SK10199A3 - Hppd gene and inhibitors - Google Patents

Hppd gene and inhibitors Download PDF

Info

Publication number
SK10199A3
SK10199A3 SK101-99A SK10199A SK10199A3 SK 10199 A3 SK10199 A3 SK 10199A3 SK 10199 A SK10199 A SK 10199A SK 10199 A3 SK10199 A3 SK 10199A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
hppd
cell
cells
herbicide
plant
Prior art date
Application number
SK101-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen Sturner
Lynne M Hirayama
Bijay Singh
Newell Bascomb
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of SK10199A3 publication Critical patent/SK10199A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka DNA kódujúcej 4-hydroxyfenylpyruvát dioxygenázu (HPPD), herbicídov inhibujúcich HPPD a spôsobov vyšetrovania zlúčenín za účelom identifikácie herbicídov inhibujúcich HPPD. Vynález sa tiež týka HPPD variantov, ktoré sú rezistentné na inhibičný účinok herbicídov, spôsobov vyšetrovania HPPD variantov a rastlín obsahujúcich HPPD rezistentnú na herbicídy.
Doterajší stav techniky
V rastlinách je 4-hydroxyfenylpyruvát dioxygenáza (HPPD, EC 1.13.11.27) kľúčový enzým v biosyntéze plastochinónov a tokoferolov. Kyselina 4-hydroxyfenylpyrohroznová (odvodená od kyseliny chorizmovej shikimate dráhou) je oxidovaná a dekarboxylovaná HPPD za zisku kyseliny homogentisovej (Fiedler a Schultz, Dev. Plánt. Biol. 8, 537, 1982, Fiedler et al., Planta 155, 511, 1982). Ďalšia polyprenylácia a dekarboxylácia kyseliny homogentisovej vedie k vzniku plastochinónov a tokoferolov.
U zvierat je HPPD obsiahnutá v katabolizme tyrozínu. Genetická deficiencia v tejto dráhe u ľudí a myší vedie k hereditárnej tyrozinémii typu 1. Toto ochorenie môže byť liečené NTBC (2-(2-nitro-4-trifluórmetylbenzoyl)-1,3cyklohexándiónom, inhibítorom HPPD, ktorý bráni hromadeniu medziproduktov katabolizmu tyrozínu, ktoré sú hepatotoxické (Ellis et al., Tox. and Appl. Pharm. 133, 12, 1995).
158/B
Pretože plastochinóny a tokoferoly sú základné zlúčeniny pre rastliny, sú inhibítory tohto enzýmu potenciálnymi herbicídmi. Novo sa preukázalo, že jedna trieda inhibítorov HPPD, triketóny, má herbicídnu aktivitu (Prisbylia et al., Brighton Crop Protection Conference: Weeds, British Crop Protection Council, Surrey, UK, str. 731-738, 1993, Schulz et al., FEBS Letts. 318, 162, 1993). Herbicíd sulcotrión (2-(2-chlór-4-metánsulfonylbenzoyl)-1,3-cyklohexándión) selektívny pre kukuricu spôsobuje silné odfarbenie citlivých rastlín, ktoré je spojené so stratou karotenoidov a chlorofylu a so zvýšením fytoénu a tyrozínu (Barta et al., Pest. Sci. 45, 286, 1995, Soeda et al., Pestic. Biochem. Physiol. 29, 35, 1987, Mayonado et al., Pestic. Biochem. Physiol. 35, 138, 1989). Ošetrenie Lemna sulcotriónom výrazne inhibuje rast a herbicídny účinok môže byť zrušený kyselinou homogentisovou. Preukázalo sa, že čiastočne prečistený enzým extrahovaný z kukurice je významne inhibovaný sulcotriónom s vypočítanou IC50 45 nM (Schulz et al., 1993, vyššie). Čiastočne prečistená HPPD zježatky kuracej nohy (Echinochloa crus-galli L.) ukázala, že sulcotrión je účinný kompetitívny inhibítor enzýmu s K, 9,8 nM (Secor, Plánt Physiol. 106, 1429, 1994). Kanadská patentová prihláška č. 2 116 421 opisuje identifikáciu HPPD inhibítorov odvodených od 2-benzoylcyklohexamín-1,3-diónov.
Albinický mutant (psdl) izolovaný z populácie Arabidopsis s T-DNA, bol pôvodne selektovaný vďaka závažnej pigmentovej deficiencii, o ktorej sa usudzovalo, že je spôsobená defektom v génoch na syntézu karotenoidov (Norris et al., Plánt Celí 7, 2139, 1995). Keď sa nechal albinický mutart klíčiť v MS2 médiu a potom bol prenesený do MS2 média doplneného buď 4hydr.oxyfenylpyruvátom (OHPP) alebo kyselinou homogentisovou (HGA), zozeleneli rastliny v HGA, nie však v OHPP. Ďalšia analýza tohto mutantu naznačila, že defekt spôsobujúci albinický fenotyp nie je spôsobený priamo mutáciou enzýmu pre biosyntézu karotenoidu, ale skôr vzniká v dôsledku mutácie HPPD, ktorá bráni biosyntéze plastochinónu nutného na biosyntézu karotenoidu.
158/B
I napriek významu tejto metabolickej dráhy pre rastliny neboli gény kódujúce enzým na biosyntézu plastochinónu a tokoferolu doteraz izolované. Preto v odbore existuje potreba spôsobov a prostriedkov, ktoré poskytujú HPPD gény, HPPD inhibítory použiteľné ako herbicídy a varianty rezistentné na HPPD herbicídy. Vynálezcovia izolovali gén kódujúci rastlinnú HPPD, exprimovali ho v E. coli a preukázali, že rastlinná HPPD exprimovaná v baktériách je enzymaticky aktívna a že jej enzymatická aktivita je inhibovaná triketónovými herbicídmi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 uvádza aminokyselinovú sekvenciu 4-hydroxyfenylpyruvát dioxygenázy (HPPD) z Arabidopsis thaliana (AtHPPD) a ukazuje zoradenie tejto sekvencie s príbuznými sekvenciami od myší, ľudí, ošípaných a Streptomyces avermitilis (S. Avet).
Obrázok 2 je grafické znázornenie produkcie hnedého pigmentu E. coli transformovanej Arabidopsis HPPD génom („Arabidopsis,,) v porovnaní s E. coli transformovanou kontrolným vektorom („plazmid,,). Je ukázaný účinok pridávania zvyšujúcich sa koncentrácií tyrozínu do kultivačného média na tvorbu pigmentu.
Obrázok 3A je ilustráciou HPLC elučného profilu média z E. coli transformovanej kontrolným vektorom. Obrázok 3B je ilustráciou HPLC elučhého profilu média z E. coli transformovanej Arabidopsis HPPD génom. Elučná pozícia autentického štandardu kyseliny homogentisovej je ukázaná šípkou. Vložený graf v obrázku 3B znázorňuje absorpčné spektrum piku kyseliny homogentisovej.
Obrázok 4 je grafickým znázornením účinku zvyšujúcich sa koncentrácií sulcotriónu na HPPD enzymatickú aktivitu bunkových extraktov získaných od E. coli transformovanej Arabidopsis HPPD génom.
158/B
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález obsahuje prečistené izolované nukleové kyseliny kódujúce rastlinnú 4-hydroxyfenylpyruvát dioxygenázu (HPPD), hlavne HPPD odvodenú zArabidopsis thaliana, rovnako ako jej konzervatívne sekvenčné varianty a konzervatívne funkčné varianty; DNA vektory obsahujúce nukleovú kyselinu kódujúcu HPPD operatívne naviazanú na element regulujúci transkripciu; a bunky obsahujúce HPPD vektory vrátane, ale bez obmedzenia, bakteriálnych, mykotických, rastlinných, hmyzích a cicavčích buniek. V jednom vyhotovení je poskytnutá bakteriálna bunka exprimujúca vysoké hladiny rastlinnej HPPD. Vynález tiež obsahuje HPPD polypeptidy a enzymaticky aktívne fragmenty od nich odvodené.
V inom aspekte vynález poskytuje spôsob na identifikáciu herbicídov/HPPD inhibítorov, ktorý obsahuje:
a) poskytnutie mikrobiálnej bunky exprimujúcej rastlinnú HPPD;
b) inkubáciu bunky v prítomnosti testovanej zlúčeniny za tvorby testovacej kultúry a za absencie testovanej zlúčeniny za tvorby kontrolnej kultúry;
c) sledovanie hladiny kyseliny homogentisovej alebo jej oxidačných produktov v testovacích a kontrolných kultúrach; a
d) identifikáciu zlúčeniny, ktorá inhibuje HPPD, ktorou je akákoľvek zlúčenina, ktorá redukuje hladiny kyseliny homogentisovej alebo jej oxidačných produktov v testovacej kultúre vzhľadom na kontrolnú kultúru. Vo vyššie uvedenom spôsobe môže byť krok sledovania vykonaný napríklad meraním absorbancie uvedenej kultúry pri 450 nm alebo vizuálnou detekciou tvorby hnedého pigmentu. Alternatívne je inhibítor identifikovaný ako zlúčenina, ktorá inhibuje rast testovanej kultúry, kde inhibícia môže byť zrušená pridaním kyseliny homogentisovej do kultúry.
158/B
V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob na identifikáciu variantov HPPD rezistentných na herbicídy, ktorý obsahuje:
a) poskytnutie populácie buniek exprimujúcich rastlinnú HPPD;
b) mutovanie populácie buniek;
c) kontaktovanie mutovanej populácie buniek s herbicídom, za podmienok inhibičných pre rast nemutovaných buniek;
d) získanie buniek rezistentných na inhibičné účinky herbicídu na rast a/alebo tvorbu pigmentu; a
e) sekvencovanie nukleovej kyseliny kódujúcej HPPD zo získaných buniek.
Alternatívne je DNA kódujúca HPPD podrobená náhodnej alebo miestne riadenej mutagenéze in vitro, po ktorej nasleduje expresia v heterológnych bunkách a vyšetrovanie alebo selekcia buniek vykazujúcich rezistenciu na herbicíd.
V ešte inom aspekte vynález poskytuje variantné HPPD proteíny, ktoré sú rezistentné na herbicídy. Výhodne, variantný HPPD proteín rezistentný na herbicídy vykazuje pri expresii v bunkách, pre ktoré je nutná HPPD aktivita pre životaschopnosť:
i) katalytickú aktivitu, ktorá je samotná dostatočná na udržanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná; alebo katalytickú aktivitu v kombinácii s akýmkoľvek iným HPPD variantným proteínom rezistentným na herbicídy, ktorý môže byť rovnaký alebo odlišný od prvého HPPD variantného proteínu, ktorá je dostatočná na udržiavanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná; a ii) katalytickú aktivitu, ktorá je viac rezistentná na herbicíd ako je prirodzená HPPD.
