAAATTTG	GCTGTTTACG	ATTTCGGTGG	TGGGACCTTC	GACGTGTCTA	TCATTTCATA	10200
CCGCAACAAT	ACTTTTGTTG	TGCGAGCTTC	TGGAGGCGAT	CTAAATCTCG	GTGGAAGGGA	10260
TGTTGATCGT	GCGTTTCTCA	CGCACCTCTT	CTCTTTAACA	TCGCTGGAAC	CTGACCTCAC	10320
TTTGGATATC	TCGAATCTGA	AAGAATCTTT	ATCAAAAACG	GACGCAGAGA	TAGTTTACAC	10380
TTTGAGAGGT	GTCGATGGAA	GAAAAGAAGA	CGTTAGAGTA	AACAAAAACA	TTCTTACGTC	10440

107

GGTGATGCTC CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT	TAAAATCGTA	10500
TGCTAAGAGT ATGAATGAGA TGTCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA	TAGGAGGATC	10560
TTCATATCTT CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG	ATCGTATCTT	10620
AAGAGTTTCG GATCCTCGGG CTGCCGTGGC CGTCGGTTGC GCATTATATT	CTTCATGCCT	10680
CTCAGGATCT GGGGGGTTGC TACTGATCGA CTGTGCAGCT CACACTGTCG	CTATAGCGGA	10740
CAGAAGTTGT CATCAAATCA TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT	TTTCAGGAAG	10800
CATGCCTTTG TACTTAGCCA GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG	CCGTGTTTGA	10860
AGGGGAGTAC GTTAAGTGCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA	TAAGATTTTT	10920
TGATATAGGA GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG	atttctccat	10980
TTCAAGCGTA GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC	AAGTGTCACT	11040
CACTGGAACT CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA	GTGTCCGAGA	11100
ATTGCATATT AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA	GAAAGGCGGA	11160
TCGACGAATA CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGATTCAA	TTGATATCGC	11220
GGATGTGCTA AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCAGTGCC TTACCACCAG	ACGAGGATGT	11280
CGAATTACTC CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC	TGGAAGAAAT	11340
ACCTCTCTAG GAGCATAGCA GCACACTCAA GTGAAATTAA AACTCTACCA	GACATTCGAT	11400
TGTACGGCGG TAGGGTTGTA AAGAAGTCCG AATTCGAATC AGCACTTCCT	AATTCTTTTG	11460
AACAGGAATT AGGACTGTTC ATACTGAGCG AACGGGAAGT GGGATGGAGC	AAATTATGCG	11520
GAATAACGGT GGAAGAAGCA GCATACGATC TTACGAATCC CAAGGCTTAT	AAATTCACTG	11580
CCGAGACATG TAGCCCGGAT GTAAAAGGTG AAGGACAAAA ATACTCTATG	GAAGACGTGA	11640
TGAATTTCATGCGTTTATCA AATCTGGATG TTAACGACAA GATGCTGACG GAACAGTGTT	11700
GGTCGCTGTC CAATTCATGC GGTGAATTGA TCAACCCAGA CGACAAAGGG	CGATTCGTGG	11760
CTCTCACCTT TAAGGACAGA GACACAGCTG ATGACACGGG TGCCGCCAAC	GTGGAATGTC	11820
GCGTGGGCGA CTATCTAGTT TACGCTATGT CCCTGTTTGA GCAGAGGACC	CAAAAATCGC	11880
AGTCTGGCAA CATCTCTCTG TACGAAAAGT ACTGTGAATA CATCAGGACC	TACTTAGGGA	11940
GTACAGACCT GTTCTTCACA GCGCCGGACA GGATTCCGTT ACTTACGGGC	ATCCTATACG	12000
ATTTTTGTAA GGAATACAAC GTTTTCTACT CGTCATATAA GAGAAACGTC	GATAATTTCA	12060
GATTCTTCTT GGCGAATTAT ATGCCTTTGA TATCTGACGT CTTTGTCTTC	CAGTGGGTAA	12120
AACCCGCGCC GGATGTTCGG CTGCTTTTTG AGTTAAGTGC AGCGGAACTA	ACGCTGGAGG	12180
TTCCCACACT GAGTTTGATA GATTCTCAAG TTGTGGTAGG TCATATCTTA	AGATACGTAG	12240

108

AATCCTACAC	ATCAGATCCA	GCCATCGACG	CGTTAGAAGA	CAAACTGGAA	GCGATACTGA	12300
AAAGTAGCAA	TCCCCGTCTA	TCGACAGCGC	AACTATGGGT	TGGTTTCTTT	TGTTACTATG	12360
GTGAGTTTCG	TACGGCTCAA	AGTAGAGTAG	TGCAAAGACC	AGGCGTATAC	AAAACACCTG	12420
AXTCAGTGGG	TGGATTTGAA	ATAAACATGA	AAGATGTTGA	GAAATTCTTC	GATAAACTTC	12480
AGAGAGAATT	GCCTAATGTA	TCTTTGCGGC	GTCAGTTTAA	CGGAGCTAGA	GCGCATGAGG	12540
CTTTCAAAAT	ATTTAAAAAC	GGAAATATAA	GTTTCAGACC	TATATCGCGT	TTAAACGTGC	12600
CTAGAGAGTT	CTGGTATCTG	AACATAGACT	ACTTCAGGCA	CGCGAATAGG	TCCGGGTTAA	12660
CCGAAGAAGA	AATACTCATC	CTAAACAACA	TAAGCGTTGA	TGTTAGGAAG	TTATGCGCTG	12720
AGAGAGCGTG	CAATACCCTA	CCTAGCGCGA	AGCGCTTTAG	TAAAAATCAT	AAGAGTAATA	12780
TACAATCATC	ACGCCAAGAG	CGGAGGATTA	AAGACCCATT	GGTAGTCCTG	AAAGACACTT	12840
TATATGAGTT	CCAACACAAG	CGTGCCGGTT	GGGGGTCTCG	AAGCACTCGA	GACCTCGGGA	12900
GTCGTGCTGA	CCACGCGAAA	GGAAGCGGTT	GATAAGTTTT	TTAATGAACT	AAAAAACGAA	12960
AATTACTCAT	CAGTTGACAG	CAGCCGATTA	AGCGATTCGG	AAGTAAAAGA	AGTGTTAGAG	13020
AAAAGTAAAG	AAAGTTTCAA	AAGCGAACTG	GCCTCCACTG	ACGAGCACTT	CGTCTACCAC	13080
ATTATATTTT	TCTTAATCCG	ATGTGCTAAG	ATATCGACAA	GTGAAAAGGT	GAAGTACGTT	13140
GGTAGTCATA	CGTACGTGGT	CGACGGAAAA	ACGTACACCG	TTCTTGACGC	TTGGGTATTC	13200
AACATGATGA	AAAGTCTCAC	GAAGAAGTAC	AAACGAGTGA	ATGGTCTGCG	TGCGTTCTGT	13260
TGCGCGTGCG	AAGATCTATA	TCTAACCGTC	GCACCAATAA	TGTCAGAACG	CTTTAAGACT	13320
AAAGCCGTAG	GGATGAAAGG	TTTGCCTGTT	GGAAAGGAAT	ACTTAGGCGC	CGACTTTCTT	13380
TCGGGAACTA	GCAAACTGAT	GAGCGATCAC	GACAGGGCGG	TCTCCATCGT	TGCAGCGAAA	13440
AACGCTGTCG	ATCGTAGCGC	TTTCACGGGT	GGGGAGAGAA	AGATAGTTAG	TTTGTATGAT	13500
CTAGGGAGGT	ACTAAGCACG	GTGTGCTATA	GTGCGTGCTA	TAATAATAAA	CACTAGTGCT	13560
TAAGTCGCGC	AGAAGAAAAC	GCTATGGAGT	TGATGTCCGA	CAGCAACCTT	AGCAACCTGG	13620
TGATAACCGA	CGCCTCTAGT	CTAAATGGTG	TCGACAAGAA	GCTTTTATCT	GCTGAAGTTG	13680
AAAAAATGTT	GGTGCAGAAA	GGGGCTCCTA	ACGAGGGTAT	AGAAGTGGTG	TTCGGTCTAC	13740
TCCTTTACGC	ACTCGCGGCA	AGAACCACGT	CTCCTAAGGT	TCAGCGCGCA	GATTCAGACG	13800
TTATATTTTC	AAATAGTTTC	GGAGAGAGGA	ATGTGGTACT	AACAGAGGGT	GACCTTAAGA	13860
AGGTACTCGA	CGGGTGTGCG	CCTCTCACTA	GGTTCACTAA	TAAACTTAGA	ACGTTCGGTC	13920
GTACTTTCAC	TGAGGCTTAC	GTTGACTTTT	GTATCGCGTA	TAAGCACAAA	TTACCCCAAC	13980

TCAACGCCGC GGCGGAATTG GGGATTCCAG CTGAAGATTC GTACTTAGCT GCAGATTTTC 14040

109

TGGGTACTTG	CCCGAAGCTC	TCTGAATTAC	AGCAAAGTAG	GAAGATGTTC	GCGAGTATGT	14100
ACGCTCTAAA	AACTGAAGGT	GGAGTGGTAA	ATACACCAGT	GAGCAATCTG	CGTCAGCTAG	14160
GTAGAAGGGA	AGTTATGTAA	TGGAAGATTA	CGAAGAAAAA	TCCGAATCGC	TCATACTGCT	14220
ACGCACGAAT	CTGAACACTA	TGCTTTTAGT	GGTCAAGTCC	GATGCTAGTG	TAGAGCTGCC	14280
TAAACTACTA	ATTTGCGGTT	ACTTACGAGT	GTCAGGACGT	GGGGAGGTGA	CGTGTTGCAA	14340
CCGTGAGGAA	TTAACAAGAG	ATTTTGAGGG	CAATCATCAT	ACGGTGATCC	GTTCTAGAAT	14400
CATACAATAT	GACAGCGAGT	CTGCTTTTGA	GGAATTCAAC	AACTCTGATT	GCGTAGTGAA	14460
GTTTTTCCTA	GAGACTGGTA	GTGTCTTTTG	GTTTTTCCTT	CGAAGTGAAA	CCAAAGGTAG	14520
AGCGGTGCGA	CATTTGCGCA	CCTTCTTCGA	AGCTAACAAT	TTCTTCTTTG	GATCGCATTG	14580
CGGTACCATG	GAGTATTGTT	TGAAGCAGGT	ACTAACTGAA	ACTGAATCTA	TAATCGATTC	14640
TTTTTGCGAA	GAAAGAAATC	GTTAAGATGA	GGGTTATAGT	GTCTCCTTAT	GAAGCTGAAG	14700
ACATTCTGAA	AAGATCGACT	GACATGTTAC	GAAACATAGA	CAGTGGGGTC	TTGAGCACTA	14760
AAGAATGTAT	CAAGGCATTC	TCGACGATAA	CGCGAGACCT	ACATTGTGCG	AAGGCTTCCT	14820
ACCAGTGGGG	TGTTGACACT	GGGTTATATC	AGCGTAATTG	CGCTGAAAAA	CGTTTAATTG	14880
ACACGGTGGA	GTCAAACATA	CGGTTGGCTC	AACCTCTCGT	GCGTGAAAAA	GTGGCGGTTC	14940
ATTTTTGTAA	GGATGAACCA	AAAGAGCTAG	TAGCATTCAT	CACGCGAAAG	TACGTGGAAC	15000
TCACGGGCGT	GGGAGTGAGA	GAAGCGGTGA	AGAGGGAAAT	GCGCTCTCTT	ACCAAAACAG	15060
TTTTAAATAA	AATGTCTTTG	GAAATGGCGT	TTTACATGTC	ACCACGAGCG	TGGAAAAACG	15120
CTGAATGGTT	AGAACTAAAA	TTTTCACCTG	TGAAAATCTT	TAGAGATCTG	CTATTAGACG	15180
TGGAAACGCT	CAACGAATTG	TGCGCCGAAG	ATGATGTTCA	CGTCGACAAA	GTAAATGAGA	15240
ATGGGGACGA	AAATCACGAC	CTCGAACTCC	AAGACGAATG	TTAAACATTG	GTTAAGTTTA	15300
ACGAAAATGA	TTAGTAAATA	ATAAATCGAA	CGTGGGTGTA	TCTACCTGAC	GTATCAACTT	15360
AAGCTGTTAC	TGAGTAATTA	AACCAACAAG	TGTTGGTGTA	ATGTGTATGT	TGATGTAGAG	15420
AAAAATCCGT	TTGTAGAACG	GTGTTTTTCT	CTTCTTTATT	TTTAAAAAAA	AAATAAAAAA	15480
AAAAAAAAAA	AAGCGGCCGC					15500

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 920 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna

