SK1499A3 - Analogs of cationic proteins - Google Patents

Analogs of cationic proteins Download PDF

Info

Publication number
SK1499A3
SK1499A3 SK14-99A SK1499A SK1499A3 SK 1499 A3 SK1499 A3 SK 1499A3 SK 1499 A SK1499 A SK 1499A SK 1499 A3 SK1499 A3 SK 1499A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
seq
analog
acid sequence
Prior art date
Application number
SK14-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas C Boone
Ellen N Y Cheung
Susan I Hershenson
John D Young
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of SK1499A3 publication Critical patent/SK1499A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Oblasť techniky
Vynález sa všeobecne týka polypeptidových analógov terapeuticky aktívnych katiónaktívnych proteínov, vrátane (ale nie len) analógov neurotrofických faktorov známych ako neurotrofín-3 (NT-3) a neurotrofického faktoru pochádzajúceho z mozgu (BDNF-faktor; brain derived neurotrophic factor). Presnejšie povedané, tento vynález opisuje katiónaktívne polypeptidy, ktorých natívna sekvencia bola pozmenená tak, že vzniknuté analógy majú nižšie izoelektrické body a/alebo vykazujú po parenterálnej aplikácii zvýšenú absorpciu in vivo. Vynález rovnako opisuje materiály a spôsoby produkcie uvedených polypeptidových analógov, protilátok namierených proti týmto analógom a farmaceutické prípravky obsahujúce tieto analógy, kde zmienené farmaceutické prípravky môžu byť použité na liečbu najrôznejších ochorení a patologických stavov.
Doterajší stav techniky
Po parenterálnej aplikácii (ako napríklad subkutánnej, intravenóznej alebo intramuskulárnej injekcii) dajakého terapeutického proteínu sa pri jednotlivých takto aplikovaných proteínoch môžu podstatne líšiť ich farmakokinetické vlastnosti ako napríklad biologická dostupnosť, čas zotrvania v cirkulácii alebo rýchlosť clearence (vymiznutie z organizmu). Hoci sú v mnohých laboratóriách uskutočňované pokusy o vyvinutie alternatívnych spôsobov aplikácie proteínových produktov, je v súčasnosti velmi málo známe o faktoroch, ktoré riadia farmakokinetiku terapeutických proteínov po parenterálnej aplikácii. Bolo preukázané, že zvýšenie molekulovej hmotnosti proteínu má za následok prednostný príjem takého proteínu lymfatickým systémom (skôr ako krvnými kapilárami); pozri Supersaxo a ďalší, Pharmaceutical Res., zväzok 7, strana 167 a nasledujúce, 1990. Velkost molekuly terapeutického proteínu hrá rovnako kiúčovú úlohu pri príjme inzulínu, kde bolo preukázané, že limitujúcim krokom pri príjme inzulínu je disociácia hexamérov inzulínu spojených prostredníctvom iónov zinku na monomérnu formu; pozri Kang a ďalší, Diabetes Čare, zväzok 14, strany 942 až 948, 1991. Klinické testy analógov monomérneho inzulínu, pri ktorých bolo odstránené miesto zodpovedné za asociáciu molekúl, vykonávané na pacientoch postihnutých diabetes preukázali pri týchto pacientoch rýchlejší príjem zmienených analógov vedúci k podstatnému zlepšeniu v riadení hladiny glukózy; pozri Brange a ďalší, Náture, zväzok 33, strana 679 a nasledujúce, 1988.
Opis obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu ludského NT-3 divokého typu (tzn. natívnu sekvenciu). Tento polypeptid bol produkovaný rekombinantne v bakteriálnych bunkách E. coli a exprimovaný s metionínom na N-konci, tzn. ide o r-metHuNT-3 (SEK. ID. Č: 1). číslovanie aminokyselinových zvyškov začína na obrázku 1 pri prvom aminokyselinovom zvyšku nasledujúceho po štartovnom metioníne (Met-1) a to preto, že prirodzene sa vyskytujúci proteín je v cicavčích bunkách normálne exprimovaný bez tohto metionínu. (Povšimnite si, že v Zozname sekvencií je Met počítaný ako +1).
Na obrázku 2 je znázornená nukleotidová sekvencia (SEK. ID. Č: 2 a obrázok 2A) a aminokyselinová sekvencia (SEK. ID. Č: 3 a obrázok 2B) polypeptidového analóga r-metHuNT-3 podlá vynálezu, menovite NT-3 ()R61A,K64D (s číslovaním aminokyselín začínajúcim pri prvom aminokyselinovom zvyšku nasledujúceho po štartovnom metioníne).
Na obrázku 3 je znázornená nukleotidová sekvencia (SEK. ID. Č: 4 a obrázok 3A) a aminokyselinová sekvencia (SEK. ID. Č: 5a obrázok 3B) iného polypeptidového analóga r-metHuNT-3 podľa vynálezu, menovite NT-3(1-117)R61A,K64D (s číslovaním aminokyselín začínajúcim pri prvom aminokyselinovom zvyšku nasledujúceho po štartovnom metioníne).
Na obrázku 4 sú znázornené kalibračné (štandardné) krivky pri stanovení ELISA pre NT-3 divokého typu (tzn. sekvencia SEK. ID. Č: 1; krúžky) a pre analóga NT-3 so sekvenciami SEK. ID. Č: 3 (NT-3(1_119)R61A,K64D; trojuholníky) a SEK. ID. Č: 5 (NT-3()R61A,K64D; štvorčeky). V grafe je vynesená optická hustota v závislosti od koncentrácie vzorky vyjadrené v nanogramoch na mililiter (ng/ml). Pri stanoveniach ELISA je krížová reaktivita k analógom NT-3 približne desať percent. Vzorky sér z farmakokinetických štúdií boli analyzované metódou ELISA a koncentrácie NT-3 divokého typu a analógov NT-3 boli stanovované na základe porovnania so zodpovedajúcimi kalibračnými krivkami.
Obrázok 5 znázorňuje chromátogram z vysokoúčinnej kvapalinovej chromátografie na nosiči pre gélovú chromátografiu (SEC-HPLC; size exclusion high performance liquid chromátogram), kde je NT-3 divokého typu porovnávaný s analógmi NT-3 so sekvenciami znázornenými na obrázkoch 2 a 3.
Na ose y sú vynesené jednotky absorbancie (AU) a na ose x je znázornený elučný čas (v minútach). Z obrázku je vidieť, že zmienené analógy sú eluované v rovnakom čase ako molekula divokého typu čo ukazuje, že nekovalentná dimérna štruktúra NT-3 divokého typu nebola rozrušená ani pri jednom z analógov. V žiadnom z týchto preparátov neboli detekované agregované molekuly proteínov. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu;
(----) NT-3 (1_117 )R61A,K64D; a ( ) NT-3(1-119)R61A,K64D
Obrázok 6 znázorňuje chromátogram z vysokoúčinnej kvapalinovej chromátografie na katexe (CEX-HPLC; cation exchance high performance liquid chromátogram), kde je NT-3 divokého typu porovnávaný s analógmi NT-3 so sekvenciami znázornenými na obrázkoch 2a 3. Na zvislej ose sú vynesené jednotky absorbancie (AU). Na vodorovnej ose je znázornený elučný čas (v minútach). Na tomto obrázku je vidieť, že zmienené analógy sú eluované skôr ako NT-3 divokého typu, čo je v súlade s nižšou hodnotou izoelektrických bodov týchto analógov. Legenda: ( _ ) NT-3 divokého typu; (----)
NT-3(1_117)R61A,K64D; a ( ) NT-3(χ_119)R61A,K64D.
Na obrázku 7 je znázornený elektroforetický chromá togram SDS polyakrylamidového gélu farbeného striebrom. Tu je NT-3 divokého typu (pozri obrázok 1) porovnávaný s analógmi NT-3 so sekvenciami znázornenými na obrázkoch 2 a 3. Všetky tri vzorky putovali pri elektroforéze ako jeden prúžok s približne rovnakými molekulovými hmotnosťami zodpovedajúcich monomérnym formám. V žiadnej z vzoriek nie je pozorovaná prítomnosť významnejšieho množstva oligomérov s vyššími molekulovými hmotnosťami alebo fragmentov s nižšími molekulovými hmotnosťami. Dráha 1: NT-3(1_117)R61A,K64D,
2.5 μg; dráha 2: NT-3 (l^-ng )R61A,K64D, 2,5 μg; dráha 3:
NT-3 divokého typu, 2,5 μg; dráha 4: NT-3 divokého typu,
12.5 μg; dráha 5: štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami .
Na obrázku 8 sú znázornené profily sérových koncentrácií (v nanogramoch na mililiter) proteínov so sekvenciami SEK. ID. Č: 1 (plné kolieska), SEK. ID. Č: 3 (prázdne krúžky) a SEK. ID. Č: 5 (plné obdĺžničky) v závislosti od času (v hodinách) po intravenóznej aplikácii (IV) do organizmu pokusných potkanov. Podávaná dávka obsahovala 1 miligram proteínu na kilogram (mg/kg) telesnej hmotnosti. Profily koncentrácií sú dvojfázové. Počiatočná distribučná fáza bola nasledovaná pomalejšou eliminačnou fázou. Každý bod grafu reprezentuje priemernú hodnotu z troch pokusných zvierat.
Na obrázku 9 sú znázornené krivky sérových koncentrácií (v nanogramech na mililiter) proteínov so sekvenciami SEK. ID. Č: 1 (plné kolieska), SEK. ID. Č: 3 (prázdne krúžky) a SEK. ID. Č: 5 (plné obdĺžničky) v závislosti od * času (v hodinách) po subkutánnom podaní (SC) proteínu v množstve 1 mg/kg do organizmu pokusných potkanov. Každý bod grafu reprezentuje priemernú hodnotu z troch pokusných zvierat. Absorpčná fáza je charakterizovaná zvyšovaním sérovej koncentrácie proteínu. NT-3 divokého typu (SEK. ID.
Č: 1) vykazuje, po dosiahnutí maximálnej koncentrácie, najrýchlejšie zníženie sérovej koncentrácie.
Podstata vynálezu
Za účelom stanovenia vplyvu hodnoty izoelektrického bodu (pi) na farmakokinetické vlastnosti proteínov, boli
T vytvorené analógy NT-3 a BDNF-faktoru s relatívne nižšími hodnotami pi, pričom pri týchto analógoch bola zachovaná štruktúra a biologická aktivita proteínov v natívnom stave (tzn. proteínov s prirodzene sa vyskytujúcou aminokyselinovou sekvenciou, ako tiež ich verziou Met-1 (s metionínom na prvej pozícii); obidve tieto verzie sú v prihláške označované ako proteíny divokého typu)). Na základe týchto štúdií bolo zistené, že vytvorené proteínové analógy s nižšou hodnotou pi a/alebo nižším nábojom za fyziologických podmienok (vzhľadom na molekulu divokého typu) zotrvávajú po injekčnej aplikácii in vivo v krvnom obehu dlhšie (tzn. ich polčas života je dlhší) a vykazujú zvýšenú absorpciu. Hoci je tento vynález ilustrovaný na príkladoch ľudského NT-3 a BDNF-faktoru, je jeho použiteľnosť samozrejme širšia a tento vynález môže byt využitý pri akomkoľvek katiónaktívnom proteíne, a najmä potom pri bázických proteínoch s hodnotou pi vyššou ako 7,0.
Malo by byt zrejmé, že termíny proteín a polypeptid používané v tejto prihláške sú navzájom zameniteľné a označujú jednu a tu samú vec.