Vynález tiež obsahuje nukleové kyseliny kódujúce varianty HPPD rezistentné na herbicíd, DNA vektory obsahujúce nukleové kyseliny a bunky obsahujúce vektory kódujúce variantnú HPPD. Gény kódujúce varianty HPPD
15«/R rezistentné na herbicíd sa môžu použiť ako genetické markery, napríklad v plazmidoch a môžu sa použiť pri vkladaní a selekcii akýchkoľvek iných požadovaných génov.
V inom aspekte vynález poskytuje spôsob na vyvolanie rezistencie na herbicíd v bunke alebo v bunkách, a hlavne v rastlinnej bunke alebo bunkách, ako sú napríklad semená. HPPD gén, výhodne Arabidopsis thaliana HPPD gén, je mutovaný tak, aby menil schopnosť herbicídu inhibovať enzymatickú aktivitu HPPD. Mutovaný gén je klonovaný do kompatibilného expresného vektora a gén je transformovaný do buniek senzitívnych na herbicíd za podmienok, pri ktorých je exprimovaný v hladinách dostatočných na vyvolanie rezistencie na herbicíd v bunke.
Vynález tiež obsahuje spôsoby na kontrolu rastu buriny, v ktorých je rastlina obsahujúca gén HPPD rezistentná na herbicíd podľa predkladaného vynálezu kultivovaná a ošetrená množstvom herbicídu dostatočným na účinnú kontrolu buriny.
Predkladaný vynález obsahuje prečistené izolované nukleové kyseliny kódujúce rastlinnú 4-hydroxyfenylpyruvát dioxygenázu (HPPD), expresné systémy, v ktorých je enzymaticky aktívna HPPD produkovaná a vyšetrovacie metódy na identifikáciu inhibítorov HPPD.
Predkladaný vynález tiež obsahuje spôsoby na vyšetrovanie a produkciu rastlinných HPPD variantov, ktoré sú rezistentné na inhibičný účinok herbicídov, DNA kódujúcu tieto varianty, vektory obsahujúce tieto varianty, HPPD variantné proteíny a bunky exprimujúce tieto varianty. Ďalej obsahuje spôsoby na vyvolanie rezistencie na herbicídy v rastlinách pomocou expresie týchto variantov a spôsoby na kontrolu buriny.
Izolácia a charakterizácia génu kódujúceho Arabidopsis HPPD
Vynálezcovia izolovali a sekvencovali gén kódujúci Arabidopsis thaliana HPPD s použitím spôsobov uvedených ďalej. Stručne, Arabidopsis thaliana λ Yes cDNA knižnica (Elledge et ak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1731, 1991)
158/B bola vyšetrovaná pomocou PCR (Amaravadi et al., BioTechniques 16, 98, 1994).
Priméry: „Sense,, primér, označený ATHPPD1F (5'CGTGCTCAGCGATGATCAGA-3') a „antisense,, primér, označený ATHPPD1R (5'-CGGCCTGTCACCTAGTGGTT-3') boli syntetizované na základe Arabidopsis EST sekvencie (GenBank ID No. T20592), ktorá vykazovala homológiu k cicavčej HPPD sekvencii.
Priméry boli hodnotené v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) s použitím 1 μΙ alikvót (obsahujúcich 3 x 106 pfu/ml) cDNA fágovej knižnice ako templátovej DNA. Pre PCR obsahovalo 50 μΙ reakčnej zmesi 1X PCR pufor, 200 mM každého deoxynukleozid trifosfátu, 1,25 jednotiek AmpliTaq DNA polymerázy (všetko od Perkin Elmer) a 7,5 pmól každého priméru. Reakčná zmes sa zahriala na 95 °C na 2 minúty a bola amplifikovaná v 35 cykloch: 95 °C 1 minúta, 48 °C 2 minúty, 72 °C 1 minúta 30 sekúnd. Potom nasledovala inkubácia pri 72 °C počas 7 minút. Produkoval sa fragment predpokladanej veľkosti 112 bp. Tento fragment bol klonovaný do pCRII vektora (TA Cloning kit, Invitrogen) a sekvencovaný a zistilo sa, že je identický s Arabidopsis EST sekvenciou (s adíciou 3 zvyškov, ktoré neboli určené v opise sekvencie EST).
Vyšetrovanie knižnice: cDNA knižnica bola umiestnená na 13 platní obsahujúcich NZCYM agar v denzite 40 000 pfu/platňa. Fág z každej platne bol eluovaný do SM a alikvóty z 13 jednotlivých súborov fágu sa použili ako templát pre PCR sATHPPDIF a ATHPPD1R párom primérov. Podmienky PCR boli rovnaké ako sú opísané vyššie (v prvom kole bol 1 μΙ každého eluovaného 'i fágového súboru použitý ako templát a 5 μΙ bolo použitých v ďalších kolách).
V prvom kole bolo 10 z trinástich fágových súborov pozitívnych podľa PCR. Jeden z pozitívnych súborov bol vybraný na ďalšie vyšetrovanie. V druhom kole bol pri výplachoch z 10 platní s 5 000 pfu/platňa získaný 1 pozitívny súbor.
V treťom kole boli pri výplachoch z 10 platní s 20 pfu/platňa získané 2 pozitívne súbory. Pozitívne súbory z tretieho kola sa odobrali, získalo sa 36 jednotlivých plakov a vyšetrovali sa kvôli získaniu jediného HPPD pozitívneho plaku. Plazmid nesúci inzert bol excidovaný z tohto fágu pomocou automatických
158/B subklonovacích charakteristík vektora. Reštrikčná analýza ukázala, že plazmid obsahuje 1,5 kb inzert.
Analýza sekvencie: Templátová DNA na sekvencovanie bola pripravená s použitím Wizard DNA Purification System (Promega). Sekvenčné reakcie boli vykonané s použitím fmol DNA Sequencing System (Promnega) a gélové spracovanie sekvencie sa vykonalo na Hydrolink Long Ranger (AT Biochem) géloch. Inzert HPPD obsahujúceho plazmid izolovaný zcDNA knižnice bol sekvencovaný s použitím dvoch primérov, ktoré hybridizovali s λ Yes vektorom na opačných miestach Xhol klonovacieho miesta a série vnútorných primérov:
ATHPPD1F, ATHPPD1R, ako sú uvedené vyššie, a
ATHPPD2F (5'-CTTCTACCGATTAACGAGCCAGTG-3');
ATHPPD2R (5'-CACTGGCTCGTTAATCGGTAGAAG-3');
ATHPPD3F (5'-TCCATCACATCGAGTTCTGGTGCG-3');
ATHPPD3R (5'-AAAAGGAATCGGAGGTCACCGGA-3');
ATHPPD4F (5'-CTGAGGTTAAACTATACGGCGA-3'); a
ATHPPD4R (5'-TCGCCGTATAGTTTAACCTCAG-3').
Všetky informácie o sekvencii boli potvrdené sekvencovaním oboch reťazcov. Translácia HPPD nukleotidovej sekvencie, porovnanie sekvencii a mnohonásobné zoradenie sekvencii boli vykonané s použitím softwaru v The Wisconsin Package, verzia 8.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin).
Výsledky ukazujú, že 1,5 kb inzert obsahoval otvorený čítací rámček so 445 aminokyselinami (obrázok 1). TFASTA prehľadávanie GenEMBL databázy identifikovalo päť známych sekvencii s čiastočnou homológiou: Streptomyces HPPD (U11864); krysí F aloantigén (M18405); myší HPPD (D29987); prasačí HPPD (D13390); a ľudský HPPD (X72389). Priame párové porovnanie Arabidopsis sekvencie s vyššie uvedenými sekvenciami ukázalo 56 % priemernú podobnosť a 37 % priemernú identitu. Ďalej, počet konzervovaných tyrozínových a histidínových zvyškov, o ktorých sa usudzuje, že sú väzbovými miestami pre kovy v cicavčej HPPD (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem. 205, 459,
158/B
1992, Denoya et al., J. Bacteriol. 176, 5312, 1994), sa tiež pozoruje v Arabidopsis sekvencii.
Genómová organizácia HPPD génu v Arabidopsis: Southern blok analýza bola vykonaná s použitím genómovej DNA pripravenej zo semien Arabidopsis spôsobom, ktorý opísal Dellaporta (Dellaporta et al., Plánt. Mol. Biol. Rep., 1, 19, 1983). 10 pg DNA bolo trávených reštrikčnými enzýmami BamHI, EcoRI a Hindlll a potom boli produkty trávenia separované na 0,9 % agarózovom géli, boli prenesené na Duralon-UV membránu (Stratagene) s použitím VacuGen XI Vacuum blotting System (Pharmacia) a boli skrížené naviazané s použitím Stratalinker UV Crosslinker (Stratagene). HPPD próba bola pripravená: (i) gélovým prečistením (s použitím GeneClean Kit, Bio 101, Inc.) Xhol/Sstl fragmentu z trávenia HPPD/λ Yes plazmidovej DNA. Fragment obsahoval 50 báz sekvencie ležiacej vyššie (upstream) od ATG štart kodónu a siahal do pozície 55 báz ležiacej vyššie TGA stop kodónu; a (ii) značením fragmentu s použitím Prime-lt Fluor Fluorescence Labeling gitu (Stratagene). Membrána bola premytá 0,1X SSC/0,1 % SDS raz pri izbovej teplote a dvakrát pri 60 °C a potom bola hybridizácia vizualizovaná s použitím llluminator Nonradioactive Detection System (Stratagene).
Iba jeden prúžok hybridizoval na próbu za podmienok vysokej prísnosti ako v BamHI, tak v Hindlll produktoch trávenia. Dva prúžky boli pozorované v EcoRI produkte trávenia, čo odráža prítomnosť vnútorného EcoRI miesta v HPPD sekvencii. Výsledky naznačujú, že HPPD je kódovaná v Arabidopsis jednou kópiou génu.