110 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.:2

ACATTGCGAG	AGAACCCCAT	TAGCGTCTCC	GGGGTGAACT	TGGGAAGGTC	TGCCGCCGCT	60
CAGGTTATTT	ATTTCGGCAG	TTTCACGCAG	CCCTTCGCGT	TGTATCCGCG	CCAAGAGAGC	120
GCGATCGTAA	AAACGCAACT	TCCACCGGTC	AGTGTAGTGA	AGGTGGAGTG	CGTAGCTGCG	180
GAGGTAGCTC	CCGACAGGGG	CGTGGTCGAC	AAGAAACCTA	CGTCTGTTGG	CGTTCCCCCG	240
CAGCGCGGTG	TGCTTTCTTT	TCCGACGGTG	GTTCGGAACC	GCGGCGACGT	GATAATCACA	300
GGGGTGGTGC	ATGAAGCCCT	GAAGAAAATT	AAAGACGGGC	TCTTACGCTT	CCGCGTAGGC	360
GGTGACATGC	GTTTTTCGAG	atttttctca	TCGAACTACG	GCTGCAGATT	CGTCGCGAGC	420
GTGCGTACGA	ACACTACAGT	TTGGCTAAAT	TGCACGAAAG	CGAGTGGTGA	GAAATTCTCA	480
CTCGCCGCCG	CGTGCACGGC	GGATTACGTG	GCGATGCTGC	GTTATGTGTG	TGGCGGGAAA	540
TTTCCACTCG	TCCTCATGAG	TAGAGTTATT	TACCCGGATG	GGCGCTGTTA	CTTGGCCCAT	600
ATGAGGTATT	TGTGCGCCTT	TTACTGTCGC	CCGTTTAGAG	AGTCGGATTA	TGCCCTCGGA	660
ATGTGGCCTA	CGGTGGCGCG	TCTCAGGGCA	TGCGTTGAGA	AGAACTTCGG	TGTCGAAGCT	720
TGTGGCATAG	CTCTTCGTGG	CTATTACACC	TCTCGCAATG	TTTATCACTG	TGATTATGAC	780
TCTGCTTATG	TAAAATATTT	TAGAAACCTT	TCCGGCCGCA	TTGGCGGTGG	TTCGTTCGAT	840
CCGACATCTT	TAACCTCCGT	AATAACGGTG	AAGATTAGCG	GTCTTCCAGG	TGGTCTTCCT	900
AAAAATATAG	CGTTTGGTGC	CTTCCTGTGC	GATATACGTT	ACGTCGAACC	GGTAGACTCG	960
GGCGGCATTC	AATCGAGCGT	TAAGACGAAA	CGTGAAGATG	CGCACCGAAC	CGTAGAGGAA	1020
CGGGCGGCCG	GCGGATCCGT	CGAGCAACCG	CGACAAAAGA	GGATAGATGA	GAAAGGTTGC	1080
GGCAGAGTTC	CTAGTGGAGG	TTTTTCGCAT	CTCCTGGTCG	GCAACCTTAA	CGAAGTTAGG	1140
AGGAAGGTAG	CTGCCGGACT	TCTACGCTTT	CGCGTTGGCG	GTGATATGGA	TTTTCATCGC	1200
TGCCTTGAAC	TTTACTCACC	ATCTAAAAAC	TTTTTGCGTT	ACGATGTCTT	GCCCTGTTCT	1320
GGAGACTATG	CAGCGATGTT	TTCTTTCGCG	GCGGGCGGCC	GTTTCCCTTT	AGTTTTGATG	1380
ACTAGAATTA	GATACCCGAA	CGGGTTTTGT	TACTTGGCTC	ACTGCCGGTA	CGCGTGCGCG	1440
TTTCTCTTAA	GGGGTTTTGA	TCCGAAGCGT	TTCGACATCG	GTGCTTTCCC	CACCGCGGCC	1500
AAGCTCAGAA	ACCGTATGGT	TTCGGAGCTT	GGTGAAAGAA	GTTTAGGTTT	GAACTTGTAC	1560
GGCGCATATA	CGTCACGCGG	CGTCTTTCAC	TGCGATTATG	ACGCTAAGTT	TATAAAGGAT	1620
TTGCGTCTTA	TGTCAGCAGT	TATAGCTGGA	AAGGACGGGG	TGGAAGAGGT	GGTACCTTCT	1680
GACATAACTC	CTGCCATGAA	GCAGAAAACG	ATCGAAGCCG	TGTATGATAG	ATTATATGGC	1740

111

GGCACTGACT	CGTTGCTGAA	ACTGAGCATC	GAGAAAGACT	TAATCGATTT	CAAAAATGAC	1800
GTGCAGAGTT	TGAAGAAAGA	TCGGCCGATT	GTCAAAGTGC	CCTTTTACAT	GTCGGAAGCA	1860
ACACAGAATT	CGCTGACGCG	TTTCTACCCT	CAGTTCGAAC	TTAAGTTTTC	GCACTCCTCG	1920
CATTCAGATC	ATCCCGCCGC	CGCCGCTTCT	AGACTGCTGG	AAAATGAAAC	GTTAGTGCGC	1980
TTATGTGGTA	ATAGCGTTTC	AGATATTGGA	GGTTGTCCTC	TTTTCCATTT	GCATTCCAAG	2040
ACGCAAAGAC	GGGTTCACGT	ATGTAGGCCT	GTGTTGGATG	GCAAGGATGC	GCGCGTCGC	2100
GTGGTGCGTG	ATTTGCAGTA	TTCCAACGTG	CGTTTGGGAG	ACGATGATAA	AATTTTGGAA	2160
GGGCCACGCA	ATATCGACAT	TTGCCACTAT	CCTCTGGGCG	CGTGTGACCA	CGAAAGTAGT	2220
GCTATGATGA	TGGTGCAGGT	GTATGACGCG	TCCCTTTATG	AGATATGTGG	CGCCATGATC	2280
AAGAAGAAAA	GCCGCATAAC	GTACTTAACC	ATGGTCACGC	CCGGCGAGTT	TCTTGACGGA	2340
CGCGAATGCG	TCTACATGGA	GTCGTTAGAC	TGTGAGATTG	AAGTTGATGT	GCACGCGGAC	2400
GTCGTAATGT	ACAAATTCGG	TAGTTCTTGC	TATTCGCACA	AGCTTTCAAT	CATCAAGGAC	2460
ATCATGACCA	CTCCGTACTT	GACACTAGGT	GGTTTTCTAT	TCAGCGTGGA	GATGTATGAG	2520
GTGCGTATGG	GCGTGAATTA	CTTCAAGATT	ACGAAGTCCG	AAGTATCGCC	TAGCATTAGC	2580
TGCACCAAGC	TCCTGAGATA	CCGAAGAGCT	AATAGTGACG	TGGTTAAAGT	TAAACTTCCA	2640
CGTTTCGATA	AGAAACGTCG	CATGTGTCTG	CCTGGGTATG	ACACCATATA	CCTAGATTCG	2700
AAGTTTGTGA	GTCGCGTTTT	CGATTATGTC	GTGTGTAATT	GCTCTGCCGT	GAACTCAAAA	2760
ACTTTCGAGT	GGGTGTGGAG	TTTCATTAAG	TCTAGTAAGT	CGAGGGTGAT	TATTAGCGGT	2820
AAAATAATTC	ACAAGGATGT	GAATTTGGAC	CTCAAGTACG	TCGAGAGTTT	CGCCGCGGTT	2880
ATGTTGGCCT	CTGGCGTGCG	CAGTAGACTA	GCGTCCGAGT	ACCTTGCTAA	GAACCTTAGT	2940
CATTTTTCGG	GAGATTGCTC	CTTTATTGAA	GCCACGTCTT	TCGTGTTGCG	TGAGAAAATC	3000
AGAAACATGA	CTCTGAATTT	TAACGAAAGA	CTTTTACAGT	TAGTGAAGCG	CGTTGCCTTT	3060
GCGACCTTGG	ACGTGAGTTT	TCTAGATTTA	GATTCAACTC	TTGAATCAAT	AACTGATTTT	3120
GCCGAGTGTA	AGGTAGCGAT	TGAACTCGAC	GAGTTGGGTT	GCTTGAGAGC	GGAGGCCGAG	3180
AATGAAAAAA	TCAGGAATCT	GGCGGGAGAT	TCGATTGCGG	CTAAACTCGC	GAGCGAGATA	3240
GTGGTCGATA	TTGACTCTAA	GCCTTCACCG	AAGCAGGTGG	GTAATTCGTC	ATCCGAAAAC	3300
GCCGATAAGC	GGGAAGTTCA	GAGGCCCGGT	TTGCGTGGTG	GTTCTAGAAA	CGGGGTTGTT	3360
GGGGAGTTCC	TTCACTTCGT	CGTGGATTCT	GCCTTGCGTC	TTTTCAAATA	CGCGACGGAT	3420
CAACAACGGA	TCAAGTCTTA	CGTGCGTTTC	TTGGACTCGG	CGGTCTCATT	CTTGGATTAC	3480
AACTACGATA	ATCTATCGTT	TATACTGCGA	GTGCTTTCGG	AAGGTTATTC	GTGTATGTTC	3540

112

GCGTTTTTGG	CGAATCGCGG	CGACTTATCT	AGTCGTGTCC	GTAGCGCGGT	GTGTGCTGTG	3600
AAAGAAGTTG	CTACCTCATG	CGCGAACGCG	AGCGTTTCTA	AAGCCAAGGT	TATGATTACC	3660
TTCGCAGCGG	CCGTGTGTGC	TATGATGTTT	AATAGCTGCG	ATTTTTCAGG	CGACGGTCGG	3720
GAGTATAAAT	CGTATATACA	TCGTTACACG	CAAGTATTGT	TTGACACTAT	CTTTTTTGAG	3780
GACAGCAGTT	ACCTACCCAT	AGAAGTTCTG	AGTTCGGCGA	TATGCGGTGC	TATCGTCACA	3840
CTTTTCTCCT	CGGGCTCGTC	CATAAGTTTA	AACGCCTTCT	TACTTCAAAT	TACCAAAGGA	3900
TTCTCCCTAG	AGGTTGTCGT	CCGGAATGTT	GTGCGAGTCA	CGCATGGTTT	GAGCACCACA	3960
GCGACCGACG	GCGTCATACG	TGGGGTTTTC	TCCCAAATTG	TGTCTCACTT	ACTTGTTGGA	4020
AATACGGGTA	ATGTGGCTTA	CCAGTCAGCT	TTCATTGCCG	GGGTGGTGCC	TCTTTTAGTT	4080
AAAAAGTGTG	TGAGCTTAAT	CTTCATCTTG	CGTGAAGATA	CTTATTCCGG	TTTTATTAAG	4140
CACGGAATCA	GTGAATTCTC	TTTCCTTAGT	AGTATTCTGA	AGTTCTTGAA	GGGTAAGCTT	4200
GTGGACGAGT	TGAAATCGAT	TATTCAAGGG	GTTTTTGATT	CCAACAAGCA	GGTGTTTAAA	4260
GAAGCTACTC	AGGAAGCGAT	TCGTACGACG	GTCATGCAAG	TGCCTGTCGC	TGTAGTGGAT	4320
GCCCTTAAGA	GCGCCGCGGG	AAAAATTTAT	AACAATTTTA	CTAGTCGACG	TACCTTTGGT	4380
AAGGATGAAG	GCTCCTCTAG	CGACGGCGCA	TGTGAAGAGT	ATTTCTCATG	CGACGAAGGT	4440
GAAGGTCCGG	GTCTGAAAGG	GGGTTCCAGT	TATGGCTTCT	CAATTTTAGC	gttcttttca	4500
CGCATTATGT	GGGGAGCTCG	TCGGCTTATT	GTTAAGGTGA	AGCATGAGTG	TTTTGGGAAA	4560
CTTTTTGAAT	TTCTATCGCT	CAAGCTTCAC	GAATTCAGGA	CTCGCGTTTT	TGGGAAGAAT	4620
AGAACGGACG	TGGGAGTTTA	CGATTTTTTG	CCCACGGGCA	TCGTGGAAAC	GCTCTCATCG	4680
GCTTCGTTGA	CCGATATGAA	TTACTTTGAG	TTCTCAGAAG	ACTTCTTAGC	CTCTATCGAG	4800
GAGCCGCCTT	TCGCTGGATT	GCGAGGAGGT	AGCAAGAACA	TCGCGATTTT	GGCGATTTG	4860
GAATACGCGC	ATAATTTGTT	TCGCATTGTC	GCAAGCAAGT	GTTCGAAACG	ACCTTTATTT	4920
CTTGCTTTCG	CCGAACTCTC	AAGCGCCCTT	ATCGAGAAAT	TTAAGGAGGT	TTTCCCTCGT	4980
AAGAGCCAGC	TCGTCGCTAT	CGTGCGCGAG	TATACTCAGA	GATTCCTCCG	AAGTCGCATG	5040
CGTGCGTTGG	GTTTGAATAA	CGAGTTCGTG	GTAAAATCTT	TCGCCGATTT	GCTACCCGCA	5100
TTAATGAAGC	GGAAGGTTTC	AGGTTCGTTC	TTAGCTAGTG	TTTATCGCCC	ACTTAGAGGT	5160
TTCTCATATA	TGTGTGTTTC	AGCGGAGCGA	CGTGAAAAGT	TTTTTGCTCT	CGTGTGTTTA	5220
ATCGGGTTAA	GTCTCCCTTT	CTTCGTGCGC	ATCGTAGGAG	CGAAAGCGTG	CGAAGAACTC	5280
GTGTCCTCAG	CGCGTCGCTT	TTATGAGCGT	ATTAAAATTT	TTCTAAGGCA	GAAGTATGTC	5340
TCTCTTTCTA	ATTTCTTTTG	TCACTTGTTT	AGCTCTGACG	TTGATGACAG	TTCCGCATCT	5400