Stručne povedané, tento vynález opisuje substitučné, inzerčné a delečné analógy katiónaktívnych terapeutických proteínov a/alebo chemicky modifikované verzie uvedených terapeutických proteínov. Tieto analógy alebo chemicky modifikované verzie zmienených terapeutických proteínov sú charakterizované nižšou hodnotou pi a rovnako vykazujú, vzhľadom na nemodifikované proteíny (tzn. proteíny s natívnou sekvenciou), zvýšenú absorpciu a/alebo dlhšie zotrvanie v krvnom obehu. Proteínové analógy podľa vynálezu sú zvyčajne ľudské terapeutické proteíny, ktoré sú zvyčajne, ale ne nezbytne, bázické proteíny..Vo výhodnom rozpracovaní majú tieto proteíny, v porovnaní s nemodifikovanými bázickými proteínmi, za fyziologických podmienok nižší náboj.
A
Vynález opisuje materiály a spôsoby produkcie zmienených analógov rekombinantnými technikami (výhodné spôsoby pre praktické využitie). Vynález rovnako opisuje protilátky proti týmto analógom a farmaceutické prípravky na použitie pri liečbe ochorení alebo patologických stavov, obsahujúce uvedené analógy ako biologicky aktívne látky.
Princípy opísané vo vynáleze môžu byt aplikované na akýkoľvek katiónaktívny proteín, pri ktorom bude mat zníženie hodnoty pi (a v niektorých prípadoch náboja proteínu) za následok posilnenie biologických vlastností dôležitých pre terapeutickú funkciu. Takými vlastnosťami sú napríklad čas zotrvania v krvnom obehu a/alebo absorpcia po parenterálnej aplikácii. Príkladom takých proteínov sú (vyratúvanie nie je limitujúce) bázické proteíny ako napríklad NT-3, BDNF-faktor, rastový a diferenciačný faktor makrofágov, ktorého najrôznejšie známe izoformy vykazujú v podstate rovnakú schopnosť stimulovať in vivo a ex vivo produkciu krvných doštičiek (v tejto prihláške sú izoformy zmieneného faktoru spoločne označované ako MGDF) a rastový faktor keratinocytov (KGF). Detailné opisy týchto faktorov, ich biologických vlastností a spôsobov ich prípravy a testovania sú opísané v patentových prihláškach: NT-3 je opísaný v prihláške PCT WO91/03569; BDNF-faktor v patentových prihláškach US 5180820, 5229500, 5438121 a 5453361 a v publikovanej prihláške PCT WO95/26745; MGDF v publikovaných prihláškach PCT WO95/26745, WO95/21919 a W095/21920; a KGF v publikovanej prihláške PCT W090/08771.
Cielom vynálezu je v podstate vytvoriť jednu alebo viac modifikácií primárnej štruktúry proteínu divokého typu tak, aby bola zachovaná štruktúra a biologická aktivita zmieneného proteínu, ale aby súčasne došlo k zníženiu hodnoty izoelektrického bodu a zníženiu náboja pri fyziologickom pH. Presný spôsob, ktorého prostredníctvom sú tieto modifikácie uskutočňované nie je podstatný, a na dosiahnutie opisovaných vylepšených vlastností môže byt použitý akýkoľvek postup vedúci k hore uvedeným zmenám. Iba ako ilustrácia je uvedený postup, ktorý na dosiahnutie požadovaných modifikácií využíva cielenú mutagenézu zahŕňajúcu pridanie kyslých aminokyselinových zvyškov do danej sekvencie, a to vložením kyslých aminokyselinových zvyškov a/alebo substitúciou iných aminokyselín kyslými aminokyselinovými zvyškami a/alebo odstránením bázických aminokyselín deléciou a/alebo ich nahradením. Inou možnosťou, vedúcou k dosiahnutiu rovnakého cieľa (tzn. zníženia hodnoty pi a náboja pri zachovaní štruktúry a biologickej aktivity), je pridanie chemických skupín alebo častí molekúl na vybrané miesta (tzn. na aminokyselinové zvyšky) v peptidovom reťazci molekuly divokého typu. Špeci8 fickým prípadom je pripojenie kyseliny jantárovej na vybrané aminokyselinové zvyšky v reťazci proteínu.
Nukleové kyseliny kódujúce analógy proteínov podlá vynálezu (tzn. polypeptidy líšiace sa od polypeptidu divokého typu v jednom alebo viacerých aminokyselinových zvyškoch) môžu byť vytvorené pri využití cielenej mutagenézy alebo amplifikáciou metódou PCR, pri ktorej obsahuje prajmer (prajmery) požadovanú bodovú mutáciu. Detailné opisy vhodných postupov mutagenézy sú uvedené v publikáciách Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; alebo Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY, 1994. Na prípravu zmienených nukleových kyselín môžu byť rovnako využité postupy chemickej syntézy opísané v publikácii Engels a další, Angew. Chem. Intl. Ed., zväzok 28, strany 716 až 734, 1989.
Uvedené molekuly DNA môžu byt použité na expresiu analógov polypeptidov podlá vynálezu v rekombinantných systémoch odborníkom dobre známych. Medzi také spôsoby produkcie patria (nie len) spôsoby opísané v hore zmienených patentových prihláškach pre NT-3, BDNF-faktor, KGF a MGDF. Ako ilustrácia môže byt uvedený postup, ked je nukleotidová sekvencia kódujúca dajaký analóg polypeptidu podlá vynálezu vložená do vhodného biologicky funkčného vektoru (napríklad do cirkulárneho plazmidu alebo vírusovej DNA) na expresiu vo vhodnej hostitelskej bunke. Zmienený vektor zahŕňa regulačné sekvencie na expresiu vloženej nukleotidovej sekvencie a je zvolený tak, aby bol funkčný v použitej hostitelskej bunke (tzn. tento vektor je kompatibilný s mašinériou hostitelskej bunky tak, že môže dôjsť k amplifikácii a/alebo expresii daného génu). Zmienený polypeptid môže byt amplifikovaný/exprimovaný v kvasinkách, prokaryotickej, hmyzej (bakulovírusový systém) a/alebo eukaryotickej hostitelskej bunke. Výber hos9 titeľskej bunky bude, aspoň sčasti, závisieť od toho, či má byt exprimovaný polypeptidový produkt glykozylovaný. Keď je glykozylácia žiadúca, sú vo výhodnom rozpracovaní použité kvasinky, hmyzie alebo cicavčie hostiteľské bunky.
Zvyčajne budú dané vektory obsahovať sekvenciu (táto sekvencia je rovnako označovaná ako promótor) priliehajúcu k 5' koncu vloženej sekvencie a ďalšie regulačné elementy, a rovnako posilňovač(-e) transkripcie (enhancery), počiatok replikácie, terminátor transkripcie, kompletnú intrónovú sekvenciu obsahujúcu donorové a akceptorové miesto zostrihu, sekvenciu signálneho peptidu, miesto zodpovedné za väzbu na ribozómy (RBS), polyadenylačný signál, selekčný markér a oblasť polylinkeru slúžiacu na vloženie nukleotidovej sekvencie kódujúcej polypeptid, ktorý má byť exprimovaný.
Sekvencia priliehajúca k 5' koncu vloženého génu môže byť prirodzená sekvencia vyskytujúca sa na 5' konci tohto génu divokého typu alebo to môže byt sekvencia homológna (tzn. z rovnakého druhu a/alebo kmeňa ako hostiteľská bunka), heterológna (tzn. z druhu a/alebo kmeňa odlišného od hostiteľskej bunky), hybridná (tzn. kombinácia sekvencií z viac ako jedného zdroja) alebo synteticky pripravená. Zdrojom sekvencie priliehajúcej k 5' koncu vloženého génu môže byť jednobunkový prokaryotický alebo eukaryotický organizmus, akýkoľvek stavovec alebo bezstavcový alebo akákoľvek rastlina a to za predpokladu, že táto 5' sekvencia je funkčné v hostiteľskej bunke a môže byt v tejto hostiteľskej bunke aktivovaná.
Počiatok replikácie je zvyčajne súčasťou prokaryotických expresívnych vektorov zakúpených komerčne a je nezbytný pre amplifikáciu daného vektoru v hostiteľskej bunke. Amplifikácia vektoru na určitý počet kópií môže byť v niektorých prípadoch dôležitá pre optimálnu expresiu daného polypeptidu. Keď zvolený vektor neobsahuje miesto počiatku replikácie, môže byt tento element syntetizovaný chemicky na základe známej sekvencie a následne zaligovaný do daného vektoru.
Terminátor transkripcie je zvyčajne umiestnený v oblasti prilahlej k 3' koncu sekvencie kódujúcej požadovaný polypeptid a slúži na ukončenie (termináciu) transkripcie tohto polypeptidu. V prokaryotických bunkách je terminátor transkripcie zvyčajne fragment s vysokým obsahom párov C-G nasledovaný sekvenciou poly-T. I keď tento element môže byt lahko naklonovaný z nejakej knižnice alebo komerčne zakúpený ako súčasť vektoru, môže byť rovnako lahko syntetizovaný pri využití postupov na syntézu nukleových kyselín opísaných hore.
Selekčný markér kóduje proteín nezbytný na prežitie a rast hostiteíských buniek kultivovaných v selekčnom kultivačnom médie. Zvyčajne využívané gény selekčných markérov kódujú proteíny, ktoré (a) požičajú nositelovi rezistenciu voči antibiotikám alebo iným toxínom, napríklad voči ampicilínu, tetracyklínu alebo kanamycínu u prokaryotických hostiteíských buniek; (b) komplementujú auxotrofné deficiencie buniek; alebo (c) dodávajú životne dôležité látky, ktoré nie sú dostupné z komplexných médií. Vo výhodných rozpracovaniach sú ako selekčné markéry používané gén na rezistenciu voči kanamycínu, gén na rezistenciu voči ampicilínu a gén na rezistenciu voči tetracyklínu.
Miesto zodpovedné za väzbu na ribozómy, zvyčajne nazývané Shine-Dalgarnova sekvencia (pre prokaryonty) alebo Kozákova sekvencia (pre eukaryonty), je nezbytné na iniciáciu translácie mRNA. Tento element je zvyčajne umiestnený v oblasti priliehajúcej k 3' koncu promótoru a 5' koncu kódujúcej sekvencie polypeptidu, ktorý má byť exprimovaný.
Shine-Dalgarnova sekvencia je rôznorodá, ale zvyčajne má veľké zastúpenie purínových báz (tzn. má vysoký obsah A-G). Dosiaľ bolo identifikované množstvo Shine-Dalgarnových sekvencií a každá z týchto sekvencií môže byt ľahko syntetizovaná pri využití postupov opísaných hore a následne použitá v prokaryotickom vektore.
V prípadoch keď je žiadúce, aby bol daný polypep» tid sekrétovaný z hostiteľskej bunky, môže byt na smerovanie tohto polypeptidu von z hostiteľskej bunky, v ktorej je syntetizovaný, využitá signálna sekvencia. Zvyčajne je signálna sekvencia umiestnená v kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie alebo priamo na 5' konci kódujúcej oblasti. Dosial bolo identifikované množstvo signálnych sekvencií a akákoľvek z týchto sekvencií môže byt využitá (v tejto prihláške) v hostiteľských bunkách za predpokladu, že je v týchto hostiteľských bunkách funkčná. Vzhľadom na daný polypeptid môže byt signálna sekvencia homológna alebo heterológna. Signálna sekvencia môže byt navyše syntetizovaná chemickou cestou pri využití postupov uvedených v predchádzajúcom texte.