Celá HPPD kódujúca sekvencia bola potom amplifikovaná z Arabidopsis genómovej DNA s použitím primérov ATHPPD5F (5'CCATGGGCCACCAAAACG-3') a ATHPPD5R-(5'CTGCAGTCATCCCACTAACTGTTTG-3'). Vzniknutý genómový HPPD fragment, ktorý bol o niečo väčší ako zodpovedajúci cDNA fragment, bol klonovaný do pCRII vektora (TA Cloning Kit, Invitrogen) a bol sekvencovaný. Bol detegovaný jediný intrón so 107 bp, ktorý bol umiestnený v nukleotidovej pozícii 1163-1164 cDNA sekvencie.
158/B
Nukleové kyseliny, vektory, expresné systémy a polypeptidy
Pri vykonávaní predkladaného vynálezu je použitých veľa techník molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA a proteínovej biochémie, ako sú napríklad techniky opísané plne v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, zv. I a II, 1985 (D. N. Glovervyd.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M. L. Gait vyd.); Transcription and Translation, 1984 (Hames a Higgins vyd.); A Practical Guide to Molecular Cloning; séria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); a Protein Purification: Principles and Practise, 2. vyd. (SpringerVerlag, N. Y.).
Predkladaný vynález obsahuje sekvencie nukleových kyselín kódujúce rastlinnú HPPD, enzymaticky aktívne fragmenty od nej odvodené a príbuzné sekvencie odvodené od HPPD z iných rastlinných druhov. Ako sa tu používa, znamená nukleová kyselina „odvodená od„ HPPD sekvencie sekvenciu nukleovej kyseliny zodpovedajúcu regiónu sekvencie, sekvencie, ktoré sú homológne alebo komplementárne ksekvencii a „konzervatívne sekvenčné varianty,, a „konzervatívne funkčné varianty,,. Konzervatívne sekvenčné varianty sú tie varianty, v ktorých zmena jedného alebo viacerých nukleotidov v danej pozícii kodónu nevedie k zmene aminokyseliny kódovanej v tejto pozícii. Konzervatívne funkčné varianty sú tie varianty, v ktorých bol daný aminokyselinový zvyšok v HPPD zmenený bez zmeny celkovej konformácie a funkcie HPPD polypeptidu, vrátane, ale bez obmedzenia náhrady aminokyseliny inou aminokyselinou majúcou podobné fyzikálno-chemické vlastnosti (ako sú napríklad kyslé, bázické, hydrofóbne a podobne). Fragmenty HPPD, ktoré si uchovávajú enzymatickú aktivitu, môžu byť identifikované spôsobmi, ktoré sú tu opísané, napríklad expresiou v E. coli, po ktorej nasleduje enzymatické testovanie bunkového extraktu.
158/B
HPPD sekvencie od rastlín iných ako Arabidopsis thaliana môžu byť izolované rutinnými pokusmi s použitím spôsobov a prostriedkov podľa predkladaného vynálezu. Napríklad hybridizácia nukleovej kyseliny obsahujúcej celú alebo časť Arabidopsis HPPD sekvencie za podmienok strednej prísnosti (ako je napríklad vodný roztok 2X SSC pri 65 °C) na cDNA alebo genómovú DNA odvodenú od iných rastlinných druhov môže byť použitá na identifikáciu HPPD homológov. cDNA knižnice od iných rastlinných druhov sú komerčne dostupné (Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Alternatívne môžu byť na amplifikáciu sekvencií príbuzných s HPPD z cDNA alebo genómovej DNA z iných rastlinných druhov použité PCR metódy. Expresia identifikovaných sekvencií, napríklad v E. coli, s použitím metód podrobnejšie opísaných ďalej, je potom použitá na potvrdenie toho, že enzymatická aktivita polypeptidu kódovaného sekvenciou zodpovedá aktivite HPPD. V súlade s tým spadajú HPPD sekvencie odvodené od dvojklíčnolistých a jednoklíčnolistých rastlín do rozsahu predkladaného vynálezu.
Nukleové kyseliny podľa predkladaného vynálezu zahrňujú polyméry obsahujúce puríny a pyrimidíny akejkoľvek dĺžky, buď polyribonukleotidy alebo polydeoxyribonukleotidy alebo zmes polyribo-deoxyribonukleotidov. Spadajú sem jedno- a dvojreťazcové molekuly, t.j. DNA-DNA, DNA-RNA a RNA-RNA hybridy, rovnako ako „proteínové nukleové kyseliny,, (PNA) tvorené konjugáciou báz na aminokyselinovom skelete. Patria sem tiež nukleové kyseliny obsahujúce modifikované bázy. Nukleové kyseliny môžu byť izolované nriamo z buniek. Alternatívne môže byť na produkciu nukleových kyselín podľa predkladaného vynálezu použitá PCR, využívajúca buď chemicky syntetizované reťazce alebo genómové materiály ako templáty. Priméry použité pre PCR môžu byť syntetizované s použitím tu poskytnutých informácií o sekvencií a môžu byť ďalej navrhnuté tak, aby zavádzali nové vhodné reštrikčné miesta, pokiaľ je to vhodné, kvôli uľahčeniu inkorporácie do daného vektora pre rekombinantnú expresiu.
158/B
Nukleové kyseliny podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripojené na prirodzené regulačné sekvencie z Arabidopsis, alebo môžu byť spojené s heterológnymi sekvenciami, vrátane promótorov, zosilňovačov transkripcie, responzívnych elementov, signálnych sekvencií, polyadenylačných sekvencíí, intrónov, 5'- a 3'- nekódujúcich regiónov a podobne. Nukleové kyseliny môžu byť tiež modifikované akýmikoľvek v odbore známymi prostriedkami. Nelimitujúce príklady takýchto modifikácií zahrňujú metyláciu, „pripojenie čapičky,,, substitúciu jedného alebo viacerých prirodzených nukleotidov analógom a internukleotidové modifikácie, ako je napríklad nenabitá väzba (napríklad metylfosfonátová, fosfotriesterová, fosforoamidatová, karbamátová atď.) a nabitá väzba (napríklad fosforotioátová, fosforoditioátová, atď.). Nukleové kyseliny skupín, ako sú napríklad proteíny (napríklad nukleózy, toxíny, protilátky, signálne peptidy, poly-L-lyzín, atď.), interkalačné činidlá (napríklad akridín, psoralén, atď.), chelačné činidlá (napríklad kovy, rádioaktívne kovy, železo, oxidatívne kovy, atď.) a alkylačné činidlá. Nukleové kyseliny môžu byť derivatizované tvorbou metyl- alebo etylfosfotriesterovej alebo alkylfosforoamidátovej väzby. Okrem toho, sekvencie nukleových kyselín podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež modifikované tak, aby obsahovali značku umožňujúcu detekciu, buď priamu alebo nepriamu. Príkladom značenia sú rádioizotopy, fluorescentné molekuly, biotín a podobne.
Vynález tiež obsahuje vektory nukleových kyselín obsahujúce opísané HPPD sekvencie alebo ich deriváty alebo fragmenty. Veľké množstvo vektorov, vrátane plazmidových a mykotických vektorov, bolo opísané pre replikáciu a/alebo expresiu v rôznych eukaryotických a prokaryotických hostiteľoch. Nelimitujúce príklady zahrňujú pKK plazmidy (Clontech), pUC plazmidy, pET plazmidy (Novagen, Inc., Madison, Wl) alebo pRSET alebo pREP (Invitrogen, San Diego, CA) a veľa vhodných hostiteľských buniek, s použitím tu opísaných spôsobov alebo iných spôsobov v odbore známych. Rekombinantné klonovacie vektory budú často obsahovať jeden alebo viacero replikačných systémov na klonovanie a expresiu, jeden alebo viacero markerov na selekciu v hostiteľovi, napríklad rezistenciu na antibiotiká a jednu alebo viacero expresných kaziet. Vhodné hostiteľské bunky môžu byť transforrpované/transfektované/infikované
158/B podľa toho, čo je vhodné, akýmikoľvek vhodnými spôsobmi, vrátane elektroporácie, CaCL sprostredkovaného vychytávania DNA, mykotickej infekcie, mikroinjekcie, mikroprojektilov alebo pomocou inej zavedenej metódy.
Vhodné hostiteľské bunky zahrňujú baktérie, archaebaktérie, huby, hlavne kvasinky a rastlinné a zvieracie bunky, hlavne cicavčie bunky. Najmä vhodné sú E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Schizosaccharomyces pombi, SF9 bunky, C129 bunky, 293 bunky, Neurospora a CHO bunky, COS bunky, HeLa bunky a imortalizované cicavčie myeloidné a lymfoidné bunkové línie. Výhodne replikačné systémy zahrňujú M13, ColE1, SV40, bakulovírus, lambda, adenovírus a podobne. Bol izolovaný veľký počet transkripčných iniciačných a terminačných regulačných regiónov a preukázalo sa, že sú účinné v transkripcii a translácii heterológnych proteínov v rôznych hostiteľoch. Príklady týchto regiónov, spôsoby izolácie, spôsoby manipulácie, atď. sú v odbore známe, pri vhodných podmienkach na expresiu môžu byť hostiteľské bunky použité ako zdroj rekombinantne produkovaných peptidov a polypeptidov odvodených od HPPD.
Výhodne môžu vektory tiež obsahovať transkripčný regulačný element (t.j. promótor) operatívne naviazaný na HPPD časť. Promótor môže voliteľne obsahovať operátor a/alebo väzbové miesta pre ribozómy. Nelimitujúce príklady bakteriálnych promótorov kompatibilných s E. coli zahrňujú: trc promótor, betalaktamázový (penicilinázový) promótor, laktózový promótor, tryptofánový (trp) promótor, promótor z Arabinosa BAD operónu, promótor odvodený od lambda P1 a väzbové miesto pre ribozómy N génu a hybridný tac promótor odvodený od sekvencií trp a lac UV5 promótorov. Nelimitujúce príklady kvasinkových promótorov zahrňujú promótor 3-fosfoglycerát kinázy, promótor glyceraldehyd3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH), galaktokinázový (GALI) promótor, galaktoepimerázový promótor a alkohol dehydrogenázový (ADH) promótor. Vhodné promótory pre cicavčie bunky zahrňujú bez obmedzenia vírusové promótory ako je promótor zo Simian vírus 40 (SV40), vírus Rousovho sarkómu (RSV), adenovírus (ADV) a hovädzí papiloma vírus (BVP). Cicavčie bunky môžu tiež vyžadovať terminačné sekvencie a poly A adičné sekvencie a môžu
158/B byť tiež obsiahnuté sekvencie zosilňovačov transkripcie, ktoré môžu zvyšovať expresiu. Sekvencie, ktoré spôsobujú amplifikáciu génu, môžu byť tiež žiaduce. Ďalej môžu byť tiež obsiahnuté sekvencie uľahčujúce sekréciu rekombinantného produktu z buniek, vrátane, ale bez obmedzenia, bakteriálnych, kvasinkových a zvieracích buniek, ako sú sekrečné signálne sekvencie a/alebo sekvencie pre región prohormónu.
