SI8013067A8 - Postopek za pripravo monoklonalnega protitelesa - Google Patents

Description

Ovaj pronalazak odnosi se uglavnom na nove hibridne čelijske linije 1 speolfičnije na hibridne čelijske linije za proizvodnju monoklonalnog antitela ZS antigen koji SO nalazi ne približno 95£ normalnih ljudskih timocita na tAVO proizvedeno antitelo, 1 na terapeutske 1 dljagnostičke postupke 1 preparate koji koriste ovo antitelo. —

OPIS RANIJE NAUKE

Kondenzacija čelija mišjeg mieloma za čelije.

imuniziranih miSeva ko Ju su opisali Kobler and Milstein 1975 /Nature 256. 495-497 (1975)/demonstrirala Je prvi put da Je moguče da se dobije kontinualna čelijaka linija aa pravljenje homogenog (takozvanog monoklonalnog) antitela. Posle ovog početno rada, uloženo Je mnogo napora na proizvodnju raznih hibridnih čelija (takozvanlh hibridoma) i na koriščenj e antitela koje prave ovi hibridoml za razna naučna iatrašivanja.

Vidi, na primer, Current Topics in Miorobloiomr and Immunology. Volume 81 - Lymhooyte Hybrldomas, P, Meloher·^ M« Potter, and N.

t

Varner, Editors, Springer-Verlag, 1978, i reference koje se' tu nalaze; C. J. Barnstable, et al.. Celi, 14, 9-20 (maj, 1978);

P. Parham and W. P. Bodmer, Nature 276, 397-399 (novembar, 1978); Handbook of Experjmental Immunology, Third Edition, Volume 2,

D. M. Wier, Editor, Blaokvell, 1978, Chapter 25; and Chemical and Engineering Nevs, Januar 1, 1979, 15-17. Ove reference iatovremei no ukazuj u na uspehe i komlikaoije u pokušaj ima da ae proizvodi monoklonalno antlterlo^lz hibridoma. Mada je koncepoijlskl opšta tehnika dobro ahvačena, poatoje mnoge teškoče 1 potrebne au varijacije u svakom posebnom slučaju. U stvari, nema sigurnosti, pre pokušaja da se naprave dati hibridoml, da če se željeni hibridoml dobiti, da če oni proizvesti antitelo ako se dobiju, 111 da če tako proizvedeno antitelo imatl željenu specifičnost. Na stepen uapeha utlče ae u principu tipom korlSčenog antigena 1 izborom tehnike koja ae koriatl za izolovanje željenog hibridoma.

PokuSana proizvodnja monoklonalnog antitela za površinske antigene ljudskih limfooltnih čelija objavljena Je aamo u nekoliko slučajeva. Vidi, na primer, Current Topiča in

Mlcroblology and Immunology, lbjfl, 66-69 i 164-169- Koriščenj

- 3 antigeni u ovim objavljenim eksperiment ima kultivirali čelijske linije ljudske limfoblastoidne leukemije 1 ljudske hronične limfocitne leukemije. Izgleda da su avl dobiveni hibridomi proizvodni antitelo za razae antigene na _SVim ljudskim čelijama. Nljedan od proizvedenih hibridoma nije v' prolzvodio antitelo protiv predefinisahe klase ljudskih limfoI cita.

U novije vreme, sadašnji prljaviool al drugi bili su autori članaka koji opisuju pravljenje 1 testiranje hibridoma koji prave antitelo za izvesne antigene Τ-čeliJa. Vidi« na primer, Relnherz, E. L., Sl al. , J. Immunol. 123, 1312-Χ317 (1979)?' i

Relnherz, E. L., et aX.. Proo. Hatl. Aoad. Sol,, 76, 4061— 4065,(1979); i Kung, P. C., e£ al., Soienoe, 206, 347-349 (1979)Treba da je Jasno da postoje dve glavne klase limfooita uključenlh u imunološki sistem ljudi 1 životinja., Prvi od ovih (čelija Izvedena iz timusa 111 T čelija) diferencira .1 se u tlmusu iz hemopoletskih čelija peteljke. Dok su unutar tlmusa, dlferemoirajuče čelije so zovu tlmocltl’’. Zrele T čelije izlaze iz tlmusa 1 oirkulifiu izmedju tkiva, limfotoka 1 krvo ka. Ove T čelije obrazuju veliki deo količine reolrkulifiučih malih limfooita. One imaju imunološku speolfičnost i direktno su uključene u čelijama posredovane imunološke reakolje (kao što Je odbaclvanje kalema) kao efektorske čelije? Mada T ^— čelije ne luče humoralna antitela, ponekad su potrebne za lzlučlvanje ovih antitela pomoču druge klase limfocita koja je d.iskutovana niže. Neki tipovi T čelija imaju regulišuču ' ''

funkciju u drugim aspekt Ima. imuno lo Skog sistema, Mehanizem ovog procesa čelijske saradnjo JoS nije potpuno shvačen·

Druga klasa limfocita (čelije izvedene iz koStane srti lli B čelije) su one koje luče antitelo. Takodje se razvijaju iz peteljke hemoploitesklh čelija, ali njihovo diferenoiranje nije odredjeno timusom, Kod ptica, one se diferenciraju u organu koji je analogan sa timusom i zovo se Bursa lli Fabrloius,

Kod sisara, medjutim, nije otkriven ekvivalentni organ, pa se misli da se ove čelije diferenoiraju unutar koStane ar ti.

Sada je shvačeno da ae T čelije delo u najmanje nekoliko podtipova, koje se zovu pomagačke, supreaorake l^<Nunittlvačkeⁿ

--T-čelije,, koje imaju funkoiju (bez obzira Sto proaovifiu reakciju, potlakuju reakciju 111 uniStavaJu (raskidaju)) st ranih čelija. Ovepodklase su dobro shvačene za miflje sisteme, ali su tek ne devn<T opisane sa ljudske sisteme. Vidi, na primer, B. L, Evans, et al..Journal pf Experlmental Medicine, Volan»?

145, 221-252, 1977; i L. Chsr.s and S, F, Sohlossman Functional Analysls of Dlstinot Human T-Cell Subsets Beari&g tlnique Differentiation Antigena,, in Topiča in ImmunobioloKy^ir.

0. 3titman, Editor, Plenum Fresa, 1977, Volume 7, u

Sposobnost za identifikacija potisnutih (supresorskih) klasa iii podklasa T čelija je vatna za dijagnozu ill tretiranje raznih imunoregulatorskih poretmečaja ill stanja.

Na primer, izvesne leukemlj© i limfami imaju različitu prognozi’, zavisno od toga da 11 su porekla B čelija ill T čelija. Tako, procent prognoze bolesti zavisl od razlikovanja izmedju ove dve klase limfooita. Vidi, na primer, A. C, Aisenberg and J<

’ ⁿ · k T^··'·.'·? < X · J

F T t*i rr <Ej Λ χν * ,»> o T' > **·χ> ‘ f* V r-. 4 <·> λ

Ji*

- 5 . f '· ' - - i, .

D. Belpomme, et al., u Immunologloal Dlagnosis of Leukemlas AND Lymphomas , 3. Thierfelder, et r!.. eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33*45; i D. Belpomme, et fl·, British Journal of Haamatology, 1978, 3θ> 83«

Izvesna bolesna stanja (n.pr., Juvenilni revmatoidni artritis, maligne bolesti i agamaglobulinemija) pradena su sa neravnotežom podklasa T čelija. Sugerirano je da su autoimunoloSke bolesti uglavnom pračene sa viflkom pomagačkih T čelija ill sa nedostatkom izvesnih supresorskih T čelija, doj Je agamaglobulinemija pračena sa viflkom izvesnih supresorskih-T čelija----iii nedostatkom pomagačkih T čelija. Maligne bolesti su uglavnom pračene ea vtikom *supresorskih T čelija.