Hostiteľskými bunkami môžu byt prokaryotické hostiteľské bunky (ako napríklad E. coli) alebo eukaryotické hostiteľské bunky (ako napríklad kvasinky, hmyzie bunky alebo bunky stavovcov). Keď sú hostiteľské bunky kultivované za vhodných nutričných podmienok, môžu tieto bunky syntetizovať požadovaný polypeptid, ktorý môže byt následne zhromažďovaný z kultivačného média (keď je tento proteín sekrétovaný do média) alebo priamo z produkujúcich hostiteľských buniek (keď nie je sekrétovaný). Následne môže byt tento polypeptid purifikovaný pri využití metód zahŕňajúcich napríklad gélovú chromátografiu, afinitnú chromátografiu a podobne. Všeobecne je možné povedať, že keď je daný polypeptid exprimovaný v E. coli, bude tento proteín po izolácii obsahovať na
N-konci metionínový zvyšok (tzn. Met-1). Výnimkou je situácia, kde je polypeptid exprimovaný v takom kmeni E. coli, v ktorom je N-koncový metionín hostiteľskou bunkou enzymaticky odštiepený.
Vhodnými hostiteľskými bunkami alebo bunkovými líniami sú rovnako cicavčie bunky, ako napríklad bunky ovárií chrčkov (CHO) alebo bunky 3T3. V súčasnosti sú dobre známe spôsoby transformácie, kultivácie, amplifikácie, screeningu (testovania) a produkcie a purifikácie požadovaného produktu, ako tiež výber vhodných cicavčích hostiteľských buniek. Inými vhodnými cicavčími bunkovými líniami sú opičie bunkové línie COS-1 a COS-7 a bunková línia CV-1. Ďalšími príkladmi cicavčích hostiteľských buniek sú bunkové línie odvodené z primátov a bunkové línie z hlodavcov, vrátane transformovaných bunkových línií. Rovnako sú vhodné normálne diploidné bunky, bunky odvodené z primárnych tkanív kultivovaných in vitro a rovnako primárne explantáty. Vhodné bunky môžu byt genotypovo deficientné a táto deficiencia môže byt využitá ako selekčný markér. Ako selekčný markér môže byt rovnako využitý dominantný gén. Medzi dalšie vhodné hostiteľské cicavčie bunky patria (vyratúvanie nie je limitujúce) bunky HeLa, myšie bunky L-929, línie 3T3 odvodené z myší Swiss, Balb-c alebo NIH a bunkové línie BHK alebo HaK chrčkov.
Inzercia (rovnako označovaná termínom transformácia alebo transfekcia) príslušného vektoru do zvolenej hostiteľskej bunky môže byt vykonaná pri využití chloridu vápenatého, elektroporáciou, mikroinjekciou, lipofekciou alebo metódou využívajúcou DEAE-dextrán. Zvolený spôsob inzercie vektoru bude sčasti závisieť od typu použitej hostiteľskej bunky. Zmienené metódy a rovnako iné vhodné metódy transformácie sú odborníkom dobre známe a sú opísané napríklad v publikácii Sambrook a další, Molecular Cloning: A La13 boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.
Hostiteľské bunky nesúce príslušný vektor môžu byt kultivované v štandardných médiách odborníkom dobre známych. Tieto média budú zvyčajne obsahovať všetky nutričné zložky nezbytné pre rast a prežívanie buniek. Vhodnými médiami na kultiváciu buniek E. coli sú napríklad Luria Broth (LB) a/alebo Terrific Broth (TB). Vhodnými médiami na kultiváciu eukaryotických buniek sú RPMI 1640, MEM a DMEM; v závislosti od druhu kultivovanej bunkovej línie môžu byt všetky tieto médiá doplnené sérom a/alebo rastovými faktormi. Vhodným médiom na kultiváciu hmyzích buniek je Graceho médium doplnené (keď je to nezbytné) Yeastolatom, hydrolyzátom laktalbumínu a/alebo fetálnym teľacím sérom.
Obyčajne je ako suplement pridávané do média rovnako dajaké antibiotikum alebo iná zlúčenina použiteľná na selektívny rast transformovaných buniek. Použitie zmienenej zlúčeniny bude závisieť od povahy selekčného markéru prítomného na plazmide, ktorým bola príslušná hostiteľská bunka transformovaná. Keď je napríklad ako selekčný markér použitý gén kódujúci rezistenciu voči kanamycínu, bude takou zlúčeninou pridanou do média práve kanamycín.
Množstvo polypeptidu produkovaného hostiteľskou bunkou môže byt stanovené pomoci štandardných metód v súčasnosti známych. Takými metódami sú napríklad (vyratúvanie nie je limitujúce) analýza metódou Western blot, elektroforéza na SDS-polyakrylamidovom géli, delenie pri využití HPLC, imunoprecipitácia a/alebo stanovenie aktivity ako napríklad DNA-binding gel shift assay (pozn. ide o stanovenie založené na rozdielnych pohyblivostiach samotných molekúl DNA a molekúl DNA s naviazanými proteínmi, kde je toto stano14 venie vykonávané elektroforézou v nedenaturujúcom polyakrylamidovom géli).
Keď je polypeptid navrhnutý tak, aby bol sekrétovaný von z hostiteľskej bunky, bude sa väčšina tohto polypeptidu pravdepodobne nachádzať v kultivačnom médiu. Avšak, keď nie je daný polypeptid sekrétovaný, bude tento prítomný v cytoplazme (pri eukaryotických hostiteľských bunkách, Grampozitívnych baktériách a hmyzích hostiteľských bunkách) alebo v periplazme (pri Gram-negatívnych bakteriálnych hostiteľských bunkách).
Pri produkcii intracelulárnych peptidov sú hostiteľské bunky zvyčajne najskôr rozrušené mechanicky alebo osmotickým šokom, čím je obsah cytoplazmy uvoľnený do tlmeného roztoku. Následne je polypeptid z tohto roztoku izolovaný. Následná purifikácia polypeptidu z roztoku môže byt vykonaná rôznymi spôsobmi. Keď bol polypeptid syntetizovaný tak, že má na svojom C-konci alebo N-konci umiestnenú dajakú kotvu, ako napríklad hexahistidín alebo iný malý polypeptid, môže byt tento purifikovaný v jednom kroku. Táto jednokroková purifikácia sa vykonáva tak, že je roztok obsahujúci zmienený polypeptid nanesený na afinitnú kolónu naplnenú nosičom, ktorý má vysokú afinitu voči použitej kotve alebo priamo voči polypeptidu (tzn. monoklonálna protilátka). Polyhistidín sa napríklad špecificky s veľkou afinitou viaže na nikel a na purifikáciu môže byt teda využitá afinitná kolóna s iónmi niklu (ako napríklad afinitné kolóny s naviazanými iónmi niklu od firmy Qiagen); pozri napríklad Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY, 1994.
Na druhej strane, keď k danému polypeptidu nie je pripojená žiadna kotva a rovnako nie sú dostupné žiadne protilátky, môžu byť pri purifikácii využité iné dobre známe postupy. Medzi také postupy patrí (vyratúvanie nie je limitujúce) chromatografia na iónomeničoch, gélová chromatografia, HPLC, gélová elektroforéza proteínov v natívnom stave v kombinácii s následnou elúciou z gélu a preparatívna izoelektrická fokusácia (prístroj/metóda Isopŕime, Hoefer Scientific). V niektorých prípadoch môžu byť za účelom dosiahnutia vyššej čistoty použité dve alebo viac z hore uvedených purifikačných techník.
Keď sa predpokladá, že daný polypeptid sa bude primárne nachádzať v periplazmatickom priestore baktérií alebo cytoplazme eukaryotických buniek, môže byt obsah periplazmy alebo cytoplazmy, vrátane inkluzných teliesok (napríklad pri Gram-negatívnych baktériách, keď vytvára zmienený polypeptid také komplexy) hostiteíských buniek extrahovaný pri využití akéhokoľvek štandardného postupu odborníkom známeho. Hostiteľské bunky môžu byť napríklad lyzované (aby došlo k uvoľneniu obsahu periplazmy) pri využití French prešu, homogenizáciou a/alebo sonikáciou. Získaný homogenát je následne centrifugovaný.
Okrem prípravy polypeptidových analógov podľa vynálezu rekombinantnými technikami môžu byt tieto polypeptidy pripravené pri využití metód chemickej syntézy v súčasnosti známych (ako napríklad syntéza peptidov na pevnej fáze), vrátane postupov opísaných v publikáciách Merrifield a ďalší, J. Am. Chem. Soc., zväzok 85, strana 2149, 1964; Houghten a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zväzok 82, strana 5132, 1985; a stewart a Young v Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984. Aby došlo k vytvoreniu disulfidických mostíkov, môžu byť polypeptidy pripravené chemickou syntézou oxidované pri využití postupov opísaných v hore uvedených publikáciách.
Hodnoty pi a náboj proteínových analógov pripravených akoukoľvek z hore uvedených metód môžu byt merané pomocou štandardných techník ako napríklad pomocou techník opísaných v ďalšom texte v spojení s príkladmi rozpracovania vynálezu.
Do rozsahu vynálezu rovnako spadajú polypeptidy chemicky modifikované (tzn. deriváty) tak, že zmienený polypeptid je pripojený k dajakému polyméru, čím dôjde k ovplyvneniu vlastností tohto polypeptidu. Použitý polymér je zvyčajne rozpustný vo vode, aby proteín, ku ktorému je tento polymér pripojený, neprecipitoval vo vodnom prostredí, ako napríklad vo fyziologickom prostredí. Aby mohol byt riadený stupeň polymerizácie, môže mat zmienený polymér jednu reaktívnu skupinu, ako napríklad aktívny ester (pre acylačnú reakciu) alebo aldehyd (pre alkyláciu). Výhodne používaným reaktívnym aldehydom je polyetylénglykolpropiónaldehyd, ktorý je stabilný vo vodnom prostredí, alebo jeho mono Cj až C1Q alkyloxy- alebo aryloxy-deriváty (pozri patentovú prihlášku US 5252714). Zmienený polymér môže byt rozvetvený alebo nerozvetvený. Vo výhodnom rozpracovaní bude, kvôli terapeutickému využitiu pripraveného koncového produktu, zmienený polymér farmaceutický prijateľný. Polymér rozpustný vo vode alebo, keď je to žiadúce, zmes takých polymérov, môže byt vybraný zo skupiny zahŕňajúcej napríklad polyetylénglykol (PEG), monometoxypolyetylénglykol, dextrán, celulózu alebo iné polyméry na báze cukrov, poly(N-vinylpyrolidón)polyetylénglykol, homopolyméry propylénglykolu, kopolymér polypropylénoxid/etylénoxid, polyoxyetylované polyoly (napríklad glycerol) a polyvinylalkohol.
Všeobecne je možné povedať, že polypeptidové analógy podľa vynálezu budú použiteľné na rovnaké účely ako proteíny divokého typu, z ktorých sú tieto analógy odvodené. Pri NT-3 napríklad prebieha klinická štúdia mapujúca jeho využiteľnosť pri liečbe neuropatií periférnych nervov (vrátane diabetickej neuropatie) a pri BDNF-faktore je uskutočňovaná klinická štúdia posudzujúca možnosti liečby amyotrofickej laterálnej sklerózy (ALS). 0 KGF-faktoru je známe, že je aktívny pri raste tkanív a obnove poškodených tkanív, a v súčasnosti prebieha v klinickej praxe snaha vyvinúť spôsob využitia zmieneného faktoru pri liečbe zápalov sliznice navodených chemoterapiou alebo pôsobením ionizujúceho žiarenia. Pri MGDF (vo forme s naviazaným polyetylénglykolom) prebiehajú klinické štúdie týkajúce sa stimulácie tvorby krvných doštičiek pri trombocytopénii (nedostatku krvných doštičiek) vyvolané pôsobením chemoterapeutických látok. Predpokladá sa však, že analógy podľa vynálezu budú, vzhľadom na nemodifikované formy, výhodnejšie, a to v dôsledku ich dlhšieho terapeutického polčasu života a vyššej absorpcie.