Nukleové kyseliny kódujúce prirodzené alebo variantné HPPD polypeptidy môžu byť tiež vložené do buniek pomocou rekombinantných techník. Napríklad takáto sekvencia môže byť vložená do bunky a môže spôsobiť homológnu rekombináciu v mieste endogénneho génu alebo sekvencie s významnou identitou s génom. Môžu sa tiež použiť iné metódy založené na rekombinácii, ako je nehomológna rekombinácia alebo delécia endogénnych génov homológnou rekombináciou.
Polypeptidy odvodené od HPPD podľa predkladaného vynálezu, vrátane funkčne konzervatívnych variantov HPPD, môžu byť izolované z prirodzených alebo mutantných Arabidopsis buniek, alebo z heterológnych organizmov alebo buniek (vrátane, ale bez obmedzenia, bakteriálnych, mykotických, hmyzích, rastlinných a cicavčích buniek), do ktorých bola vložená a exprimovaná sekvencia kódujúca proteín odvodený od HPPD. Okrem toho, polypeptid môže byť súčasťou rekombinantných fúznych proteínov. Alternatívne môže byť polypeptid syntetizovaný chemicky s použitím komerčne dostupných automatizovaných postupov, vrátane, ale bez obmedzenia, vylučovacej syntézy na pevnej fáze, spôsobov využívajúcich čiastočnú pevnú fázu, kondenzáciu fragmentu a klasické syntézy v roztoku.
„Prečistenie,, HPPD polypeptidu označuje izoláciu HPPD polypeptidu vo forme, ktorá umožňuje meranie jeho enzymatickej aktivity bez interferencie s inými zložkami buniek, v ktorých je polypeptid exprimovaný. Spôsoby na prečistenie polypeptidu sú v odbore dobre známe, vrátane, ale bez obmedzenia, preparatívnej diskovo-gélovej elektroforézy, izoelektrického fokusovania, HPLC, HPLC s reverznou fázou, gélovej filtrácie, iónomeničovej a rozdeľovacej chromatografie a protiprúdového rozdeľovania. Na niektoré účely
158/B je výhodné produkovať polypeptid v rekombinantnom systéme, v ktorom obsahuje HPPD proteín ďalšiu sekvenciu, ktorá uľahčuje prečistenie, ako je napríklad, ale bez obmedzenia, polyhistidínová sekvencia. Polypeptid môže byť prečistený zo surového lyzátu hostiteľských buniek chromatografiou na vhodnej matrici pevnej fázy. Alternatívne môžu byť ako činidlo pri prečisťovaní použité protilátky proti HPPD a peptidom od nej odvodených. Iné metódy prečistenia sú tiež možné.
Predkladaný vynález tiež obsahuje deriváty a homológy HPPD polypeptidov. Na niektoré účely môže byť sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej peptidy zmenená substitúciami, adíciami alebo deléciami tak, že vznikajú funkčne ekvivalentné molekuly, t.j. funkčne konzervatívne varianty. Napríklad jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov v sekvencii môžu byť substituované inými aminokyselinami podobných vlastností, ako sú napríklad pozitívne nabité aminokyseliny (arginín, lyzín a histidín), negatívne nabité aminokyseliny (aspartát a glutamát), polárne neutrálne aminokyseliny a nepoláme aminokyseliny.
Izolované polypeptidy môžu byť modifikované napríklad fosforyláciou, sulfatáciou, acyláciou alebo inými spôsobmi modifikácie proteínov. Môžu byť tiež opatrené značkou umožňujúcou detekciu, buď priamu alebo nepriamu, vrátane, ale bez obmedzenia, rádioaktívnych alebo fiuorescentných zlúčenín.
Vyšetrovacie metódy na identifikáciu HPPD inhibítorov/herbicídov > Spôsoby a prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité na identifikáciu zlúčenín, ktoré inhibujú funkciu HPPD, a preto sú použiteľné ako herbicídy alebo ako východiskové zlúčeniny pri vývoji herbicídov. Tento účel sa dosiahne pomocou buniek, ktoré exprimujú HPPD, a tak produkujú kyselinu homogentisovú z 4-hydroxyfenylpyruvátu (OHPP). Bunkové kultúry exprimujúce HPPD sú inkubované za prítomnosti testovaných zlúčenín za vzniku testovacích kultúr a za absencie testovaných zlúčenín za vzniku kontrolných kultúr. Inkubácia prebieha dostatočne dlhý čas a za vhodných
Ί4 1GQ/D podmienok, aby sa umožnila interferencia s funkciou HPPD. Vo vopred určený čas po začiatku inkubácie s testovanou zlúčeninou je vykonaný test na sledovanie HPPD enzymatickej aktivity. Vo výhodnom vyhotovení je HPPD aktivita sledovaná vizuálne, podľa vzniku červenohnedých pigmentov produkovaných pri oxidácii a/alebo polymerizácii kyseliny homogentisovej (La Du et al., v Ochronosis, Pigments in Pathology, M. Wolman (ed.) Academic Press, NY, 1969). Alternatívne môže byť HPPD enzymatická aktivita sledovaná v bunkových extraktoch, s použitím bežných testov, ako sú napríklad testy opísané v príklade 1, ďalej. Ďalšie kontroly vzhľadom na kultivačné vzorky a testovacie vzorky, sú tiež obsiahnuté, ako je napríklad hostiteľská bunka neexprimujúca HPPD (napríklad hostiteľská bunka transformovaná expresným plazmidom obsahujúcim HPPD gén v reverznej orientácii alebo bez inzertu). Zlúčeniny s ínhibičnou aktivitou pre HPPD sú identifikované ako tie zlúčeniny, ktoré redukujú HPPD aktivitu v testovacích kultúrach vo vzťahu ku kontrolným kultúram.
Hostiteľské bunky, ktoré môžu byť použité v predkladanom vynáleze, zahrňujú bez obmedzenia bakteriálne, mykotické, hmyzie, cicavčie a rastlinné bunky. Výhodne sú použité bakteriálne bunky. Najlepšia je bakteriálna bunka variantná (napríklad imp mutant E. coli) vykazujúca zvýšenú membránovú permeabilitu pre testovanú zlúčeninu vzhľadom na prirodzený typ hostiteľských buniek.
Výhodne sú spôsoby podľa predkladaného vynálezu adaptované na priame vyšetrovanie, ktoré umožňuje testovanie mnohých zlúčenín v jednom teste. Takéto inhibičné zlúčeniny môžu byť nájdené napríklad v knižniciach prirodzených produktov, fermentačných knižniciach (obsahujúcich rastliny a mikroorganizmy), kombinatoriálnych knižniciach, súboroch zlúčenín a knižniciach syntetických zlúčenín. Napríklad, knižnice syntetických zlúčenín sú komerčne dostupné od Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) a Microsource (New Milford, CT). Vzácna chemická knižnica je dostupná od Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, Wl). Alternatívne, knižnice
158/B prirodzených zlúčenín vo forme bakteriálnych, mykotických, rastlinných alebo zvieracích extraktov sú dostupné napríklad od Pan Laboratories (Bothell, WA) alebo MycoSearch (NC), alebo je možné ich ľahko vyrobiť. Ďalej, prirodzené a syntetické produkované knižnice a zlúčeniny je možné ľahko modifikovať bežnými fyzikálnymi, chemickými a biochemickými prostriedkami (Blondelle et al., TibTech 14, 60, 1996). Testy na inhibítor HPPD podľa predkladaného vynálezu sú výhodné vtom, že sa prispôsobujú mnohým rôznym typom rozpúšťadiel, a tak umožňujú testovanie zlúčenín z mnohých zdrojov.
Po tom, čo bola zlúčenina pomocou spôsobov podľa predkladaného vynálezu identifikovaná ako inhibítor HPPD, môžu byť vykonané in vitro a in vivo testy na ďalšiu charakterizáciu vlastností a mechanizmu HPPD inhibičnej aktivity. Napríklad, účinok identifikovanej zlúčeniny na in vitro enzymatickú aktivitu prečistenej alebo čiastočne prečistenej HPPD môže byť určený spôsobom opísaným v príklade 1 ďalej. Grafy klasickej enzýmovej kinetiky sa môžu použiť na rozlíšenie napríklad kompetitívnych a nekompetitívnych inhibítorov.
Zlúčeniny identifikované ako inhibítory HPPD s použitím spôsobov podľa predkladaného vynálezu sa môžu modifikovať tak, aby sa zvýšila ich účinnosť, sila, vychytávanie, stabilita a vhodnosť na komerčné použitie herbicídov, atď. Tieto modifikácie sa dosiahnu známymi spôsobmi a sú testované s použitím spôsobov dobre známych v odbore.
Izolácia HPPD variantov rezistentných na herbicíd
Predkladaný vynález tiež obsahuje izoláciu HPPD variantov rezistentných na účinok HPPD inhibítorov/herbicídov. HPPD varianty môžu byť prirodzené alebo sa môžu získať náhodnou alebo miestne riadenou mutagenézou.
158/B
V jednom vyhotovení je vykonaná mutácia populácie buniek alebo organizmov exprimujúcich HPPD s použitím postupov dobre známych v odbore a potom sú bunky alebo organizmy podrobené vyšetrovaniu alebo selekcii na identifikáciu tých buniek alebo organizmov, ktoré sú rezistentné na toxické účinky HPPD inhibítora. Variantný HPPD gén je potom izolovaný z rezistentných buniek alebo organizmov napríklad s použitím PCR techník.
V inom vyhotovení je izolovaný HPPD gén podrobený náhodnej alebo miestne riadenej mutagenéze in vitro a po nej sú mutované verzie génu znova vložené do vhodných buniek, ako je napríklad E. coli a bunky sú podrobené selekcii alebo vyšetrovaniu ako bolo opísané vyššie.