ϋ izvesnlm reukemiyama7^_IivsThe^_ T čellJe proizvode ee u zarobiJenoj fazi razvoja. Dijagnosa tada može zavisltl od sposobnosti da se detektuje ova neravnoteSa 111 viflak 1 da se odredi koja Je faza razvoja u viflku. Vidi, na primer, J. Kersey et al., Surfaoe Markera Deflne Human Lymphold Malignanoies vith Differing Prognoses u Haematology and Blood Transfuslon, Volume 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24, i reference koje se tu nalaze; 1 E, L. Reinher«, et al., J. Ciin. Invest., 64, 392-397 (1979).

Zadobivena agamaglobulinemija, bolesno stanje u koJem se ne proizvodi imunološki globulin, obuhvata najmanje dva tipa.

O tipu I nedostatak proizvodnje ImunoloSkog globulina Je pesledioa viflka supresorskih T čelija, dok Je u tipu II paoledica nedostatka pomagačkih T čelija. Kod oba tlpa7 ~ izgloda da ne postoji defekt lli nedostatak B čelija kod pacijenta, limfooita koji su odgovorni za stvarno lučenje antitela; medjutim, ove B dalije au lli potisaute 111 nisu pomognute i to dovodi do jako smanjene iii potpuno otsutne proizvodnja imuno loško g globulina. Tip zadobivene agamaglobulinemije moža sa tako odrediti testiranjea viška supresorskih T čelija ill otsustva pomagačklh T dalija.

Iz terapeutskog aspekta postoje neke sugestije, mada to nije definitivno dokazano, da davanja antitela protiv podtipa T čelija u višku može imatl terapeutski efekat kod autolaunološke bolesti ill malignih bolesti. Na primer, rak pomagačklh T deliJa (izvesnl kožni limfomi T dalija i izvesne limfoblastne leukemije (akutne) T čelija) nože ae trenirati aa antltalom sa antigen pomagačklh Th delija» Tretiranje autoimunoloSke bolesti izazvane-Ariškom pomagadkih delija može ae poatldi na isti način. Tretiranje bolesti (n.pr., malignih bolesti ill zadoblvene agamaglobullnemlje tipa I) zbog viška slupresorskih T čelija može se postiči davanjem antitela za antigen supresorskih T čelija.

Navedeno je da su antiserumi protiv cele klasa ljudskih T čelija (takozvanl antihumani timooltni globulin lli ATO) terapeutski korisni kod paoijanata na kojima se vrši presadjlvanje organa. Pošto če lij ski posredovana imunološka rjs&koija· (mehanizam pomoču kojeg se trasnsplantl odbaouju) zavili od T čelija, davanje antitela za T čelije sprečava iii zadrživa proces odbacivanje. Vidi, na primer, Cosimi, flil·, Randomized Clinioal Trial of ATO in Cadaver Renal Allgraft Reolpients: Importanoe of T Celi Monitoring, 8urgery JoT155-165 (1976) i referenoe koje se tu nalaze. Identifikacija i potisklvanje ljudskih T dalija 1 klasa 1 potklasa monooita rani Ja Je postignuta korlždenjem spontanih autoantitela iii selektivnih antiseruma za ljudska T dalije dobivenim imunizacijom životinja aa ljudskim T dalijama, krvavi J e njem životinja da se dobija serum, i adsorpoljom antiseruma sa (na primer) autologim ali ne alogensklm B čelijama da ae odvoje antitela sa neželjenlm reaktlvnostima. Pravljenje ovih » ^z I antiseruma Je krajnje težko, naročito u fazama adaorpoije 1 prečisčavanja. Cak l adsorbovanl i prediždenl antiserumi sadrže mnoge nečistoče pored željenog antitela, ls nekoliko raaloga. Prvo, serum sadrži miliona molekula antitela čak 1 pre imunizacije T čelija. Drugo, lmw^MoiJa liMlva prolzvodnju antitela protiv raznih antigena koja se nalaze u svim inektiranim ljudskim T čelijama. Ne postoji selektivna proizvodnja antitela protiv pojedinačnog antigena. Treče, tltar specifičnog antitela kol e se dobiva jo obično ndsvjjn'nitak, (ri.or·,, inaktivan pri razblaženjima večim od 1:100) i odnos specifičnog 6 prema ne-specifičnom antitelu je manji od 1/10 .

Vidi, na primer, članak Chess-a i Schlossman-a citiran gore (na stranama 365 i posle toga) kao i članak iz Chemical and Engineering News citiran gore/ u kojima su opisani nedostaci antiseruma iz ranije nauke i prednosti monoklonalnog antitela.

IZVOD IZ PRONALASKA

Sada je pronadjen novi hibridom (označen 0KT10) koji može da proizvede novo monoklonalno antitelo protiv antigena koji se nalazi na približno 95% normalnih ljudskih timocita, 5% normalnih ljudskih perifernih T čelija, 10% E perifernih mononuklearnih čelija (B čelije i nulte čelije) i 10-20% čelija koštane srži.

I

Tako proizvedeno antitelo je monospecifično za'jednu determinantu na približno 95% normalnih ljudskih monocita i šuštinšlci—ne sadrži drugi antihumani imunološki globulin, nasuprot antiserumima iz ranije nauke (koji su obavezno kontaminirani sa antitelom koje reaguje sa brojnim ljudskim antigenima) i monoklonalnim antitelima iz ranije nauke (koja nisu monospecifična za ljudski timocitni antigen). Staviše, ovaj hibridom se može kultivisati tako da se proizvodi antitelo bez potrebe za imunizacijom i ubijanjem životinja, posle čega slede mukotrpne faze adsorpcije i prečiščevanj a koje su potrebne za dobivanje čak i nečistih antiseruma iz ranije nauke.

Prema torne, jedan cilj ovog pronalaska jeste da obezbedi hibridome koji proizvode antitela protiv antigena koji se nalazi na oko 95% normalnih ljudskih timocita.

Dalji aspekt pronalaska jeste da se obezbede postupci za pravljenje ovih hibridoma.

Dalji cilj pronalaska jeste da se obezbedi homogeno antitelo protiv antigena koji se nalazi na oko 95% normalnih ljudskih timocita.

Dalji cilj jeste da se obezbede postupci za tretiranje iii dijagnozu bolesti iii za identifikaciju T čelija iii timocitnih podklasa koriščenjem ovog antitela.

Drugi ciljevi i prednosti pronalaska postače jasni na osnovu ispitivanja sadašnjeg opisa.

Za zadovoljevanje prethodnih ciljeva i prednosti obezbedjen je ovim pronalaskom novi hibridom koji proizvodi novo antitelo za antigen koji se nalazi na približno 95% normalnih ljudskih i

timocita,. zatim samo antitelo, kao i dijagnostički i terapeutski postupci koriščenjem antite-l-a. Hi bridora_aa_prayi uglavnom prema postupku koji su dali Milstein and Kohler. Posle imunizacije miševa sa leukemičnim čelijama iz ljudi sa akutnom limfoblastnom leukemijom T-čelija (T-ALL), čelije slezine imuniziranih miševa kondenzovane su sa čelijama iz linije mišjeg mieloma pa se dobiveni hibridomi anallziraju na one koji sa eupernatantima sadrže antitelo koje daje selektivno vezivanje za normalne E rozeta pozitivne ljudske T čelije i/ili timocite. Zeljeni hibridomi se kasnije kloniraju i karakterišu.

Kao posledica ovoga, dobiva se hibridom koji proizvodi antitelo (označeno 0KT10) protiv antigena na približno 95% normalnih ljudskih timocita. Ne samo da ovo antitelo reaguje sa oko 95% normalnih ljudskih timocita, več takodje reaguje sa oko 5% normalnih ljudskih perifernih T čelija, 10% E perifernih mononuklearnih čelija (B čelije i nulte čelije),

Cellja kuštane srži.

t ι>η·->|'ΊΤ ϊ} JTIff I Tf f? ·)· i— --«-r-·- -f-rf·.» r · · < 7 ..........