Na terapeutické účely budú analógy podľa vynálezu formulované do formy vhodných farmaceutických prípravkov upravených na terapeutickú aplikáciu. Táto skutočnosť rovnako spadá do rozsahu vynálezu. Zmienené farmaceutické prípravky budú zvyčajne obsahovať terapeuticky účinné množstvo polypeptidového analóga a to bučí samostatne alebo spolu s jednou alebo viacerými pomocnými látkami, nosičmi alebo inými prídavkami používanými štandardne pri formulácii farmaceutických prípravkov. Ako vehikulum (nosič) môže byt použitá voda pre injekcie, ktorá je vo výhodnom rozpracovaní doplnená inými látkami zvyčajne používanými pri aplikácii do organizmu cicavcov. Analóg polypeptidu bude zvyčajne podávaný vo forme prípravku obsahujúceho purifikovanú formu zmieneného polypeptidu (ktorá môže byt chemicky modifikovaná) spolu s jedným alebo viacerými fyziologicky prijateľnými vehikulami, pomocnými látkami alebo rozpúšťadlami. Príkladom vhodných vehikul sú fyziologický roztok s neutrálnym pH alebo fyziologický roztok so sérovým albumínom. Ked je to žiadúce, môžu byť použité iné štandardné vehikulá, pomocné látky alebo rozpúšťadlá.
Farmaceutické prípravky podlá vynálezu môžu byt pripravené na uskladnenie zmiešaním vybranej látky (zmesi látok) s požadovaným stupňom čistoty s fyziologicky prijateľnými vehikulami, pomocnými látkami alebo stabilizátormi (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, Mack Publishing Company, editor A. R. Gennaro, 1990) vo forme lyofilizátu alebo vodného roztoku. Vhodné vehikulá, pomocné látky a stabilizátory sú pre organizmus príjemca netoxické a vo výhodnom rozpracovaní sú v použitých dávkach a koncentráciách inertné a zahŕňajú: tlmivé roztoky ako napríklad soli fosforečnanu, citrátu, acetátu, sukcinátu a iných organických kyselín; antioxidanty ako napríklad kyselinu askorbovú; polypeptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou; proteíny ako napríklad sérový albumín, želatínu alebo imunoglobulíny; hydrofilné polyméry ako napríklad polyvinylpyrolidón; aminokyseliny ako napríklad glycín, glutamín, asparagín, arginín a lyzín; monosacharidy, disacharidy a iné karbohydráty vrátane glukózy, manózy alebo dextrínov; alkoholické cukry ako napríklad manitol alebo sorbitol; opačne nabité ióny tvoriace soli ako napríklad ióny sodné; a/alebo neionogénne povrchovo aktívne látky ako napríklad Tween, Pluronic alebo polyetylénglykol (PEG).
Akýkoľvek prípravok podlá vynálezu na aplikáciu in vivo musí byt sterilný. Sterilizácia je lahko vykonávaná filtráciou cez sterilné filtračné membrány. Keď je prípravok lyofilizovaný, je sterilizácia vykonávaná hore uvedenými postupmi uskutočňovaná pred alebo až po lyofilizácii a rekonštitúcii. Prípravok na parenterálnu aplikáciu bude zvyčajne uskladnený v lyofilizovanej forme alebo vo forme roztoku.
Množstvo polypeptidu, ktoré bude účinné pri liečbe daného ochorenia alebo patologického stavu, bude závisieť od chemickej podstaty tohto polypeptidu a rovnako od veku a celkového zdravotného stavu príjemca. Toto množstvo môže byt stanovené štandardnými klinickými metódami. Ked je to možné, bude, pred vlastným testovaním na ľuďoch, žiadúce stanoviť krivku odpovedi na podanú dávku farmaceutického prípravku najskôr in vitro a následne na vhodnom živočíšnom modele in vivo. Všeobecne je možné povedať, že vhodné množstvá používané in vivo môžu byt odvodené zo známych terapeuticky účinných dávok proteínov divokého typu, z ktorých sú príslušné analógy odvodené. Skúsený lekár bude schopný, ked zoberie do úvahy kontext liečby, druh liečeného ochorenia apod., stanoviť vhodné dávkovanie bez vynaloženia neprimeraného úsilia.
Spôsoby aplikácie prípravku zahŕňajú aplikáciu intradermálnu, intramuskulárnu, intraperitoneálnu, intravenóznu a subkutánnu. Do rozsahu vynálezu navyše spadajú polypeptidové analógy aplikované prostredníctvom lipozómov, mikročastíc alebo mikrotoboliek; tento druh aplikácie je osobitne výhodný na dosiahnutie predĺženého uvoľňovania.
V prípadoch použitia niektorých polypeptidových analógov ako napríklad analógov NT-3, BDNF-faktoru a iných neurotrofických faktorov určených na liečbu neurologických stavov spojených s mozgom alebo inými oblasťami centrálneho nervového systému, môže byt nezbytné použitie špeciálnych aplikačných zariadení. Medzi také zariadenia napríklad patria implantáty a osmotické pumpy na intratekálne a intrakraniálne podávanie.
Analógy podľa vynálezu môžu byt využité pri štandardných postupoch slúžiacich na produkciu protilátok použiteľných na lekárske účely ako napríklad sledovanie hladiny zodpovedajúceho analóga v krvi pacienta podstupujúceho liečbu. Na produkciu polyklonálnych protilátok rozpoznávajúcich epitopy daných polypeptidov môžu byt využité najrôznejšie postupy v súčasnosti známe. Za účelom produkcie protilátky môžu byt imunizovaní (injekciou polypeptidového analóga alebo jeho fragmentu alebo derivátu) rôzni živočíšni hostitelia vrátane (nie len) králikov, myší, potkanov apod.
V závislosti od druhu hostitela môžu byt, za účelom zvýšenia imunologickej reakcie hostitela, použité najrôznejšie adjuvansy vrátane (nie len) Freundovho adjuvansu, minerálnych gélov ako napríklad hydroxidu hlinitého (alum), povrchovo aktívnych látok ako napríklad lyzolecitínu, polyolov Pluronic, polyaniónov, peptidov, emulzií olejov, hemokyanínov z druhu Megathura crenulata, dinitrofenolu a adjuvansov používaných v humánnej medicíne ako napríklad CalmettehoGuerinova bacilu a Corynebacteriuir parvum.
Na prípravu monoklonálnych protilátok namierených proti polypeptidovým analógom môžu byt použité akékolvek postupy vedúce k molekulám protilátok produkovaných kontinuálnymi bunkovými líniami v bunkových kultúrach. Vhodnými postupmi produkcie monoklonálnych protilátok sú napríklad príprava hybridomov pôvodne vyvinutá Kohlerom a Milsteinom a opísaná v článku v Náture, zväzok 256, strany 495 až 497, 1975; príprava triomov, príprava hybridomov ludských B-buniek opísaná v publikácii Rozbor a další, Immunology Today, zväzok 4, strana 72, 1983; príprava EBV-hybridomov produkujúcich monoklonálne protilátky opísaná v publikácii Cóle a čfalší, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., strany 77 až 96, 1985.
Kloň protilátky namierenej proti epitopu alebo epitopom daného polypeptidu môže byt pripravený pri využití známych postupov. Na vytvorenie nukleotidových sekvencií kódujúcich molekulu monoklonálnej protilátky alebo jej oblasti viazajúcej antigén je osobitne výhodné využitie rekombinantných techník; pozri napríklad Maniatis a ďalší, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982.
Protilátky sú užitočné pre diagnózu vykonávanú ak in vivo tak in vitro, osobitne potom keď sú tieto protilátky značené a používané na detekciu prítomnosti daných polypeptidov vo vzorkách tekutín a tkanív.
Príklady rozpracovania vynálezu
Vynález je ďalej detailne opísaný s odkazom na nasledujúci materiál, metódy, postupy a výsledky experimentov. Aminokyselinové zvyšky proteínov sú v texte označované obvyklým spôsobom pri použití tro j písmenových skratiek (napríklad met zastupuje metionín, val valín apod.) alebo v niektorých prípadoch pri použití zavedených jednopísmenových skratiek (napríklad M zastupuje metionín, R arginín apod.).
Materiál a metódy
Príprava analógov NT-3
Substituované aminokyselinové zvyšky z natívnej sekvencie ludského NT-3 boli vybrané s cielom zachovať základnú štruktúru a biologickú/terapeutickú aktivitu (pozri Holland a ďalší, J. Mol. Biol., zväzok 239, strany 385 až 400, 1994; Ibanez a ďalší, Celí, zväzok 69, strany 329 až 341, 1992; Ibanez a ďalší, EMBO Journal, zväzok 12, strany 2281 až 2293, 1993). Skutočne vykonané substitúcie v natívnej sekvencii ludského NT-3 sú znázornené na obrázkoch 2 a 3. Pri analógu znázorneného na obrázku 2 boli vykonané nasledujúce dve substitúcie: arginín v polohe 61 (arg61) bol nahradený alanínom (ala) a lyzín v pozícii 64 (lys64) bol nahradený kyselinou asparágovou. Tento analóg bol označený NT-3(i_il9)R61A,K64D. Pri druhom analógu znázornenom na obrázku 3 boli vykonané rovnaké substitúcie aminokyselín ako pri analógu prvom a navyše bol polypeptidový reťazec ukončený za aminokyselinovým zvyškom 117 (preto došlo k odstráneniu aminokyselín argllg a thrlig). Tento analóg bol označený NT-3(1_117)R61A,K64D. Za účelom vytvorenia zmienených analógov boli do sekvencie íudského NT-3 zavedené pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) zodpovedajúce mutácie. Pri analógu NT-3(1-119)R61A,K64D boli použité páry chemicky syntetizovaných oligonukleotidov a s ich využitím boli vytvorené fragmenty génu NT-3 zahŕňajúce (1) počiatočnú oblasť až do miesta mutáciou v kodónoch zodpovedajúcich pozíciám aminokyselín 61 a 64 a (2) koncovú oblasť zmieneného génu od miesta mutáciou až do konca sekvencie. Na vytvorenie celej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej obidve mutácie v pozíciách 61 a 64 bola vykonaná druhá reakcia PCR, ktorá zlúčila počiatočnú a koncovú oblasť pripravené skôr. Pri analógu NT-3()R61A,K64D bol zopakovaný hore uvedený postup s výnimkou toho, že z koncovej oblasti boli vypustené kodóny pre arginín a treonín v pozíciách 118 a 119.
Expresia v E. coli
Z účelom expresie zmienených analógov v E. coli bola na 5' koniec DNA molekúl pripravených postupom opísaným hore zavedená sekvencia kódujúca metionín a na 3' koniec potom stop kodón. Navyše bola vo vhodnej vzdialenosti proti smeru transkripcie od miesta štartovného metionínu umiestnená sekvencia zodpovedná za väzbu na ribozóm a na 5' a 3 ' konce génu boli zavedené miesta rozpoznávané reštrikčnými enzýmami Xbal (5' koniec) a HindlII (3' koniec). Vzniknuté synteticky pripravené fragmenty génov boli na 5' konci ohraničené reštrikčným miestom Xbal a na 3' konci reštrikčným miestom HindlII, obsahovali miesto zodpovedné za väzbu na ribozómy, štartovný kodón ATG (kódujúci metionín), sekvenciu kódujúcu príslušný analóg a stop kodón. Fragmenty boli štiepené reštrikčnými endonukleázami Ndel a BamHI a zaligované do vektoru pAMG12.