Variantné HPPD gény sú exprimované vo vhodných hostiteľských bunkách a enzymatické vlastnosti variantných HPPD polypeptidov sú porovnávané s vlastnosťami prirodzeného HPPD. Výhodne vedie daná mutácia k vzniku HPPD variantného polypeptidu, ktorý si zachováva in vitro enzymatickú aktivitu pre 4-hydroxyfenylpyrohroznovú kyselinu (OHPP), t.j. pre konverziu OHPP na kyselinu homogentisovú (a tak je možné očakávať biologickú aktivitu in vivo) a zároveň vykazuje katalytickú aktivitu, ktorá je relatívne viac rezistentná voči vybranému herbicídu ako je prirodzený HPPD. Výhodne vykazuje variantný HPPD proteín rezistentný na herbicídy pri expresii v bunkách, pre ktoré je nutná HPPD aktivita pre životaschopnosť: (i) katalytickú aktivitu, ktorá je samotná dostatočná na udržiavanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná; alebo katalytickú aktivitu v kombinácii s akýmkoľvek iným HPPD variantným proteínom rezistentným na herbicídy, ktorý môže byť rovnaký alebo odlišný od prvého HPPD variantného proteínu, ktorá je dostatočná na udržiavanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná; a (ii) katalytickú aktivitu, ktorá je viac rezistentná na herbicíd ako je prirodzená HPPD.
Preto nemusí mať akýkoľvek špecifický HPPD variantný proteín celkovú katalytickú aktivitu nevyhnutnú na udržanie životaschopnosti buniek, ale musí mať určitú katalytickú aktivitu v množstve, ktoré je samostatne alebo v kombinácii s katalytickou aktivitou ďalších kópií rovnakého HPPD variantu
158/B a/alebo katalytickou aktivitou iného HPPD variantného proteínu, dostatočná na udržanie životaschopnosti buniek, ktoré vyžadujú HPPD aktivitu pre svoju životaschopnosť. Napríklad katalytická aktivita sa môže zvýšiť na minimálne prijateľné hladiny vložením mnohých kópií génu kódujúceho variant do buniek alebo vložením génu, ktorý ďalej obsahuje relatívne silný promótor na zvýšenie produkcie variantu.
Väčšia rezistencia znamená, že katalytická aktivita variantu je zmenšená herbicídom, pokiaľ vôbec, tak v menšom rozsahu ako katalytická aktivita prirodzenej HPPD. Výhodne si viac rezistentný variant HPPD uchováva dostatočnú katalytickú aktivitu na udržanie životaschopnosti bunky, rastliny alebo organizmu, keď pri rovnakej koncentrácii rovnakého herbicídu si prirodzená HPPD neuchová dostatočnú katalytickú aktivitu na udržanie životaschopnosti bunky, rastliny alebo organizmu.
Výhodne je katalytická aktivita za neprítomnosti herbicídu aspoň približne 5 % a lepšie je vyššia ako približne 20 % katalytickej aktivity prirodzenej HPPD za neprítomnosti herbicídu.
V prípade variantu HPPD rezistentnej na triketóny je výhodné, aby HPPD variantný proteín mal:
(i) katalytickú aktivitu za neprítomnosti herbicídu vyššiu ako približne 20 % katalytickej aktivity uvedenej prirodzenej HPPD; a (ii) katalytickú aktivitu, ktorá je relatívne viac rezistentná na prítomnosť triketónových herbicídov v porovnaní s prirodzenou HPPD.
Variantné HPPD rezistentné na herbicídy môžu byť použité ako genetické markery v akýchkoľvek bunkách, ktoré sú normálne senzitívne na inhibičný účinok herbicídov na rast a/alebo tvorbu pigmentu. V jednom vyhotovení je DNA kódujúca variant HPPD rezistentnej na herbicídy vložená do plazmidu pod kontrolou vhodného promótora. Akýkoľvek požadovaný gén môže byť potom vložený do plazmidu a konečný rekombinantný plazmid je potom vložený do buniek senzitívnych na herbicíd. Bunky, ktoré boli transformované plazmidom, sú potom selektované alebo vyšetrované inkubáciou za prítomnosti
15ft/R takej koncentrácie herbicídu, ktorá je dostatočná na inhibíciu rastu a/alebo tvorby pigmentu.
Chemicky rezistentné rastliny a rastliny obsahujúce variantné HPPD gény
Predkladaný vynález obsahuje transgénne rastliny, vrátane, ale bez obmedzenia, semien, organizmov a rastlín, do ktorých boli vložené gény kódujúce varianty HPPD rezistentné na herbicídy. Nelimitujúce príklady vhodných rastlín, ktoré môžu byť príjemcami génov, sú uvedené v tabuľke 1, ďalej.
Tabuľka 1
Všeobecný názov Čeľaď Latinský názov
Kukurica, siata Gramineae Zea mays
Kukurica zubovitá (konský zub) Gramineae Zea mays dentiformis
Kukurica sklovitá (tvrdá) Gramineae Zea mays vulgaris
Kukurica pukancová (perlová) Gramineae Zea mays microsperma
Kukurica škrobová (mäkká) Gramineae Zea mays amylacea
Kukurica obalenozrnová Gramineae Zea mays amyleasaccharate
Kukurica cukrová Gramineae Zea mays sacchara*e
Kukurica vosková (čínska) Gramineae Zea mays ceratina
Pšenica špaldová Pooideae Triticum spelta
Pšenica tvrdá Pooideae Triticum durum
Pšenica hrubozrnová Pooideae Triticum turgidum
Pšenica špaldová Pooideae Triticum spelta
Pšenica poľská Pooideae Triticum polónium
Pšenica hrubozrnová Pooideae Triticum turgidum
Pšenica jednozrnková Pooideae Triticum monococcum
Pšenica jednozrnková Pooideae Triticum monococcum
15fl/R
Pšenica pravá (ostenná) Pooideae Triticum aestivum
Ryža siata Gramineae Oryza sativa
Zizania vodná (indická ryža) Gramineae Zizania aquatica
Ryža austrálska Gramineae Oryza australiensis
Zizania vodná (indická ryža) Gramineae Zizania aquatica
Ryža červená Gramineae Oryza glaberrima
Zizania vodná (indická ryža) Gramineae Zizania aquatica
Ryža západoafrická Gramineae Oryza glaberrima
Jačmeň siaty Pooideae Hordeum vulgare
Jačmeň etiópsky stredný a tiež nepravidelný Pooideae Hordeum irregulare
Jačmeň Ancestral Tworow Pooideae Hordeum spontaneum
Jačmeň bezfúzatý Pooideae Hordeum trifurcatum
Jačmeň egyptský Pooideae Hordeum trifurcatum
Jačmeň štvorradový Pooideae Hordeum vulgare polystichon
Jačmeň šesťradový Pooideae Hordeum vulgare hexastichon
Jačmeň pravý Pooideae Hordeum distichon
Bavlník Abroma Dicotyledoneae Abroma augusta
Bavlník chlpatý Malvaceae Gossypium hirsutum
Bavlník barbadoský Malvaceae Gossypium arboreum
Bavlník barbadoský brazílsky Malvaceae Gossypium barbadense brasiliense
Bavlník bylinný Malvaceae Gossypium herbaceum
Bavlník barbadoský Malvaceae Gossypium barbadense
Bavlník chlpatý Malvaceae Gossypium hirsutum
Sója fazuľová Leguminosae Glycine max
Repa obyčajná cukrová Chenopodiaceae Beta vulgaris altissima
Cukrová trstina Dreviny Arenga pinnata
Rajčiak jedlý Solanaceae Lycopersicon esculentum
Rajčiak jedlý višňovitý Solanaceae Lycopersicon esculentum
158/B
cerasiforme
Rajčiak jedlý obyčajný Solanaceae Lycopersicon esculentum commune
Rajčiak bedrovníkolistý (ríbezľový) Solanaceae Lycopersicon pimpinellifolium
Rajčiak jedlý (Husk) Solanaceae Physalis ixocarpa
Rajčiak jedlý (Hyenas) Solanaceae Solanum incanum
Rajčiak jedlý hruškovitý Solanaceae Lycopersicon esculentum pyriforme
Rajčiak jedlý (Tree) Solanaceae Cyphomandra betacea
Ľuľok zemiakový (zemiak) Solanaceae Solanum tuberosum
Povojník batatový Convolvulaceae Ipomoea batatas
Raž siata Pooideae Secale cereale
Raž horská Pooideae Secale montanum
Paprika ročná veľkoplodá Solanaceae Capsicum annuum grossum
Paprika ročná Solanaceae Capsicum annuum minimum
Paprika čínska Solanaceae Capsicum sinense
Paprika ročná veľkoplodá Solanaceae Capsicum annuum grossum
Paprika ročná (Cherry) Solanaceae Capsicum annuum cerasiforme
Paprika ročná (Cluster, Red Cluster) Solanaceae Capsicum annuum fasciculatum
Paprika ročná (Cone) Solanaceae Capsicum annuum conoides
Paprika kríčkovitá (Goat, Spur) Solanaceae Capsicum frutescens
Paprika kríčkovitá dlhoplodá Solanaceae Capsicum frutescens longum
Paprika ročná zakrpatená Solanaceae Capsicum annuum abbreviatum
Paprika ročná (Tabasco Red) Solanaceae Capsicum annuum conoides
Šalát siaty Compositae Lactuca sativa
Šalát siaty špargľový Compositae Lactuca sativa asparagina
Šalát trváci Compositae Lactuca perennis
15R/R
Šalát (Blue, cigorka) Compositae Lactuca pulchella
Šalát siaty hlávkový Compositae Lactuca sativa capitata
Šalát siaty dlholistý (rímsky) Compositae Lactuca sativa longifolia
Šalát siaty kučeravý Compositae Lactuca sativa crispa
Zeler voňavý stopkový Umbelliferae Apium graveolens dulce
Zeler voňavý stopkový Umbelliferae Apium graveolens dulce
Zeler voňavý buľvový Umbelliferae Apium graveolens repaceum
Ľuľok baklažánový (baklažán) Solanaceae Solanum melongena
Cirok obyčajný (všetky druhy) Sorghum Všetky druhy
Lucerna siata Leguminosae Medicago sativum
Mrkva obyčajná siata Umbelliferae Daucus carota sativa
Fazuľa záhradná pravá Leguminosae Phaseolus vulgaris vulgaris
Fazuľa zlatá Leguminosae Phaseolus aureus
Fazuľa (brazílska veľká) Leguminosae Canavalia ensiformis
Bôb obyčajný Leguminosae Vicia faba
Fazuľa záhradná Leguminosae Phaseolus vulgaris
Lablab obyčajný Leguminosae Dolichos lablab
Vigna špargľová Leguminosae Vigna sesquipedalis
Psofokarp paľadencový (fazuľa goa) Leguminosae Psophocarpus tetragonolobus
Ovos siaty (Side Tree) Avena Sativa
Ovos hrebienkatý Avena Strigosa
Ovos štetinatý Avena
Hrach siaty pravý Leguminosae Pisum sativum sativum
Vigna čínska Leguminosae Vigna sinensis
Hrach siaty cukrový Leguminosae Pisum sativum axiphium
Hrach siaty kŕmny Leguminosae Pisum sativum speciosum
Paľadenec purpurový Leguminosae Tetragonolobus purpureus
Hrach siaty stržňový Leguminosae Pisum sativum medullare
Slnečnica ročná Compositae Heliantus annuus
Tekvica obrovská Dicotyledonae Cucurbita maxima
158/B
Tekvica obyčajná sladkastá Dicotyledonae Cucurbita pepo melopepo
Tekvica obrovská turbanovitá Dicotyledonae Cucurbita maxima turbaniformis
Uhorka siata Dicotyledonae Cucumis sativus
Momordika horká Dicotyledonae Momordica charantia
Tekvičník striekaný Ecballium elaterium
Uhorka divoká Cucumis anguria
Topoľ chlpatoplodý Dreviny Populus trichocarpa
Topoľ čierny Populus nigra
Topoľ sivý Populus canescens
Topoľ lombardský Populus italica
Topoľ biely Populus alba
Topoľ chlpatoplodý Populus trichocarpa
Tabak Solanacea Nicotiana
Arábovka thalova Cruciferae Arabidopsis thaliana
Mätonoh Lolium
Psinček Agrostis
Ďalšie rody tráv
Ďatelina Leguminosae
Expresia variantných HPPD polypeptidov v transgénnych rastlinách spôsobuje vysokú hladinu rezistencie na herbicídy, vrátane, ale bez obmedzenia, triketónových herbicídov, ako je napríklad sulcotrión, čo umožňuje použitie takýchto herbicídov v priebehu kultivácie transgénnych rastlín.