113

GCAGGGTTGA	AAGGTGGTGC	GTCGCGAATG	ACGCTCTTCC	ACCTTCTGGT	TCGCCTTGCT	5460
AGTGCCCTCC	TATCGTTAGG	GTGGGAAGGG	TTAAAGCTAC	TCTTATCGCA	CCACAACTTG	5520
TTATTTTTGT	GTTTTGCATT	GGTTGACGAT	GTGAACGTCC	TTATCAAAGT	TCTTGGGGGT	5580
CTTTCTTTCT	TTGTGCAACC	AATCTTTTCC	TTGTTTGCGG	CGATGCTTCT	ACAACCGGAC	5640
AGGTTTGTGG	AGTATTCCGA	GAAACTTGTT	ACAGCGTTTG	AATTTTTCTT	AAAATGTTCG	5700
CCTCGCGCGC	CTGCACTACT	CAAAGGGTTT	TTTGAGTGCG	TGGCGAACAG	CACTGTGTCA	5760
AAAACCGTTC	GAAGACTTCT	TCGCTGTTTC	GTGAAGATGC	TCAAACTTCG	AAAAGGGCGA	5820
GGGTTGCGTG	CGGATGGTAG	GGGTCTCCAT	CGGCAGAAAG	CCGTACCCGT	CATACCTTCT	5880
AATCGGGTCG	TGACCGACGG	GGTTGAAAGA	CTTTCGGTAA	AGATGCAAGG	AGTTGAAGCG	5940
TTGCGTACCG	AATTGAGAAT	CTTAGAAGAT	TTAGATTCTG	CCGTGATCGA	AAAACTCAAT	6000
AGACGCAGAA	ATCGTGACAC	TAATGACGAC	GAATTTACGC	GCCCTGCTCA	TGAGCAGATG	6060
CAAGAAGTCA	CCACTTTCTG	TTCGAAAGCC	AACTCTGCTG	GTTTGGCCCT	GGAAAGGGCA	6120
GTGCTTGTGG	AAGACGCTAT	AAAGTCGGAG	AAACTTTCTA	AGACGGTTAA	TGAGATGGTG	6180
AG GAAAG G GA	GTACCACCAG	CGAAGAAGTG	GCCGTCGCTT	TGTCGGACGA	TGAAGCCGTG	6240
GAAGAAATCT	CTGTTGCTGA	CGAGCGAGAC	GATTCGCCTA	AGACAGTCAG	GATAAGCGAA	6300
TACCTAAATA	GGTTAAACTC	AAGCTTCGAA	TTCCCGAAGC	CTATTGTTGT	GGACGACAAC	6360
AAGGATACCG	GGGGTCTAAC	GAACGCCGTG	AGGGAGTTTT	ATTATATGCA	AGAACTTGCT	6240
CTTTTCGAAA	TCCACAGCAA	ACTGTGCACC	TACTACGATC	AACTGCGCAT	AGTCAACTTC	6480
GATCGTTCCG	TAGCACCATG	CAGCGAAGAT	GCTCAGCTGT	ACGTACGGAA	GAACGGCTCA	6540
ACGATAGTGC	AGGGTAAAGA	GGTACGTTTG	CACATTAAGG	ATTTCCACGA	TCACGATTTC	6600
CTGTTTGACG	GAAAAATTTC	TATTAACAAG	CGGCGGCGAG	GCGGAAATGT	TTTATATCAC	6660
GACAACCTCG	CGTTCTTGGC	GAGTAATTTG	TTCTTAGCCG	GCTACCCCTT	TTCAAGGAGC	6720
TTCGTCTTCA	CGAATTCGTC	GGTCGATATT	CTCCTCTACG	AAGCTCCACC	CGGAGGTGGT	6780
AAGACGACGA	CGCTGATTGA	CTCGTTCTTG	AAGGTCTTCA	AGAAAGGTGA	GGTTTCCACC	6840
ATGATCTTAA	CCGCCAACAA	AAGTTCGCAG	GTTGAGATCC	TAAAGAAAGT	GGAGAAGGAA	6900
GTGTCTAACA	TTGAATGCCA	GAAACGTAAA	GACAAAAGAT	CTCCGAAAAA	GAGCATTTAC	6960
ACCATCGACG	CTTATTTAAT	GCATCACCGT	GGTTGTGATG	CAGACGTTCT	TTTCATCGAT	7020
GAGTGTTTCA	TGGTTCATGC	GGGTAGCGTA	CTAGCTTGCA	TTGAGTTCAC	GAGGTGTCAT	7080
AAAGTAATGA	TCTTCGGGGA	TAGCCGGCAG	ATTCACTACA	TTGAAAGGAA	CGAATTGGAC	7140
AAGTGTTTGT	ATGGGGATCT	CGACAGGTTC	GTGGACCTGC	AGTGTCGGGT	TTATGGTAAT	7200

114

ATTTCGTACC	GTTGTCCATG	GGATGTGTGC	GCTTGGTTAA	GCACAGTGTA	TGGCAACCTA	7260
ATCGCCACCG	TGAAGGGTGA	AAGCGAAGGT	AAGAGCAGCA	TGCGCATTAA	CGAAATTAAT	7320
TCAGTCGACG	ATTTAGTCCC	CGACGTGGGT	TCCACGTTTC	TGTGTATGCT	TCAGTCGGAG	7380
AAGTTGGAAA	TCAGCAAGCA	CTTTATTCGC	AAGGGTTTGA	CTAAACTTAA	CGTTCTAACG	7440
GTGCATGAGG	CGCAAGGTGA	GACGTATGCG	CGTGTGAACC	TTGTGCGACT	TAAGTTTCAG	7500
GAGGATGAAC	CCTTTAAATC	TATCAGGCAC	ATAACCGTCG	CTCTTTCTCG	TCACACCGAC	7560
AGCTTAACTT	ATAACGTCTT	AGCTGCTCGT	CGAGGTGACG	CCACTTGCGA	TGCCATCCAG	7620
AAGGCTGCGG	AATTGGTGAA	CAAGTTTCGC	GTTTTTCCTA	CATCTTTTGG	TGGTAGTGTT	7680
ATCAATCTCA	ACGTGAAGAA	GGACGTGGAA	GATAACAGTA	GGTGCAAGGC	TTCGTCGGCA	7740
CCATTGAGCG	TAATCAACGA	CTTTTTGAAC	GAAGTTAATC	CCGGTACTGC	GGTGATTGAT	7800
TTTGGTGATT	TGTCCGCGGA	CTTCAGTACT	GGGCCTTTTG	AGTGCGGTGC	CAGCGGTATT	7860
GTGGTGCGGG	ACAACATCTC	CTCCAGCAAC	ATCACTCATC	ACGATAAGCA	GCGTGTTTAG	7920

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 2639 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: protein

	(xi) Popi	s sekvencie:	SEQ.	, ID.	No.	:3
Thr 1	Leu Arg Glu	Asn Pro íle Ser 5	Val	Ser 10	Gly	Val Asn Leu Gly Arg 15
Ser	Ala Ala Ala 20	Gin Val íle Tyr	Phe 25	Gly	Ser	Phe Thr Gin Pro Phe 30
Ala	Leu Tyr Pro 35	Arg Gin Glu Ser 40	Ala	íle	Val	Lys Thr Gin Leu Pro 45
Pro	Val Ser Val 50	Val Lys Val Glu 55	Cys	Val	Ala	Ala Glu Val Ala Pro 60
Asp 65	Arg Gly Val	Val Asp Lys Lys 70	Pro	Thr	Ser 75	Val Gly Val Pro Pro 80
Gin	Arg Gly Val	Leu Ser Phe Pro 85	Thr	Val 90	Val	Arg Asn Arg Gly Asp 95
Val	íle íle Thr 100	Gly Val Val His	Glu 105	Ala	Leu	Lys Lys íle Lys Asp 110

115

Gly

Leu

Leu

Arg

Phe

Arg

Val

Gly

Gly

Asp

Met

Arg

Phe

Ser

Arg

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Ser

Asn

Tyr

Gly

Cys

Arg

Phe

Val

Ala

Ser

Val

Arg

Thr

Asn

130

135

140

Thr

Thr

Val

Trp

Leu

Asn

Cys

Thr

Lys

Ala

Ser

Gly

Glu

Lys

Phe

Ser

145

150

155

160

Leu

Ala

Ala

Ala

Cys

Thr

Ala

Asp

Tyr

Val

Ala

Met

Leu

Arg

Tyr

Val

165

170

175

Cys

Gly

Gly

Lys

Phe

Pro

Leu

Val

Leu

Met

Ser

Arg

Val

íle

Tyr

Pro

180

185

190

Asp

Gly

Arg

Cys

Tyr

Leu

Ala

His

Met

Arg

Tyr

Leu

Cys

Ala

Phe

Tyr

195

200

205

Cys

Arg

Pro

Phe

Arg

Glu

Ser

Asp

Tyr

Ala

Leu

Gly

Met

Trp

Pro

Thr

210

215

220

Val

Ala

Arg

Leu

Arg

Ala

Cys

Val

Glu

Lys

Asn

Phe

Gly

Val

Glu

Ala

225

230

235

240

Cys

Gly

íle

Ala

Leu

Arg

Gly

Tyr

Tyr

Thr

Ser

Arg

Asn

Val

Tyr

His

245

250

255

Cys

Asp

Tyr

Asp

Ser

Ala

Tyr

Val

Lys

Tyr

Phe

Arg

Asn

Leu

Ser

Gly

260

265

270

Arg

íle

Gly

Gly

Gly

Ser

Phe

Asp

Pro

Thr

Ser

Leu

Thr

Ser

Val

íle

275

280

285

Thr

Val

Lys

íle

Ser

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly

Leu

Pro

Lys

Asn

íle

Ala

290

295

300

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

Cys

Asp

íle

Arg

Tyr

Val

Glu

Pro

Val

Asp

Ser

305

310

315

320

Gly

Gly

íle

Gin

Ser

Ser

Val

Lys

Thr

Lys

Arg

Glu

Asp

Ala

His

Arg

325

330

335

Thr

Val

Glu

Glu

Arg

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

Val

Glu

Gin

Pro

Arg

Gin

340

345

350

Lys

Arg

íle

Asp

Glu

Lys

Gly

Cys

Gly

Arg

Val

Pro

Ser

Gly

Gly

Phe

355

360

365

Ser

His

Leu

Leu

Val

Gly

Asn

Leu

Asn

Glu

Val

Arg

Arg

Lys

Val

Ala

370

375

380

Ala

Gly

leu

Leu

Arg

Phe

Arg

Val

Gly

Gly

Asp

Met

asp

Phe

His

Arg

385

390

395

400

Ser

Phe

Ser

Thr

Gin

Ala

Gly

His

Arg

Leu

Leu

Val

Trp

Arg

Arg

Ser

405

410

415

Ser

Arg

Ser

Val

Cys

Leu

Glu

Leu

Tyr

Ser

Pro

Ser

Lys

Asn

Phe

Leu

420

425

430

116

Arg

Tyr

Asp 435

Val

Leu

Pro

Cys

Ser 440

Gly Asp

Tyr

Ala

Ala 445

Met

Phe

Ser

Phe

Ala 450

Ala

Gly

Gly

Arg

Phe 455

Pro

leu

Val

Leu

Met 460

Thr

Arg

íle

Arg

Tyr 465

Pro

Asn

Gly

Phe

Cys 470

Tyr

leu

Ala

His

Cys 475

Arg

Tyr

Ala

Cys

Ala 480

Phe

Leu

Leu

Arg

Gly 485

Phe

Asp

Pro

Lys

Arg 490

Phe

Asp

íle

Gly

Ala 495

Phe

Pro

Thr

Ala

Ala 500

Lys

Leu

Arg

Asn

Arg 505

Met

Val

Ser

Glu

Leu 510

Gly

Glu

Arg

Ser

Leu 515

Gly

Leu

Asn

Leu

Tyr 520

Gly

Ala

Tyr

Thr

Ser 525

Arg

Gly

val

Phe

His 530

Cys

Asp

Tyr

Asp

Ala 535

Lys

Phe

íle

Lys

Asp 540

Leu

Arg

Leu

Met

Ser 545

Ala

Val

íle

Ala

Gly 550

Lys

Asp

Gly

Val

Glu 555

Glu

Val

Val

Pro

Ser 560

Asp

íle

Thr

Pro

Ala 565

Met

Lys

Gin

Lys

Thr 570

íle

Glu

Ala

Val

Tyr 575

Asp

Arg

Leu

Tyr

Gly 580

Gly

Thr

Asp

Ser

Leu 585

Leu

Lys

Leu

Ser

íle 590

Glu

Lys

Asp

Leu

íle 595

Asp

Phe

Lys

Asn

Asp 600

Val

Gin

Ser

Leu

Lys 605

Lys

Asp

Arg

Pro

íle 610

Val

Lys

Val

Pro

Phe 615

Tyr

Met

Ser

Glu

Ala 620

Thr

Gin

Asn

Ser

Leu 625

Thr

Arg

Phe

Tyr

Pro 630

Gin

Phe

Glu

Leu

Lys 635

Phe

Ser

His

Ser

Ser 640

His

Ser

Asp

His

Pro 645

Ala

Ala

Ala

Ala

Ser 650

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn 655

Glu

Thr

Leu

Val

Arg 660

Leu

Cys

Gly

Asn

Ser 665

Val

Ser

Asp

íle

Gly 670

Gly

Cys

Pro

Leu

Phe 675

His

Leu

His

Ser

Lys 680

Thr

Gin

Arg

Arg

Val 685

His

Val

Cys

Arg

Pro 690

Val

Leu

Asp

Gly

Lys 695

Asp

Ala

Gin

Arg

Arg 700

Val

Val

Arg

Asp

Leu 705

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val 710

Arg

Leu

Gly

Asp

Asp 715

Asp

Lys

íle

Leu

Glu 720

Gly

Pro

Arg

Asn

íle 725

Asp

íle

Cys

His

Tyr 730

Pro

Leu

Gly

Ala

Cys 735

Asp

His

Glu

Ser

Ser 740

Ala

Met

Met

Met

Val 745

Gin

Val

Tyr

Asp

Ala 750

Ser

Leu

117

Tyr	Glu íle Cys 755	Gly Ala Met íle Lys 760	Lys	Lys	Ser	Arg 765	íle	Thr	Tyr
Leu	Thr Met Val 770	Thr Pro Gly Glu Phe 775	Leu	Asp	Gly 780	Arg	Glu	Cys	Val
Tyr 785	Met Glu Ser	Leu Asp Cys Glu íle 790	Glu	Val 795	Asp	Val	His	Ala	Asp 800
Val	Val Met Tyr	Lys Phe Gly Ser Ser 805	Cys 810	Tyr	Ser	His	Lys	Leu 815	Ser
íle	íle Lys Asp 820	íle Met Thr Thr Pro 825	Tyr	Leu	Thr	Leu	Gly 830	Gly	Phe
Leu	Phe Ser val 835	Glu Met Tyr Glu Val 840	Arg	Met	Gly	Val 845	Asn	Tyr	Phe
Lys	íle Thr Lys 850	Ser Glu Val Ser Pro 855	Ser	íle	Ser 860	Cys	Thr	Lys	Leu
Leu 865	Arg Tyr Arg	Arg Ala Asn Ser Asp 870	Val	Val 875	Lys	Val	Lys	Leu	Pro 880
Arg	Phe Asp Lys	Lys Arg Arg Met Cys 885	Leu 890	Pro	Gly	Tyr	Asp	Thr 895	íle
Tyr	Leu Asp Ser 900	Lys Phe Val Ser Arg 905	Val	Phe	Asp	Tyr	Val 910	Val	Cys
Asn	Cys Ser Ala 915	Val Asn Ser Lys Thr 920	Phe	Glu	Trp	Val 925	Trp	Ser	Phe
íle	Lys Ser Ser 930	Lys Ser Arg Val íle 935	íle	Ser	Gly 940	Lys	íle	íle	His
Lys 945	Asp Val Asn	Leu Asp Leu Lys Tyr 950	Val	Glu 955	Ser	Phe	Ala	Ala	Val 960
Met	Leu Ala Ser	Gly Val Arg Ser Arg 965	Leu 970	Ala	Ser	Glu	Tyr	Leu 975	Ala
Lys	Asn Leu Ser 980	His Phe Ser Gly Asp 985	Cys	Ser	Phe	íle	Glu 990	Ala	Thr
Ser	Phe Val Leu 995	Arg Glu Lys íle Arg 1000	Asn	Met	Thr	Leu Asn 1005	Phe	Asn
Glu	Arg Leu Leu 1010	Gin Leu Val Lys Arg 1015	Val	Ala	Phe Ala 1020	Thr	Leu	Asp
Val Ser Phe Leu 1025	Asp Leu Asp Ser Thr 1030	Leu	Glu Ser 1035	íle	Thr	Asp	Phe 1040
Ala	Glu Cys Lys	Val Ala íle Glu Leu 1045	Asp Glu 1050	Leu	Gly	Cys	Leu Arg 1055
Ala	Glu Ala Glu Asn Glu Lys íle Arg Asn 1060 1065	Leu	Ala	Gly	Asp Ser 1070	íle