Expresný plazmid pAMG12 môže byt odvodený z plazmidu pCFM1656 (prístupové číslo ATCC 69576, uložený 24. februára 1994) vykonaním množstva miestne špecifických zámen báz uskutočnených substitúciou sekvencie DNA a mutagenézou metódou PCR pri využití prekrývajúcich sa oligonukleotidov. Od reštrikčného miesta BglII (pár báz č. 180), nachádzajúceho sa na 5' konci počiatku replikácie PcopB plazmidu pCFM1656, boli, v smere k replikačným génom plazmidu, vykonané nasledujúce zámeny párov báz (bp):
pár báz číslo pár báz pár báz zamenený za (v pAMG12) V pCFM1656 (v pAMG12)
204 T/A C/G
428 A/T G/C
509 G/C A/T
617 inzercia dvoch párov báz G/C
679 G/C T/A
980 T/A C/G
994 G/C A/T
1004 A/T C/G
1007 C/G T/A
1028 A/T T/A
1047 C/G T/A
1178 G/C T/A
1466 G/C T/A
2028 G/C delécia páru báz
pár báz číslo (v pAMG12) pár báz v pCFM1656 pár báz zamenený za (v pAMG12)
2187 C/G T/A
2480 A/T T/A
2499 - 2502 AGTG GTCA
TCAC CAGT
2642 TCCGAGC AGGCTCG delécia párov báz
3435 G/C A/T
3446 G/C A/T
3643 A/T T/A
Navyše sekvencie DNA nachádzajúce sa medzi jedinečnými reštrikčnými miestami AatlI (pozícia 4364 v plazmide pCFM1656) a SacII (pozícia 4585 v plazmide pCFM1656) bola nahradená nasledujúcou sekvenciu DNA:
[kohézny koniec AatlI]
5' CGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3 1 GCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT- T AAAACG AAAGGCTC AGTCG AAAG ACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG -ATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-ACGCTCTCCTGAGTAGGACAÁATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG- TGCG AG AGG ACTC ATCCTGTTT AGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGC AACGCTTCGTTGCC - CCGGAGGGTGGCGGGCAGG ACGCCCGCCATAAACTGCCAGGC ATC AAATTAAGC AGAAG-GGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-CCATCCTGACGGÄTGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTA• AatlI
-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC-TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAÄAAATTTTTTAAC-TAAACTGTTTACGATTTTAAG-TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACÄATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGAGT-AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA-TTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGT-AAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTÄTACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCA25
SacII
-GTCGACCTGCAGGGTACCATGGÁAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAG-CAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTC-AAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA-TTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATT-CCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTT-GGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAA-CACGCTCTTCACGC 3 ' -GTGCGAGAAGTG 51 [kohézny koniec SacII]
Produktom ligačnej reakcie boli transformované kompetentné bunky E. coli kmeňa FM15. Pri narastených kolóniách bola testovaná produkcia rekombinantného proteínu a pri kolóniách produkujúcich proteín so správnou veľkosťou bola stanovená sekvencia DNA vloženého génu. Kmeň nesúci správny gén bol zaočkovaný do kultivačného média Luria Broth (10 g/1 Trypticase-Pepton, 10 g/1 kvasničný autolyzát, 5 g/1 chlorid sodný) a kultivácia prebiehala 16 hodín pri 37’C za stáleho miešania s intenzitou 250 otáčok za minútu. Takto získaná kultúra bola prenesená do sterilného média (sterilizované priamo vo fermentore) a za stáleho prísunu glukózy a organického dusíku boli bunky namnožené a následne indukované prostredníctvom laktózy. Po indukcii bola fermentácia zastavená, bunky boli centrifugované, supernatant po centrifugácii odstránený a zvyšná bunková pasta zmrazená.
Purifikácia proteínu
Bunky z bunkovej pasty boli rozbité homogenizáciou pri vysokom tlaku a inklúzne telieska boli izolované centrifugáciou. Takto získané inklúzne telieska boli rozpustené v roztoku guanidín-HCl a následne zriedené do roztoku močoviny. Po niekoľkodennom státí bolo pH roztoku upravené na hodnotu 3, roztok bol zriedený vodou, centrifugovaný a purifikovaný, najskôr chromátografiou na katexovej kolóne a potom chromátografiou na hydrofóbnej kolóne. Frakcie obsahujúce požadovaný proteín boli spojené a sterilizované filtráciou.
Izoelektrický bod a náboj proteínu
Hodnoty izoelektrických bodov ludského NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3, SEK. ID. Č: 1) a jeho analógov (tzn. SEK. ID. Č: 3 a SEK. ID. Č: 5) boli spočítané pri využití softwarového balíku pre sekvenčnú analýzu proteínov/ DNA označovaného CGC od spoločnosti Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin. Náboj zmienených molekúl pri fyziologickom pH (predpokladá sa hodnota pH 7,4) bol odhadnutý pri využití rovnakého programového balíka. Hodnota pi prvého analóga (NT-3()R61A,K64D, SEK. ID. Č: 3) bola spočítaná na hodnotu o približne 0,9 jednotiek pH nižšie ako je to pri NT-3 divokého typu (8,5 v porovnaní s 9,4). Náboj pre tento analóg pri fyziologickom pH (7,4) bol znížený o približne 2,5 jednotky pH vzhladom na NT-3 divokého typu (tzn. približne z hodnoty +7 na hodnotu +4,5). Vypočítaná hodnota pi druhého analóga (NT-3(1-117)R61A,K64D, SEK. ID.
Č: 5) bola 8,2, čo bolo o približne 1,2 jednotiek pH menej ako je hodnota pi NT-3 divokého typu (9,4). Náboj pre tento (druhý) analóg pri fyziologickom pH (7,4) bol znížený o približne 3,5 jednotky pH (na hodnotu približne +3,5) vzhladom na hodnotu pre NT-3 divokého typu (+7).
Stanovenie metódou ELISA
Stanovenie metódou ELISA bolo vykonávané na 96 jamkových doštičkách pokrytých monoklonálnou protilátkou proti ludskému NT-3. Ako sekundárna protilátka bola použitá králičia polyklonálna protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou. Pred vlastným stanovením boli vzorky séra, kalibračné štandardy a vzorky na overenie kvality zriedené fosfátovým tlmivým roztokom a pred stanovením obsahovali približne 50 % séra. Objem použitých vzoriek bol 100 mikrolitrov (μΐ) na jednu jamku. Každá vzorka bola analyzovaná v dvoch paralelných stanoveniach. Medzné limity pre kvantifikáciu boli 0,65 ng/ml (NT-3 divokého typu), 4,00 ng/ml (NT-3(1_11g)R61A,K64D) a 4,05 ng/ml (NT-3(!_117)R61A,K64D).
Gélová chromátografia (SEC-HPLC)
Gélová chromátografia každej vzorky bola vykonaná pri využití systému Waters 600 spolu s kolónou G2000SWXL (TosoHaas). Vzorky boli eluované pri prietoku 0,7 mililitrov za minútu (ml/min) tlmivým roztokom so zložením 100 mM fosforečnan sodný, 0,5 M NaCl, pH 6,09. Piky boli detekované pri vlnovej dĺžke 230 nanometrov (nm).
Chromátografia na katexe (CEX-HPLC)
Chromatografia na katexe bola vykonaná pri využití systému Waters 625 spolu s kolónou Resource S (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Vzorky boli eluované pri prietoku 1 mililiter za minútu gradientom chloridu sodného od 0 do 1 M v tlmivom roztoku obsahujúcom 20 mM Tris-HCl, pH 8,5. Piky boli detekované pri vlnovej dĺžke 220 nanometrov (nm).
SDS-PAGE farbená striebrom
Proteíny boli zriedené roztokom 2% SDS, zmiešané s vzorkovým tlmivým roztokom a počas piatich minút zahrievané vo vriacej vode. Vlastné elektroforetické delenie bolo vykonávané postupom odporúčaným výrobcom pri použití prefabrikovaných gradientových gélov TRIS-Tricin, 10 až 20%, zakúpených od spoločnosti ISS (Integrated Separation Systems,
Natick, MA). Farbenie striebrom bolo vykonané postupom opísaným v publikácii Blum a ďalší, Electrophoresis, zväzok 8, strany 93 až 99, 1987.
Biologické stanovenie mitogénnej aktivity pri využití buniek 3T3trkC
Biologická aktivita r-metHuNT-3 ako referenčného štandardu je stanovovaná prostredníctvom biostanovenia mitogénnej aktivity pri využití buniek 3T3trkC. Tieto bunky sú získané transfekciou buniek 3T3 (ATCC), ktoré normálne na svojom povrchu neexprimujú receptor trkC, plazmidom pcDNAl/ neo (Invitrogen, San Diego, CA) modifikovaným tak, že obsahuje sekvenciu kódujúcu ludský receptorový proteín trkC. Sekvencia génu trkC je opísaná v publikácii Shelton a ďalší, Journal of Neuroscience, zväzok 15, strany 477 až 491, 1995; a príklad uskutočnenia transfekcie je opísaný v publikácii Valenzuela a ďalší, Neurón, zväzok 10, strany 963 až 974,
1993. Transfekované bunky sú kultivované pri teplote 37±2°C v inkubátore s vysokou vlhkosťou v atmosfére obsahujúcej 5,5±l,0 % CO2 v Dulbeccovom minimálnom médie doplnenom fetálnym bovinným sérom a G-418 so síranovým aniónom. Pri každom stanovení boli bunky rozdelené na 96 jamkové doštičky. Po približne 24 hodinovej inkubácii za rovnakých podmienok bolo kultivačné médium nahradené médiom RPMI 1640 a k bunkám boli pridané testované vzorky. V médie RPMI 1640 boli v rôznych koncentráciách pripravené štandardné a testované vzorky r-metHuNT-3 a získaná zmes bola pridaná do príslušných jamiek Doštičky pre tkanivové kultúry boli umiestnené späť do inkubátoru a približne po 24 hodinách bol počet živých buniek stanovený farbením soíou 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3karboxymetoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)2H tetrazolu, zlúčeninou tetrazolu (MTS). Následne boli doštičky pre tkanivové kultúry umiestnené späť do inkubátoru a po uplynutí približne 5 hodín bola v každej jamke meraná optická hustota pri víno29 vej dĺžke 490 nm. Bola vytvorená štandardná krivka závislosti optickej hustoty od dávky pridaného polypeptidu a lineárny úsek tejto štandardnej krivky bol podrobený lineárnej regresnej analýze. Potom boli stanovené koncentrácie testovaných vzoriek pri riedeniach, ktorých nameraná optická hustota spadá do lineárneho úseku štandardnej krivky.
Biologické testovanie in vivo
Vplyv aminokyselinových zámen na biologické vlastnosti molekúl bol stanovovaný in vivo na samcoch potkanov Sprague Dawley v krížovom experimente. Presnejšie povedané, deväť pokusných zvierat bolo rozdelených do troch skupín po troch a každému potkanovi zo skupiny bola aplikovaná dávka 1 miligram na kilogram telesnej hmotnosti (mg/kg) buď polypeptidu NT-3 divokého typu (3 potkania), NT-3(1-119)R61A,K64D (iní 3 potkania) alebo NT-3()R61A,K64D (zvyšní 3 potkania). Testovaný materiál bol aplikovaný buď (1) intravenózne (IV) ako prvá dávka a následne subkutánne (SC) 24 hodín po prvej dávke; alebo (2) v obrátenom poradí. Vzorky krvi boli odoberané pred podaním a v časoch 1, 5, 15 a 30 minút a 1, 2, 4 a 8 hodín po intravenóznej aplikácii. Koncentrácia NT-3 v krvnom sére boli stanovované metódou ELISA (pozri hore). Protilátky použité pri stanoveniach slúžili na kvantifikáciu NT-3 divokého typu. Hoci neboli podmienky experimentu celkom optimalizované, vykazovali zmienené protilátky dostatočnú krížovú reaktivitu s NT-3()R61A,K64D a NT-3()R61A,K64D, čím bola umožnená rovnako kvantifikácia týchto analógov. Pre jednotlivé proteíny boli vytvorené štandardné krivky (pozri obrázok 4).
