SI9400363A - Human macrophage migration inhibitory factor of nonlymphoid origin, expression of mif in e. coli and purification of recombinant protein - Google Patents

Description

OPIS IZUMA

NAZIV IZUMA

Humani faktor inhibicije migracije makrofagov nelimfoidnega (epitelialnega) izvora, ekspresija MIF-a v bakteriji Escherichia coli in postopek Čiščenja rekombinantnega proteina

OZADJE IZUMA

Faktor inhibicije migracije makrofagov (MIF) je prvi odkriti limfokin. Leta 1966 so prvič pokazali, da se v z antigenom stimuliranih limfocitih tvori snov, ki inhibira migracijo makrofagov in vitro (Bloom, B. R. & Bennett, B. ( 1966 ) . Science 153, 80-82 / David, J. R. ( 1966 ) . Proč. Nati. Acad. Sci. USA 65, 72-77). To nepoznano spojino so poimenovali faktor inhibicije migracije makrofagov (macrophage migration inhibitory factor ali MIF). Kmalu zatem so odkrili, da supernatanti stimuliranih makrofagov, ki vsebujejo MIF, ne le da preprečijo gibanje makrofagov, pač pa tudi spremenijo njihovo funkcijo v smeri pospešenega uničevanja mikrobov in tumorskih celic ( Churchill, W. H. , Piessens W. F. , Sulis, C: A. , David, J.R. (1975). J. Immunol. 115, 781 / Nathan, C. F., Karnovsky, M.L., David J. R. (1971). J. Exp. Med. 133, 1356 / Nathan, C. F., Remold, H.

G., David, J. R. (1973). J. Exp. Med. 137, 275). MIF aktivnost so dokazali tudi v sinovialni tekočini pacientov z reumatoidnim poliartritisom (Odink, K. , Cerletti, N., Bruggen, J., Clerc, R. G., Tarcsay, L., Zwadlo, G., Gerhards, G., Schlegel, R. & Sorg, C. (1987). Nature ( London ) 330, 80-82), v supernatantih leukocitnih kultur med zavračanjem presadkov pri miškah (Al-Askari, S., David, J. R., Lawrence,

H. S. & Thomas, L. (1965). Nature ( London ) 205, 916-917 / Harrington, J. T. (1977). Celi. Immunol. 30, 261-271) ter pri številnih kroničnih vnetnih procesih ( Burmeister, G., Zwadlo, G., Michels, E., Brocker, E . & Sorg, C. ( 1984 ). Lymphokine Res. 3, 236 / Schlegel Gomez, R. , Diepgen, T. L.

, Neumann C., Sorg, C. (1990). Arch. Dermatol. Res. 282, 374378). MIF naj bi bil tesno povezan s pojavom pozne preobčutljivosti in celične imunosti (Bloom, B. R. & Bennett, B. ( 1966 ) . Science 153, 80-82 / David, J. R. ( 1966 ) . Proč. Natl. Acad. Sci. USA 65, 72-77 / David, J. R. & David, R. A. ( 1972). Prog. Allergy 16, 300-449). Da bi lahko nedvoumno pokazali, da so zgoraj omenjene spremenjene funkcije makrofagov inducirane z MIF-om in ne s katerokoli drugo spojino, se je pojavila močna potreba po očiščenem nativnem ali (in) rekombinantnem proteinu. Nizek nivo MIF aktivnosti v nativnih vzorcih zelo otežkoča njegovo izolacijo in biokemijsko karakterizacijo in tako še do danes ni uspelo izolirati nativnega proteina v čisti obliki.

cDNA, ki kodira za humani MIF je bila prvič klonirana leta 1989. Weisser s kolegi jo je kloniral v celicah COS. Funkcionalno ekspresijsko kloniranje cDNA iz stimuliranih celic T je tako omogočilo identifikacijo klona z močno aktivnostjo inhibicije migracije makrofagov (Weisser, W. Y., Temple P. A., Witek-Giannotti J. S., Remold H. G., Clark S.C. & David J.R. ( 1989 ). Proč. Natl. Acad. Sci. USA 86, 75227526). Pokazali so tudi, da supernatanti po centrifugiranju kulture celic COS (vsebujočih rekombinantni gen, ki kodira za humani MIF) stimulirajo sintezo protiteles (Weisser, W. Y., Pozzi, L. M. , David J. R. & Titus R. G. (1992). Proč. Natl. Acad. Sci. 89, 8049-8052). Preliminarne študije infekcij z intracelularnim parazitom Leischmania donovani (Weisser, Y. W. , Pozzi, L. M. & David J. R. ( 1991 ). J. Immunol. 147, 2006-2011), kakor tudi dokazana sposobnost MIF vsebujočih supernatantov iz kultur celic COS, da aktivirajo makrofage (pri čemer slednji eksprimirajo dušikov oksid sintetazo in tvorijo dušikov oksid) prepričljivo kažejo na to, da igra novo odkriti 14 kDa velik protein zelo verjetno ključno vlogo pri celično uravnavani imunosti (Cunha F. Q., Weisser W. Y., David J. R., Moss D. W., Moncada S. & Liew F.Y. (1993). The Journal of Immunology 150, 1908 -1912 / Liew, F. Υ. , Millot, S. , Parkinson, C. , Palmer, R. M. J. , Moncada, S. (1990). J Immunol. 129, 351). V zadnjem času so poročali tudi o osrednji vlogi MIF-a pri endotoksemiji in toksičnem šoku. Leta 1993 je Wistow s kolegi izoliral MIF iz očesnih leč ( Wistow G. J., Shaughnessy, M. P., Lee, D. C., Hodin, J. & Zelenka, P. S. (1993). Proč. Natl. Acad. Sci. USA 90, 804980529), leto pred njim pa Blocki in sodelavci protein iz podganjih jeter (Blocki F. A., Schlievert P. M. & Wackett L.P. ( 1992 ). Nature 360, 269-270), ki se je s primarno strukturo humanega limfocitnega MIF-a ujemal v 25 (od 26) Nterminalnih aminokislinskih ostankih. Domnevni MIF iz podganjih jeter je izražal tako MIF kot glutation reduktazno aktivnost in naj bi povezoval kemični in imunski razstrupljevalni sistem.