---Γξ·' 'TV ' ~

Obzirom na^teškočetnmznačen» H^Hinljoj naučil na ob j avl J ene neuspešne pokušaj e koriščenj ea malignihčelijsklh linija kao antigena, bilo je neočekivano da aadažnji poatupak > obezbedjuje Željeni hibridom. Treba da ae naglasi da nepredvidlva priroda hibridnog dalijskog preparata———_ ne omogučuje ekatrapolaolju aa jednog antigena ili čelij8kog sistema na drugi. Ujtvarl, aadašnji prijavioc? su otkrill da Je koriščenje maligne čelijske linije T čelija ill prečiščenih antigena odvojenlh sa površine čelije kao antigena bilo uglavnom neuspešno„

I predmetni hlbrldomi 1 antitelo koje se njime proizvodi identlflkovanl au ovde oznako»^?oktio; pri Česni je odredjeni materijal o koje» ae govori očevidan iz konteksta teksta. Predmetni hibridom deponovan je < 21 novembra,

1979, n tbn American Type Culture Collection, 12501 P ':lavn

Drive, Rockville, Maryuaid 20852, 1 dat mu Je ATCC pri Ywr'broj GRL θθ22. Pravljenje i karakterizacija hibridoma i.dobivenog antitela biče bolje shvščenb imajuči za re-ferencu sledeči opis i Primere. . . / pgTAUAM OPIS TOUIALASKA ., .·„ g '

Postupak za pravljenje hibridoma uglavnom obuhvata sledeče

- 11 faze :

A. Imunizaciju miševa sa leukemičnim T-ALL čelijama.

Mada Je nadjeno da su ženke

CAF₁ miševa požel jne, podrazumeva se da se mogu koristiti drugi sojevi miševa. Raspored imunizacije i koncentracija timocita treba da su takvi da se proizvode korisne količine podesno primiranih splenoclta. Nadjeno je da su tri lmunl7 zacije u četrnaestodnevnim intervalima sa 2 x 10' čelija/miševa/inekcija u 0.2 ml fosfatnog puferovanog slanog rastvora efikasne.

B. Odvajanje slezina iz imuniziranih miševa I pravljenje suspenzije u odgovarajučoj podloži. Dovoljan je oko Jedan

-_ml po slezinl. Ove eksperimentalne tehnike su dobro poznate.

C. Kondenzaciju suspendovanih čelija slezine sa čelijama mišjeg mieloma iz podesne Čelijske linije koriščenjem podesnog promotora kondenzacije. Poželjan odnos je oko 5 čelija slezine po čeliji mieloma. Ukupna zapremina od oko 0.5 - T~ml podloge za kondenzaciju odgovarajuči je za oko 10° splenoclta. Poznate su mnoge čelijske linije mišjeg mieloma, uglavnom od članova akademskih društava raznih depozitnih banaka, kao što je Salk Institute Celi Distribution Center, La Jolla, CA. Koriščena čelijska linija treba da je poželjno takozvani tip rezistentan na lek, tako da nekondenzovane čelije mieloma neče preživeti u izabranoj podloži, dok če hibridi preživeti. NajobiČnija klasa jesu čelijske linije rezistentne na 8-azaguanln, koje nemaju enzlm hlpoksantin-guanin — fooforibozil transferazu i zato neče biti podržane pomoču

HAT (hlpoksantin, aminopterin i timidln) podloge. Takodje

- 12 je uglavnom poželjno da se čelijska linija mieloma koristi u obliku takozvanog ne-sekretirajučeg tipa, tako da ne proizvodi sama po sebi nikakvo antitelo, mada se mogu koristiti sekretirajuči tipovi. Medjutim, u izvesnim slučajevlma, mogu biti poželjne linije sekretirajučeg tipa. Mada Je požel Jni promotor kondenzacije polietilenglikol koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 1000 do oko 4000 (komercijalno pristupačan kao PEG 1000, ltd.), mogu so koristiti drugi promotori kondenzacije poznati u nauči.

D. Razblaživanje 1 kultivisanje u odvojenim kontejnerima, smeše nekondenzovanih čelija slezine, nekondenzovanih »

čelija mieloma i kondenzovanih čelija u selektivnoj podloži koja neče podržati nekondenzovane čelije mieloma tokom zadovoljavajučeg perioda tako da se omogučuje smrt nekondenzovanih čelija (oko jedna nedelja). Razblaživanje može biti ograničavajučeg tipa, u kojem se zapremina razblaživača statistlčkl izračunava tako da se izoluje Izvestan broj čelija (n.pr., 1-4) u svakom posebnom konte jneru (n.pr., svaka rupica mikrotitarske ploče). Podloga je ona (n.pr., HAT podloga) koja neče podržati nekondenzovanu čelljsku liniju rezistentnu na lek (n.pr., rezistentnu na 8-azaguanln). Zbog toga čelije mišjeg mieloma Iščezavaju. Pošto nekondenzovane čelije slezine nisu maligne, mogu imati samo definitiven broj generacija. Tako če posle Izvesnog vremenskog perioda (oko jedna nedelja) ove nekondenzovane čelije'Slezlne propuštati da se reprodukuju. 8 druge strane, kondenzovane čelije nastavljaju da se reprodukuju pošto imaju maligni kvalitet porekla mieloma i sposobnost da prežive u

- 1? selektivnoj podloži za izvor čelija slezine,..*··;

E. Procenu supernatanta u svakom kontejneru (ruplci) ' koja sadrži hibridome na prisuatvo antitela na E rozeta pozitivne prečiščene ljudske T čelije Jli timocite.

F. Izbor (n,pr., ograničenim razblaživanjem) i kloniranje hibridoma koji proizvode željeno antitelo.

Pošto se jednom izabere i klonira željeni hibridom, dobiveno antitelo se može proizvesti na Jedan od dva načina. Najčistije monoklonalno antitelo proizvodi se ln vitro kultlvisanjem željenog hibridoma u podesnoj podloži tokom podesno dugog vremena, posle čega sledi izolovanje željenog antitela iz supernatanta. Podesna podloga i podesna dužina vremena kultlvlsanja su poznati 111 se lako odredjuju. Ova in vitro tehnika proizvodi suštinski monospecifično monoklonalno antitelo, suštinski slobodno od drugog specifičnog antihumanog imunološkog globulina. Postoji mala količina drugog prisutnog imunološkog globulina pošto podloga sadrži ksenogenski serum (n.pr., serum fetusa teleta). Medjutim, ovaj postupak ln vitro može da ne proizvode zadovoljavaJuču količinu ill koncentracij u antitela za iste svrhe, pošto Je koncentracija monoklonalnog antitela samo oko 50 ^g/ml.

Za proizvodnju mnogo veče koncentracije neznatno manje čistog monoklonalnog antitela, željeni hibridom se može inektirati u miševe, poželjno singenske iii šemi-singenske miševe. Hibridomi če lzazvati formiranje tumora koji proizvode antitelo posle podesnog inkubacionog vremena,

- 14 što če dovesti do visoke koncentracije željenog antitela (oko 5-20 mg/ml) u krvotoku i peritonealnom eksudatu (ascitima) miša domačiha. Mada ovi miševi domačini imaju normalna antitela u svoj oj krvi i ascitima, koncentracij a ovih normalnih antitela Je samo oko 5,X.od Irapcentracije . monoklonalnog antitela. Staviše, pošto ova normalna antitela nisu antihumana po svojo j specifičnosti, dobiveno monoklonalno antitelo iz požnjevenih ascita ill iz seruma Je suštinski slobodno od makojeg kontaminirajučeg antihumanog'imunološkog globulina. Ovo monoklonalno antitelo Je visokog titra (aktivno pri razblaženjima od 1:50,000 ill vili višim) i visokog odnosa specifičnog prema nespecifičnom imunološkom globulinu (oko 1/20).

lakih nlzova mieloma su ne-specifični, besmlsleni peptidi koji‘samo razblažuju monoklonalno antitelo bez smanj Ivanja njegove specifičnosti.