Výsledky testov
Charakterizácia analógov polypeptidu NT-3
Pri biostanovení vykonávanom in vitro na bunkách PC-12 bolo pozorované, že si obidva analógy (ako s NT-3(1_ )R61A,K64D tak NT-3(1-117)R61A,K64D) zachovávajú aktivitu proteínu NT-3 divokého typu (r-metHuNT-3) (tabulka 1). V skutočnosti sa zdá, že biologická aktivita zmienených analógov (ako bola nameraná pri tomto stanovení) je trocha vyššia ako aktivita NT-3 divokého typu, čo snáď naznačuje ich zvýšenú afinitu voči receptoru trkC (receptor pre NT-3).
Tabulka 1
Biologická aktivita proteínov NT-3 stanovovaná in vitro
Analóg NT-3 Aplikovaná koncentrácia (mg/ml) Nameraná koncentrácie (mg/ml) Očakávaná aktivita (v percentách)
NT-3 divokého typu 0,32 0,23 72
NT-3(1_117)- R61A,K64D 0,36 1,18 328
NT-3(l-líg) R61A,K64D 0,25 1,31 524
Obidva analógy boli pri gélovej vylučovacej chromatografii v realizácii HPLC eluované ako nekovalentne spojené diméry, rovnako ako NT-3 divokého typu (pozri obrázok
5). Ako sa predpokladalo, v molekulových hmotnostiach jednotlivých proteínov nebol pozorovaný žiadny podstatný rozdiel. Pri žiadnom z analógov nebola detekovaná významná agregácia molekúl proteínov. Výsledky HPLC na kolóne katexu (pozri obrázok 6) boli v súlade so zníženou hodnotou pi obidvoch analógov. Nepatrný posun pri SDS-PAGE (pozri obrázok 7) je patrne dôsledkom zmeny v náboji analógov vzhíadom na NT-3 divokého typu. Obidva analógy si zachovávajú biologickú aktivitu a štruktúru nekovalentne spojených dimérov polypeptidu NT-3 divokého typu.
Farmakokinetické správanie
Bolo pozorované, že krivky sérovej koncentrácie po intravenóznej aplikácii sú dvojfázové (pozri obrázok 8). Medzi jednotlivými typmi NT-3 boli podstatné rozdiely v počiatočnej distribučnej fáze. Polčasy boli 3,3 minúty pre NT-3 divokého typu, 5,4 minút pre NT-3(1_lig)R61A,K64D a 7,6 minút pre NT-3(1-117)R61A,K64D (pozri tabu! ku 2). Pozorované zníženie clearence po intravenóznej aplikácii môže byť zapríčinené tolko pomalejšou distribúciou analógov NT-3. Najvýraznejšie zníženie koncentrácie v priebehu tejto fázy bolo pozorované pri NT-3 divokého typu. Pol časy koncovej fázy b°li podobné pre všetky tr zmienené typy a pohybovali sa v rozmedzí 0,9 až 1,0 hodina čo naznačuje, že mechanizmus odstraňovania môže byt pre všetky zmienené typy totožný. Plochy pod krivkami znázorňujúcimi časovú závislosť koncentrácií (t-AUC infj boli pre analógy NT-3(1_117)R61A,K64D a NT-3(1_lig)R61A,K64D približne 1,2 až 2-krát väčšie ako to bolo pri NT-3 divokého typu.
Tabuľka 2
Farmakokinetické parametre získané u potkanov, ktorým bola intravenózne aplikovaná jedna dávka proteínov NT-3 v koncentráciách 1 mg/kg.
Typ NT-3 t-AUC(inf)1 (ng-hod/ml) CL2 (ml/kg-hod) aTl/23 (min) ľTl/24 (hodín)
NT-3 divokého typu 724,11151,0 1411,7±294,4 3,3±0,3 1,010,6
ΝΤ-3(ΐ_119)- R61A,K64D 880,71320,3 1276,21581,8 5,411,9 0,910,6
NT-3(i_ii7)~ R61A,K64D 1420,71117,9 706,3158,7 7,610,0 1,010,0
1 Plocha pod krivkou časovej závislosti sérovej koncentrácie v časoch nula až nekonečno. Plocha je vypočítaná lichobežníkovou metódou.
2 Rýchlosť clearence vypočítaná ako: dávka : AUC 3 Polčas distribučnej fázy (aTi/2) 4 Polčas koncovej fázy (βΤ·^)
Po subkutánnej injekcii NT-3 divokého typu došlo k rýchlemu zvýšeniu sérovej koncentrácie tohto peptidu (pozri obrázok 9). Maximálna koncentrácia bolo dosiahnutá v čase (T) približne 0,17 hodín (pozri tabuľku 3). Pri modifikovaných polypeptidoch bol pozorovaný pozvolnejší profil absorpcie. Presnejšie povedané, hodnoty T^, boli 0,67 hodín pre NT-3(1-119)R61A,K64D a 1,33 hodín pre NT-3(1_117)R61A,K64D. Maximálne pozorované sérové koncentrácie poly33 peptidov NT-3 ( )R61A,K64D a NT-3 ()R61A, K64D boli v porovnaní s NT-3 divokého typu 6 až 10 násobne vyššie, čo naznačuje, že zmienené analógy vykazujú vyšší stupeň absorpcie z miesta injekčnej aplikácie. Stupeň alebo rozsah absorpcie (biologická dostupnosť) je zvyčajne stanovovaný z pomeru plôch pod krivkami časových závislostí sérových koncentrácií na subkutánnu a intravenóznu aplikáciu (tabuľka 3). Biologické dostupnosti boli 2,2 % pre NT-3 divokého typu, 28,2 % pre NT-3()R61A,K64D a 43,22 % pre NT-3()R61A, K64D. Polčasy koncových fáz pre zmienené analógy sa javili dlhšie v porovnaní s polypeptidom divokého typu.
Tabuľka 3
Farmakokinetické parametre získané pri potkanoch, ktorým bola subkutánne aplikovaná jedna dávka proteínov NT-3 v koncentráciách 1 mg/kg.
Typ NT-3 t-AUC (inf)‘ (ng-hod/ml) L p2 (%) c 3 lmax (ng/ml) T 4 iMAX (hod) ?Tl/25 (hod)
NT-3 divo- 15,2+9,5 2,2+1,3 17,8+11,6 0,2+0,0 0,4+0,0
kého typu
NT-3(i„h9)- 241,3+74,8 28,5+6,3 106,5+47,1 . 0,7+0,3 1,4+0,6
R61A,K64D
NT-3<1-117>- 632,9+38,0 43,2+2,0 180,1+51,2 1,3+0,6 1,4+0,8
R61A,K64D 1Plocha pod krivkou časovej závislosti sérovej koncentrácie v časoch nula až nekonečno. Plocha je vypočítaná lichobežníkovou metódou.
2Biologická dostupnosť (F) je vypočítaná ako: (t-AUCsc/ t-AUCIV) x 100 %, kde boli obidve plochy získané z rovnakého živočícha.
3cMAX je maximálna koncentrácia 4Tmax je polčas na dosiahnutie maximálnej koncentrácie 5Polčas koncovej fázy (βΤ1/2)
Výsledky z týchto experimentov ukazujú, že znížením hodnoty pi polypeptidu NT-3 môže byt dosiahnuté zníženie rýchlosti clearence po intravenóznej aplikácii (aspoň na počiatku) a rovnako môže byt dosiahnuté zvýšenie absorpcie po subkutánnom podaní. Získané výsledky rovnako ukazujú, že náboj daného proteínu hrá dôležitú úlohu pri stanovovaní farmakokinetických vlastností. V prípade bázických proteínov ako napríklad NT-3 a rovnako iných katiónaktívnych proteínov môže mat zníženie izoelektrického bodu (alebo náboja pri fyziologickej hodnote pH) za následok podstatné zlepšenie absorpcie a biologickej dostupnosti danej molekuly po subkutánnej aplikácii. Táto znalosť a opis uvedený v tejto prihláške umožňujú navrhnúť nové molekuly so zlepšenými terapeutickými vlastnosťami.
Malo by byt zrejmé, že analógy opísané v predchádzajúcom texte sú uvedené len ako príklady, a že je možné, pri využití opisu uvedeného v tejto prihláške, vytvoriť iné analógy NT-3, ako tiež analógy iných proteínov, vyznačujúce sa nižšou hodnotou izoelektrického bodu a dlhším zotrvaním v krvnom obehu a/alebo vyššou absorpciou. V jednom variante môžu byt napríklad vytvorené analógy proteínov SEK. ID. Č: 3 a 5 tak, že je uskutočnená expresia v cicavčích bunkách alebo sekrétujúcich bakteriálnych bunkách takým spôsobom, že je získaný produkt Met~ (tzn. metionínový zvyšok na N-konci je odstránený a výsledkom sú polypeptidy so sekvenciami SEK. ID. Č: 6 a 7). To rovnaké bude platiť v prípade analógov BDNF-faktoru opísaných v ďalšom texte.
Analógy BDNF-faktoru
Pri využití postupov opísaných hore (pre polypeptid NT-3) boli pripravené analógy BDNF-faktoru, ktoré boli purifikované z E. coli. Pri každom z týchto analógov bola stanovená hodnota izoelektrického bodu (pi) a (približný) výsledný náboj pri fyziologickom pH (7,4). Na porovnanie sú rovnako uvedené hodnoty izoelektrického bodu a náboja pri fyziologickom pH pre BDNF-faktor divokého typu (tzn. BDNFfaktor s prirodzene sa vyskytujúcou sekvenciou; pozri patentovú prihlášku US 5180820, obrázok 5; SEK. ID. Č: 8). Miesta substitúcií sú číslované s počiatkom na prvom aminokyselinovom zvyšku nasledujúcom po metioníne v maturovanej forme proteínu exprimovaného v E. coli (tzn. počiatočný metionínový zvyšok nie je započítaný).
BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97A
Vykonanými substitúciami sú zámena lyzínu za kyselinu asparágovú v pozíciách 65 a 73, zámena lyzínu za alanín v pozícii 95 a zámena arginínu za alanín v pozícii 97. (SEK. ID. Č: 9)
Vyrátaná hodnota pi: 8,46
Náboj: +4,0
BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95A
Vykonanými substitúciami sú zámena prolínu za kyselinu glutámovú v pozícii 60, zámena lyzínu za kyselinu asparágovú v pozíciách 65 a 73 a zámena lyzínu za alanín V pozícii 95. (SEK. ID. Č: 10)
Vyrátaná hodnota pi: 8,45
Náboj: +4,0
BDNF-faktor divokého typu
Vyrátaná hodnota pi: 10,23
Náboj: +9,5
Opis a výsledky biologických testov
1) Stanovenie biologickej aktivity in vitro; biologické stanovenie mitogénnej aktivity pri využití buniek 3T3trkC
V tomto experimente je biologická aktivita BDNF-faktoru divokého typu a biologická aktivita analogov BDNF-faktoru stanovovaná kvantitatívne meraním inkorporácie (MTS) do buniek PC-12 (ATCC), ktoré boli transformované tak, aby exprimovali receptor trkB (vysokoafinitný receptor pre BDNF-faktor). Tieto transformované bunky boli kultivované v Dulbeccovom minimálnom médie obsahujúcom fetálne bovinné a konské sérum a 1% L-glutamínu. Kultivácia prebiehala pri teplote 37°C ± 2°C v inkubátore s vysokou vlhkosťou vzduch a obsahom oxidu uhličitého 7,5 ± 1%. Pri vlastnom experimente boli bunky prenesené do doštičiek pre tkanivové kultúry a ďalej kultivované. Po uplynutí približne 48 hodín bolo kultivačné médium nahradené médiom RPMI 1640, k bunkám boli pridané testované vzorky a inkubácia prebiehala za rovnakých podmienok ďalších 48 hodín. Následne boli bunky ofarbené pomocou MTS, inkubované ďalších päť hodín za rovnakých podmienok a pri využití čítacieho zariadenia doštičiek bola v každej jamke zmeraná optická hustota pri vlnovej dĺžke 490 nm. Získané výsledky biologickej aktivity zmienených dvoch analógov BDNF-faktoru (vzhladom na BDNF-faktor divokého typu) sú znázornené v tabulke 4.