Spôsoby na zavedenie cudzorodých génov do rastlín sú v odbore známe, nelimitujúcimi príkladmi takýchto metód sú infekcie Agrobácterium, ostreľovanie časticami, ošetrenie protoplastov polyetylénglykolom (PEG), elektroporácia protoplastov, mikroinjekcie, makroinjekcie, kultivačné injekcie, prostredníctvom peľových zŕn, inhibícia suchých semien, laserová perforácia a elektroforéza. Tieto spôsoby sú opísané napríklad v B. Jenes et al., a S. W. Ritchie et al., vTransgenic Plants, zv. 1, Engineering and Utilization, ed. S. D.
158/B
Kung, R. Wu, Academic Press, Inc. Harcourt Brače Jovanovich 1993, a L. Mannonen etal., Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310, 1994).
Vo výhodnom vyhotovení je DNA kódujúca variantnú HPPD klonovaná do DNA vektora obsahujúceho markerový gén pre rezistenciu na antibiotiká a rekombinantný plazmid obsahujúci DNA pre HPPD je vložený do Agrobacterium tumefaciens obsahujúceho Ti plazmid. Tento „binárny vektorový systém,, je opísaný napríklad v U.S. patente č. 4 490 838 a v An et al., Plánt. Mol. Biol. Manual A3, 1-19 (1988). Transformované Agrobacterium je potom kultivované súčasne s listovými diskami z rastliny, ktorá má byť príjemcom a tak sa umožní infekcia a transformácia rastlinných buniek. Transformované rastlinné bunky sú potom kultivované v regeneračnom médiu, ktoré navodzuje tvorbu výhonkov, najprv za prítomnosti vhodného antibiotika kvôli selekcii transformovaných buniek a potom za prítomnosti herbicídu. V rastlinných bunkách úspešne transformovaných DNA kódujúcej HPPD rezistentnú na herbicíd prebieha tvorba výhonkov i za prítomnosti takých koncentrácií herbicídu, ktoré inhibujú tvorbu výhonkov u netransformovaných buniek. Po potvrdení prítomnosti variantnej DNA s použitím napríklad analýzy polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) sú transformované rastliny testované na schopnosť odolávať postreku herbicídom a na schopnosť klíčenia semien a tvorbu koreňov za prítomnosti herbicídu.
Spôsoby a prostriedky podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť na produkciu variantov HPPD rezistentnej na herbicíd, ktoré môžu byť vložené do rastlín a môžu spôsobiť rezistenciu rastlín na herbicíd. Intermediálne varianty HPPD (napríklad varianty, ktoré vykazujú sub-optimálnu špecifickú aktivitu, ale vysokú rezistenciu na herbicíd, alebo naopak), sú použiteľné ako templáty na vývoj druhej generácie variantov HPPD, ktoré si budú uchovávať zodpovedajúcu špecifickú aktivitu a vysokú rezistenciu.
Gény pre HPPD rezistentné na herbicídy môžu byť transformované do plodín za účelom vyvolania rezistencie na herbicídy v jednej alebo vo viacerých kópiách. Genetické spracovanie plodín s redukovanou citlivosťou na herbicídy môže:
158/B
1. Zvýšiť spektrum a pružnosť použitia špecifických účinných herbicídov neškodných pre životné prostredie.
2. Zvýšiť komerčnú hodnotu takýchto herbicídov.
3. Redukovať pôsobenie buriny na poliach s použitím herbicídu na plodiny rezistentné na herbicíd a zodpovedajúcim spôsobom zvýšiť zber.
4. Zvýšiť predaj semien rastlín rezistentných na herbicídy.
5. Zvýšiť odolnosť plodín na poškodenie spôsobené herbicídmi, ktoré zostali z predchádzajúceho pestovania.
6. Znížiť citlivosť na zmeny citlivosti voči herbicídu, ktoré sú spôsobené nepriaznivými klimatickými podmienkami a
7. Zvýšiť toleranciu na nerovnomerne alebo zle aplikované herbicídy.
Napríklad sa môže pestovať rastlina obsahujúca transgénny variantný HPPD proteín. Plodina môže byť ošetrená účinným množstvom herbicídu na kontrolu rastu burín, na ktoré je transgénna rastlina obsahujúca HPPD variant rezistentná, čo vedie ku kontrole rastu buriny bez škodlivého ovplyvnenia pestovanej plodiny.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady sú myslené ako ilustrácia predkladaného vynálezu, bez jeho obmedzenia.
Príklad 1
Expresia Arabidopsis HPPD v E. coli
Nasledujúci pokus bol vykonaný ako dôkaz produkcie vysokých koncentrácií enzymaticky aktívneho Arabidopsis HPPD v E. Coli.
1ŕ5fi/B
A. Klonovanie a transformácia baktérií
HPPD kódujúca sekvencie bola klonovaná do pKK233-2 expresného vektora (Clontech) tak, že ATG iniciačný kodón HPPD bol v rámčeku strč promótorom, s použitím PCR metódy. Primér označený ATHPPD6F (5'GAAATCCATGGCACCAAAACG-3'), ktorý hybridizoval v regióne HPPD štart kodónu (tučné), obsahoval zmenu jednej bázy (A na C, kurzívou) na generovanie Ncol miesta (podčiarknuté). Primér označený ATHPPD6R (5'CTTCTCCATGGTCATCCCACTAACTGT-3'), ktorý hybridizoval v regióne HPPD stop kodónu (tučné) obsahujúci Ncol miesto mimo kódujúci región (podčiarknuté).
PCR reakcia bola vykonaná s použitím vyššie uvedených primérov a HPPD sekvencie izolovanej z vyšetrenia cDNA knižnice ako templátovej DNA. Reakčná zmes (100 μΙ) obsahovala nasledujúce zložky: 2 ng plazmidovej DNA, 1X PCR pufor, 200 mM každého deoxynukleotid trifosfátu, 2,5 jednotiek AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer), 13 pmól priméru ATHPPD6F a 11 pmól priméru ATHPPD6F. Reakčná zmes sa zahriala na 95 °C na 2 minúty a potom bola amplifikovaná s použitím 30 cyklov: 95 °C, 1 minúta, 55 °C, 2 minúty, 72 °C, 1,5 minúty. Potom nasledovala inkubácia pri 72 °C počas 7 minút.
Bol amplifikovaný 1,3 kb PCR produkt. Fragment bol rozdelený na 1,2 % Nu Sieve GTG gélu (FMC) a bol prečistený (GeneClean, Bio 101). Prečistený fragment bol trávený Ncol a bol ligovaný do Ncol tráveného, alkalickou fosfatázou ošetreného pKK233-2 vektora (Clontech). Ligačná zmes bola transformovaná do DH5cc Library Efficiency Competent Celíš (Gibco BRL). Transformanty exprimujúce HPPD boli identifikované podľa produkcie červenohnedej farby pri kultivácii cez noc na LB s ampicilínom.
Transformanty boli tiež pripravené transformáciou DH5a buniek prázdnym pKK233-2 vektorom a tieto transformanty boli použité ako kontrola v enzymatíckých testoch.
1AQ/R
B. Produkcia hnedého pigmentu a kyseliny homogentisovej v E. coli
Tvorba hnedého pigmentu bola pozorovaná v kolóniách kultivovaných na pevnom médiu a v kvapalných kultúrach E. coli transformovanej HPPD génom Arabidopsis. Žiadna podobná hnedá pigmentácia nebola asociovaná s netransformovanými E. coli alebo s E. coli transformovanými kontrolným vektorom. Tvorba hnedého pigmentu (ktorý vykazuje charakteristickú absorpciu pri 240 nm) bola zvýšená pri doplnení média tyrozínom (obr. 2).
Je známe, že kyselina homogentisová hnedne pri státí alebo pri alkalizácii alebo pri expozícii kyslíka, čo je spôsobené tvorbou ochronotického pigmentu (La Du et al., v Ochronosis, Pigments in Pathology, M. Wolman (ed.), Academic Press, NY, 1969). Podobné pigmenty sa tvoria pri prirodzene sa vyskytujúcej sekrécii a oxidácii kyseliny homogentisovej v niektorých baktériách (Trias et al., Can. J. Microbiol. 35, 1037, 1989, Goodwin et al., Can. J. Microbiol. 40, 28, 1995). Preto výskyt hnedého pigmentu ukazuje, že E. coli bunky transformované Arabidopsis HPPD génom ako je opísané vyššie, produkujú veľké množstvá kyseliny homogentisovej. Okrem toho, pretože tyrozín je metabolizovaný na hydroxyfenylpyruvát (čo poskytuje ďalší substrát pre HPPD), podporuje zvýšený vývoj farbiva za prítomnosti zvýšených koncentrácií tyrozínu záver, že hnedý pigment vzniká v dôsledku aktivity HPPD.