...... / ,

PRIMER I

Proizvodnja monoklonalnlh Antitela A. Imunizacija i hibridizacija somatskih čelija

2enke caf₁ miševa (Jackson Laboratories; 6-8 nedelja stare) imunizirane su lntraperitonealno sa 2 x 10? ljudskih leukemičnih T-ALL čelija u 0.2 ml fosf-atnog puferovanog slanog rastvora u 14-dnevnim intervalima. četiri dana posle treče imunizacije, slezine su odvojene sa miševa i napravljena je Jedna, čelijska suspenzija presovanjem tkiva kroz mrežu od, nerdjajučeg

Čelika.

- 15 Kondenzacija čelija vršena Je prema postupku koji su p

razvili Kohler and Milstein. 1 x 10 splenocita kondenzovano Je u 0.5 ml podloge za kondenzaciju koja sadrži 35Χ polletllenglikola (PEG 1000) i 5% dimetilsulfoksida u RPMI 1640 podloži (Gibco, Grand Island, ΝΎ) sa 2 x 10^ P3X63Ag8Ul mieloma čelija koje Je dao Dr. M.

Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY.

Ove čelije mieloma Izlučuju IgG^ lake nizove.

B. Izbor 1 rast hibridoma

Posle kondenzacije čelija, čelije su kultivisane u HAT podloži (hipoksantin, aminopterin i-timidin} na 37°C sa 5% COg u vlažnoj atmosferi. Nekoliko nedelja kasnije, do 100 1 supernatanta iz kultura koje sadrže hibridome doda se na granulu od 10^ perifernih limfocita koja je odvojena u E-rozeta pozitivne (E⁺) 1 E rozeta^-negativne (E”) populacije, i koja Je pripremljena iz krvi zdravih ljudskih davaoca kao Sto Je opisano u Mendes (J. Immunol. 111: 860, 1973). Detekcija antitela mišjih hibridoma koja se vezuju za ove čelije odredjena Je lndlrektnom imunofluor3escencijom. Čelije inkubirane sa supernatant ima tkiva oboj ene su sa fluoroscentnira koza-anti-miš IgG . (G/M PITC)(Meloy Laboratories, Springfield, VA; F/p =

2.5) i čelije prevučene fluorescentnim antitelom kasnije ' : 7 su analizirane na Cytofluorograf-u FC200/4800A (Ortho

Instruments, Vestvood, MA) kao što je opisano u Primeru III. Izabrane su kulture hibridoma koje sadrže antitela koja reaguju specifično sa E⁺ limfocitima (T čelije) i/ill '-timocitima izabrane su i klonirane dva puta postupcima ograničenog razblaživanja u prisustvu čelija za hranjenje.

Kasnije su kloni preneti intraperitonealno inektiranjem 1 x 10? čelija datog klona (zapremina 0.2 ml) u CAF₁ miševima primiranim .sa 2,6,10,14-tetrametilpentadekanom, koji prodaje Aldrich Chemical Company pod imenom Prištine. Maligni asciti iz ovih miševa koriste se tada za karakterlzaciju limfocita kao Sto je opisano niž u Primeru II. Demonstrirano je standardnim, tehnikama da predmetno hibridno antitelo OKT10 pripade IgG^ podklaei.

PRIMER II

Karakterizacija 0KT10 Reaktivnosti

A, Izolovanje populacija limfocita

Mononuklearne čelije ljudske periferne krvi izolovane su iz zdravih ljudskih dobrovoljaca (doba 15-40) pomoču gradientnog centrifugiranja na Ficoll-Hypaque gustinu (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) prema tehnici iz Boyum, Scand. J. Ciin.

Lab. Invest. , 21 (Suppl. 97): 77, 1960. Nefrakcionisane mononuklearne čelije se odvoje u površinske Ig* (B) 1 Ig (T plus nulte populacije pomoču hromatografije na koloni Ssphadex G-200 antiF(ab.’)2 kao što je ranije opisano u Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T čelije ee regenerišu E rozetiranjem Ig populacije sa 5% ovčjih eritrocita (Microbiological Associates, Bethesda, MO). Rozetirana smeša se rasloji preko Ficoll.Hypaque i regenerisana E⁺ peleta se tretira sa 0.155M NH^Cl (10 ml na 10& čelija). Tako dobivena populacija T čelija bila je *(2%

EAK rozeta pozitivna i ^95¾ E rozeta pozitivna kao što je odredjeno standardnim postupcima. Dalje ne-rozetorajuča Ig populacija obrana je sa Ficoll medjupovršine. Ova poslednja populacija bila je 5% E⁺ i ^2% slg⁺. Površinska Ig⁺ populacija dobivena je sa Sephadex G-200 kolone posle eluirenja sa normalnim ljudskim gama globulinom kao što je opisano ranije. Ova populacije bila je >95% površinski Ig⁺ i <5% E⁺.

Normalne čelije ljudske koštane srži dobivene su iz posteriorns iliačne grbe normalnih ljudskih dobrovoljaca izvlačenjem sa iglora.

B. Izolovanja timocita

Normalna ljudska timijana žljezda dobivena je iz pacijenata starih dva meseca do 14 godina koji su podvrgnuti korektivnoj srčanoj operaciji. Sveže dobiveni delovi timuene žljezde se trenutno stave u 5% serume fetusa teleta u podloži 199 (Gibco), fino se ieitne sa pincetom i makazama i kasnije se formulišu u jednočelijeke suspenzije presevanjem kroz žičanu mrežu.

Celijs se dalje rasloje preko Ficoll-Hypaque i spinuju i isperu kao žto je ranije opisano u odsljku A gore. Tako dobiveni timociti bili su >95% životno sposobni i >90% rozeta pozitivni.

C. Čelijske linije T Linije i T čelija akutne limfoblastne leukemljt

T Čelijske linije CEN, HSB-2, i MOLT-4 obezbedio Je Or, H. Lazarus (Sldney Farber Cancer Institute, Boston, NA). Leukemične čelije dobivene su sa 25 pacijenata sa dijagnozom ALL T čelija. Ovi pojedinačni tumori su prethodno odrsdjeni da pripadaju T čelijskoj liniji njihovem sposobnošču da spontano obrazuju rozete sa ovčjim eritrocitima (>20% E⁺), i reaktivnošču sa specifičnim antiserumima anti-HTL na T čelije (B.K.) i A99, kao što je ranije opisano. Tumporne populacije su krioodržavane na -196°C sa tečnim azotom u parnoj fazi ea 10% OMSO i 20% AB ljudskog seruma do trenutka površinske karakterizacije. Sve analizirane tumorne populacije bile su viže od 90% blasti pomoču Wright-Giemsa morfologije citocentrifugiranih preparata.

PRIMER III

Citofluorografska analiza ί odvajanje čelija

Citofluorografska analiza monoklonalnih antitela sa svim čalijskim populacijama vršena je indirektnom imunofluorescencijom sa fluorescein-konjugovanim koza anti-miš IgG (G/M FITC)(Meloy Laboratories) koriščenjem Cytofluorograf-a FC200/4800A (Ortho Instruments). Ukratko, 1 x 10^ čelija tretira se sa 0.15 ml OKT5 pri 1:500 razblaženju, inkubira se na 4^C 30 minuta i ispere se dva puta. Celije tada reaguju sa U.15 ml 1:40 razblaženja G/M FITC na 4°C tokom 30 minuta, centrifugiraju ee i isperu se tri puta. Celije se tada analiziraju na Citofluorografu, i zabeleži se intenzitet fluorescencije po čeliji na analizatoru višine pulsa. Slična šema reaktivnosti vidi se pri razblaženju 1:10,000, ali je dalje razblaživanje izazvalo gubljenje reaktivnosti. Osnovno bojenje postiže se zamenom alikvota od 15 ml 1:500 ascita iz CAF,j niševa koji su intraperitonealno inektirani sa ne-proizvodnim hibridnim klonom.