118

Ala

Ala

Lys Leu 1075

Ala

Ser

Glu

íle Val 1080

Val

Asp

íle

Asp Ser 1085

Lys

Pro

Ser

Pro

Lys Gin

Val

Gly

Asn

Ser Ser

Ser

Glu

Asn

Ala Asp

Lys

Arg

1090

1095

1100

Glu

Val

Gin Arg

Pro

Gly

Leu

Arg Gly

Gly

Ser

Arg

Asn Gly

Val

Val

1105

1110

1115

1120

Gly

Glu

Phe Leu

His

Phe

Val

Val Asp

Ser

Ala

Leu

Arg Leu

Phe

Lys

1125

1130

1135

Tyr

Ala

Thr Asp

Gin

Gin

Arg

íle Lys

Ser

Tyr

Val

Arg Phe

Leu

Asp

1140

1145

1150

Ser

Ala

Val Ser

Phe

Leu

Asp

Tyr Asn

Tyr

Asp

Asn

Leu Ser

Phe

íle

1155

1160

1165

Leu

Arg

Val Leu

Ser

Glu

Gly

Tyr Ser

Cys

Met

Phe

Ala Phe

Leu

Ala

1170 1175 1180

Asn Arg Gly Asp Leu Ser Ser Arg Val Arg Ser Ala Val Cys Ala Val

1185

1190

1195

1200

Lys Glu

Val

Ala

Thr

Ser Cys

Ala

Asn

Ala

Ser Val

Ser

Lys

Ala

Lys

1205

1210

1215

Val Met

íle

Thr

Phe

Ala Ala

Ala

Val

Cys

Ala Met

Met

Phe

Asn

Ser

1220

1225

1230

Cys Gly

Phe

Ser

Gly

Asp Gly Arg

Glu

Tyr

Lys Ser

Tyr

íle

His

Arg

1235

1240

1245

Tyr Thr

Gin

Val

Leu

Phe Asp

Thr

íle

Phe

Phe Glu

Asp

Ser

Ser

Tyr

1250

1255

1260

Leu Pro

íle

Glu

Val

Leu Ser

Ser

Ala

íle

Cys Gly

Ala

íle

Val

Thr

1265

1270

1275

1280

Leu Phe

Ser

Ser

Gly

Ser Ser

íle

Ser

Leu

Asn Ala

Phe

Leu

Leu

Gin

1285

1290

1295

íle Thr

Lys

Gly

Phe

Ser Leu

Glu

Val

Val

Val Arg

Asn

Val

Val

Arg

1300

1305

1310

Val Thr

His

Gly

Leu

ser Thr

Thr

Ala

Thr

Asp Gly

Val

íle

Arg

Gly

1315

1320

1325

Val Phe

Ser

Gin

íle

Val Ser

His

Leu

Leu

Val Gly

Asn

Thr

Gly

Asn

1330

1335

1340

Val Ala

Tyr

Gin

Ser

Ala Phe

íle

Ala

Gly

Val Val

Pro

Leu

Leu

Val

1345

1350

1355

1360

Lys Lys

Cys

Val

Ser

Leu íle

Phe

íle

Leu

Arg Glu

Asp

Thr

Tyr

Ser

1365

1370

1375

Gly Phe íle Lys His Gly íle Ser Glu Phe Ser Phe Leu Ser Ser íle 1380 1385 1390

119

Leu	Lys	Phe Leu Lys Gly Lys 1395	Leu Val Asp Glu 1400	Leu	Lys Ser íle 1405	íle
Gin	Gly Val Phe Asp Ser Asn	Lys His Val Phe	Lys	Glu Ala Thr	Gin
	1410 1415	1420
Glu	Ala	íle Arg Thr Thr Val	Met Gin Val Pro	Val	Ala Val Val	Asp
1425	1430	1435		1440
Ala	Leu	Lys Ser Ala Ala Gly	Lys íle Tyr Asn	Asn	Phe Thr Ser	Arg
		1445	1450		1455
Arg	Thr	Phe Gly Lys Asp Glu	Gly Ser Ser Ser	Asp	Gly Ala Cys	Glu
		1460	1465		1470
Glu	Tyr	Phe Ser Cys Asp Glu	Gly Glu Gly Pro	Gly	Leu Lys Gly	Gly
		1475	1480		1485
Ser	Ser	Tyr Gly Phe Ser íle	Leu Ala Phe Phe	Ser	Arg íle Met	Trp
	1490 1495	1500
Gly	Ala	Arg Arg Leu íle Val	Lys Lys Val His	Glu	Cys Phe Gly	Lys
1505	1510	1515		1520
Leu	Phe	Glu Phe Leu Ser Leu	Lys Leu His Glu	Phe	Arg Thr Arg	Val
		1525	1530		1535
Phe	Gly	Lys Asn Arg Thr Asp	Val Gly Val Tyr	Asp	Phe Leu Pro	Thr
		1540	1545		1550
Gly	íle	Val Glu Thr Leu Ser	Ser íle Glu Glu	Cys	Asp Gin íle	Glu
		1555	1560		1565
Glu	Leu	Leu Gly Asp Asp Leu	Lys Gly Asp Lys	Asp	Ala Ser Leu	Thr
	1570 1575	1580
Asp	Met	Asn Tyr Phe Glu Phe	Ser Glu Asp Phe	Leu	Ala Ser íle	Glu
1585	1590	1595	1600
Glu	Pro	Pro Phe Ala Gly Leu	Arg Gly Gly Ser	Lys	Asn íle Ala	íle
		1605	1610		1615
Leu	Ala	íle Leu Glu tyr Ala	His Asn Leu Phe	Arg	íle Val Ala	Ser
		1620	1625		1630
Lys	Cys	Ser Lys Arg Pro Leu	Phe Leu Ala Phe	Ala	Glu Leu Ser	Ser
		1635	1640		1645
Ala	Leu	íle Glu Lys Phe Lys	Glu Val Phe Pro	Arg	Lys Ser Gin	Leu
	1650 1655	1660
Val	Ala	íle Val Arg Glu Tyr	Thr Gin Arg Phe	Leu	Arg Ser Arg	Met
1665	1670	1675		1680
Arg Ala	Leu Gly Leu Asn Asn	Glu Phe Val Val	Lys	Ser Phe Ala	Asp

1685 1690 1695

Leu Leu Pro Ala Leu Met Lys Arg Lys Val Ser Gly Ser Phe Leu Ala 1700 1705 1710

120

Ser Val	Tyr Arg Pro Leu Arg Gly Phe	Ser	Tyr	Met Cys Val 1725	Ser	Ala
1715	1720
Glu Arg	Arg Glu Lys Phe Phe	Ala Leu	Val	Cys	Leu íle Gly	Leu	Ser
173C	1 1735			1740
Leu Pro	Phe Phe Val Arg íle	Val Gly	Ala	Lys	Ala Cys Glu	Glu	Leu
1745	1750			1755		1760
Val Ser	Ser Ala Arg Arg Phe	Tyr Glu	Arg	íle	Lys íle Phe	Leu	Arg
	1765		1770		1775
Gin Lys	Tyr Val Ser Leu Ser	Asn Phe	Phe	Cys	His Leu Phe	Ser	Ser
	1780	1785		1790
Asp Val	Asp Asp Ser Ser Ala	Ser Ala	Gly	Leu	Lys Gly Gly	Ala	Ser
	1795	1800			1805
Arg Met	Thr Leu Phe His Leu	Leu Val	Arg	Leu	Ala Ser Ala	Leu	Leu
181C	1 1815			1820
Ser Leu	Gly Trp Glu Gly Leu	Lys Leu	Leu	Leu	Ser His His	Asn	Leu
1825	1830			1835		1840
Leu Phe	Leu Cys Phe Ala Leu	Val Asp	Asp	Val	Asn Val Leu	íle	Lys
	1845		1850		1855
Val Leu	Gly Gly Leu Ser Phe	Phe Val	Gin	Pro	íle Phe Ser	Leu	Phe
	1860	1865		1870
Ala Ala	Met Leu Leu Gin Pro	Asp Arg	Phe	Val	Glu Tyr Ser	Glu	Lys
	1875	1880			1885
Leu Val	Thr Ala Phe Glu Phe	Phe Leu	Lys	Cys	Ser Pro Arg	Ala	Pro
189C	1 1895			1900
Ala Leu	Leu Lys Gly Phe Phe	Glu Cys	Val	Ala	Asn Ser Thr	Val	Ser
1905	1910			1915		1920
Lys Thr	Val Arg Arg Leu Leu	Arg Cys	Phe	Val	Lys Met Leu	Lys	Leu
	1925		1930		1935
Arg Lys	Gly Arg Gly Leu Arg	Ala Asp	Gly	Arg	Gly Leu His	Arg	Gin
	1940	1945		1950
Lys Ala	Val Pro Val íle Pro	Ser Asn	Arg	Val	Val Thr Asp	Gly	Val
	1955	1960			1965
Glu Arg	Leu Ser Val Lys Met	Gin Gly	Val	Glu	Ala Leu Arg	Thr	Glu
197C	l 1975			1980
Leu Arg	íle Leu Glu Asp Leu	Asp Ser	Ala	Val	íle Glu Lys	Leu	Asn
1985	1990			1995		2000
Arg Arg	Arg Asn Arg Asp Thr	Asn Asp	Asp	Glu	Phe Thr Arg	Pro	Ala

2005 2010 2015

His Glu Gin Met Gin Glu Val Thr Thr Phe Cys Ser Lys Ala Asn Ser 2020 2025 2030

121

Ala	Gly	Leu Ala 2035	Leu	Glu	Arg Ala Val 2040	Leu Val	Glu	Asp Ala 2045	íle	Lys
Ser	Glu	Lys Leu	Ser	Lys	Thr Val Asn	Glu Met	Val	Arg Lys	Gly	Ser
	2050			2055		2060
Thr	Thr	Ser Glu	Glu	Val	Ala Val Ala	Leu Ser	Asp	Asp Glu	Ala	Val
2065			2070	2075			2080
Glu	Glu	íle Ser	Val	Ala	Asp Glu Arg	Asp Asp	Ser	Pro Lys	Thr	Val
			2085		2090			2095
Arg	íle	Ser Glu	Tyr	Leu	Asn Arg Leu	Asn Ser	Ser	Phe Glu	Phe	Pro
		2100		2105		2110
Lys	Pro	íle Val	Val	Asp	Asp Asn Lys	Asp Thr	Gly	Gly Leu	Thr	Asn
		2115			2120			2125
Ala	Val	Arg Glu	Phe	Tyr	Tyr Met Gin	Glu Leu	Ala	Leu Phe	Glu	íle
	2130			2135		2140
His	Ser	Lys Leu	Cys	Thr	Tyr Tyr Asp	Gin Leu	Arg	íle Val	Asn	Phe
2145			2150	2155			2160
Asp	Arg	Ser Val	Ala	Pro	Cys Ser Glu	Asp Ala	Gin	Leu Tyr	Val	Arg
			2165		2170			2175
Lys	Asn	Gly Ser	Thr	íle	Val Gin Gly	Lys Glu	Val	Arg Leu	His	íle
		2180		2185		2190
Lys	Asp	Phe His	Asp	His	Asp Phe Leu	Phe Asp	Gly	Lys íle	Ser	íle
		2195			2200			2205
Asn	Lys	Arg Arg	Arg	Gly	Gly Asn Val	Leu Tyr	His	Asp Asn	Leu	Ala
	2210			2215		2220
Phe	Leu	Ala Ser	Asn	Leu	Phe Leu Ala	Gly Tyr	Pro	Phe Ser	Arg	Ser
2225			2230	2235			2240
Phe	Val	Phe Thr	Asn	Ser	Ser Val Asp	íle Leu	Leu	Tyr Glu	Ala	Pro
			2245		2250			2255
Pro	Gly	Gly Gly	Lys	Thr	Thr Thr Leu	íle Asp	Ser	Phe Leu	Lys	Val
		2260		2265		2270
Phe	Lys	Lys Gly	Glu	Val	Ser Thr Met	íle Leu	Thr	Ala Asn	Lys	Ser
		2275			2280			2285
Ser	Gin	Val Glu	íle	Leu	Lys Lys Val	Glu Lys	Glu	Val Ser	Asn	íle
	2290			2295		2300
Glu	Cys	Gin Lys	Arg	Lys	Asp Lys Arg	Ser Pro	Lys	Lys Ser	íle	Tyr
2305			2310	2315			2320
Thr	íle	Asp Ala	Tyr	Leu	Met His His	Arg Gly	cys	Asp Ala	Asp	Val
			2325		2330			2335