Toto bolo potvrdené priamym meraním kyseliny homogentisovej s použitím metódy HPLC. Podmienky HPLC na určenie kyseliny homogentisovej boli rovnaké ako podmienky, ktoré opísal Denoya et al. (J. Bacteriol. 176, 5312, 1994). HPLC systém sa skladal zWaters 510 prenosového modulu (Waters Assoc., Milford, MA), Waters 996 fotodiódového detektoru, WISP 710B automatického zariadenia na odber vzoriek a Waters 840 systému na zhromažďovanie dát. Bola použitá Phenomenex Spherisorb 5 ODS (1) C18 kolóna s reverznou fázou (5 mm veľkosť častíc, 250 x 4,6 mm vnútorný priemer), ktorá bola pripojená na predkolónu z nehrdzavejúcej ocele vybavená C18 živicou. Mobilná fáza (10 mM kyselina octová : metariol, 85 : 15 obj./obj.) pretekala pri prietoku 1 ml/min. Vlnová dĺžka bola nastavená na 292 nm. Vzorky
158/B kultivačného média (1 ml) boli okyslené zmiešaním so 100 ml ľadovej kyseliny octovej a boli prejasnené centrifugáciou. 50 ml zmesi bolo injikované do kolóny. Pík zodpovedajúci kyseline homogentisovej bol porovnávaný so štandardom kyseliny homogentisovej za účelom identifikácie a kvantifikácie.
Kultivačné médium získané z kultúr kontrolných E. coli buniek kultivovaných cez noc nevykazovalo žiadne stopy kyseliny homogentisovej (obr. 3A). Naopak, E. coli transformované HPPD produkovali vysoké hladiny kyseliny homogentisovej (obr. 3B). Pík eluovaný v 8. minúte migroval súčasne so skutočnou kyselinou homogentisovou a mal absorpčné spektrum rovnaké so skutočnou kyselinou homogentisovou (vložený graf).
C. Test HPPD aktivity
Transformanty E. coli boli ošetrené 0,1 mg/ml lyzozýmom v 50 mM pufra obsahujúceho fosforečnan draselný (pH 7,3) pri 30 °C počas 10 minút. Bunky boli sonikované (3-krát, zakaždým 5 sekúnd, s použitím VibraCelI sonikátora, Sonics and Materiál, Inc., Danbury, CT) a extrakt bol podrobený centrifugácii. Supernatant bol odsolený na Econo-Pac 10 DG kolóne (Bio-Rad, Richmond, CA), ktorá bola uvedená do rovnováhy 50 mM fosfátovým pufrom (pH 7,3). Odsolený extrakt obsahujúci HPPD bol použitý pre HPPD test.
HPPD enzymatická aktivita bola určená záchytom uvoľneného 14CO2 z 14C-hydroxyfenylpyruvátu (Schuly et al., FEBS Letts., 318, 162, 1993, Secor, Plánt Physiol. 106, 1429, 1994). Reakcia bola vykonaná v 20 scintilačných fiolách, ktoré boli uzatvorené zátkou nepriepustnou pre sérum, cez ktorú bola suspendovaná polypropylénová kyveta obsahujúca 50 μΙ benzetóniumhydroxidu. Každých 450 μΙ reakčnej zmesi obsahovalo: 50 mM pufra skladajúceho sa z fosforečnanu draselného (pH 7,3), 50 μΙ čerstvo pripravenej 1 : 1 (obj./obj.) zmesi 150 mM redukovaného glutatiónu a 3 mM dichlórfenolindofenolu, 2 500 jednotiek katalázy a bakteriálny extrakt (zdroj HPPD). Inhibítory enzýmu boli pridané tam, kde je uvedené. 14C hydroxyfenylpyruvát (50 μΙ 2 mM roztoku), pripravený spôsobom podľa Secor
15ft/R (1994, vyššie) bol pridaný kvôli iniciácii reakcie, ktorá prebiehala pri 30 °C počas 30 minút. Reakcia bola skončená pridaním 100 μΙ 4 N kyseliny sírovej a zmes bola inkubovaná počas ďalších 30 minút. Rádioaktivita zachytená v benzetóniumhydroxide bola odpočítaná na scintilačnom prístroji.
Výsledky ukazujú, že E. coli bunky transformované Arabidopsis HPPD génom exprimujú veľmi vysoké hladiny HPPD aktivity, t.j. 2,7 pmól/mg proteínu a hodinu. Naopak, HPPD aktivita nebola detegovateľná v netransformovaných alebo kontrolných E. coli bunkách. Okrem toho HPPD aktivita bola senzitívna na inhibíciu sulcotriónom (obr. 4). Takmer kompletná inhibícia aktivity bola pozorovaná pri viac ako 1 μΜ sulcotriónu. Koncentrácia sulcotriónu nutná pre 50 % inhibíciu aktivity bola 100 nM.
Príklad 2
Priame vyšetrovanie testovaných zlúčenín pre identifikáciu inhibítorov HPPD
Nasledujúci spôsob je použitý na priamu identifikáciu inhibítorov HPPD.
E. coli transformované Arabidopsis HPPD génom ako je opísané v príklade 1, vyššie, sú kultivované cez noc pri 37 °C v Luria bujóne so 100 pg/ml ampicilínu.
liter rozpusteného LB agaru obsahujúceho 100 μρ/ml ampicilínu a 1 mM tyrozínu sa ochladí na 50 °C. Potom sa pridá 0,1 ml E. coli kultúry kultivovanej cez noc a 150 ml zmesi sa naleje do každej jamky 9x9 sterilnej Sumilon bioplatne (Vangard International, Neptúne, NJ).
Platne sa nechajú stuhnúť a sušia sa počas 30 minút. Testované zlúčeniny (do 25 μΙ) sa aplikujú na testovacie platne vo vzorkových jamkách (144 jamôk/platňa, 5 cm priemer, usporiadanie 12 x 12) alebo v škvrnách (6 x 96 zlúčenín/platňa). Platne sa inkubujú cez noc pri 37 °C.
Platne sú hodnotené sledovaním: (i) rastu E. coli a (ii) intenzity hnedého pigmentu. Zóny, v ktorých sú bakteriálne bunky životaschopné, ale pigment je redukovaný, sú hodnotené ako pozitívne na inhibítory HPPD.
158/B
Všetky patenty, prihlášky, články, publikácie a testovacie metódy uvedené vyššie sú tu uvedené ako odkaz.
Odborníkom v odbore budú vo svetle uvedeného opisu zrejmé mnohé varianty predkladaného vynálezu. Takéto varianty patria plne do rozsahu pripojených patentových nárokov.

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Prečistená izolovaná nukleová kyselina kódujúca rastlinnú HPPD.
  2. 2. Nukleová kyselina podľa nároku 1, ktorá je odvodená od Arabidopsis thaliana.
  3. 3. Nukleová kyselina podľa nároku 2, ktorá je vybraná z nukleovej kyseliny SEQ ID NO: 1, konzervatívnych variantov k tejto sekvencii a ich funkčne konzervatívnych variantov.
  4. 4. DNA vektor obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny podľa nároku 3, ktorý je operatívne naviazaný na transkripčný regulačný element.
  5. 5. Bunka obsahujúca DNA vektor podľa nároku 4, kde uvedená bunka je vybraná zo skupiny skladajúcej sa z bakteriálnych, mykotických, rastlinných, hmyzích a cicavčích buniek.
  6. 6. Bunka podľa nároku 5, kde uvedená bunka je bakteriálna bunka.
  7. 7. Bunka podľa nároku 5, kde uvedená bunka je rastlinná bunka.
  8. 8. Semeno, ktoré obsahuje bunky podľa nároku 7.
  9. 9. HPPD proteín, ktorý obsahuje proteín kódovaný DNA podľa nároku 2.
  10. 10. Spôsob na identifikáciu herbicídov/HPPD inhibítorov, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje:
    31 15ň/R
    a) poskytnutie mikrobiálnej bunky exprimujúcej rastlinnú HPPD,
    b) inkubáciu bunky v prítomnosti testovanej zlúčeniny za tvorby testovacej kultúry a za absencie testovanej zlúčeniny za tvorby kontrolnej kultúry,
    c) sledovanie hladiny kyseliny homogentisovej alebo jej oxidačných produktov v testovacích a kontrolných kultúrach, a
    d) identifikáciu zlúčeniny, ktorá inhibuje HPPD, ktorou je akákoľvek zlúčenina, ktorá redukuje hladiny kyseliny homogentisovej alebo jej oxidačných produktov v testovacej kultúre vzhľadom na kontrolnú kultúru.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že uvedenou mikrobiálnou bunkou je E. coli.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že uvedené sledovanie zahrňuje meranie absorbancie uvedenej kultúry pri 450 nm.
  13. 13. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že uvedené sledovanie zahrňuje detekciu tvorby hnedého pigmentu.
  14. 14. Spôsob identifikácie variantov HPPD rezistentných na herbicídy, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
    a) poskytnutie populácie buniek exprimujúcich rastlinnú HPPD,
    b) mutovanie uvedenej populácie buniek,
    c) kontaktovanie uvedenej mutovanej populácie buniek s herbicídom, za podmienok inhibičných pre rast alebo produkciu pigmentu v nemutovaných bunkách,
    d) získanie buniek rezistentných na inhibičné účinky uvedeného herbicídu pre rast a/alebo tvorbu pigmentu, a
    e) sekvencovanie nukleovej kyseliny kódujúcej HPPD z uvedených získaných buniek na identifikáciu variantov HPPD rezistentných na herbicídy.
    31 158/B
  15. 15. Variantný HPPD proteín, kde uvedený proteín je rezistentný na herbicídy.
  16. 16. Variantný HPPD proteín podľa nároku 15, kde uvedený variantný HPPD proteín rezistentný na herbicídy vykazuje pri expresii v bunkách, pre ktoré je nutná HPPD aktivita pre životaschopnosť:
    (i) katalytickú aktivitu, ktorá samotná je dostatočná na udržiavanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná; alebo katalytickú aktivitu v kombinácii s akýmkoľvek iným HPPD variantným proteínom rezistentným na herbicídy, ktorý môže byť rovnaký alebo odlišný od prvého HPPD variantného proteínu, ktorá je dostatočná na udržiavanie životaschopnosti buniek, v ktorých je exprimovaná a (ii) katalytickú aktivitu, ktorá je viac rezistentná na herbicíd, ako je prirodzená HPPD.