Suzuki je leta 1994 poročal o kristalizaciji in preliminarnih kristalografskih študijah MIF-a iz humanih limfocitov (Suzuki, M. , Murata E. & Tanaka I. (1994). J. Mol. Biol. 235, 1141-1143). Iz omenjenega članka se da, iz na moč skopih informacij, razbrati, da so MIF izrazili v Escherichii coli in ga očistili z afinitetno kromatografijo, pri čemer so se opirali na podatke Blockija s sodelavci. (Blocki F. A., Schlievert P. M. & Wackett L.P. ( 1992 ). Nature 360, 269-270).

Čeprav raziskave v zvezi z MIF-om danes kontinuirano naraščajo, MIF iz naravnih virov doslej še ni bil izoliran v dovolj velikih količinah, ki bi omogočile vsaj njegovo biokemijsko karakterizacijo, količine rekombinantnega MIF-a iz tkivnih kultur so nizke, informacije o ekspresiji MIF-a v bakterijah pa zelo skope. V zadnjem primeru niso dostopni nikakršni podatki o donosih, niso opisani natančni postopki izolacije in, kolikor nam je poznano, očiščen rekombinantni

MIF še ni na trgu, dasiravno humano cDNA nekatere firme že nekaj časa prodajajo.

PODROBNI OPIS IZUMA

Konstrukcija ekspresijskih vektorjev

Regijo gena, ki kodira za humani MIF smo izolirali z reakcijo PCR (polymerase Chain reaction). Dvovijačno cDNA, ki je služila kot matrica pri pomnoževanju s PCR smo sintetizirali s kemikalijami in po navodilih tovarne Amersham (cDNA synthesis kit). mRNA za zgoraj omenjeno reakcijo sinteze cDNA z reverzno transkriptazo pa smo izolirali iz humanega endometrija uterusa z gvanidinium izotiocianatno metodo, ki ji je sledilo izopiknično centrifugiranje v gradientu cezijev klorid trifluoracetata in zatem še prečiščevanje totalne RNA z afinitetno kromatografijo na oligo-dt spin kolonicah.

Uporabljeni začetni oligonukleotidi (primerji):

I. : 5' GGATCCGAATTCATGCCGATGTTCATCGTAAACACCA 3’ (oligonukleotid, ki ustreza N terminalnemu delu MIF-a; mesto rezanja z restrikcijsko endonukleazo EcoRI je podčrtano, začetni /start/ kodon je prikazan s povdarjenimi črkami)

II. : 5' GTCGACAAGCTTTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTTCCA 3' (oligonukleotid, ki ustreza C terminalnemu delu MIF-a; mesto rezanja z restrikcijsko endonukleazo Hindlll je podčrtano, terminalni /stop/ kodon je prikazan s povdarjenimi črkami)

Isti začetni oligonukleotidi v isti reakciji niso omogočili zgolj pomnoževanja s PCR, pač pa tudi kreacijo ustreznih mest na obeh straneh kodirajoče regije, prepoznavnih za rezanje z restrikcijskimi endonukleazami.

Slednja so omogočila usmerjeno insercijo (kloniranje) za MIF kodirajoče regije v multipla mesta za kloniranje na različnih vektorjih Escherichie coli; kot so pUcl9 ( Messing, J. (1983). Methods in Enzymology, Vol. 101, pp. 20-78 ( Wu, R., Grossman, L. & Moldave, K., Ed. ). San Diego: Academic Press), pIN-III-ompA2 (Auerswald, E. A. , Genenger, G. , Mentele, R. , Lenzen, S. , Assfalg-Machleidt, I., Mitschang, L. , Oschkinat, H. & Fritz H. (1991). Eur. J. Biochem., 200, 131-158 / Ghrayeb, J. ,Kimura, H. ,Takahara, M. , Hsiung, H., Masui, Z. , Inouye, M. (1984). EMBO J., 3 (10), 2437-2442), pKpl500 (Miki, T., Yasukochi, T., Nagatani, H., Furuno, M., Orita, T., Yamada, H., Imoto, T., Horiuchi, T. (1987). Protein Engineering 1, 327-332) . Oligonukleotide smo sintetizirali na aparaturi Applied Biosystem DNA Synthesizer po navodilih proizvajalca. Z nasičenim amonijevim hidroksidom smo produkte sinteze ekstrahirali iz kolonic in izvršili deprotekcijo zaščitnih skupin. Nakar smo oligonukleotide očistili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo (Sanbrook,

J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory ).