U eksperimentima koji uključuju antitelo i komplementno posredovan' limfolizu, timociti i periferne T čelije kultivisani su pruka noči posle selektivnog raskidanja i tada su kasnije analizirani na Citofluorografu.

PRIMER IV

Raskidanje limfoidnih populacija sa monoklonalnim antitelom 1 komplementom

Cetdeset x 10 perifernih T čelija iii timocita stavi se u plastičnu epruvetu od 15 ml (Falcon, 0xnard, CA), čelijske granule se inkubiraju sa 0.B cc OKT3, 0KT4, 0KT8 iii sa normalnim kontrolnim ascitima razblaženim 1:200 u PBS, resuspenduju se i i y inkubiraju na 20°C tokom 60 minuta. Kasnije se doda 0.2 cc evežeg komplementa kuniča na populacije tretirane antitelom, resuspenduje ea, i vrši se dalja inkubacija na 37°C u vodi koja se mučka tokom 60 minuta. Na kraju ovog perioda, čelije se spinuju i životno sposobne čelije se označe brojevima pomoču isključivanja Trypan plavog. Posle odbrojavanja, čelije se i3paru još dva puta u 5% FCS i stave se u finalne podloge (RPMI 1640 (Grand Island biological Company, Grand Island, ΝΎ) koje sadrže 20% AB⁺ ljudskog seruma, 1% penicilin-streptomicina, 200mM L-glutamina, 25 mM HEPES pufera i 0.5% natrijum-bikarbonata/ i inkubira se preko noči u vlažnoj atmosferi sa 5% CL^ na 37°C.

KRATAK OPIS CRTE2A

Slika 1 prikazuje šemu fluorescencije koja je dobivena na Cytofluorografu posle reakcije normalnih ljudskih timocita sa 0KT10 i drugim monoklonalnim antitelima pri 1:500 razblaženju i G/M FITC. Osnovno fluorescentno bojenje postifnuto je inkubacijom svake populacije sa 1:500 razblaženjem aecitnog fluida iz miša koji je inektiran sa ns-proizvodnim klonom.

Slika 2 prikazuje faze intratimusne diferencijacije kod ljudi.

Proizvodnja hibridoma i proizvodnja i karakterizacija dobivenog monoklonalnog antitela sprovedeni su kao što je opisano u gornjim Primerima. Mada su velike količine predmetnog antitela napravljene inektiranjem predmetnog hibridoma intraperitonealno u miševe i žetvom malignih ascita, jasno je da se predvidja da se hibridom može kultivisati in vitro tehnikama koje su dobro poznate u nauči i onda se antitelo odvaja iz supernatanta.

Tablica 1 prikazuje reaktivnost OKT6, ΟΚΤΘ, 0KT9 i 0KT10 sa raznim ljudskim limfoidnim čelijskim populacijama. 0KT10 monoklonalno antitelo reaguje sa približno 95¾ normalnih ljudskih timocita,

5¾ normalnih ljudskih perifernih T čelija, 10¾ E perifernih mononukelearnih čelija (B čelije i nulte čelije) i 10-20¾ čelija koštane srži. Ova šema reaktivnosti je jedqan test pomoču kojeg se predmetno antitelo 0KT10 može detektovati i razlikovati od drugih antitela.

Slika 1 prikazuje reprezentativnu šemu reaktivnosti dobivenu na Cytofluorograf-u posle reakcije normalnih ljudskih timocitnih suspenzija sa 1:500 razblaženjem 0KT3, 0KT4, 0KT5, OKT6, OKTB, OKT9, OKT10 i G/M FITC. Vide se slične šeme reaktivnosti sa 12 dopunski testiranih normalnih ljudskih timocitnih populacija. Kao što je prikazano, postoje značajne razlike i u pogledu procenta reaktivnosti i intenziteta fluorescencije sa svakim od ovih monoklonalnih antitela. Na primer, OKT9 reaguje sa približno 10¾ timocita sa niškim intenzitetom fluorescencije dok 0KT5, ΟΚΤ6, ΟΚΤΘ i OKT10 reaguju sa približno 70¾ timocita sa višim intenzitetom fluorescencije. 0KT4 koji reaguje sa 75¾ timocita je po sredini izmedju 0KT9 i monoklonalnih antitela koja daju šemu sa večim Intenzitetom fluoreecencije. Dalje,

Slika 1 prikazuje da je približno 15¾ timocita detektovano sa 0KT3 indirektnom imunofluorescencijom. Nije prikazan OKT1, čija je šema reaktivnosti praktično identična sa OKT3 na timocitima. Šema reaktivnosti na Slici 1 je drugi t8st pomoču kojeg se predmetno antitelo 0KT6 može detektovati i razlikovati od drugih antitela.

Tablica 2 prikazuje distribuciju antigena definisanih raznim monoklonalnim antitelima na ljudskim perifernim T čelijama i limfocitima, kao što je odredjeno serijom eksperimenata raskida21 nja opisanih u Primeru IV. PoSto su samo 0KT3, 0KT4 i OKT8 bila monoklonslna antitela fiksirana sa komplementom, koriščena eu ova tri.

Kao što je prikazano u Tablici 2A, cela T čelijeka populacija reaguje aa OKT3 dok 0KT4, QKT5i OKT8 reaguju sa 60%, 25% i 34% čelija. Raskidanje sa OKT4 i komplementom smanjilo je ukupan broj za 62% i specifično je izostala 0KT4⁺ populacija. Dalje, procenat QKT5⁺ i OKTB⁺ čelija se je povečao i nije bilo efekta na apsolutan broj OKT5⁺ i UKT8* čelija. Ovi eksperimenti su sugerirali da se 0KT4⁺ razlikuje od OKT5⁺ i 0KT6⁺ populacija.

Oalji dokaz za ovakav zaključek dobiven je raskidanjem T čelija sa ΟΚΤΘ i komplementom. II ovom slučaju, procenat 0KT4+ čelija se je povečao, dok je apsolutni broj ostao isti, a QKT8⁺ i 0KT5+ populacije su eliminisane. Staviše, rezultati su pokazali da je OKT8⁺ populacija bila recipročna sa 0KT4⁺ populacijom i sadržala je ceo podest OKT5 T čelija.

Slični eksperimenti sa ljudskim timocitnim populacijama dali su različita rezultate. Kao što je prikazano u Tablici 2B, približno 75% timocita bili su 0KT4⁺ iii OKT8+. Staviše, poeleraskidanja iii sa 0KT4 iii 0KT8, ostalo je samo 25% timocita. Glavni deo rezidualnih timocita bio je reaktiven sa 0KT3, dok je samo manji deo reagovao sa 0KT6. Ovi nalazi demonstriraju da glavna populacija ljudskih timocita nosi 0KT4, 0KT5, OKT6 i ΟΚΤΘ površinske antigene na istoj čeliji. Dalje, Tablica 2 demonstrira da posle tretiranja sa OKT8 iii 0KT4, postoji značajno povečanje zrelih timocita koji noše 0KT3 antigen. Tako je glavni deo 0KT3 reaktivnih timocita več segregisan u 0KT4⁺ iii OKT8⁺ podsetovs, pošto je glavna količina rezidualnih čelija posle 0KT4 iii OKT8 raskidanja bila OKT3+. Ako ja 0KT3⁺ subpopulacija bila i 0ΚΤ4 i 0KT6 . tada raskidanje sa mekojim monoklonalnim antitelom treba da odvoji 0KT3 reaktivne timocite.

Da se dalje odredi odnos 0KT3 reaktivnih timocitnih subpopulacija prema drugom monoklonalnom antitelu koje je definisano timocitnim frakcijama, timociti su tretirani sa 0KT3 i komplementom i rezidualne čelije su tada uporedjene sa netretiranim timocitnim populacijama. Kao što je prikazano u Tablici 2B, OKT3 i komplement su odvojili 25¾ timocita. Staviše, posle raskidanja nije bio veliki gubitak 0KT4, OKT5, UKT6 iii OKT8 reaktivnih populacija.