Tabulka 4
Biologická aktivita BDNF-faktorov stanovovaná in vitro
Biologická aktivita (mg/mg)
BDNF-faktor divokého typu 0,61
BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97A 1,24
BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95A 0,61
2) Biologické testovanie in vivo a získané výsledky
Biologické vlastnosti zmienených analógov boli hodnotené in vivo na samcoch potkanov Sprague Dawley a to v dávkach 3,0 miligramy na kilogram telesnej hmotnosti pre BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97A a 1,7 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti pre BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95A. Testované látky boli podávané intravenózne a subkutánne a potom nasledovali odbery vzoriek séra a meranie koncentrácií zmienených analógov v krvnom sére (bol uplatnený rovnaký postup ako pri NT-3 a analógov NT-3). Pre každú formu podania sú ďalej uvedené farmakokinetické vlastnosti jednotlivých proteínov.
Tabulka 5
Farmakokinetické vlastnosti merané na potkanoch; jedna intravenózna dávka BDNF-faktorov
Typ BDNF-faktoru t-AUC (inf) (ng-hod/ml)
BDNF-faktor BDNF-faktor BDNF-faktor divokého typu
K65D,K73D,K95A,R97A
P60E,K65D,K73D,K95A
8652,81833,6
12932,81913,0
14097,21949,8
Tabulka 6
Farmakokinetické vlastnosti merené na potkanoch; jedna subkutánna dávka BDNF-faktorov
Typ BDNF-faktoru t-AUC (inf) (ng-hod/ml) F (%)
BDNF-faktor divokého typu 462,51130,3 4,712,0
BDNF-faktor K65D,K73D,K95A,R97A 2401,61297,1 16,810,1
BDNF-faktor P60E,K65D,K73D,K95A 2049,21357,4 13,9±2,0
Získané výsledky ukazujú, že zavedenie mutácií do BDNF-faktoru divokého typu má meratelný vplyv na farmakokinetické vlastnosti. Ide osobitne o dosiahnutie väčšej biologickej dostupnosti zmienených dvoch analógov BDNF-faktoru (v porovnaní s BDNF-faktorom) in vivo, čo sa odráža vo vyšších hodnotách t-AUC(inf) po intravenóznom podaní týchto analógov a vyšších hodnotách t-AUC(inf) a F% po subkutánnej aplikácii.
Tento vynález je definovaný pripojenými patentovými nárokmi.
ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:
(i) PRIHLASOVATEĽ: Boone, Thomas C.
Cheung, Elien N.
Hershenson, Susan I.
Young, John D.
(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Polypeptidové analógy katiónaktívnych polypeptidov (iii) POČET SEKVENCIÍ: 10 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:
(A) ADRESÁT: Advokátska kancelária Bušová, Ursínyová,
Buso (B) ULICA: Tobrucká 6 (C) MESTO: Bratislava (D) ŠTÁT: Slovensko (E) PSČ: 811 02 (v) STROJNE ČITATEĽNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0,
Verzia č. 1.25 (vi) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:
(B) DÁTUM PODANIA:
(C) ZATRIEDENIE:
(viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:
(A) MENO: Mazza, Richard J.
(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO:
(C) ČÍSLO SPISU: A-411 (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:
(A) TELEFÓN:
(B) TELEFAX:
(C) TELEX:
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÉŽKA: 120 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín
(xi) OPIS SEKVENCIE : SEK. ID. . Č. :1:
Met 1 Tyr Ala Glu His 5 Lys Ser His Arg Gly 10 Glu Tyr Ser Val Cys 15 Asp
Ser Glu Ser Leu 20 Trp Val Thr Asp Lys 25 Ser Ser Ala íle Asp 30 íle Arg
Gly His Gin 35 Val Thr Val Leu Gly 40 Glu íle Lys Thr Gly 45 Asn Ser Pro
Val Lys 50 Gin Tyr Phe Tyr Glu 55 Thr Arg Cys Lys Glu 60 Ala Arg Pro Val
Lys 65 Asn Gly Cys Arg Gly 70 íle Asp Asp Lys His 75 Trp Asn ser Gin cys 80
Lys Thr Ser Gin Thr 85 Tyr val Arg Ala Leu 90 Thr Ser Glu Asn Asn 95 Lys
Leu Val Gly Trp 100 Arg Trp íle Arg íle 105 Asp Thr Ser Cys Val 110 Cys Ala
Leu Ser Arg Lys íle Gly Arg Thr 115 120 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĎŽKA: 360 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÔGIA: 1ineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:2:
atgtacgctg aacacaaatc tcaccgtggt gaataecccg tttgcgactc tgaatctctg 60 tgggctaccg acaaatcttc tgctatcgac at.ccgtggtc accaggCtac cgttctgggt 120 gaaatcaaaa ccggtaactc tccggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa 180 gctgcaccgg ttgacaacgg ttgccgtggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 naaacctctc agacctacgt tcgtgctctg acctctgaaa acaacaagcfc tgttggttgg 300 egttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggtcgtacc 360 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĎŽKA: 120 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:3:
Met Tyr Ala Glu 1 His Lys Ser His Arg 5 Gly Glu 10 Tyr Ser Val Cys 15 Asp
Ser. Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala íle Asp íle Arg
20 25 30
Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu íle Lys Thr Gly Asn Ser Pre
35 40 45
Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Ala Pro val
50 55 60
Λ Asp Asn Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys
65 70 75 80
Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys
• 85 90 95
Leu Val Gly Trp Arg Trp íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val cys Ala
100 105 110
Leu Ser Arg Lys íle Gly Arg Thr
115 120
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:4:
(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍ.ŽKA: 354 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:4:
atgtacgctg aacacaaatc tcaccgtggt gaatactctg tttgcgactc tgaatctctg 60 tgggttaccg acaaatcttc tgctatcgac atccgtggtc accaggttac egttctgggt 120 gaaatcaaaa ccggtaactc tccggttaaa cagtacttct acgaaacccg ttgcaaagaa 180 gctgcaccgg ttgacäacgg ttgccgcggt atcgacgaca aacactggaa ctctcagtgc 240 aaaacctctc agacctacgt tcgtgcbctg acctctgaaa acaacaagct tgttggttgg 300 · cgttggattc gtatcgacac ctcttgcgtt tgcgctctgt ctcgtaaaat cggt 354 , (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 118 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:5:
Met 1 Tyr Ala Glu His 5 Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp
10 15
Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala íle Asp íle Arg
20 25 30
Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu íle Lys Thr Gly Asn Ser Pro
35 40 45
Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Ala Pro val
50 55 60
Asp Asn Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys
65 70 75 80
Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys
85 90 95
Leu Val Gly Trp Arg Trp íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Xle Gly
115 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 119 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:6:
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu 10 Tyr Ser Val Cys Asp 15 Ser
1 5
Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala íle Asp íle Arg Gly
20 25 30
His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu íle Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val
35 40 45
Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Ala Pro Val Asp
50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys
65 70 75 80
Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu
85 90 95
Val Gly Trp Arg Trp íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu
100 105 110
Ser Arg Lys íle Gly Arg Thr
115 (2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍiŽKA: 117 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:7:
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu. Tyr ser Val Cys Asp Ser
1 5 10 15
Glu Ser Leu Trp Val Thr ASp Lys Ser Ser Ala íle Asp íle Arg Gly
20 25 30
HÍS Gin Val Thr Val Leu Gly Glu Ilc Lys Thr Gly Asn Ser Prô Val
35 40 45
Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Ala Pro Val Asp
50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys
65 70 75 80
Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr' Ser Glu Asn Asn Lys Leu
85 90 95
Val Gly Trp Arg Trp íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu
100 105 110
Ser Arg Lys íle Gly
115
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍ.ŽKA: 120 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:8:
Met 1 His Ser Asp Pro 5 Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser
10 .15
íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro val Ser Lys Gly
35 40 45
Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
50 55 60
Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin
65 70 75 80
Cye Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys
85 90 95
Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 110
Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg
115 120
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍiŽKA: 120 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:9:
Met Hís Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser
1 5 10 15
íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly
35 .40 45
Gin Leu Lys Gin Tyr Phe' Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr
50 55 60
Thr Asp Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Arg Kis Trp Asn Ser Gin
65 70 75 80
Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Ilc Gly Trp Arg Phe Xle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 110
Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg
115 120
(2) INFORMÁCIE O SEK. ID. Č.:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍiŽKA: 120 aminokyselinových zvyškov (B) TYP: polypeptid (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEK. ID. Č.:10:
Met 1 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser
5 10 15
íle Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly
35 40 45
Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys cys Asn Glu Met Gly Tyr
50. 55 60
Thr Asp Glu Gly Cys Arg Gly íle Asp Asp Arg His Trp Asn Ser Gin
65 70 75 80
Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Ala
85 30 95
Lys Arg íle Gly Trp Arg Phe íle Arg íle Asp Thr Ser Cys Val Cys
100 105 110
Thr Leu Thr íle Lys Arg Gly Arg
115 120

Claims (48)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polypeptidový analóg katiónaktívneho polypeptidu, kde zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od natívnej sekvencie pôvodného polypeptidu v jednom alebo viacerých aminokyselinových zvyškoch alebo sa od natívnej sekvencie pôvodného polypeptidu líši chemickou modifikáciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov natívnej sekvencie, pričom dôsledkom týchto odlišností je zníženie hodnoty izoelektrického bodu a zvýšenie času zotrvania v obehu in vivo a/alebo zvýšenie absorpcie zmieneného analóga vzhíadom na tieto vlastnosti pri nemodifikovanom katiónaktívnom polypeptide.
  2. 2. Polypeptid podlá nároku 1, kde tento polypeptid je rovnako charakterizovaný, v porovnaní s neraodifikovaným katiónaktívnym polypeptidom, nižším nábojom za fyziologických podmienok.
  3. 3. Polypeptid podlá nároku 1, kde tento polypeptid je analógom katiónaktívneho polypeptidu vybraného zo skupiny zahŕňajúcej neurotrofický faktor-3 (NT-3), neurotrofický faktor pochádzajúci z mozgu (BDNF-faktor), rastový a diferenciačný faktor makrofágov (MGDF-faktor) a rastový faktor keratinocytov (KGF).
  4. 4. Polypeptid podlá nároku 3, kde tento polypeptid je analógom NT-3.
  5. 5. Polypeptid podlá nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID.
    Č: 3.
  6. 6. Polypeptid podlá nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 5.
  7. 7. Polypeptid podlá nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. č: 6.
  8. 8. Polypeptid podlá nároku 4, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 7.
  9. 9. Polypeptid podlá nároku 3, kde tento polypeptid je analógom BDNF-faktoru.
  10. 10. Polypeptid podlá nároku 9, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 9.
  11. 11. Polypeptid podlá nároku 9, kde tento polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 10.