Posamezen cikel pomnoževanja s PCR je potekal v naslednjih zaporedno si sledečih fazah: denaturaciji (1 minuto pri 94°C) je sledil annealing (1 minuto pri 55°C) in nato ekstenzija (2 minuti pri 72°C). 100 μΐ reakcijske mešanice pa je vsebovalo: lOraM Tris (pH 8,4), 50 mM KC1, 100 ng cDNA (predhodno za 10 minut inkubirane v vreli vodni kopeli), lgm oligonukleotid I, Ipm oligonukleotid II, deoksinukleotid trifosfate (dATP, dCTP, dGTP in dTTP; vsak posamezen nukleotid v 200 μΜ koncentraciji), 1 mM MgCl2,z 2,5 enot Taq polimeraze (Perkin Elmer). Da bi preprečili evaporacijo, smo na vrh reakcijske mešanice odpipetirali plast (100 μΐ) mineralnega olja. Pomnoževanje s PCR je potekalo v aparaturi Perkin Elmer thermo cycler. Terminalno ekstenzijo (sintezo mankajočih baznih parov) smo po 30 ciklih pomoževanja omogočili z 10 minutnim segrevanjem produkta PCR pri 72° C. Zatem smo previdno odstranili mineralno olje ter po fenolizaciji in

Sal, G. ; Manfioletti G. Acid. Res. 16, 9878) etanolni precipitaciji (Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory ) približno 400 baznih parov velik produkt PCR rezali z restrikcijskima endonukleazama EcoRI in Hindlll vsaj 5 ur pri standardnih pogojih (Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory ). Po rezanju z obema omenjenima restrikcijskima encimoma smo reakcijsko mešanico ponovno fenolizirali, DNA pa precipitirali z etanolom. Zatem smo nukleinsko kislino posušili v speed-vac koncentratorju, resuspendirali v 50 μΐ pufra TE in očistili z gelsko kromatografijo na lml spin kolonicah, napolnjenih s Sephacrylom S-300. Na enak način smo rezali in čistili tudi plazmidne vektorje Escherichie coli; s to razliko, da smo na stopnji gelske filtracije uporabili Sephacryl S-400. Inserte in vektorje smo lepili v molarnem razmerju 3:1 v korist insertov, ligacija pa je potekala 15 ur pri 15°C pri sicer standardnih pogojih (Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory ). Pri določanju koncentracij vektorjev in insertov smo se posluževali fluorescenčne metode (Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory ).

Kompetentne celice Escherichie coli, sev DH5a (Hannahan, D. ( 1983 ). J. Mol. Biol. 160, 557-580 / Hannahan, D.

(1985). DNA cloning: a practical approach, Vol.l, pp!09-135 ( Glover, D. M. Ed.). Oxford: IRL Press), smo transformirali z 1 μΐ ligacijske mešanice. Po izolaciji plazmidne DNA (Del & Schneider C. ( 1988 ) . Nucleic smo na MIF pozitivne klone identificirali z restrikcijsko analizo. Zaporedja nukleotidov pri treh pozitivnih klonih iz treh neodvisnih reakcij PCR smo potrdili z metodo dideoksisekveniranja (Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson (1977). Proč. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463). Z izjemo enega samega različnega nukleotida, katerega različnost je imela za posledico informacijo za drugačno aminokislino, je zaporedje nukleotidov ustrezalo objavljenemu (Weisser, W. Y., Temple P. A., Witek-Giannotti J. S., Remold H. G., Clark S.C. & David J.R. ( 1989 ). Proč. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7522-7526). Substitucija je bila enaka kot jo je opisal Wistow (Wistow G. J., Shaughnessy, M. P., Lee, D. C., Hodin, J. & Zelenka, P. S. (1993). Proč. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8049-80529). Zaporedje nukleotidov in pripadajoče zaporedje aminokislin pa sta prikazana spodaj:

ATG Met

CCG ATG TTC ATC GTA

AAC ACC AAC GTG

CCC Pro

CGC GCC TCC

GTG Val 15

45

Pro

Met

Phe

Ile 5

Val

As n

Thr

As n

Val 10

Arg

Ala

Ser

CCG

GAC

GGG

TTC

CTC

TCC

GAG

CTC

ACC

CAG

CAG

CTG

GCG

CAG

GCC

90

Pro

Asp

Gly

Phe

Leu

Ser

Glu

Leu

Thr

Gin

Gin

Leu

Ala

Gin

Ala

20

25

30

ACC

GGC

AAG

CCC

CCC

CAG

TAC

ATC

GCG

GTG

CAC

GTG

GTC

CCG

GAC

135

Thr

Gly

Lys

Pro

Pro

Gin

Tyr

Ile

Ala

Val

His

Val

Val

Pro

Asp

35

40

45

CAG

CTC

ATG

GCC

TTC

GGC

GGC

TCC

AGC

GAG

CCG

TGC

GCG

CTC

TGC

180

Gin

Leu

Met

Ala

Phe

Gly

Gly

Ser

Ser

Glu

Pro

Cys

Ala

Leu

Cys

50

55

60

AGC

CTG

CAC

AGC

ATC

GGC

AAG

ATC

GGC

GGC

GCG

CAG

AAC

CGC

TCC

225

Ser

Leu

His

Ser

Ile

Gly

Lys

Ile

Gly

Gly

Ala

Gin

As n

Arg

Ser

65

70

75

TAC

AGC

AAG

CTG

CTG

TGC

GGC

CTG

CTG

GCC

GAG

CGC

CTG

CGC

ATC

270

Tyr

Ser

Lys

Leu

Leu

Cys

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Arg

Leu

Arg

Ile

80

85

90

AGC

CCG

GAC

AGG

GTC

TAC

ATC

AAC

TAT

TAC

GAC

ATG

AAC

GCG

GCC

315

Ser

Pro

Asp

Arg

Val

Tyr

Ile

As n

Tyr

Tyr

Asp

Met

As n

Ala

Ala

95

100

105

AAT GTG GGC TGG AAC AAC TCC ACC TTC GCC TAA

360

	Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala *
110	115
Enega	izmed rekombinantnih	plazmidov pUC19,	s klonirano za
MIF	kodirajočo regijo,	smo rezali z	restrikcij skima

endonukleazama EcoRI in Hindlll, posamezne fragmente pa smo po rezanju frakcionirali z agarozno gelsko elektroforezo. Liso, ki je, glede na ustrezne velikostne markerje DNA, vsebovala približno 400 baznih parov velik fragment smo izrezali iz gela, zatem pa DNA izolirali z metodo adherence na steklene delce (Vogelstein, B. & Gillespie, D. ( 1979 ). Proč. Natl. Acad. Sciu. USA 76, 615-619). Regijo, ki kodira za humani MIF pa smo nato subklonirali v ekspresijske vektorje pIN-III-ompA2 in pKP1500 po enakem postopku kot smo ga opisali zgoraj.

Ekspresija in čiščenje rekombinantnega proteina

I. stopnja: Namnoževanje bakterij skih kultur

1 bioreaktor (Chemap LF 7/14/20), napolnjen z 10 1 sterilne juhe LB (10 g triptona, 5g kvasnega ekstrakta in 10 g NaCl na 1 gojišča) smo inokulirali z 200 ml nasičene predkulture Escherichie coli. Predkulturo smo pripravili tako, da smo 200 ml sterilnega minimalnega gojišča M9 (s 100 mg ampicilina/1 gojišča)(Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory) v 500 ml erlenmajerici nacepili z 10 μΐ v glicerolu zamrznjene izhodne (stock) kulture celic E. coli, sev JM 109 (Miller, H. (1987). Methods in Enzymology 152, 145-170), transformiranih z ekspresijskim plazmidom pMEX (pKP1500 s klonirano za MIF kodirajočo regijo) in bakterije namnoževali 36 ur pri 21°C na rotacijskem stresalnem inkubatorju (140 obratov v minuti). Tik pred nacepitvijo s predkulturo smo sterilnemu gojišču v fermentorju aseptično dodali ampicilin (100 mg/1 kulture), še pred sterilizacijo z avtoklaviranjem pa smo mu dodali 15 ml Silicona 1510 (kot agens proti penjenju). Po inokulaciji je namnoževanje bakterijske kulture v fermentorju potekalo pri 37°C ob kontroliranem mešanju (600 obratov/min) in aeraciji (301/min) 2,5 do 3 ure (dokler kultura ni dosegla vrednosti absorbance pri 6oo nm med o, 5 in 1). Takrat smo kulturo inducirali z IPTG (0,5g/101 kulture) in jo pri enakih pogojih kot pred indukcijo namnoževali še 4 ure.

II. stopnja: Priprava bakterijskega celičnega lizata ure po indukciji z IPTG smo bioreaktor ohladili na 12°C, kulturo bakterij pa pretočili v steklenice, ki smo jih hranili na ledu. Bakterijske celice smo od gojišča ločili z 20 minutnim centrifugiranjem v centrifugi Sorval pri 4°C in 8000xg. Vseh 50g po centrifugiranju dobljene bakterijske biomase smo resuspendirali v 200 ml sterilizirane deionizirane vode, suspenzijo trikrat zaporedoma zamrznili in spet odtalili ter jo zatem še 1,5 minute sonicirali v ultrazvočni kopeli (70 W). Ostanke celic po razbijanju membran s kombinacijo zamrzovanja in odtaljevanja ter ultrazvoka smo odstranili s centrifugiranjem. Po 20 minutnem centrifugiranju pri 4°C in 8000xg smo supernatant prenesli v 350 ml ultrafiltracijsko celico (Amicon), opremljeno z magnetnim mešalom in filtrom ΥΜ2 (z velikostjo por, ki omogoča prehod preko membrane le proteinom manjšim od 2 kDa) in ga štirikrat skoncentrirali pri 4°C.