Ovi nalazi eugeriraju da se veliki višak timocita koji noss OKT6 marker nalaze u OKT3 populaciji. Dalje, oni dalje sugeriraju da su timociti koji istovremeno izražavaju antigene definisane sa 0KT4, OKT5 i OKTB na sličan način ograničeni na 0KT3 populaciju. Treba takodje da se naglasi da OKT9 reaktivna populacija timocita nije bila smanjena posle tretiranja sa OKT3 i k-omplementom nefrakcionisanih timocita, što ukazuje da je OKT9⁺ subpopulacij a uglavnom ograničena na 0KT3 timocitnu populaciju.

Na bazi ovih rezultata moguče je da se opišu faze intratimusnog razvoja ljudskih timocita. Kao što je prikazano na Slici 2, praktično svi timociti noše OKT1O marker. Dalje, timociti imaju u jednoj ranoj fazi 0KT9 marker (odnosno Thy1 i Thy 2). Dva faza definiše manji broj timocita i objašnjava približno 10¾ nefrakcionisane populacije. Kasnije, ljudski timociti zadobivajt jedinstveni timocitni antigen definisan sa 0KT6 i konkurentno izražavaju 0KT4, OKT5 i 0KT8 (Thy4). Ova poslednja subpopulacija pretstavlja glavni deo timocita i objašnjava do 70-80¾ timusne populacije. Sa daljim sazrevanjem, timociti gube OKTB reaktivnost, dobivaju 0KT3 (i 0KT1) reaktivnost, i dele se u 0KT4⁺ i OKT5⁺/OKT8⁺ subsetove (Thy7 i Thy 8). Na kraju, izgleda da kako timocit odlazi u odeljak ea perifernim T čelijama, on gubi

0KT10 markar pošto ovaj antigen nedostaje nepraktično svim perifernim T limfocitima. Moguče tranzitne faze izmedju ove tri glavne faza razvoja u timusu označene su Thy3, Thy5 i Thy 6 na Slici 2.

Pošto se misli da je akutna limfoblastna leukemija T linije izvedena iz nezrelih timocita, odredjen je odnos izmedju tumornih čelija pojedinaoa sa T-ALL i ovih predloženih faza intratimusne diferencijacije. Ispitane su 25 populacije čelija tumora sa pojedinaoa sa T-ALL i tri T čelijske linije koje eu prethodno proučevane sa konvencionalnim anti-T čelijskim reagensima i E rozetoranjem. Kao Sto je prikazano u Tablici 3, glavni deo T-ALL leukemičnih čelija reagovao je iii samo sa OKT1O iii sa OKT9 i OKT1O a nije reagovao sa drugim monoklonalnim antitelima. Tako, 15/25 proučevanih slučajeva izgleda da poseduje rane timocitne antigene (Faza I). .

Nasuprot, 5/25 slučajeva reagovalo je sa OKT6, Sto sugerira izvodjenjn iz zrelije timusne populacije (Faza II). Ova T-ALL grupa bil j je sama po sebi heterogena u odnosu na 0KT4, OKT0 i OKT9 reaktivnost kao što je prikazano u Tablici 3. Čelije iz 2/5 pacijenata poseduju največi deo timocitnih antigena uključujuči 0KT4, 0KT6 i ΟΚΤΘ. Vredno je spomenuti da OKT5 nije prisutan na makojem od ovih 5 tumora Faze II čak i kada je zapažena OKTB reaktivnost. Ovaj poslednji rezultat sugerira da OK.T5 i OKTB definišu različite antigene iii različite determinante na letom antigenu. Konačno, tumori 1/25 pacijenta došli su iz zrele ti mocitnc populacije (Faza III) kao što je definisano reaktivnošču sa 0KT3. Pored toga, tumor ovog pojsedinca reagovao je sa OKT5, OKTB i OKT10. Od 25 analiziranih leukemičnih populacija.

samo četiri tumora nisu mogla jasno da sa kategorišu. Tri su bili pozitivni sa OKT4 i OKT8, ali su nsdostajali DKT3 i OKT6 i najvarova nije su pretstavljali prelaza od Thy4 i Thy7,6. Jedan od 25 slučajeva izgleda da je bio prelaz od Thy3 prema Thy4 pošto je posedpvao OKT8 i 0KT10 reaktivnost.

T čelijske linijs izvedene iz T-ALL tumornih populacija takodje su pretstavljale čelije iz specifičnog stanja intratimusne diferencijacije. Kao što je prikazano u Tablici 4, HSB je raagovao eamo sa DKT9 i OKT1O pa če zato definisati tumornu populaciju izvedenu iz Faze I. Nasuprot, CEM je reagovao sa 0KT4, OKT6,

OKT8, OKT9 i OKT1O i izgleda da je izveden iz timocita Faze II. Konačno, M0LT-4 izgleda da pretstavlja leukemičnu transformaciju u fazi izmedju HSB-2 i CEM pošto izražava 0KT6, OKT8, OKT9 i

0KT10.

Pošto je pokazano da svi proučevani paciijenti sa akutnom limfoblastnom leukemijom T čelija imaju OKT1O+ čelije, koriščenje OKT1O antitela omogučuje dijagnozu ALL T-čelija. PacijBnti sa ALL nultih čelija takodje au ispoljavali OKT1O⁺ čelije.

Odnosi prikazani u Tablicama 2-4 su dalji način pomoču kojeg se OKT10 antitelo može detektovati i razlikovati od drugih antitela.

Drugi hibridomi koji proizvode monoklonalno antitelo koje su napravili sadašnji prijavioci (označeni OKT1, 0KT3, 0KT4 i OKT5) opisani su i zaštičeni u sledečim U.S. patentnim prijavama:

SN 22,132, podneta 20 marta, 1979, SN 33,639, podneta 26 aprila, 1979, SN 33,669, podneta 26 aprila, 1979, i SN 76,642, podneta 16 septembra, 1979, i SN 62,515, podneta 9 oktobra, 1979.

Dalji drugi hibridomi koji proizvode monoklonalno antitelo koje eu napravili aadašnji prijavioci (označeni OKT6, OKT8 i OKT9) opisani su i zaštičeni u U.S. patentnim prijavama koje su podnete istog datume kao i sadašnja prijava i imaju naslove t

Hybrid Celi Line Far Producing Complement-Fixing Monoclonal Antibody to Human Suppreseor T Celiš, Antibody, and Methods;

Hybrid Celi Line For Producing Monoclonal Antibody to Human Early Thymocyte Antigen, Antibody, and Msthods; and Hybrid Celi Lina For Producing Monoclonal Antibody to a Human Thymocyte Antigen, Antibody, and Methods.

Ove prijave unete su ovde kao reference.

Prema sadašnjem pronalasku obezbedjen je hibridom koji može da proizvodi antitelo protiv antigena koji se nalazi na približno 95¾ normalnih ljudskih timocita, postupak za proizvodnju ovog hibridoma, monoklonalno antitelo protiv antigena koji se nalazi na približno 95¾ normalnih ljudskih timocita, postupoi za proizvodnju antitela, i postupoi i preparati za tretiranje ill dijagnozu bolesti iii identifikaciju T čelija iii timocitnih potklaea koriščenjem ovog antitela.

TABLICA 1

REAKTIVNOST MONOKLONALNIH ANTITELA NA LJUDSKE LIMFOIDNE POPULACIJE

Monoklonalno antitelo	Periferna	Koštana srž (6)	Timus (22)
krv	(30)*
	E +	E~
OKT6	0¾	0¾	0¾	70¾
0KT8	30¾	0¾	<2*	80¾
OKT9	0¾	0¾	0¾	£10¾
0KT10	<5<	10¾	£20¾	95¾
* Brojevi u	zagradama	pretstavljaju	broj testiranih	uzoraka;

š vrednosti su proseči.