Leu Phe íle Asp Glu Cys Phe Met Val His Ala Gly Ser Val Leu Ala 2340 2345 2350

122

Cys	íle	Glu Phe 2355	Thr	Arg	Cys His Lys Val Met íle Phe Gly Asp Ser
2360	2365
Arg	Gin	íle His	Tyr	íle	Glu Arg Asn Glu	Leu Asp Lys Cys Leu Tyr
	2370			2375	2380
Gly	Asp	Leu Asp	Arg	Phe	Val Asp Leu Gin	Cys Arg Val Tyr Gly Asn
2385			2390	2395 2400
íle	Ser	Tyr Arg	Cys	Pro	Trp Asp Val Cys	Ala Trp Leu Ser Thr Val
			2405	2410 2415
Tyr	Gly	Asn Leu	íle	Ala	Thr Val Lys Gly	Glu Ser Glu Gly Lys Ser
		2420		2425	2430
Ser	Met	Arg íle	Asn	Glu	íle Asn Ser Val	Asp Asp Leu Val Pro Asp
		2435			2440	2445
Val	Gly	Ser Thr	Phe	Leu	Cys Met Leu Gin	Ser Glu Lys Leu Glu íle
	2450			2455	2460
Ser	Lys	His Phe	íle	Arg	Lys Gly Leu Thr	Lys Leu Asn Val Leu Thr
2465			2470	2475 2480
Val	Lys	Glu Ala	Gin	Gly	Glu Thr Tyr Ala	Arg Val Asn Leu Val Arg
			2485	2490 2495
Leu	Lys	Phe Gin	Glu	Asp	Glu Pro Phe Lys	Ser íle Arg His íle Thr
		2500		2505	2510
Val	Ala	Leu Ser	Arg	His	Thr Asp Ser Leu	Thr Tyr Asn Val Leu Ala
		2515			2520	2525
Ala	Arg	Arg Gly	Asp	Ala	Thr Cys Asp Ala	íle Gin Lys Ala Ala Glu
	2530			2535	2540
Leu	Val	Asn Lys	Phe	Arg	Val Phe Pro Thr	Ser Phe Gly Gly Ser Val
2545			2550	2555 2560
íle	Asn	Leu Asn	Val	Lys	Lys Asp Val Glu	Asp Asn Ser Arg Cys Lys
			2565	2570 2575
Ala	Ser	Ser Ala	Pro	Leu	Ser Val íle Asn	Asp Phe Leu Asn Glu Val
		2580		2585	2590
Asn	Pro	Gly Thr	Ala	Val	íle Asp Phe Gly	Asp Leu Ser Ala Asp Phe
		2595			2600	2605
Ser	Thr	Gly Pro	Phe	Glu	Cys Gly Ala Ser	Gly íle Val Val Arg Asp
	2610			2615	2620
Asn	íle	Ser Ser	Ser	Asn	íle Thr Asp His	Asp Lys Gin Arg Val
2625			2630	2635

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.4:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1380 párov báz

123 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.:4

AGCGTAGTTC	GGTCGCAGGC	GATTCCGCGT	AGAAAACCTT	CTCTACAAGA	AAATTTGTAT	60
TCGTTTGAAG	CGCGGAATTA	TAACTTCTCG	ACTTGCGACC	GTAACACATC	TGCTTCAATG	120
TTCGGAGAGG	CTATGGCGAT	GAACTGTCTT	CGTCGTTGCT	TCGACCTAGA	TGCCTTTTCG	180
TCCCTGCGTG	ATGATGTGAT	TAGTATCACA	CGTTCAGGCA	TCGAACAATG	GCTGGAGAAA	240
CGTACTCCTA	GTCAGATTAA	AGCATTAATG	AAGGATGTTG	AATCGCCTTT	GGAAATTGAC	300
GATGAAATTT	GTCGTTTTAA	GTTGATGGTG	AAGCGTGACG	CTAAGGTGAA	GTTAGACTCT	360
TCTTGTTTAA	CTAAACACAG	CGCCGCTCAA	AATATCATGT	TTCATCGCAA	GAGCATTAAT	420
GCTATCTTCT	CTCCTATCTT	TAATGAGGTG	AAAAACCGAA	TAATGTGCTG	TCTTAAGCCT	480
AACATAAAGT	TTTTTACGGA	GATGACTAAC	AGGGATTTTG	CTTCTGTTGT	CAGCAACATG	540
CTTGGTGACG	ACGATGTGTA	CCATATAGGT	GAAGTTGATT	TCTCAAAGTA	CGACAAGTCT	600
CAAGATGCTT	TCGTGAAGGC	TTTTGAAGAA	GTAATGTATA	AGGAACTCGG	TGTTGATGAA	660
GAGTTGCTGG	CTATCTGGAT	GTGCGGCGAG	CGGTTATCGA	TAGCTAACAC	TCTCGATGGT	720
CAGTTGTCCT	TCACGATCGA	GAATCAAAGG	AAGTCGGGAG	CTTCGAACAC	TTGGATTGGT	780
AACTCTCTCG	TCACTTTGGG	TATTTTAAGT	CTTTACTACG	ACGTTAGAAA	TTTCGAGGCG	840
TTGTACATCT	CGGGCGATGA	TTCTTTAATT	TTTTCTCGCA	GCGAGATTTC	GAATTATGCC	900
GACGACATAT	GCACTGACAT	GGGTTTTGAG	ACAAAATTTA	TGTCCCCAAG	TGTCCCGTAC	960
TTTTGTTCTA	AATTTGTTGT	TATGTGTGGT	CATAAGACGT	TTTTTGTTCC	CGACCCGTAC	1020
AAGCTTTTTG	TCAAGTTGGG	AGCAGTCAAA	GAGGATGTTT	CAATGGATTT	CCTTTTCGAG	1080
ACTTTTACCT	CCTTTAAAGA	CTTAACCTCC	GATTTTAACG	ACGAGCGCTT	AATTCAAAAG	1140
CTCGCTGAAC	TTGTGGCTTT	AAAATATGAG	GTTCAAACCG	GCAACACCAC	CTTGGCGTTA	1200
AGTGTGATAC	ATTGTTTGCG	TTCGAATTTC	CTCTCGTTTA	GCAAGTTATA	TCCTCGCGTG	1260
AAGGGATGGC	AGGTTTTTTA	CACGTCGGTT	AAGAAAGCGC	TTCTCAAGAG	TGGGTGTTCT	1320
CTCTTCGACA	GTTTCATGAC	CCCTTTTGGT	CAGGCTGTCA	TGGTTTGGGA	TGATGAGTAG	1380

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

124 (A) Dĺžka: 459 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.5:

Ser 1

Val

Val

Arg

Ser 5

Gin

Ala

íle

Pro

Arg 10

Arg

Lys

Pro

Ser

Leu 15

Gin

Glu

Asn

Leu

Tyr 20

Ser

Phe

Glu

Ala

Arg 25

Asn

Tyr

Asn

Phe

Ser 30

Thr

Cys

Asp

Arg

Asn 35

Thr

Ser

Ala

Ser

Met 40

Phe

Gly

Glu

Ala

Met 45

Ala

Met

Asn

Cys

Leu 50

Arg

Arg

Cys

Phe

Asp 55

Leu

Asp

Ala

Phe

Ser 60

Ser

Leu

Arg

Asp

Asp 65

Val

íle

Ser

íle

Thr 70

Arg

Ser

Gly

íle

Glu 75

Gin

Trp

Leu

Glu

Lys 80

Arg

Thr

Pro

Ser

Gin 85

íle

Lys

Ala

Leu

Met 90

Lys

Asp

Val

Glu

Ser 95

Pro

Leu

Glu

íle

Asp 100

Asp

Glu

íle

Cys

Arg 105

Phe

Lys

Leu

Met

Val 110

Lys

Arg

Asp

Ala

Lys 115

Val

Lys

Leu

Asp

Ser 120

Ser

Cys

Arg

Phe

Lys 125

His

Ser

Ala

Ala

Gin 130

Asn

íle

Met

Phe

His 135

Arg

Lys

Ser

íle

Asn 140

Ala

íle

Phe

Ser

Pro 145

íle

Phe

Asn

Glu

Val 150

Lys

Asn

Arg

íle

Met 155

Cys

Cys

Leu

Lys

Pro 160

Asn

íle

Lys

Phe

Phe 165

Thr

Glu

Met

Thr

Asn 170

Arg

Asp

Phe

Ala

Ser 175

Val

Val

Ser

Asn

Met 180

Leu

Gly

Asp

Asp

Asp 185

Val

Tyr

His

íle

Gly 190

Glu

Val

Asp

Phe

Ser 195

Lys

Tyr

Asp

Lys

Ser 200

Gin

Asp

Ala

Phe

Val 205

Lys

Ala

Phe

Glu

Glu 210

Val

Met

Tyr

Lys

Glu 215

Leu

Gly

Val

Asp

Glu 220

Glu

Leu

Leu

Ala

íle 225

Trp

Met

Cys

Gly

Glu 230

Arg

Leu

Ser

íle

Ala 235

Asn

Thr

Leu

Asp

Gly 240

Gin

Leu

Ser

Phe

Thr 245

íle

Glu

Asn

Gin

Arg 250

Lys

Ser

Gly

Ala

Ser 255

Asn

125

Thr

Trp

íle

Gly Asn 260

Ser Leu Val

Thr Leu Gly íle Leu Ser Leu Tyr

265

270

Tyr

Asp

Val

Arg

Asn

Phe

Glu

Ala

Leu

Tyr

íle

ser

Gly

Asp

Asp

Ser

275

280

285

Leu

íle

Phe

Ser

Arg

Ser

Glu

íle

Ser

Asn

Tyr

Ala

Asp

Asp

íle

Cys

290

295

300

Thr

Asp

met

Gly

Phe

Glu

Thr

Lys

Phe

Met

Ser

Pro

Ser

Val

Pro

Tyr

305

310

315

320

Phe

Cys

Ser

Lys

Phe

Val

Val

Met

Cys

Gly

His

Lys

Thr

Phe

Phe

Val

325

330

335

Pro

Asp

Pro

Tyr

Lys

Leu

Phe

Val

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Lys

Glu

Asp

340

345

350

Val

Ser

Met

Asp

Phe

Leu

Phe

Glu

Thr

Phe

Thr

Ser

Phe

Lys

Asp

Leu

355

360

365

Thr

Ser

Asp

Phe

Asn

Asp

Glu

Arg

Leu

íle

Gin

Lys

Leu

Ala

Glu

Leu

370

375

380

Val

Ala

Leu

Lys

Tyr

Glu

Val

Gin

Thr

Gly

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Leu

385

390

395

400

Ser

Val

íle

His

Cys

Leu

Arg

Ser

Asn

Phe

Leu

Ser

Phe

Ser

Lys

Leu

405

410

415

Tyr

Pro

Arg

Val

Lys

Gly

Trp

Gin

Val

Phe

Tyr

Thr

Ser

Val

Lys

Lys

420

425

430

Ala

Leu

Leu

Lys

Ser

Gly

Cys

Ser

Leu

Phe

Asp

Ser

Phe

Met

Thr

Pro

435

440

445

Phe

Gly

Gin

Ala

Val

Met

Val

Trp

Asp

Asp

Glu

450 455 (2) Informácia pre sekvenciu ID.No.6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 171 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.6:

ATGAATCAGG TTTTGCAGTT TGAATGTTTG TTTCTGCTGA ATCTCGCGGT TTTTGCTGTG

ACTTTCATTT TCATTCTTCT GGTCTTCCGC GTGATTAAGT CTTTTCGCCA GAAGGGTCAC

GAAGCACCTG TTCCCGTTGT TCGTGGCGGG GGTTTTTCAA CCGTAGTGTA G

120

171

126 (2) Informácia pre sekvenciu ID.No.7:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 56 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.7:

Met 1

Asn

Gin

Val

Leu 5

Gin

Phe

Glu

Cys

Leu 10

Phe

Leu

Leu

Asn

Leu 15

Ala

Val

Phe

Ala

Val 20

Thr

Phe

íle

Phe

íle 25

Leu

Leu

Val

Phe

Arg 30

Val

íle

Lys

Ser

Phe 35

Arg

Gin

Lys

Gly

His 40

Glu

Ala

Pro

Val

Pro 45

Val

Val

Arg

Gly

Gly 50

Gly

Phe

Ser

Thr

Val 55

Val

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.8:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1800 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.8:

ATGGTAGTTT	TCGGTTTGGA	CTTTGGCACC	ACATTCTCTA	CGGTGTGTGT	GTACAAGGAT	60
GGACGAGTTT	TTTCATTCAA	GCAGAATAAT	TCGGCGTACA	TCCCCACTTA	CCTCTATCTC	120
TTCTCCGATT	CTAACCACAT	GACTTTTGGT	TACGAGGCCG	AATCACTGAT	GAGTAATCTG	180
AAAGTTAAAG	GTTCGTTTTA	TAGAGATTTA	AAACGTTGGG	TGGGTTGCGA	TTCGAGTAAC	240
CTCGACGCGT	ACCTTGACCG	TTTAAAACCT	CATTACTCGG	TCCGCTTGGT	TAAGATCGGC	300
TCTGGCTTGA	ACGAAACTGT	TTCAATTGGA	AACTTCGGGG	GCACTGTTAA	GTCTGAGGCT	360
CATCTGCCAG	GGTTGATAGC	TCTCTTTATT	AAGGCTGTCA	TTAGTTGCGC	GGAGGGCGCG	420
TTTGCGTGCA	CTTGCACCGG	GGTTATTTGT	TCAGTACCTG	CCAATTATGA	TAGCGTTCAA	480
AGGAATTTCA	CTGATCAGTG	TGTTTCACTC	AGCGGTTATC	AGTGCGTATA	TATGATCAAT	540
GAACCTTCAG	CGGCTGCGCT	ATCTGCGTGT	AATTCGATTG	GAAAGAAGTC	CGCAAATTTG	600