III. stopnja: Gelska filtracija

Stekleno kolono (premera 50 mm) smo napolnili s Sephadexom G50 do višine 1500 mm in jo uravnotežili s pufrom A (0,1 M

Tris pH 7,4; 0,3 M NaCl;

skoncentriranega supernatanta nanesli na površino gela in pretoku 42ml/uro. Frakcije,

lmM	EDTA).	Vzorec	(200 ml
iz	stopnje	11) smo	previdno
ga	eluirali	s pufrom A pri
velikosti 14	ml smo	zbirali

avtomatično (s frakcijskim kolektorjem). Separacija vzorca na koloni s Sephadeksom G-50 je potekala približno 32 ur pri 4°C. Količino proteinov v posameznih frakcijah smo sledili z merjenjem absorbance pri 280 nm. Glede na krivuljo, ki je kazala odvisnost med zaporedno številko posamezne frakcije in vsebnostjo proteinov v njej smo izbrali določene frakcije in jih analizirali na SDS poliakrilamidni elektroforezi in z IEF. Alikvote frakcij, odvzetih za analizo smo predhodno dializirali z mikrodializno metodo (Andrej Francky, osebna komunikacija). Kot kontrolo smo uporabili proteinske ekstrakte celic E. coli JM109, ki so vsebovale ekspresijski plazmid pKPISOO brez inserta. Frakcije, pri katerih smo z IEF, oziroma z SDS poliakrilamidno elektroforezo pokazali dovolj veliko vsebnost rekombinantnega proteina smo združili in jih na že prej omenjenem ultrafiltratorju skoncentrirali na skupen volumen 150 ml.

IV. stopnja: Ionsko izmenjevalna kromatografija

Stekleno kolono smo napolnili z 250 ml CM celuloze, ki smo jo predhodno regenerirali po navodilih proizvajalca in suspendirali v pufru B (10 mM fosfatni pufer pH 6,4) . Nakar smo kolono ekvilibrirall z istim pufrom 24 ur pri pretoku 19 ml/uro. 75 ml koncentriranega vzorca (iz stopnje III) pa smo pred nanosom na kolono dializirali proti pufru B. Da bi odstranili nevezane proteine, smo po nanosu vzorca kolono spirali s pufrom B dokler absorbanca pri 280 nm ni ponovno padla na vrednosti nižje od 0,05, nakar smo vezane proteine eluirali z linearnim gradientom NaCl (500 ml pufra B in 500 ml pufra B z 0,3 M NaCl smo mešali v posebni gradientni posodi). Separacija je potekala pri 4°C. Frakcije (cca 6,3 ml) smo zbirali avtomatično. Elucijo proteinov smo spremljali na enak način kot smo ga opisali pri gelski filtraciji.Vse frakcije iz drugega vrha elucijskega diagrama so vsebovale visoko očiščen rekombinantni MIF. Po združitvi smo jih dializirali pri 4°C napram deionizirani vodi, skoncentrirali z ultrafiltracijo do koncentracije 5mg/ml ter shranili pri 70°C. Nekaj vzorcev smo predhodno liofilizirali.

Elektroforeza

Čistost proteina smo preverjali in molekulsko težo določali z SDS poliakrilamidno elektroforezo na aparaturi Pharmacia Phast sistem, pri čemer smo uporabljali tovarniško pripravljene 8-25% poliakrilamidne gele in mešanico standardov Sigma SDS 7 za določanje molekulske teže (sedem proteinov v velikostnem redu od 14400 do 94000 Da) . Elektroforeza in barvanje proteinov z barvilom Comassie brilliant blue G-250 so potekali po navodilih proizvajalca aparature.

Pri analizi proteinov iz totalnih celičnih lizatov smo kulturo celic centrifugirali, usedlino resuspendirali v deionizirani vodi, jo zmešali z enakim volumnom 2 krat koncentriranega pufra za SDS elektroforezo (Sanbrook, J., Maniatis, T. & Fritsch, E. F. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory) in mešanico segreli za 10 minut v vreli vodni kopeli. Zatem smo celice 1 minuto sonicirali v ultrazvočni kopeli (70W) in 10 minut centrifugirali v hemofugi Eppendorf pri 14000 obratih na minuto. Supernatanti po centrifugiranju, ki smo jih po potrebi redčili z 1 krat koncentriranim pufrom za SDS elektroforezo, so predstavljali vzorce za nanos na poliakrilamidne gele.

Izoelektrično fokusiranje mm debel poliakrilamidni gel za izoelektrično fokusiranje ( 5% T in 5% C, 10% glicerol, 0,45% amonijev persulfat in 6,66% amfolini Pharmalyt /pH 3-10/) smo predfokusirali pri konstantni električni moči 25W (z limito napetosti 300 V) pri 7 °C. Po nanosu vzorcev (vsak vzorec smo nanašali v volumnu od 20 do 50 μΐ) in standardov (uporabljali smo Pharmaciino mešanico standardov z izoelektričnimi točkami v obmolčju od 3,5 do 9,3) pa je izoelektrično fokusiranje potekalo pri konstantni moči 25 W (z limito napetosti 1500V) približno 2 uri.