CD komplement β e e rt* D *J

O rt*	O	o	o	z	n	O	o	z
t*· rt	X	X	X	a	rt	X	X	B
•b*J	-t	M	rt	rt	rt	rt	-1	rt
rt B	UJ	03	4»	•J	rt	O»		•J
03				B				(D
3- β	+	+	+	rt		ί-	+	rt
O				rt				rt
o	O	O	Cl	•J		ο	n	•1
•J 0			«	0)				B
BT3				3			-4-	3
B C				rt				a
Xrt				•				•

TJ »i rt

-b

B »J , n

rt a ao n h* □ t-h Cj. (D O rt σ

h· n rt o o XI c

L» rt e s >ftc

rt«					M
		to			Ul	Ul
rt	U)	•		A	•	«	tt
»J	o	Ul	o	O	M	M	o
B B
< rt	X	X	X	X	X	X	X
rt rt
3 1	. —·*			«A	-A		«A
B	o	Cl	o	o	O	O	o
B 3	cn	cn	an	cn	cn	cn	σ

»-»e c

o v B B <-3

S o <

rt B

B B • TT O

X»3

N rt		OJ	OJ	U)	(O	(O	(O	o
c s	O	Ul	o	O	Ul	Ul	CD	n
rt 3								Ή
rtB								U)
B 3
rt rt								a
rt O	cn	cn		xj	(O		cn	X
3	o	Ul	o	Ul .	M	o	o	H
B-								•u
C 3
rt								o
Ό B	CD		CD	XI		XI	M	X
•J C	O	o	Ul	O	O	(3	Ul	rt
rt								Ul
X3
B O	CD		λ	cn				o
N OD	M	OJ	o	o	O	o	o	X
rt								H
ΟΙ B								cn
ο a								a
XB	(O		Ul	XI.		(O	ω	X
B	O	o	Ul	m	O	Ul	•f*	-(
X) B								OD
B B
•J				*.				a
rt Π	_»							X
3 B	M	Ul	an	03	1	1	1	-«
B N								(O
3 rt
B rt
rt χ								o
B C	OJ	OJ	x|	(O				X
• (—»·	O1	Ul	Ul	N	1	1	1	rt

a

B

I

B

B ίο r o rt ro 3 c -t» rt O B rt Cl <X rt 3 Lm B B »1 β

m

B C

X C •JO rtB

B 3 B σ k-n

3· o.

CX

B •o n

o o

e

B rt

Ί O β 3 B O X Χ** t-* t* 0 < 3 3 B O rt B 3 rt rt rt »J B O 3 N rt rt rt Q. rt-C B B rt rt rt 3 3 rt B 3*

CX a

X

X m

c o

M cn •H rt g

n rt t_l

Tl m

x

Cl m

o m

n

O

Z o

X

Ιο z

>

t~ >

z —H »-t rt m

r o

Γ' c_»

C a

cn x

rt

TABLICA •Poslednja četiri tumora ne mogu se lako kategorisati u Fazu I-III- Vidi tekst za detalje njihove karakterizacije, i“Thy oznaka odnosi ae na Sliku 2 ^Pozitivna (+) reaktivnost definisana je keo 30% eepcififina fluorescencije iznad osnovne kontrols negativna (-) reaktivnost ne može se razlikovati od osnovnog bojenja na suspenzijama čelija tumora.

75 *n <—> «—»		r™*	O	n	□3	>	-n	D
0» m	-1	-<	—<	-1	σ	a	•	•	o	H-
n n	3	3	3	3	H·	N			N	rt»
3 ft		»<	·<	<<	O«	a	70	0	a	Φ
H·	A*	u		OJ	n		D	►J
l-l	1	1			3	l-l	3	0	M	η a
et 1-1	cn	A				n	1*	et		rt- □
H· H					et		rt	H·		d n
3					H·		3		rt- h·
0					3		H·	O		c
0					O		3.	O		a m
H·					CJ'		O	H·		c—
rt-					H·		O	«rt.		c	rx
					rt-		H·			0.	m
							«rt			H-	r-
•rt								-1			IH
3							z—*	3			C_l
»<							•rt	»<			tn
03							3	—A			75
											m
							M	-f
											TJ
											0
			·							O X	<
+	1	1	1	1			1	1		x a	X
										-H (U	tn
										ω ?r	IH
										et	z
										H·	V)
							1			O <	75
1	1	1	+	+			1		75 3	m
•										-rt O Ji. (D	75
										rt·	>
										O (0	X
										>
+	1	1	1	1			1	1		7* Q>	75
										•rt	•rt
										Ul 3	m
										O	X
										3	IH
										a 0	ω
1	+	+	+	+			1	1		75 ?r	•rt
										-rt Ι-	IH
										Ο) O	75
										3	m
										a
										O 1—·	>
										75 3	75
+	+	+	+	+			1	1		-rt H·	c
										03 3	-rt
											z
										a	m
										O 3 Ti et	Γ
1	1	1	1	+			rt	1		—t h-	IH
										to «rt	3
										O	Π
										I—·	O
										O H·	03
										75 3	r
+	+	+	+	+			+	+		-rt a	>
								-H·		A M	cn
									0	-rt
											z
											m
											r~
											m
											c
											75
											m
											3
											IH
										03	Cl
											rn
										0
										t-M	-1 1 r
										«rt
										0	IH
										z^a	Z
										3 rt·	M
										H·	C_i
u 1										n	m
A 1 -i		W	-A	-A				VJ		a
«1									nih 25)
										•rt 1
										>
										r~
										r-

ta

TABLICA

TABLICA 4

REAKTIVNOST SA MONOKLONALNIM ANTITELIMA

Čelijska linija	OKT3	0KT4	OKT5	OKT6	OKT8	0KT9	OKT10
HSB-2 -·	-	-	-	-	-	-	-
CEM	+	-	+	+	+	+
MOLT-4	-		+	+	+	+	+
* Kriterijumi za	- i +	reaktivnost	bili su	isti	kao u	Tablici

Mada je opisan samo jedan hibridom koji proizvodi jedno monoklonalno antitelo protiv ljudskog monocitnog antigena, podrazumeva se da sadašnji pronalazak uključuje sva monoklonalna antitela koja ispoljavaju ovde.opisane karakteristike. Odredjeno je da predmetno antitelo OKT10 pripada podklasi IgG^, koja je jedna od četiri potklasa mišjeg IgG. Ove potklase imunološkog globulina G razlikuju se jedna od druge po takozvanim fiksiranim regionima, mada če antitelo na specifični antigen imati takozvani promenjljiv” region koji je funkcionalno identičan bet obzira kojoj klasi imunološkog globulina G pripada. To jeste, monoklonalno antitelo koje ispoljava ovde opisane karakteristike može biti potklase IgG^, IgG₂a, IgG₂b iii IgG₃, ,ili klasa IgM, IgA iii drugih poznatih Ig klasa. Razlike izmedju ovih klasa iii potklasa neče uticati na selektivnost reakcione šeme antitela, ali mogu uticati na dalju reakciju antitela sa drugim materijaiima, kao što su, na primer, komplement iii anti-miš antitela.

Mada je predmetno antitelo specifično IgG^, predvidja se da su antitela koja imaju ovde opisanu šemu reaktivnosti uključena u predmetni pronalazak bez obzira kojoj klasi iii potklasi pripadaju.

Dalje au u sadašnji pronalazak uključeni postupci za pravljenje monoklonalnih antitela koji su ovde opisani koriščenjem ovde opisane tehnike sa hibridomima. Mada je ovde dat samo jedan primer hibridoma, podrazumeva se da če stručnjak moči da pra^i postupke imunizacije, kondenzacije i selekcije koji su ovde obezb8dj8ni i da dobije druge hibridome koji mogu da proizvode antitela koja imaju ovde opisane karakteristike reaktivnosti.

Pošto se pojedinačni hibridoipi proizvedeni iz poznate čelijske linije mišjeg mieloma i čelija slezine iz poznate vrste miševa ne mogu dalje identifikovati sem po antitelu koje proizvodi hibridom, podrazumeva se da su svi hibridomi koji proizvode antitelo koje ima karakteristike reaktivnosti koje su ovde opisane uključeni u sadašnji pronalazak, kao i postupci za pravljenje ovog antitela koriščenjem hibridoma.