  12. 12. Molekula DNA kódujúca polypeptidový analóg katiónaktívneho polypeptidu, kde kódovaný analóg má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa od natívnej sekvencie pôvodného polypeptidu líši v jednom alebo viacerých aminokyselinových zvyškoch alebo sa od natívnej sekvencie pôvodného polypeptidu líši chemickou modifikáciou jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov natívnej sekvencie, pričom dôsledkom týchto odlišností je zníženie hodnoty izoelektric kého bodu a zvýšenie času zotrvania v obehu in vivo a/alebo zvýšenie absorpcie zmieneného analóga vzhíadom na tieto vlastnosti pri nemodifikovanom katiónaktívnom polypeptide.
  13. 13. Molekula DNA podlá nároku 12, kde táto molekula kóduje analóg katiónaktívneho polypeptidu vybraného zo skupiny zahŕňajúceho NT-3, BDNF-faktor, MGDF a KGF.
  14. 14. Molekula DNA podlá nároku 13, kde táto molekula kóduje polypeptidový analóg NT-3.
  15. 15. Molekula DNA podlá nároku 14, kde táto molekula kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou opísanou ako SEK. ID. Č: 3.
  16. 16. Molekula DNA podlá nároku 14, kde táto molekula kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou opísanou ako SEK. ID. Č: 5.
  17. 17. Molekula DNA podlá nároku 15, kde táto molekula má nukleotidovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. č: 2.
  18. 18. Molekula DNA podlá nároku 16, kde táto molekula má nukleotidovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 4.
  19. 19. Molekula DNA podlá nároku 13, kde táto molekula kóduje polypeptidový analóg BDNF-faktoru.
  20. 20. Molekula DNA podlá nároku 19, kde táto molekula kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou opísanou ako SEK. ID. Č: 9.
  21. 21. Molekula DNA podlá nároku 19, kďe táto molekula kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou opísanou ako SEK. ID. Č: 10.
  22. 22. Biologicky funkčný expresívny vektor, kde tento vektor zahŕňa molekulu DNA podlá nároku 12, ktorá je funkčne pripojená k sekvenciám regulujúcim expresiu.
  23. 23. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná dajakým expresívnym vektorom podlá nároku 22 tak, že je tejto hostitelskej bunke umožnené exprimovať polypeptid kódovaný zmienenou molekulou DNA.
  24. 24. Transformované alebo transfekované bakteriálne hostiteľské bunky podlá nároku 23.
  25. 25. Transformované alebo transfekované hostitelské bunky E. coli podlá nároku 24.
  26. 26. Transformované alebo transfekované cicavčie hostitelské bunky podlá nároku 23.
  27. 27. Transformované alebo transfekované bunky CHO podlá nároku 26.
  28. 28. Transformované alebo transfekované bunky COS podlá nároku 26.
  29. 29. Postup produkcie polypeptidového analóga katiónaktívneho polypeptidu vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od natívnej sekvencie pôvodného polypeptidu v jednom alebo viacerých aminokyselinových zvyškoch, pričom dôsledkom týchto odlišností je zníženie hodnoty izoelektrického bodu a zvýšenie času zotrvania v obehu in vivo a/alebo zvýšenie absorpcie zmieneného analóga vzhľadom na tieto vlastnosti pri nemodifikovanom katiónaktívnom polypeptide, kde tento postup zahŕňa kultiváciu (za vhodných nutričných podmienok) prokaryotickej alebo eukaryotickej hostitelskej bunky transformovanej alebo transfekovanéj dajakým expresívnym vektorom zahŕňajúcim molekulu DNA kódujúcu zmienený po53 lypeptid tak, aby mohla zmienená hostitelská bunka tento polypeptid exprimovat, a kde tento postup môže rovnako zahŕňať izoláciu exprimovaného polypeptidového produktu.
  30. 30. Postup podlá nároku 29 vyznačujúci tým, že zmieneným polypeptidom je analóg NT-3.
    sa t ý cifickou
  31. 31. Postup podlá nároku m, že molekula DNA bola mutagenézou.
    30 vyznačujúc pripravení miestne špe
  32. 32. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 3.
  33. 33. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 5.
  34. 34. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 6.
  35. 35. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: Ί.
  36. 36. Postup podlá nároku 29 vyznačujúci tím, že zmieneným polypeptidom je analóg BDNF-faktoru sa t fickou
  37. 37. Postup podlá nároku 36 vyznačujúci ý m, že molekula DNA bola pripravená miestne špecimutagenézou.
  38. 38. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. č: 9.
  39. 39. Postup podlá nároku 30 vyznačujúci sa tým, že zmienený analóg má aminokyselinovú sekvenciu opísanú ako SEK. ID. Č: 10.
  40. 40. Postup podlá nároku 29 vyznačujúci sa tým, že zmienenou hostitelskou bunkou je bakteriálna bunka.
  41. 41. Postup podlá nároku 40 vyznačujúci sa tým, že zmienenou bakteriálnou hostitelskou bunkou je bunka E. coli.
  42. 42. Polypeptidový produkt exprimovaný v eukaryotickej alebo prokaryotickej hostitelskej bunke z molekuly DNA podlá nároku 12.
  43. 43. Protilátka proti polypeptidu podlá nároku 1.
  44. 44. Protilátka podlá nároku 43, kde táto protilátka je polyklonálna.
  45. 45. Protilátka podlá nároku 43, kde táto protilátka je monoklonálna.
  46. 46. Derivát polypeptidu podlá nároku 1 s naviazanou molekulou/molekulami polyetylénglykolu.
  47. 47. Farmaceutický prípravok zahŕňajúci terapeuticky účinné množstvo polypeptidu podlá nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič alebo rozpúšťadlo.
  48. 48. Spôsob liečby neuropatií periférnych nervov zahŕňajúci podanie terapeuticky účinného množstva polypeptidu pódia nárokov 4 alebo 9 pacientovi postihnutému danou poruchou.
SK14-99A 1996-07-19 1997-07-17 Analogs of cationic proteins SK1499A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68435396A 1996-07-19 1996-07-19
PCT/US1997/012609 WO1998003546A1 (en) 1996-07-19 1997-07-17 Analogs of cationic proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK1499A3 true SK1499A3 (en) 1999-08-06

Family

ID=24747700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK14-99A SK1499A3 (en) 1996-07-19 1997-07-17 Analogs of cationic proteins

Country Status (11)

Country Link
US (4) US6211150B1 (sk)
EP (1) EP0938499A1 (sk)
AU (1) AU720232B2 (sk)
CA (1) CA2259163C (sk)
CZ (1) CZ399A3 (sk)
IL (1) IL127872A0 (sk)
NO (1) NO990059L (sk)
NZ (1) NZ333650A (sk)
SK (1) SK1499A3 (sk)
WO (1) WO1998003546A1 (sk)
ZA (1) ZA976326B (sk)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1284143A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-19 Sifi S.p.A A process for the preparation of pharmaceutical formulations containing lactoferrin description
RS54160B1 (sr) 2003-03-19 2015-12-31 Biogen Idec Ma Inc. Protein koji se vezuje za nogo receptor
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
EP1720564A1 (en) * 2004-02-20 2006-11-15 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5
CA2572193A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving oligodendrocytes with sp35 based agents
US7476331B2 (en) * 2005-02-09 2009-01-13 E I Du Pont Nemours And Company Compositions comprising 1,1,1,2,2,3,4,5,5,6,6,7,7,7-tetradecafluoroheptane and uses thereof
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
AU2006255101A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Wyeth Anti-TrkB monoclonal antibodies and uses thereof
EP2238986A3 (en) 2005-07-08 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
WO2007058843A2 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Lentigen Corporation Web based vector design
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
ES2568436T3 (es) * 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
EP3689912A1 (en) * 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
BRPI0817637A2 (pt) * 2007-09-28 2015-09-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-glipican-3 tendo cinéticas aperfeiçoadas no plasma
CN101980603A (zh) * 2007-10-11 2011-02-23 比奥根艾迪克Ma公司 LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途
CN101918540B (zh) * 2007-11-08 2016-05-11 比奥根Ma公司 Lingo-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用
RU2531521C2 (ru) 2007-12-05 2014-10-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
JP2015518829A (ja) 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
JP6668241B2 (ja) 2013-09-05 2020-03-18 アムジエン・インコーポレーテツド 予測可能で、一貫性のある、且つ再現可能な糖型特性を示すＦｃ含有分子
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CA2973266A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biogen Ma Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
TW202248212A (zh) 2015-02-05 2022-12-16 日商中外製藥股份有限公司 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
JP7023461B2 (ja) 2015-07-28 2022-02-22 オトノミ―，インク． 耳の疾病の処置のためのｔｒｋｂ又はｔｒｋｃアゴニスト組成物及び方法
US10066229B2 (en) 2015-07-28 2018-09-04 Otonomy, Inc. Treatment using truncated Trk B and Trk C antagonists
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
AU2016381992B2 (en) 2015-12-28 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
AU2017233658B2 (en) 2016-03-14 2023-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
KR20190024983A (ko) 2016-06-29 2019-03-08 오토노미, 인코포레이티드 트리글리세라이드 귀 제제 및 이의 용도
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
EP3596225A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
EP4034556A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5322678A (en) * 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US6247647B1 (en) * 1988-09-19 2001-06-19 Symbol Technologies, Inc. Scan pattern generator convertible between multiple and single line patterns
US5229500A (en) * 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
JPH0595786A (ja) 1991-10-07 1993-04-20 Green Cross Corp:The 変異ヒトプロウロキナーゼ
US5349055A (en) * 1992-03-06 1994-09-20 Persson Hakan B Nerve growth factor having altered receptor binding specificities
SG79882A1 (en) * 1994-02-14 2001-04-17 Kirin Brewery Protein having tpo activity
ES2196088T3 (es) * 1994-10-13 2003-12-16 Amgen Inc Analogos del factor de crecimiento de los queratinocitos.
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5830857A (en) * 1995-07-14 1998-11-03 Amgen Inc. Method of treating epilepsy

Also Published As

Publication number Publication date
CA2259163A1 (en) 1998-01-29
EP0938499A1 (en) 1999-09-01
CZ399A3 (cs) 1999-06-16
US6211150B1 (en) 2001-04-03
NO990059D0 (no) 1999-01-07
IL127872A0 (en) 1999-10-28
AU3671297A (en) 1998-02-10
US6500429B2 (en) 2002-12-31
US6723701B2 (en) 2004-04-20
AU720232B2 (en) 2000-05-25
NZ333650A (en) 2000-02-28
WO1998003546A1 (en) 1998-01-29
NO990059L (no) 1999-03-19
CA2259163C (en) 2004-07-06
US20050143294A1 (en) 2005-06-30
US20020010135A1 (en) 2002-01-24
US20010027179A1 (en) 2001-10-04
ZA976326B (en) 1998-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK1499A3 (en) Analogs of cationic proteins
US6472178B1 (en) Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
EP2238983B1 (en) Neublastin variants
JP2007209349A (ja) 新規な神経栄養因子
CN114671941B (zh) 神经生长因子突变体
WO2020143515A1 (zh) 人肝细胞生长因子突变体及其应用
CA2237543A1 (en) New form of amphiregulin, methods for producing and using the same and compositions comprising the same
US6468970B2 (en) Analogs of NT-3
MXPA99000372A (en) Products analogues of proteins cationi
US6680291B1 (en) Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof
CA2379940A1 (en) Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof
US20050090445A1 (en) Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
CA2079291A1 (en) Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor
WO1994012634A1 (en) Neurotrophic factor
EP0625196A1 (en) Neurotrophic factor
EA041758B1 (ru) Fgf21 мутанты и их применение