Proteine smo po končanem IEF fiksirali s 15 minutnim namakanjem gela v 20% TCA, jih nato 5 minut barvali v raztopini za barvanje (0,2% barvilo Coomasie blue G-250, 45% metanol in 10% ocetna kislina) in zatem razbarvali v enaki raztopini ocetne kisline in metanola; v tem primeru brez dodanega barvila.

Kot alternativno možnost smo včasih izbrali IEF na aparaturi Pharmacia Phast System, kjer smo uporabljali že tovarniško pripravljene gele v območju pH od 3 do 9 in fokusiranje izvajali po navodilih proizvajalca aparature.

Določanje N-terminalne aminokislinske sekvence

Aminoterminalno sekvenco rekombinantnega proteina smo določili po Edmanovi metodi na avtomatičnem pulzirajočem tekoče-faznem proteinskem analizatorju (applied Biosystem, Foster City, CA / model 477A) z on line aminokislinskim analizatorjem (PTH, model 120A) . Sekveniranje je potekalo v urejenih (regularnih ) cikličnih programih, s kemikalijami in po navodilih proizvajalca.

Biološki test na aktivnost inhibicije migracije makrofagov

Biološko aktivnost rekombinantnega humanega MIF-a smo določali na budrinih peritonealnih makrofagih kot indikatorskih celicah in po metodi, ki jo je opisal Harrington s sodelavci (Harrington J. T., JR. & Stastny P. (1973). J. Immunol. 110 (3), 752-759).

% inhibicije migracije smo izračunali na naslednji način:

% inhibicije = 100 - (povprečna migracija testnih vzorcev/ povprečna migracija kontrol) X 100

Pri tem se, po definiciji, vsaka inhibicija, ki preseže 20% smatra kot signifikantna.

amplifikacije elektroforezo.

Amplifikacija s polimerazno verižno reakcijo (PCR) na matrici cDNA je služila za izolacijo za MIF kodirajoče regije in obenem za konstrukcijo ustreznih restrikcijskih mest na obeh straneh gena, ki so omogočila njegovo enostavno vstavitev v multipla mesta za kloniranje pri dveh različnih ekspresijskih vektorjih Escherichie coli. Produkte

DNA smo analizirali z agarozno gelsko Prvi plazmidni vektor, pKP1500 smo uporabili za ekspresijo rekombinantnega proteina v citoplazmi celic E. coli. Drugi, pIN-III-ompA2 je nosil signalno sekvenco za transport rekombinantnega proteina v periplazmatski prostor bakterije. Pri kloniranju smo natančno sledili postopkom, opisanim v poglavju Podroben opis izuma. Učinkovitost kloniranja za MIF kodirajoče regije je bila tako pri kloniranju v vektor splošne namembnosti pUC19, v mutacijski vektor p-ALTER, kakor tudi v oba omenjena ekspresijska vektorja zelo visoka. Rekombinantne klone smo lahko identificirali z restrikcijsko analizo plazmidne DNA le manjšega števila kolonij, saj je bilo kar 70 do 90 % vseh analiziranih klonov pozitivnih na MIF.

Učinkovitost ekspresije humanega rekombinantnega MIF-a v odvisnosti od različnih uporabljenih vektorjev in sevov E. coli smo določili s proteinsko analizo totalnih celičnih lizatov, oziroma ekstraktov celic. Lizate celic smo pripravili na način, ki smo ga že opisali pri SDS poliakrilamidni elektroforezi. Priprava celičnih ekstraktov je potekala na analogen način kot v drugi stopnji protokola za ekspresijo in čiščenje rekombinantnega proteina, le v bistveno manjših količinah. Vzorce smo tako pri SDS poliakrilamidni elektroforezi kot pri IEF analizirali skupaj s poznanimi standardi za določanje molekulske teže, oziroma markerji poznanih izoelektričnih točk ter skupaj s kontrolo. Kot kontrolo smo pri SDS poliakrilamidni elektroforezi uporabljali totalni lizat, pri IEF pa grobi ekstrakt celic E. coli JM109 z ekspresijskim vektorjem brez inserta. Pri kulturah celic, ki so vsebovale v ekspresijski vektor pIN III-ompA2 klonirano za MIF kodirajoče zaporedje baz s proteinsko analizo celičnih lizatov, oziroma ekstraktov ni bilo mogoče detektirati rekombinantnega proteina. Nasprotno pa se je pri analizi kultur bakterijskih celic z vsebovanim rekombinantnim plazmidom pMEX (vektor pKP1500 s kloniranim genom, ki kodira za MIF) v primerjavi s kontrolo pojavila nova močna proteinska lisa. Slednja je pri SDS poliakrilamidni elektroforezi potovala s hitrostjo, ki je, glede na ustrezne standarde, ustrezala pričakovani (hitrosti potovanja približno 12,5 kDa velikega proteina). Z IEF smo s pomočjo kontrole in ustreznih standardov humanemu rekombinantnemu MIF-u določili izoelektrično točko 7,0.