Dalji aspekti pronalaska su postupci za tretiranje iii dijagnozu bolesti koriščenjem monoklonalnog antitela OKT1O iii makojeg drugog monoklonalnog antitela koje ispoljava ovde obezbedjenu šemu reaktivnosti. Predmetno antitelo sb može koristiti za detekciju i proučevanje intratimusne diferencijacije kao što je sumarizovano na Slici 2. Staviše, predmetno antitelo se može koristiti za dijagnozu bolesnih stanja koja uključuju defekt iii višak OKT1Q⁺ čelija. Ove tehnike se mogu koristtiti koriščenjem samo OKT1O antitela iii u kombinaciji sa drugim antitelima (n.pr., 0KT3 - OKT1O). šeme reaktivnosti sa panelom antitela na T čelije i podsetove T čelija omogučiče precizniju detekciju izvesnih bolesnih stanja nego što Je to moguče koriščenjem ranijih dijagnostičkih postupaka.

Tretiranje bolesnih stanja (n.pr., maligniteta kao što su ALL nultih čelija iii T-ALL) koja se manifestuju viškom OKT1O⁺

- 30 čelija može se postlči davanjem terapeutski efikasna količine OKT10 antitela pojedinou kojem je fiputrebno takvo tretiranje. Selektivnem reakcijom sa OKT10+ antigenom, efikasna količine 0KT10 antitela smanjiže viflak UKT10⁺ čelija, pasa tako ublažavaju efekti viška.Dijagnostički i terapeutski preparati koji obuhveteju efikasne količine 0KT10 antitela u smeSi ea dijagnostičkl lli farmaceutski prihvstljivim nosečima takodje su uključeni u sadaflnji pronalazak.

NAVOD O NAJBOLJEM,PODNOSIOCU PRIJAVE POZKATOM,

NAČINU PRIVREDNE UPOTREBE PRONALASKA

Proizvodnja monoklonalnlh antitela A. Imunizacija 1 hibridizacija somatskih čelija

Ženke CAF₁ miševa (Jackson Laboratories; 6-8 nedelja 7 stare) imunizirane su intraperitonealno sa 2 x 10’ ljudskih leukemičnih T-ALL čelija u 0.2 ml fosfatnog puferovanog slanog rastvora u 14-dnevnla intervalima.eetirl dana posle treče imunizacije, slezine su odvojene sa miševa i napravljena Je Jedna_čel_iJska suspenzija presovanjem tkiva kroz mrežu od nerdjajučeg Čelika.

Kondenzacija čelija vrSena Je prema postupku koji su o

razvili Kohler and Milsteln. 1 x 10 splenocita kondenzovano Je u 0.5 ml podloge za kondenzaciju koja sadrži 55% polietilenglikola (PEG 1000) 1 5% dimetilsulfoksida U RPMI 1640 podloži (Gibco, Grand Island, NY) sa 2 x 10? P5X65Ag8Ul mieloma čelija koje Je dao Dr. M.

Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, ΝΎ.

Ove čelije mieloma izlučuju IgG^ lake nizove.

B. Izbor 1 rast hibridoma

Posle kondenzacije čelija, čelije su kultivlsane u HAT podloži (hipoksantin, aminopterin i timidin) na 57°C '7 sa 5% COg u vlažnoj atmosferi. Nekoliko nedelja kasnije, do 100 1 supernatanta iz kultura koje sadrže hibridome doda ae na granulu od 10^ perifernih limfocita koja Je odvojena u E rozeta~pozitivne (E^hl^jozeta. negativne (E ) populacije, 1 koja Je prlpremljena lz krvi zdravih ljudskih davaoca kao što Je opisano u Mendes (J. Immunol. 111: 860, 1975). Detekcija antitela mišjih hibridoma koja se vezuju za ove čelije odredjena Je lndlrektnom inninofluorjescencijom. Čelije lnkubirane sa supcrnatantlma

- 7 Ltkiva obojene eu sa fluoroscentnira koza-anti-miS'IgG (G/M FITC)(Meloy Laboratories, Springfield, VA; F/p .........2.5 ) i deliJ e-prevučene fluorescentnim antitelom kasnije su analizirane na Cytofluorograf-u FC200/4800A (Ortho Instruments, Vestvood, MA) kao Sto Je opisano u Primeru III. Izabrane su kulture hibridoma koje sadrže antitela koja reaguju specifično sa E⁺ limfocitima (T čelije) i/ili -timocitima izabrane su i klonirane dva puta postupcima ograničenog razblaživanja u prisustvu čelija za hranjenje.

Kasnije su kloni proneti intraperitonealno inektiranjem 1 x 10? čelija uatug Klona (χχρ/Ctnins 0.2 ml) u CAF^ mižovima primiranim .sa 2,6,10,14-tatx'ametilpentddok0iioi;., koji prodaje Aldrich Chemical LOuipany poo imenom rristine« Maligni asciti iz ovih miševa koriste se tada za karakterizaciju limfocita kao što je opisano niž u Primeru II. Demonstrirano je standardnim tehnikama da predmetno hibridno antitelo OKT10 pripada IgG^ podklasi.

ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION,SAD ·

Claims (4)

1. Postupak za dobivanje monoklonalnog antitela koje reaguje sa oko 95% normalnih humanih timocita,5% normalnih imunih perifernih T čelija, 10% E perifernih mononuklearnih čelija (B čelije iii nulte čelije) i 10-20% čelija koštane srži, ispoljava šemu reaktivnosti na normalne humane timocite, ispoljava šemu reaktivnosti na periferne T čelije i timocite, ispoljava šemu reaktivnosti sa ALL fazama T čelija, reaguje sa HSB-2,CEM i MOLT-4 čelijskim linijama, naznačen time, što obuhvata imunizaciju miševa sa humanim leukemičnim T-ALL čelijama, odvajanje slezina · pomenutih miševa i pravljenje suspenzije čelija slezine, kondenzaciju čelija slezine sa čelijama mišjeg mieloma u prisustvu promotore kondenzacije, razblaživanje i kultivisanje kondenzovanih čelija u podesnim rupicama podloge koja ne pordžava nekondenzovane čelije mieloma, procenu supernatanta u svakoj rupici koja sadrži hibridom na prisustvo željenog antitela, selekciju i kloniranje hibridoma koji proizvode željeno antitelo, i regenerisanje antitela iz supernatanta iznad komenutih klonova

2. Postupak prema·-zahtevu'·· 1,- n a’z n če n t i m e, što obuhvata kultivisanje hibridoma ATCC CRL 8022.

3'. Postupak prema zahtevu 1, naznačen · time, što obuhvata inektiranje u miŠa hibridoma ATCC CRL 8022 i regenerisanje antitela iz malignih ascita iii seruma miša.

4. Postupak prema zahtevu 1, n a z na če n - time, Što je monoklonalno antitelo hibridom dobiven fuzijom P3X63Ag8Ul mielomnih čelija i CAF^ slezine miša koji je prethodno imunizovan sa humanim leukemičnim T-ALL čelijama.

OPTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION RARITAN, N.J.,SAD 'U I

- “

ABSTRAKT

VRSTA HIBRIDNE ČELIJE ZA DOBIVANJE . iiJNtlKLUNALNOG ANTITELA ZA HUMANI PROTIMOCITNI ANTIGEN, SAMO A .'TITELO I POSTUPCI ZA NJE. GOVO DOBIVANJE

Hibridna čelijska linija za proizvodnju monoklonalnog antitela na antigen koji se nalazi na približno 95% normalnih ljudskih timocite. Hibrid eo obrezuje kondenzaciJom splenocita iz imuniziranih CAF^ miševa ea P3X63AgfiU1 čelijama mieloma. Takodje &u opisane dijagneetičke i terapeutsko primene monolklonalnog antitela.