  17. 17. Variantný HPPD proteín podľa nároku 15, kde uvedený proteín je odvodený od Arabidopsis thaliana.
  18. 18. Nukleová kyselina, ktorá kóduje variantný proteín podľa nároku 15.
  19. 19. DNA vektor, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 18.
  20. 20. Bunka obsahujúca DNA vektor podľa nároku 19, kde uvedená bunka je vybraná zo skupiny skladajúcej sa z bakteriálnych, mykotických, rastlinných, hmyzích a cicavčích buniek.
  21. 21. Bunka podľa nároku 20, kde uvedená bunka je bakteriálna bunka.
  22. 22. Bunka podľa nároku 20, kde uvedená bunka je rastlinná bunka.
    0 4 1CQ/O
  23. 23. Semeno, ktoré obsahuje bunky podľa nároku 22.
  24. 24. Spôsob na vyvolanie rezistencie na herbicíd u rastliny, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje vloženie nukleovej kyseliny kódujúcej variant HPPD rezistentnej na herbicíd podľa nároku 16 do uvedenej rastliny, za podmienok, pri ktorých je uvedená nukleová kyselina exprimovaná v uvedenej rastline.
  25. 25. Spôsob na kontrolu buriny, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje pestovanie plodín obsahujúcich gén pre HPPD rezistentnej na herbicídy v prítomnosti takého množstva uvedeného herbicídu, ktoré je účinné na kontrolu buriny.
SK101-99A 1996-07-25 1997-07-25 Hppd gene and inhibitors SK10199A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2260496P 1996-07-25 1996-07-25
PCT/US1997/014351 WO1998004685A1 (en) 1996-07-25 1997-07-25 Hppd gene and inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK10199A3 true SK10199A3 (en) 1999-10-08

Family

ID=21810461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK101-99A SK10199A3 (en) 1996-07-25 1997-07-25 Hppd gene and inhibitors

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6118050A (sk)
EP (1) EP0938546A4 (sk)
JP (1) JP2001500005A (sk)
KR (1) KR20000029541A (sk)
CN (1) CN1238008A (sk)
AU (2) AU4231197A (sk)
BG (1) BG103206A (sk)
BR (1) BR9710751A (sk)
CA (1) CA2262002A1 (sk)
CZ (1) CZ22699A3 (sk)
EA (1) EA199900150A1 (sk)
EE (1) EE9900030A (sk)
HU (1) HUP0000053A3 (sk)
IL (1) IL128226A (sk)
NO (1) NO990296L (sk)
NZ (1) NZ334067A (sk)
PL (1) PL331346A1 (sk)
SK (1) SK10199A3 (sk)
TR (2) TR199900776T2 (sk)
WO (1) WO1998004685A1 (sk)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4305696A1 (de) * 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
JP2002510213A (ja) * 1997-05-31 2002-04-02 ヘキスト・シエーリング・アグレボ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 除草剤試験法
FR2770854B1 (fr) * 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
JP2002541851A (ja) 1999-04-15 2002-12-10 カルジーン エルエルシー イソプレノイド合成に関与するタンパク質の核酸配列
FR2796954B1 (fr) * 1999-07-30 2003-10-31 Aventis Cropscience Sa Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
DE19937957A1 (de) * 1999-08-11 2001-02-15 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisat-Dioxygenase
US7700838B1 (en) * 1999-09-17 2010-04-20 Monsanto Technology Llc Bacillus thuringiensis chromosomal genome sequences and uses thereof
CN1301841A (zh) * 1999-12-27 2001-07-04 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人加双氧酶13和编码这种多肽的多核苷酸
US6872815B1 (en) 2000-10-14 2005-03-29 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
US6768044B1 (en) * 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
WO2002000696A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Syngenta Participations Ag Herbicide target genes and methods
CA2418436C (en) 2000-08-07 2017-07-11 Monsanto Technology, Llc Methyl-d-erythritol phosphate pathway genes
DE10046462A1 (de) * 2000-09-19 2002-05-29 Sungene Gmbh & Co Kgaa Verbesserte Verfahren zur Vitamin E Biosynthese
JP2004528821A (ja) * 2000-12-07 2004-09-24 シンジェンタ リミテッド 除草剤抵抗性植物
WO2002053772A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-11 Greenovation Biotech Gmbh Novel biosensor system
US7161061B2 (en) 2001-05-09 2007-01-09 Monsanto Technology Llc Metabolite transporters
ATE419366T1 (de) 2001-05-09 2009-01-15 Monsanto Technology Llc Tyra-gene und ihre verwendung
US7244877B2 (en) 2001-08-17 2007-07-17 Monsanto Technology Llc Methyltransferase from cotton and uses thereof
AR036962A1 (es) 2001-10-25 2004-10-13 Monsanto Technology Llc Metiltransferasas aromaticas y usos de las mismas
BRPI0308740B1 (pt) 2002-03-19 2018-11-21 Monsanto Technology Llc molécula de ácido nucléico codificando uma homogentisato prenil transferase (“hpt”) e método de produzir planta tendo semente com nível de tocoferol aumentado
WO2004005321A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 The Rockefeller University Methods of inhibiting 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in a living system
EP1546334A4 (en) 2002-08-05 2007-01-03 Monsanto Technology Llc GENES ASSOCIATED WITH TOCOPHEROL BIOSYNTHESIS AND USES THEREOF
ES2275365B1 (es) * 2003-07-25 2008-04-16 Universidad De Cordoba Molecula de adn que codifica una p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de chlamydomonas y sus aplicaciones.
CN105368799A (zh) * 2008-04-14 2016-03-02 拜耳作物科学公司 新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制剂除草剂的植物分离
US9175305B2 (en) 2009-01-22 2015-11-03 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CA2749524C (en) 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
WO2011068567A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
EA201290559A1 (ru) * 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
AU2011212538B2 (en) 2010-02-02 2014-12-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Soybean transformation using HPPD inhibitors as selection agents
EA201291165A1 (ru) * 2010-05-04 2013-05-30 Басф Се Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам
CN103237894A (zh) 2010-08-13 2013-08-07 先锋国际良种公司 包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法
CA2823290C (en) * 2010-12-28 2021-07-20 Sds Biotech K.K. Plant having increased resistance or susceptibility to 4-hppd inhibitor
WO2013064987A1 (en) * 2011-11-02 2013-05-10 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CA2902951A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides such as pyrazolone, isoxazole, or triketone derivative herbicides
WO2014177990A2 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CN105358697A (zh) 2013-04-30 2016-02-24 巴斯夫欧洲公司 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN105264069A (zh) 2013-04-30 2016-01-20 巴斯夫欧洲公司 具有增加的除草剂耐受性的植物
WO2014177993A2 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
AR100017A1 (es) * 2013-08-12 2016-09-07 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
WO2017051347A2 (en) * 2015-09-23 2017-03-30 Pfizer Inc. Cells and method of cell culture

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56110360A (en) * 1980-02-06 1981-09-01 Pioneer Electronic Corp Muting circuit of am stereo receiver
US4535060A (en) * 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5013659A (en) * 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5084082A (en) * 1988-09-22 1992-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean plants with dominant selectable trait for herbicide resistance
DE4305696A1 (de) * 1993-02-25 1994-09-01 Hoechst Ag Nachweisverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
FR2734842B1 (fr) * 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
US6087563A (en) * 1996-01-29 2000-07-11 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Cloned arabidopsis p-hydroxyphenyl pyruvic acid dioxygenase DNA
AU3644697A (en) * 1996-06-27 1998-01-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant gene for (p)-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase

Also Published As

Publication number Publication date
AU4231197A (en) 1998-02-20
HUP0000053A2 (hu) 2000-05-28
AU2307101A (en) 2001-05-03
CA2262002A1 (en) 1998-02-05
CN1238008A (zh) 1999-12-08
JP2001500005A (ja) 2001-01-09
WO1998004685A1 (en) 1998-02-05
US6118050A (en) 2000-09-12
TR199900200T2 (xx) 1999-04-21
BR9710751A (pt) 2002-05-28
IL128226A (en) 2004-12-15
MX9900939A (en) 2000-03-01
NZ334067A (en) 2001-04-27
IL128226A0 (en) 1999-11-30
EP0938546A4 (en) 2003-07-30
BG103206A (en) 2000-06-30
NO990296D0 (no) 1999-01-22
KR20000029541A (ko) 2000-05-25
AU748196B2 (en) 2002-05-30
PL331346A1 (en) 1999-07-05
HUP0000053A3 (en) 2003-02-28
CZ22699A3 (cs) 1999-08-11
EE9900030A (et) 1999-08-16
TR199900776T2 (xx) 1999-06-21
EP0938546A1 (en) 1999-09-01
NO990296L (no) 1999-02-16
EA199900150A1 (ru) 2000-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK10199A3 (en) Hppd gene and inhibitors
CN103261424B (zh) 对除草剂具有增强的耐受性的植物
CA2074854C (en) Imidazolinone resistant ahas mutants
RU2337531C2 (ru) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
RU2608650C2 (ru) Пакетированное событие 8264.44.06.1 с устойчивостью к гербицидам, связанные трансгенные линии сои и их детектирование
WO1998004685A9 (en) Hppd gene and inhibitors
US20130053243A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
US10801035B2 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
HU226259B1 (en) Structure-based designed herbicide resistant products
US7667091B2 (en) Method of encoding information in nucleic acids of a genetically engineered organism
US20140357487A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
CN107603960A (zh) 乙酰辅酶a羧化酶除草剂抗性植物
US12049636B2 (en) Herbicide tolerance genes and methods of use thereof
CN105247058A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN108330116A (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN105358697A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
KR20080050618A (ko) 아시플루오르펜에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자
Taniguchi et al. Selecting genetic transformants of indica and indica-derived rice cultivars using bispyribac sodium and a mutated ALS gene
Dang et al. The mechanism of diflufenican resistance and its inheritance in oriental mustard (Sisymbrium orientale L.) from Australia
CN106868027B (zh) 粳稻als突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
HUT62333A (en) Process ofr producing herbicide-resistant mutants of acetohydroxy acid synthesis enzyme
CN106868028B (zh) 粳稻的als突变型基因及其蛋白和应用
CZ20002750A3 (cs) Molekula DNA obsahující geny biosyntézy riboflavinu z rostlin, buňky a rostliny obsahující tuto molekulu a způsob potlačení růstu plevelu
MXPA99000939A (en) Hppd gene and inhibitors
OA21200A (en) CYP81E genes conferring herbicide tolerance.