Glede na rezultate proteinskih analiz smo za nadaljnje delo (za produkcijo v širokem obsegu in čiščenje rekombinantnega proteina) izbrali celice Escherichie coli JM109, transformirane s plazmidom pMEX. Da bi čimbolj zmanjšali možnost proteolitične razgradnje rekombinantnega proteina smo vse stopnje izolacije in purifikacije izvajali pri 4°C. Kot prvo stopnjo čiščenja rekombinantnega humanega MIF-a smo izbrali gelsko filtracijo z namenom, da bi se po eni strani znebili zelo velikih molekul (nukleinskih kislin kot so kromosomalna ali plazmidna DNA ter visokomolekularnih proteinov, vključno z morebitnimi polimeri, nastalimi zaradi nepravilnega zvijanja rekombinantnega proteina v heterolognem bakterijskem sistemu) in zelo majhnih (kot so različni bakterijski toksini, pirogeni, metaboliti).Potek čiščenja smo zasledovali z določanjem količine proteinov v posameznih frakcijah (preko meritev absorbance pri 280 nm) in z analizo proteinov v posameznih frakcijah z IEF, oziroma z SDS poliakrilamidno elektroforezo, kjer se je ob prisotnosti rekombinantnega proteina (glede na kontrolo in poznane ustrezne standarde) na pričakovanih mestih pojavila proteinska lisa. Frakcije, pri katerih smo po proteinski analizi presodili, da vsebujejo dovolj rekombinantnega proteina smo združili, skoncentrirali in naprej očistili z ionsko izmenjevalno kromatografijo na CM celulozi. Na tem mestu smo predhodno preizkusili učinkovitost različnih pufrov pri različnih pH-jih. Kot najbolj primeren se je pokazal 10 mM fosfatni pufer pH 6,4. Za to obstaja tudi logična razlaga, saj je izoelektrična točka humanega rekombinantnega MIF-a okrog 7,0, večina bakterijskih proteinov pa je kislih ( z izoelektričnimi točkami nižjimi od 6,3 ). Da bi se pri tem pH-ju rekombinantni MIF vezal na CM celulozo, je potrebno pH pufra natančno umeriti, oziroma, v primeru, da nastopijo težave pri vezanju na nosilec, pH pufra spustiti za 0,1 do 0,2 enoti. Elucijski diagram separacije s klasično ionsko izmenjevalno kromatografijo na CM celulozi ob uporabi 10 mM fosfatnega pufra pH 6,4 kaže le dva vrha. Prvega predstavljajo nevezane nečistoče (brez rekombinantnega proteina), v drugem piku pa se eluira le močno očiščen rekombinantni humani MIF.

Po dveh stopnjah čiščenja smo iz 10 1 bakterijske kulture (oziroma približno 50 g mokre teže bakterijskih celic) uspeli izolirati lg visoko očiščenega rekombinantnega proteina. Njegovo čistost smo ocenjevali s prisotnostjo ene same intenzivne lise na gelih po SDS poliakrilamidni elektroforezi in IEF ter s prisotnostjo enega vrha na elucijskem diagramu po separaciji na aparaturi HPLC. Identiteto proteina je potrdila določitev prvih 25 N-terminalnih aminokislin in njihovo ujemanje s predvidenim aminokislinskim zaporedjem. Testi inhibicije migracije makrofagov na peritonealnih makrofagih budre kot indikatorskih celicah so pokazali, da je protein biološko aktiven.

ZAKLJUČEK

S pomočjo ekspresijskega vektorja pKP1500 (s tac promotorjem in temperaturno občutljivim mestom začetka replikacije) smo uspešno izrazili humani MIF v bakteriji Escherichia coli. Rekombinantni protein se je kopičil intracelularno v topni obliki in je po grobi oceni predstavljal preko 30% vseh celičnih proteinov. Razvili smo originalni dvostopenjski protokol z gelsko filtracijo na prvi in ionsko izmenjevalno kromatografijo na drugi stopnji čiščenja, ki je omogočil z minimalnimi izgubami pridobiti zelo čist protein, kar smo potrdili z analizo na SDS poliakrilamidni elektroforezi, z izoelektričnim fokusiranjem proteina in s separacijo na aparaturi HPLC. Identiteto proteina smo dokazali z določitvijo N-terminalne aminokislinske sekvence, njegovo aktivnost pa s testom inhibicije migracije makrofagov. Iz 10 1 bakterijske kulture (50 gramov mokre teže bakterijskih celic) smo izolirali 1 gram visoko očiščenega in biološko aktivnega rekombinantnega humanega faktorja inhibicije migracije makrofagov. Prepričani smo, da bi bili z optimizacijo postopka končni donosi lahko še višji.