127

GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA CCGCAACAAT	660
ACTTTTGTTG TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA TGTTGATCGT	720
GCGTTTCTCA CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC TTTGGATATC	780
TCGAATCTGA AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC TTTGAGAGGT	840
GTCGATGGAA GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC GGTGATGCTC	900
CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA TGCTAAGAGT	960
ATGAATGAGA GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC TTCATATCTT	1020
CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG ATCGTATCTT AAGAGTTTCG	1080
GATCCTCGGG CTGCCGTGGC CGTCGGTTGC GCATTATATT CTTCATGCCT CTCAGGATCT	1140
GGGGGGTTGC TACTGATCGA CTGTGCAGCT CACACTGTCG CTATAGCGGA CAGAAGTTGT	1200
CATCAAATCA TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAGGAAG CATGCCTTTG	1260
TACTTAGCCA GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG CCGTGTTTGA AGGGGAGTAC	1320
GTTAAGTGCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTT TGATATAGGA	1380
GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT TTCAAGCGTA	1440
GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC AAGTGTCACT CACTGGAACT	1500
CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA ATTGCATATT	1560
AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA GAAAGGCGGA TCGACGAATA	1620
CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGATTCAA TTGATATCGC GGATGTGCTA	1680
AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCAGTGCC TTACCACCAG ACGAGGATGT CGAATTACTC	1740
CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC TGGAAGAAAT ACCTCTCTAG	1800
(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.9:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 599 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.9:

Met Val Val Phe Gly Leu Asp Phe Gly Thr Thr Phe Ser Thr Val Cys 15 10 15

Val Tyr Lys Asp Gly Arg Val Phe Ser Phe Lys Gin Asn Asn Ser Ala 20 25 30

128

Tyr

íle

Pro 35

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Leu 40

Phe

Ser

Asp

Ser

Asn 45

His

Met

Thr

Phe

Gly 50

Tyr

Glu

Ala

Glu

Ser 55

Leu

Met

Ser

Asn

Leu 60

Lys

Val

Lys

Gly

Tyr

íle

Pro 35

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Leu 40

Phe

Ser

Asp

Ser

Asn 45

His

Met

Thr

Phe

Gly 50

Tyr

Glu

Ala

Glu

Ser 55

Leu

Met

Ser

Asn

Leu 60

Lys

Val

Lys

Gly

Ser 65

Phe

Tyr

Arg

Asp

Leu 70

Lys

Arg

Trp

Val

Gly 75

Cys

Asp

Ser

Ser

Asn 80

Leu

Asp

Ala

Tyr

Leu 85

Asp

Arg

Leu

Lys

Pro 90

His

Tyr

Ser

Val

Arg 95

Leu

Val

Lys

íle

Gly

Ser

Gly

Leu

Asn

Glu

Thr

Val

Ser

íle

Gly

Asn

Phe

100 105 110

Gly

Gly

Thr 115

Val

Lys

Ser

Glu

Ala 120

His

Leu

Pro

Gly

Leu 125

íle

Ala

Leu

Phe

íle 130

Lys

Ala

Val

íle

Ser 135

Cys

Ala

Glu

Gly

Ala 140

Phe

Ala

Cys

Thr

Cys 145

Thr

Gly

Val

íle

Cys 150

Ser

Val

Pro

Ala

Asn 155

Tyr

Asp

Ser

Val

Gin 160

Arg

Asn

Phe

Thr

Asp 165

Gin

Cys

Val

Ser

Leu 170

Ser

Gly

Tyr

Gin

Cys 175

Val

Tyr

Met

íle

Asn 180

Glu

Pro

Ser

Ala

Ala 185

Ala

Leu

Ser

Ala

Cys 190

Asn

Ser

íle

Gly

Lys 195

Lys

Ser

Ala

Asn

Leu 200

Ala

Val

Tyr

Asp

Phe 205

Gly

Gly

Gly

Thr

Phe 210

Asp

Val

Ser

íle

íle 215

Ser

Tyr

Arg

Asn

Asn 220

Thr

Phe

Val

Val

Arg 225

Ala

Ser

Gly

Gly

Asp 230

Leu

Asn

Leu

Gly

Gly 235

Arg

Asp

Val

Asp

Arg 240

Ala

Phe

Leu

Thr

His 245

Leu

Phe

Ser

Leu

Thr 250

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp 255

Leu

Thr

Leu

Asp

íle 260

Ser

Asn

Leu

Lys

Glu 265

Ser

Leu

Ser

Lys

Thr 270

Asp

Ala

Glu

íle

Val 275

Tyr

Thr

Leu

Arg

Gly 280

Val

Asp

Gly

Arg

Lys 285

Glu

Asp

Val

Arg

Val 290

Asn

Lys

Asn

íle

Leu 295

Thr

Ser

Val

Met

Leu 300

Pro

Tyr

Val

Asn

Arg Thr Leu Lys íle Leu Glu Ser Thr Leu Lys Ser Tyr Ala Lys Ser 305 310 215 320

129

Met

Asn

Glu

Ser Ala Arg Val Lys 325

Cys Asp Leu Val Leu íle Gly Gly

330

335

Ser

Ser

Tyr

Leu

Pro

Gly

Leu

Ala

Asp

Val

Leu

Thr

Lys

His

Gin

Ser

340

345

350

Val

Asp

Arg

íle

Leu

Arg

Val

Ser

Asp

Pro

Arg

Ala

Ala

Val

Ala

Val

355

360

365

Gly

Cys

Ala

Leu

Tyr

Ser

Ser

Cys

Leu

Ser

Gly

Ser

Gly

Gly

Leu

Leu

370

375

380

Leu

íle

Asp

Cys

Ala

Ala

His

Thr

Val

Ala

íle

Ala

Asp

Arg

Ser

Cys

385

390

395

400

His

Gin

íle

íle

Cys

Ala

Pro

Ala

Gly

Ala

Pro

íle

Pro

Phe

Ser

Gly

405

410

415

Ser

Met

Pro

Leu

Tyr

Leu

Ala

Arg

Val

Asn

Lys

Asn

Ser

Gin

Arg

Glu

420

425

430

Val

Ala

Val

Phe

Glu

Gly

Glu

Tyr

Val

Lys

Cys

Pro

Lys

Asn

Arg

Lys

435

440

445

íle

Cys

Gly

Ala

Asn

íle

Arg

Phe

Phe

Asp

íle

Gly

Val

Thr

Gly

Asp

450

455

460

Ser

Tyr

Ala

Pro

Val

Thr

Phe

Tyr

met

Asp

Phe

Ser

íle

Ser

Ser

Val

465

470

475

480

Gly

Ala

Val

Ser

Phe

Val

Val

Arg

Gly

Pro

Glu

Gly

Lys

Gin

Val

Ser

485

490

495

Leu

Thr

Gly

Thr

Pro

Ala

Tyr

Asn

Phe

Ser

Ser

Val

Ala

Leu

Gly

Ser

500

505

510

Arg

Ser

Val

Arg

Glu

Leu

His

íle

Ser

Leu

Asn

Asn

Lys

Val

Phe

Leu

515

520

525

Gly

Leu

Leu

Leu

His

Arg

Lys

Ala

Asp

Arg

Arg

íle

Leu

Phe

Thr

Lys

530

535

540

Asp

Glu

Ala

íle

Arg

Tyr

Ala

Asp

Ser

íle

Asp

íle

Ala

Asp

Val

Leu

545

550

555

560

Lys

Glu

Tyr

Lys

Ser

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ala

Leu

Pro

Pro

Asp

Glu

Asp

565

570

575

Val

Glu

Leu

Leu

Leu

Gly

Lys

Ser

Val

Gin

Lys

Val

Leu

Arg

Gly

Ser

580

585

590

Arg

Leu

Glu

Glu

íle

Pro

Leu

595 (2) Informácia pre sekvenciu ID.No.10:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1656 párov báz

130 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.10:

ATGTCGAATT	ACTCCTGGGA	AAGTCTGTTC	AAAAAGTTTT	ACGGGGAAGC	AGACTGGAAG	60
AAATACCTCT	CTAGGAGCAT	AGCAGCACAC	TCAAGTGAAA	TTAAAACTCT	ACCAGACATT	120
CGATTGTACG	GCGGTAGGGT	TGTAAAGAAG	TCCGAATTCG	AATCAGCACT	TCCTAATTCT	180
TTTGAACAGG	AATTAGGACT	CTTCATACTG	AGCGAACGGG	AAGTGGGATG	GAGCAAATTA	240
TGCGGAATAA	CGGTGGAAGA	AGCAGCATAC	GATCTTACGA	ATCCCAAGGC	TTATAAATTC	300
ACTGCCGAGA	CATGTAGCCC	GGATGTAAAA	GGTGAAGGAC	AAAAATACTC	TATGGAAGAC	360
GTGATGAATT	TCATGCGTTT	ATCAAATCTG	GATGTTAACG	ACAAGATGCT	GACGGAACAG	420
TGTTGGTCGC	TGTCCAATTC	ATGCGGTGAA	TTGATCAACC	CAGACGACAA	AGGGCGATTC	480
GTGGCTCTCA	CCTTTAAGGA	CAGAGACACA	GCTGATGACA	CGGGTGCCGC	CAACGTGGAA	540
TGTCGCGTGG	GCGACTATCT	AGTTTACGCT	ATGTCCCTGT	TTGAGCAGAG	GACCCAAAAA	600
TCGCAGTCTG	GCAACATCTC	TCTGTACGAA	AAGTACTGTG	AATACATCAG	GACCTACTTA	660
GGGAGTACAG	ACCTGTTCTT	CACAGCGCCG	GACAGGATTC	CGTTACTTAC	GGGCATCCTA	720
TACGATTTTT	GTAAGGAATA	CAACGTTTTC	TACTCGTCAT	ATAAGAGAAA	CGTCGATAAT	780
TTCAGATTCT	TCTTGGCGAA	TTATATGCCT	TTGATATCTG	ACGTCTTTGT	CTTCCAGTGG	840
GTAAAACCCG	CGCCGGATGT	TCGGCTGCTT	TTTGAGTTAA	GTGCAGCGGA	ACTAACGCTG	900
GAGGTTCCCA	CACTGAGTTT	GATAGATTCT	CAAGTTGTGG	TAGGTCATAT	CTTAAGATAC	960
GTAGAATCCT	ACACATCAGA	TCCAGCCATC	GACGCGTTAG	AAGACAAACT	GGAAGCGATA	1020
CTGAAAAGTA	GCAATCCCCG	TCTATCGACA	GCGCAACTAT	GGGTTGGTTT	CTTTTGTTAC	1080
TATGGTGAGT	TTCGTACGGC	TCAAAGTAGA	GTAGTGCAAA	GACCAGGCGT	ATACAAAACA	1140
CCTGACTCAG	TGGGTGGATT	ZGAAATAAAC	ATGAAAGATG	TTGAGAAATT	CTTCGATAAA	1200
CTTCAGAGAG	AATTGCCTAA	TGTATCTTTG	CGGCGTCAGT	TTAACGGAGC	TAGAGCGCAT	1260
GAGGCTTTCA	AAATATTTAA	AAACGGAAAT	ATAAGTTTCA	GACCTATATC	GCGTTTAAAC	1320
GTGCCTAGAG	AGTTCTGGTA	TCTGAACATA	GACTACTTCA	GGCACGCGAA	TAGGTCCGGG	1380
TTAACCGAAG	AAGAAATACT	CATCCTAAAC	AACATAAGCG	TTGATGTTAG	GAAGTTATGC	1440
GCTGAGAGAG	CGTGCAATAC	CCTACCTAGC	GCGAAGCGCT	TTAGTAAAA TCATAAGAGT	1500

131

AATATACAAT	CATCACGCCA	AGAGCGGAGG	ATTAAAGACC	CATTGGTAGT	CCTGAAAGAC	1560
ACTTTATATG	AGTTCCAACA	CAAGCGTGCC	GGTTGGGGGT	CTCGAAGCAC	TCGAGACCTC	1620
GGGAGTCGTG	CTGACCACGC	GAAAGGAAGC	GGTTGA			1656

(2) Informácia pre sekvenciu ID.No.ll:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 551 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.il:

Met 1

Ser

Asn

Tyr

Ser 5

Trp

Glu

Ser

Leu

Phe 10

Lys

Lys

Phe

Tyr

Gly 15

Glu

Ala

Asp

Trp

Lys 20

Lys

Tyr

Leu

Ser

Arg 25

Ser

íle

Ala

Ala

His 30

Ser

Ser

Glu

íle

Lys 35

Thr

Leu

Pro

Asp

íle 40

Arg

'Leu

Tyr

Gly

Gly 45

Arg

Val

Val

Lys

Lys 50

Ser

Glu

Phe

Glu

Ser 55

Ala

Leu

Pro

Asn

Ser 60

Phe

Glu

Gin

Glu

Leu 65

Gly

Leu

Phe

íle

Leu 70

Ser

Glu

Arg

Glu

Val 75

Gly

Trp

Ser

Lys

Leu 80

Cys

Gly

íle

Thr

Val 85

Glu

Glu

Ala

Ala

Tyr 90

Asp

Leu

Thr

Asn

Pro 95

Lys

Ala

Tyr

Lys

Phe 100

Thr

Ala

Glu

Thr

Cys 105

Ser

Pro

Asp

Val

Lys 110

Gly

Glu

Gly

Gin

Lys 115

Tyr

Ser

Met

Glu

Asp 120

Val

Met

Asn

Phe

Met 125

Arg

Leu

Ser

Asn

Leu 130

Asp

Val

Asn

Asp

Lys 135

Met

Leu

Thr

Glu

Gin 140

Cys

Trp

Ser

Leu

Ser 145

Asn

Ser

Cys

Gly

Glu 150

Leu

íle

Asn

Pro

Asp 155

Asp

Lys

Gly

Arg

Phe 160

Val

Ala

Leu

Thr

Phe 165

Lys

Asp

Arg

Asp

Thr 170

Ala

Asp

Asp

Thr

Gly 175

Ala

Ala

Asn

Val

Glu 180

Cys

Arg

Val

Gly

Asp 185

Tyr

Leu

Val

Tyr

Ala 190

Met

Ser

Leu Phe Glu Gin Arg Thr Gin Lys Ser Gin Ser Gly Asn íle Ser Leu 195 200 205

132

Tyr Glu 210

Lys

Tyr Cys

Glu

Tyr íle Arg Thr Tyr Leu Gly Ser Thr Asp

215

220

Leu

Phe

Phe

Thr

Ala

Pro

Asp

Arg

íle

Pro

Leu

Leu

Thr

Gly

íle

Leu

225

230

235

240

Tyr

Asp

Phe

Cys

Lys

Glu

Tyr

Asn

Val

Phe

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Lys

Arg

245

250

255

Asn

Val

Asp

Asn

Phe

Arg

Phe

Phe

Leu

Ala

Asn

Tyr

Met

Pro

Leu

íle

260

265

270

Ser

Asp

Val

Phe

Val

Phe

Gin

Trp

Val

Lys

Pro

Ala

Pro

Asp

Val

Arg

275

280

285

Leu

Leu

Phe

Glu

Leu

Ser

Ala

Ala

Glu

Leu

Thr

Leu

Glu

Val

Pro

Thr

290

295

300

Leu

Ser

Leu

íle

Asp

Ser

Gin

Val

Val

Val

Gly

His

íle

Leu

Arg

Tyr

305

310

315

320

Val

Glu

Ser

Tyr

Thr

Ser

Asp

Pro

Ala

íle

Asp

Ala

Leu

Glu

Asp

Lys

325

330

335

Leu

Glu

Ala

íle

Leu

Lys

Ser

Ser

Asn

Pro

Arg

Leu

Ser

Thr

Ala

Gin

340

345

350

Leu

Trp

Val

Gly

Phe

Phe

Cys

Tyr

Tyr

Gly

Glu

Phe

Arg

Thr

Ala

Gin

355 360 365

Ser

Arg 370

Val

Val

Gin

Arg

Pro 375

Gly

Val

Tyr

Lys

Thr 380

Pro

Asp

Ser

Val

Gly 385

Gly

Pro

Glu

íle

Asn 390

Met

Lys

Asp

Val

Glu 395

Lys

Phe

Phe

Asp

Lys 400

Leu

Gin

Arg

Glu

Leu 405

Pro

Asn

Val

Ser

Leu 410

Arg

Arg

Gin

Phe

Asn 415

Gly

Ala

Arg

Ala

His 420

Glu

Ala

Phe

Lys

íle 425

Phe

Lys

Asn

Gly

Asn 430

íle

Ser

Phe

Arg

Pro 435

íle

Ser

Arg

Leu

Asn 440

Val

Pro

Arg

Glu

Phe 445

Trp

Tyr

Leu

Asn

íle 450

Asp

Tyr

Phe

Arg

His 455

Ala

Asn

Arg

Ser

Gly 460

Leu

Thr

Glu

Glu

Glu 465

íle

Leu

íle

Leu

Asn 470

Asn

íle

Ser

Val

Asp 475

Val

Arg

Lys

Leu

Cys 480

Ala

Glu

Arg

Ala

Cys 485

Asn

Thr

Leu

Pro

Ser 490

Ala

Lys

Arg

Phe

Ser 495

Lys

Asn

His

Lys

Ser 500

Asn

íle

Gin

Ser

Ser 505

Arg

Gin

Glu

Arg

Arg 510

íle

Lys

Asp

Pro

Leu 515

Val

Val

Leu

Lys

Asp 520

Thr

Leu

Tyr

Glu

Phe 525

Gin

His

Lys

133

Arg Ala Gly Trp Gly Ser Arg Ser Thr Arg Asp Leu Gly Ser Arg Ala 530 535 540

Asp His Ala Lys Gly Ser Gly (2) Informácia pre SEQ. ID.No.12:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 672 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.12:

ATGAGTTCCA ACACAAGCGT GCCGGTTGGG GGTCTCGAAG CACTCGAGAC	CTCGGGAGTC	60
GTGCTGACCA CGCGAAAGGA AGCGGTTGAT AAGTTTTTTA ATGAACTAAA	AAACGAAAAT	120
TACTCATCAG TTGACAGCAG CCGATTAAGC GATTCGGAAG TAAAAGAAGT	GTTAGAGAAA	180
AGTAAAGAAA GTTTCAAAAG CGAACTGGCC TCCACTGACG AGCACTTCGT	CTACCACATT	240
ATATTTTTCT TAATCCGATG TGCTAAGATA TCGACAAGTG AAAAGGTGAA	GTACGTTGGT	300
AGTCATACGT ACGTGGTCGA CGGAAAAACG TACACCGTTC TTGACGCTTG	GGTATTCAAC	360
ATGATGAAAA GTCTCACGAA GAAGTACAAA CGAGTGAATG GTCTGCGTGC	GTTCTGTTGC	420
GCGTGCGAAG ATCTATATCT AACCGTCGCA CCAATAATGT CAGAACGCTT	TAAGACTAAA	480
GCCGTAGGGA TGAAAGGTTT GCCTGTTGGA AAGGAATACT TAGGCGCCGA	CTTTCTTTCG	540
GGAACTAGCA AACTGATGAG CGATCACGAC AGGGCGGTCT CCATCGTTGC	AGCGAAAAAC	600
GCTGTCGATC GTAGCGCTTT CACGGGTGGG GAGAGAAAGA TAGTTAGTTT	GTATGATCTA	660
GGGAGGTACT AA		672
(2) Informácia pre SEQ. ID.No.13:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 223 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.13:

Met Ser Ser Asn Thr Ser Val Pro Val Gly Gly Leu Glu Ala Leu Glu 15 10 15

134

Thr

Ser

Gly

Val 20

Val

Leu

Thr

Thr

Arg 25

Lys

Glu

Ala

Val

Asp 30

Lys

Phe

Phe

Asn

Glu 35

Leu

Lys

Asn

Glu

Asn 40

Tyr

Ser

Ser

Val

Asp 45

Ser

Ser

Arg

Leu

Ser 50

Asp

Ser

Glu

Val

Lys 55

Glu

Val

Leu

Glu

Lys 60

Ser

Lys

Glu

Ser

Phe 65

Lys

Ser

Glu

Leu

Ala 70

Ser

Thr

Asp

Glu

His 75

Phe

Val

Tyr

His

íle 80

íle

Phe

Phe

Leu

íle 85

Arg

Cys

Ala

Lys

íle 90

Ser

Thr

Ser

Glu

Lys 95

Val

Lys

Tyr

Val

Gly 100

Ser

His

Thr

Tyr

Val 105

Val

Asp

Gly

Lys

Thr 110

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp 115

Ala

Trp

Val

Phe

Asn 120

Met

Met

Lys

Ser

Leu 125

Thr

Lys

Lys

Tyr

Lys 130

Arg

Val

Asn

Gly

Leu 135

Arg

Ala

Phe

Cys

Cys 140

Ala

Cys

Glu

Asp

Leu 145

Tyr

Leu

Thr

Val

Ala 150

Pro

íle

Met

Ser

Glu 155

Arg

Phe

Lys

Thr

Lys 160

Ala

Val

Gly

Met

Lys 165

Gly

Leu

Pro

Val

Gly 170

Lys

Glu

Tyr

Leu

Gly 175

Ala

Asp

Phe

Leu

Ser 180

Gly

Thr

Ser

Lys

Leu 185

Met

Ser

Asp

His

Asp 190

Arg

Ala

Val

Ser

íle 195

Val

Ala

Ala

Lys

Asn 200

Ala

Val

Asp

Arg

Ser 205

Ala

Phe

Thr

Gly

Gly

Glu

Arg

Lys

íle

Val

Ser

Leu

Tyr

Asp

Leu

Gly

Arg

Tyr

210 215 220 (2) Informácia pre SEQ. ID.No.14:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 597 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.14:

ATGGAGTTGA	TGTCCGACAG	CAACCTTAGC	AACCTGGTGA	TAACCGACGC	CTCTAGTCTA	60
AATGGTGTCG	ACAAGAAGCT	TTTATCTGCT	GAAGTTGAAA	AAATGTTGGT	GCAGAAAGGG	120
GCTCCTAACG	AGGGTATAGA	AGTGGTGTTC	GGTCTACTCC	TTTACGCACT	CGCGGCAAGA	180

135

ACCACGTCTC CTAAGGTTCA GCGCGCAGAT TCAGACGTTA TATTTTCAAA TAGTTTCGGA	240
GAGAGGAATG TGGTAGTAAC AGAGGGTGAC CTTAAGAAGG TACTCGACGG GTGTGCGCCT	300
CTCACTAGGT TCACTAATAA ACTTAGAACG TTCGGTCGTA CTTTCACTGA GGCTTACGTT	360
GACTTTTGTA TCGCGTATAA GCACAAATTA CCCCAACTCA ACGCCGCGGC GGAATTGGGG	420
ATTCCAGCTG AAGATTCGTA CTTAGCTGCA GATTTTCTGG GTACTTGCCC GAAGCTCTCT	480
GAATTACAGC AAAGTAGGAA GATGTTCGCG AGTATGTACG CTCTAAAAAC TGAAGGTGGA	540
GTGGTAAATA CACCAGTGAG CAATCTGCGT CAGCTAGGTA GAAGGGAAGT TATGTAA	597
(2) Informácia pre SEQ. ID.No.15:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 198 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.15:

Met 1

Glu

Leu

Met

Ser 5

Asp

Ser

Asn

Leu

Ser 10

Asn

Leu

Val

íle

Thr 15

Asp

Ala

Ser

Ser

Leu 20

Asn

Gly

Val

Asp

Lys 25

Lys

Leu

Leu

Ser

Ala 30

Glu

Val

Glu

Lys

Met 35

Leu

Val

Gin

Lys

Gly 40

Ala

Pro

Asn

Glu

Gly 45

íle

Glu

Val

Val

Phe 50

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr 55

Ala

Leu

Ala

Ala

Arg 60

Thr

Thr

Ser

Pro

Lys 65

Val

Gin

Arg

Ala

Asp 70

Ser

Asp

Val

íle

Phe 75

Ser

Asn

Ser

Phe

Gly 80

Glu

Arg

Asn

Val

Val 85

Val

Thr

Glu

Gly

Asp 90

Leu

Lys

Lys

Val

Leu 95

Asp

Gly

Cys

Ala

Pro 100

Leu

Thr

Arg

Phe

Thr 105

Asn

Lys

Leu

Arg

Thr 110

Phe

Gly

Arg

Thr

Phe 115

Thr

Glu

Ala

Tyr

Val 120

Asp

Phe

Cys

íle

Ala 125

Tyr

Lys

His

Lys

Leu 130

Pro

Gin

Leu

Asn

Ala 135

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly 140

íle

Pro

Ala

Glu

Asp 145

Ser

Tyr

Leu

Ala

Ala 150

Asp

Phe

Leu

Gly

Thr 155

Cys

Pro

Lys

Leu

Ser 160

136

Glu

Leu

Gin

Gin

Ser 165

Arg

Lys

Met

Phe Ala 170

Ser Met Tyr Ala Leu 175

Lys

Thr

Glu

Gly

Gly

Val

Val

Asn

Thr

Pro

Val

Ser

Asn

Leu Arg

Gin

Leu

180

185

190

Gly

Arg

Arg

Glu

Val

Met

195 (2) Informácia pre SEQ. ID.No.16:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 486 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.16:

ATGGAAGATT ACGAAGAAAA ATCCGAATCG CTCATACTGC TACGCACGAA TCTGAACACT	60
ATGCTTTTAG TGGTCAAGTC CGATGCTAGT GTAGAGCTGC CTAAACTACT AATTTGCGGT	120
TACTTACGAG TGTCAGGACG TGGGGAGGTG ACGTGTTGCA ACCGTGAGGA ATTAACAAGA	180
GATTTTGAGG GCAATCATCA TACGGTGATC CGTTCTAGAA TCATACAATA TGACAGCGAG	240
TCTGCTTTTG AGGAATTCAA CAACTCTGAT TGCGTAGTGA AGTTTTTCCT AGAGACTGGT	300
AGTGTCTTTT GGTTTTTCCT TCGAAGTGAA ACCAAAGGTA GAGCGGTGCG ACATTTGCGC	360
ACCTTCTTCG AAGCTAACAA TTTCTTCTTT GGATCGCATT GCGGTACCAT GGAGTATTGT	420
TTGAAGCAGG TACTAACTGA AACTGAATCT ATAATCGATT CTTTTTGCGA AGAAAGAAAT	480
CGTTAA	486
(2) Informácia pre SEQ. ID.No.17:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 161 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.17:

Met Glu Asp Tyr Glu Glu Lys Ser Glu Ser Leu íle Leu Leu Arg Thr 15 10 15

137

Asn

Leu

Asn

Thr 20

Met

Leu

Leu

Val

Val 25

Lys

Ser

Asp

Ala

Ser 30

Val

Glu

Leu

Pro

Lys 35

Leu

Leu

íle

Cys

Gly 40

Tyr

Leu

Arg

Val

Ser 45

Gly

Arg

Gly

Glu

Val 50

Thr

Cys

Cys

Asn

Arg 55

Glu

Glu

Leu

Thr

Arg 60

Asp

Phe

Glu

Gly

Asn 65

His

His

Thr

Val

íle 70

Arg

Ser

Arg

íle

íle 75

Gin

Tyr

Asp

Ser

Glu 80

Ser

Ala

Phe

Glu

Glu 85

Phe

Asn

Asn

Ser

Asp 90

Cys

Val

Val

Lys

Phe 95

Phe

Leu

Glu

Thr

Gly 100

Ser

Val

Phe

Trp

Phe 105

Phe

Leu

Arg

Ser

Glu 110

Thr

Lys

Gly

Arg

Ala 115

Val

Arg

His

Leu

Arg 120

Thr

Phe

Phe

Glu

Ala 125

Asn

Asn

Phe

Phe

Phe 130

Gly

Ser

His

Cys

Gly 135

Thr

Met

Glu

Tyr

Cys 140

Leu

Lys

Gin

Val

Leu 145

Thr

Glu

Thr

Glu

Ser 150

íle

íle

Asp

Ser

Phe 155

Cys

Glu

Glu

Arg

Asn 160

Arg (2) Informácia pre SEQ. ID.No.18:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 618 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.18:

ATGAGGGTTA	TAGTGTCTCC	TTATGAAGCT	GAAGACATTC	TGAAAAGATC	GACTGACATG	60
TTACGAAACA	TAGACAGTGG	GGTCTTGAGC	ACTAAAGAAT	GTATCAAGGC	ATTCTCGACG	120
ATAACGCGAG	ACCTACATTG	TGCGAAGGCT	TCCTACCAGT	GGGGTGTTGA	CACTGGGTTA	180
TATCAGCGTA	ATTGCGCTGA	AAAACGTTTA	ATTGACACGG	TGGAGTCAAA	CATACGGTTG	240
GCTCAACCTC	TCGTGCGTGA	AAAAGTGGCG	GTTCATTTTT	GTAAGGATGA	ACCAAAAGAG	300
CTAGTAGCAT	TCATCACGCG	AAAGTACGTG	GAACTCACGG	GCGTGGGAGT	GAGAGAAGCG	360
GTGAAGAGGG	AAATGCGCTC	TCTTACCAAA	ACAGTTTTAA	ATAAAATGTC	TTTGGAAATG	420
GCGTTTTACA	TGTCACCACG	AGCGTGGAAA	AACGCTGAAT	GGTTAGAACT	AAAATTTTCA	480

138

CCTGTGAAAA TCTTTAGAGA TCTGCTATTA GACGTGGAAA CGCTCAACGA ATTGTGCGCC

GAAGATGATG TTCACGTCGA CAAAGTAAAT GAGAATGGGG ACGAAAATCA CGACCTCGAA

CTCCAAGACG AATGTTAA (2) Informácia pre SEQ. ID.No.19:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 205 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: protein

540

600

618 (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.19:

Met Arg 1

Val

íle

Val 5

Ser

Pro Tyr Glu Ala Glu Asp íle Leu Lys Arg

10

15

Ser

Thr

Asp

Met

Leu

Arg

Asn

íle

Asp

Ser

Gly

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

20

25

30

Glu

Cys

íle

Lys

Ala

Phe

Ser

Thr

íle

Thr

Arg

Asp

Leu

His

cys

Ala

35

40

45

Lys

Ala

Ser

Tyr

Gin

Trp

Gly

Val

Asp

Thr

Gly

Leu

Tyr

Gin

Arg

Asn

50

55

60

Cys

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

íle

Asp

Thr

Val

Glu

Ser

Asn

íle

Arg

Leu

65

70

75

80

Ala

Gin

Pro

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Val

Ala

Val

His

Phe

Cys

Lys

Asp

85

90

95

Glu

Pro

Lys

Glu

Leu

Val

Ala

Phe

íle

Thr

Arg

Lys

Tyr

Val

Glu

Leu

100

105

110

Thr

Gly

Val

gly

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Lys

Arg

Glu

Met

Arg

Ser

Leu

115

120

125

Thr

Lys

Thr

Val

Leu

Asn

Lys

Met

Ser

Leu

Glu

Met

Ala

Phe

Tyr

Met

130

135

140

Ser

Pro

Arg

Ala

Trp

Lys

Asn

Ala

Glu

Trp

Leu

Glu

Leu

Lys

Phe

Ser

145

150

155

160

Pro

Val

Lys

íle

Phe

Arg

Asp

Leu

Leu

Leu

Asp

Val

Glu

Thr

Leu

Asn

165

170

175

Glu

Leu

Cys

Ala

Glu

Asp

Asp

Val

His

Val

Asp

Lys

Val

Asn

Glu

Asn

180

185

190

Gly

Asp

Glu

Asn

His

Asp

Leu

Glu

Leu

Gin

Asp

Glu

Cys

195

200

205

(2) Informácia pre SEQ. ID.No.20:

139 (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.20:

TGCTGGAGCT TGAGGTTCTG C 21 (2) Informácia pre SEQ. ID.No.21:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.21:

CGGAATTCAC CATGGAGTTG ATGTCCGACA G 31 (2) Informácia pre SEQ. ID.No.22:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.22:

AGCGGATCCA TGGCAGATTC GTGCGTAGCA GTA 31 (2) Informácia pre SEQ. ID.No.23:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 216 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jedno vlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekula typu: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ.ID.No.23:

140

ACATTGGTTA	AGTTTAACGA	AAATGATTAG	TAAATAATAA	ATCGAACGTG	GGTGTATCTA	60
CCTGACGTAT	CAACTTAAGC	TGTTACTGAG	TAATTAAACC	AACAAGTGTT	GGTGTAATGT	120
GTATGTTGAT	GTAGAGAAAA	ATCCGTTTGT	AGAACGGTGT	TTTTCTCTTC	TTTATTTTTA	180
AAAAAAAAAT	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAGC	GGCCGC			216

Claims (78)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný proteín alebo polypeptid zodpovedajúci proteínu alebo polypeptidu vírusu zvinutky viniča (typ 2).
2. 2. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
3. 3. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je polyproteín.
4. 4. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No.3.
5. 5. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je RNA-závislá RNA polymeráza molekulovej hmotnosti od 50 do 54 kDa.
6. 6. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 5.

   142
7. 7. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je proteín tepelného šoku 70 molekulovej hmotnosti od 63 do 67 kDa.
8. 8. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 7, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 9.
9. 9. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je proteín tepelného šoku 90 molekulovej hmotnosti od 61 do 65 kDa.
10. 10. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 11.
11. 11. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je povrchový proteín molekulovej hmotnosti od 20 do 24 kDa.
12. 12. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 15.
13. 13. Izolovaný proteín alebo polypeptid podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je divergentný povrchový proteín molekulovej hmotnosti od 23 do 27 kDa.

    143
14. 14. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 13.
15. 15. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 7.
16. 16. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 17.
17. 17. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 19.
18. 18. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je prečistený.
19. 19. Izolovaný proteín alebo polypeptid podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je rekombinantný.
20. 20. Izolovaná molekula RNA kódujúca proteín alebo polypeptid podlá nároku 1.

    144
21. 21. Izolovaná molekula RNA podlá nároku 20, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
22. 22. Izolovaná molekula DNA kódujúca proteín alebo polypeptid podľa nároku 1.
23. 23. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
24. 24. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid obsahuje konzervatívne oblasti helikázy, papaínu podobnej proteázy a metyltransferázy.
25. 25. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 3.
26. 26. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 25, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 2.
27. 27. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je RNAzávislá RNA polymeráza molekulovej hmotnosti od 50 do 54 kDa.

    145
28. 28. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 5.
29. 29. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 28, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 4.
30. 30. Izolovaná molekula DNA podía nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je proteín tepelného šoku 70 molekulovej hmotnosti od 63 do 67 kDa.
31. 31. Izolovaná molekula DNA podía nároku 30, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 9.
32. 32. Izolovaná molekula DNA podía nároku 31, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 8.
33. 33. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je proteín tepelného šoku 90 molekulovej hmotnosti od 61 do 65 kDa.
34. 34. Izolovaná molekula DNA podía nároku 33, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 11.
35. 35. Izolovaná molekula DNA podľa nároku 34, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 10.

    146
36. 36. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je povrchový proteín molekulovej hmotnosti od 20 do 24 kDa.
37. 37. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 36, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 15.
38. 38. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 37, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 14.
39. 39. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 23, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je divergentný povrchový proteín molekulovej hmotnosti od 23 do 27 kDa.
40. 40. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 39, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 13.
41. 41. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 40, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 12.
42. 42. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 7.
43. 43. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 42, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 6.

    147
44. 44. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že protein alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 17.
45. 45. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 44, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 16.
46. 46. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že protein alebo polypeptid má sekvenciu aminokyselín zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 19.
47. 47. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 46, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 18.
48. 48. Izolovaná molekula DNA podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že molekula DNA má nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu SEQ. ID. No. 23.
49. 49. Expresný systém obsahujúci molekulu DNA podlá nároku 22 vo vektore heterológnom k molekule DNA.
50. 50. Expresný systém podlá nároku 49, vyznačuj ú c i sa t ý m, že protein alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyprotein, RNA-závislú RNA polymerázu, protein tepelného šoku 70, protein tepelného šoku 90, divergentný povrchový protein a povrchový protein.
51. 51. Hostiteľská bunka transformovaná heterológnou molekulou DNA podlá nároku 22.

    148
52. 52. Hostiteľská bunka podľa nároku 51, vyznačujúca sa tým, že hostiteľská bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej Agrobacterium vitis a Agrobacterium tumefaciens.
53. 53. Hostiteľská bunka podľa nároku 51, vyznačujúca sa tým, že hostiteľská bunka je vybraná zo skupiny obsahujúcej bunku viniča, bunku citrusu, bunku repy a bunku tabaku.
54. 54. Hostiteľská bunka podľa nároku 51, vyznačujúca sa tým, že protein alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, protein tepelného šoku 70, protein tepelného šoku 90, divergentný povrchový protein a povrchový protein.
55. 55. Transgénny rastlinný kultivar obsahujúci molekulu DNA podľa nároku 22.
56. 56. Transgénny rastlinný kultivar podľa nároku 55, vyznačujúci sa tým, že rastlinný kultivar je vybraný zo skupiny obsahujúcej rastlinný kultivar viniča, rastlinný kultivar citrusu, rastlinný kultivar repy a rastlinný kultivar tabaku.
57. 57. Transgénny rastlinný kultivar podľa nároku 55, vyznačujúci sa tým, že protein alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, protein tepelného šoku 70, protein tepelného šoku 90, divergentný povrchový protein a povrchový protein.

    149
58. 58. Spôsob prenosu rezistencie voči zvinutke viniča do štepu alebo koreňovej odnože kultivaru Vitis alebo kultivaru Nicotiana obsahujúci:

    transformáciu štepu alebo koreňovej odnože kultivaru Vitis alebo kultivaru Nicotiana molekulou DNA podlá nároku 22.
59. 59. Spôsob podlá nároku 58, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
60. 60. Spôsob podlá nároku 58, vyznačujúci sa tým, že vírus zvinutky viniča je GLRaV-2.
61. 61. Spôsob podľa nároku 58, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia je sprostredkovaná Agrobacterium.
62. 62. Spôsob podlá nároku 58, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia obsahuje:

    zavedenie častíc do rastlinných buniek tabaku alebo tabaku za podmienokh účinných pre prestup častíc do vnútra bunky a vloženie expresného vektora obsahujúceho molekulu DNA do vnútra bunky.
63. 63. Spôsob prenosu rezistencie voči vírusu žltnutia repy do kultivaru repy obsahujúci:

    transformáciu kultivaru repy molekulou DNA podľa nároku

    22.

    150
64. 64. Spôsob podlá nároku 63, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
65. 65. Spôsob podlá nároku 63, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia je sprostredkovaná Agrobacterium.
66. 66. Spôsob podlá nároku 63, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia obsahuje:

    zavedenie častíc do rastlinných buniek repy za podmienok účinných pre prestup častíc do vnútra bunky a vloženie expresného vektora obsahujúceho molekulu DNA do vnútra bunky.
67. 67. Spôsob prenosu rezistencie voči tristeza vírusu do štepu alebo koreňovej odnože kultivaru citrusu obsahujúci:

    transformáciu štepu alebo koreňovej odnože kultivaru citrusu molekulou DNA podľa nároku 22.
68. 68. Spôsob podľa nároku 67, vyznačujúci sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
69. 69. Spôsob podľa nároku 67, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia je sprostredkovaná Agrobacterium.

    151
70. 70. Spôsob podľa nároku 67, vyznačujúci sa tým, že uvedená transformácia obsahuje:

    zavedenie častíc do rastlinných buniek citrusu za podmienok účinných pre prestup častíc do vnútra bunky a vloženie expresného vektora obsahujúceho molekulu DNA do vnútra bunky.
71. 71. Protilátka alebo jej väzobná časť, alebo sonda rozpoznávajúca proteín alebo polypeptid podlá nároku 1.
72. 72. Protilátka alebo jej väzobná časť, alebo sonda podľa nároku 71, vyznačujúca sa tým, že proteín alebo polypeptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej polyproteín, RNA-závislú RNA polymerázu, proteín tepelného šoku 70, proteín tepelného šoku 90, divergentný povrchový proteín a povrchový proteín.
73. 73. Spôsob detekcie vírusu zvinutky viniča vo vzorke, uvedená metóda sa skladá z:

    použitia protilátky alebo jej väzobnej časti rozpoznávajúcej proteín alebo polypeptid podľa nároku 1;

    pridania protilátky alebo jej väzobnej časti ku vzorke; určenia reakcie, ktorá indikuje prítomnosť vírusu zvinutky viniča vo vzorke použitím systému stanovenia.
74. 74. Spôsob podlá nároku 73, vyznačujúci sa tým, že systém pre stanovenie je vybraný zo skupiny enzymatické imunoabsorbčné stanovenie, rádioimunostanovenie, stanovenie pomocou gélovej difúznej precipitačnej reakcie, imunodifúzne stanovenie, aglutinačné stanovenie, fluorescenčné imunostanovenie, proteín A imunostanovenie a imunoelektroforetické stanovenie.

    152
75. 75. Spôsob detekcie vírusu zvinutky viniča vo vzorke, táto metóda sa skladá z:

    použitia DNA molekuly s nukleotidovou sekvenciou podľa nároku 22 ako sondy pri hybridizácii nukleovej kyseliny;

    pridania sondy ku vzorke;

    určenia reakcie, ktorá indikuje prítomnosť vírusu zvinutky viniča vo vzorke.
76. 76. Spôsob podľa nároku 75, vyznačujúci sa tým, že spôsob hybridizácie nukleovej kyseliny je vybraný zo skupiny dot blot hybridizácia, tkanivový printing, Southern hybridizácia a northern hybridizácia.
77. 77. Spôsob detekcie vírusu zvinutky viniča vo vzorke: použitie DNA molekuly nukleotidovej sekvencie podľa nároku 22 ako sondy pri detekcii amplifikácie génu;

    pridanie sondy ku vzorke;

    určenie reakcie, ktorá indikuje prítomnosť vírusu zvinutky viniča vo vzorke.
78. 78. Spôsob podľa nároku 77, vyznačujúci sa tým, že spôsob detekcie amplifikácie génu je vybraný zo skupiny polymerázová reťazová reakcia a immunocapture polymerázová reťazová reakcia.