Claims (6)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Začetna oligonukleotida z zaporedjem nukleotidov

   I. : 5' GGATCCGAATTCATGCCGATGTTCATCGTAAACACCA 3' in

   II. : 5' GTCGACAAGCTTTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTTCCA 3' , ki sta značilna po tem, da omogočata pomnoževanje zaporedja nukleotidov, ki kodira za MIF s polimerazno verižno reakcijo in naknadno kloniranje produkta PCR v različne vektorje.
2. 2. Konstrukt ekspresijskega vektorja za ekspresijo rekombinantnega MIF-a v bakteriji Escherichia coli, imenovan pMEX, ki je značilen po tem, da vsebuje spodaj prikazano zaporedje nukleotidov, ki kodira za humani MIF

   AT G Met CCG ATG TTC ATC GTA AAC ACC AAC GTG CCC CGC GCC Ala TCC Ser GTG Val 15 Pro Met Phe lle Val 5 As n Thr As n Val 10 Pro Arg CCG GAC GGG TTC CTC TCC GAG CTC ACC CAG CAG CTG GCG CAG GCC Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Leu Ala Gin Ala 20 25 30 ACC GGC AAG CCC CCC CAG TAC ATC GCG GTG CAC GTG GTC CCG GAC Thr Gly Lys Pro Pro Gin Tyr lle Al a Val His Val Val Pro Asp 35 40 45 CAG CTC ATG GCC TTC GGC GGC TCC AGC GAG CCG TGC GCG CTC TGC Gin Leu Met Al a Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys 50 55 60 AGC CTG CAC AGC ATC GGC AAG ATC GGC GGC GCG CAG AAC CGC TCC Ser Leu His Ser lle Gly Lys lle Gly Gly Ala Gin As n Arg Ser 65 70 75

   TAC AGC AAG CTG CTG TGC GGC CTG CTG GCC GAG CGC CTG CGC ATC 270 Tyr Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile 80 85 90 AGC CCG GAC AGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCG GCC 315 Ser Pro As p Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala 95 100 105 AAT GTG GGC TGG AAC AAC TCC ACC TTC GCC TAA 360 As n Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala 110 115 druga zaporedja nukleotidov, ki kodirajo za zaporedja

   aminokislin, ki se od prikazanega ne razlikujejo več kot v dvajsetih aminokislinah, vstavljeno v plazmidni vektor pKP1500 kot je prikazano na sliki 1.
3. 3. Postopek kultivacije rekombinantnih bakterijskih celic, ki je značilen po takšni kombinaciji ekspresijskega vektorja, gostiteljskega seva in pogojev namnoževanja, da omogoča v heterolognem sistemu E. coli pridobiti rekombinantni MIF v topni obliki.
4. 4. Postopek izolacije in čiščenja rekombinantnega MIF-a, ki je značilen po tem, da vključuje kombinacijo

   a. ) ekstrakcije MIF-a iz bakterijskih celic z zamrzovanjem in odtaljevanjem bakterijskih celic

   b. ) dvostopenjskega protokola čiščenja rekombinantnega proteina, ki vključuje gelsko filtracijo in ionsko izmenjevalno kromatografijo

   c. ) in načina sledenja in kvantifikacije rekombinantnega MIFa tekom postopka čiščenja na osnovi analiz z izoelektričnim fokusiranjem in/ali z SDS poliakrilamidno elektroforezo.
5. 5. Zaporedje nukleotidov

   ATG CCG ATG TTC ATC GTA AAC ACC AAC GTG CCC CGC GCC TCC GTG 45 CCG GAC GGG TTC CTC TCC GAG CTC ACC CAG CAG CTG GCG CAG GCC 90 ACC GGC AAG CCC CCC CAG TAC ATC GCG GTG CAC GTG GTC CCG GAC 135 CAG CTC ATG GCC TTC GGC GGC TCC AGC GAG CCG TGC GCG CTC TGC 180 AGC CTG CAC AGC ATC GGC AAG ATC GGC GGC GCG CAG AAC CGC TCC 225 TAC AGC AAG CTG CTG TGC GGC CTG CTG GCC GAG CGC CTG CGC ATC 270 AGC CCG GAC AGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCG GCC 315 AAT GTG GGC TGG AAC AAC TCC ACC TTC GCC TAA 360 značilno po tem, da kodira za humani MIF v epitelialnih

   celicah različnih tkiv, kot naprimer v epitelialnih celicah humanega endometrija uterusa.
6. 6. Rekombinantni MIF z zaporedjem aminokislin

   Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val

   5 10 15

   Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Leu Ala Gin Ala

   20 25 30

   Thr Gly Lys Pro Pro Gin Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp

   35 40 45

   Gin Leu Met Ala Phe 50 Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys 55 60 Ser Leu His Ser Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gin Asn Arg Ser 65 70 75 Tyr Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile 80 85 90 Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala 95 100 105 Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala * ¹ 110 115 ali drugimi zaporedji aminokislin, ki se od prikazanega

   razlikujejo več kot v dvajsetih aminokislinah, ki je značilen po tem, da je pridobljen iz E.coli po postopku iz zahtevkov 3 in 4 ali na kakršenkoli podoben način ter njegova uporaba za pripravo farmacevtskih pripravkov, diagnostičnih reagentov kakor tudi njegova uporaba v katerekoli druge namene, ki ne spadajo v okvir neaplikativnih znanstvenih raziskav.