SI20074A - 1-(3-aminoindazol-5-il)-3-fenilmetil-ciklične sečnine, uporabne kot inhibitorji proteaze HIV - Google Patents

Abstract

Pričujoči izum se nanaša na spojine s formulama (I) in (II) ali njihove oblike farmacevtsko sprejemljivih soli ali predzdravil, ki so uporabne kot inhibitorji proteaze HIV in na farmacevtske sestavke in diagnostične komplete, ki obsegajo spojine in metode uporabe omenjenih spojin za zdravljenje virusne okužbe ali kot testni standard ali reagent.ŕ

Description

-1l-^-Aminoindazol-S-iO-S-fenilmetil-ciklične sečnine, uporabne kot inhibitorji proteaze HIV

PODROČJE IZUMA

Ta izum se na splošno nanaša na 1-(3-aminoindazol-5-il)-3-fenilmetil-ciklične sečnine, ki so uporabne kot inhibitorji proteaze HIV, farmacevtske sestavke in diagnostične komplete, ki obsegajo omenjene spojine in metode uporabe omenjenih spojin za zdravljenje virusne okužbe ali kot testnih standardov ali reagentov.

OZADJE IZUMA

Dva različna retrovirusa, človeški virus imunske pomanjkljivosti (HIV) tip-1 (HIV-1) oziroma tip-2 (HIV-2), sta bila etiološko vezana na imunosupresivno bolezen, sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti (AIDS). HIV seropozitivni posamezniki so na začetku asimptomatični, toda tipično razvijejo AIDSu soroden kompleks (ARC), ki mu sledi AIDS. Prizadeti posamezniki kažejo močno imunosupresijo, ki jih predisponira za izčrpavajoče in končno smrtne oportunistične infekcije.

Bolezen AIDS je končni rezultat virusa HIV-1 ali HIV-2, ki sledi svojemu lastnemu kompleksnemu življenjskemu ciklu. Življenjski cikel viriona se prične s pritrjevanjem viriona na gostiteljsko humano limfocitno imunsko celico T-4 preko vezanja glikoproteina, na površini zaščitnega plašča viriona, z glikoproteinom CD4 na limfocitni celici. Ko je enkrat pritrjen, virion odvrže svoj glikoproteinski plašč, penetrira v membrano gostiteljske celice in sleče svojo RNA. Virionov encim, reverzna transkriptaza, uravnava postopek prepisovanja RNA v enojnovijačno DNA. Virusna RNA se skrajša in ustvari se druga verižica DNA. Sedaj dvojnovijačna DNA se integrira v gene humanih celic in ti geni se uporabijo za celično reprodukcijo.

Na tej točki humana celica vrši svoj reprodukcijski proces z uporabo svoje lastne polimeraze RNA, da integrirano DNA prepiše v virusno RNA. Virusna RNA se prevede v prekurzorski gag-pol fuzijski poliprotein. Poliprotein se potem cepi z encimom proteazo HIV, da nastanejo zreli virusni proteini. Tako je proteaza HIV odgovorna za reguliranje

-2kaskade cepitvenih dogodkov, ki vodijo do zorenja virusnih delcev v virus, ki je zmožen polne infektivnosti.

Tipičen odziv humanega imunskega sistema, ubijanje invazivnega viriona, je na hudi preizkušnji, zato ker virion velik del življenjskega cikla prebije v latentnem stanju znotraj imunske celice. Poleg tega, virusna reverzna transkriptaza, encim, ki se uporablja pri izdelavi novega virionskega delca, ni zelo specifičen in povzroča napake pri prepisovanju, kar ima za posledico neprestano spremenjene glikoproteine na površini virusnega zaščitnega plašča. To pomanjkanje specifičnosti zmanjšuje učinkovitost imunskega sistema, ker so protitelesa, ki so specifično izdelana proti enemu glikoproteinu, lahko nekoristna proti drugemu, od tod zmanjševanje števila protiteles, ki so na voljo, da se borijo proti virusu. Virus nadaljuje z reprodukcijo, medtem ko odziv imunskega sistema še naprej slabi. Sčasoma HIV v veliki meri gospoduje nad imunskim sistemom telesa, kar omogoča, da pride do oportunističnih okužb in brez dajanja protivirusnih sredstev, imunomodulatorjev, ali obojih, lahko nastopi smrt.

V virusovem življenjskem ciklu obstajajo vsaj tri kritične točke, ki so bile identificirane kot možne tarče za protivirusna zdravila: (1) začetna pritrditev viriona na T-4 limfocitno ali makrofagno mesto, (2) prepis virusne RNA v virusno DNA (reverzna transkriptaza, RT) in (3) sestavljanje novega virusnega delca med reprodukcijo (npr., proteaza aspartinske kisline HIV ali proteaza HIV).

Genomi retrovirusov kodirajo proteazo, ki je odgovorna za proteolitično predelovanje enega ali več poliproteinskih prekurzorjev, kot so pol in gag genski produkti. Glej VVellink, Arch. Virol. 98 1 (1988). Retrovirusne proteaze navadno predelujejo prekurzor gag v proteine sredice in tudi predelujejo prekurzor pol v reverzno transkriptazo in retrovirusno proteazo.

Za sestavljanje kužnih virionov je potrebno pravilno predelovanje predhodnih poliproteinov z retrovirusno proteazo. Pokazano je bilo, da in vitro mutageneza, ki producira virus z nepopolno proteazo, vodi do produkcije nezrelih oblik proteinov sredice, ki niso infektivni. Glej Crawforf s sod., J. Virol. 53 899 (1985); Katoh s sod., Viroloav 145 280 (1985). Zato

-3inhibicija retrovirusne proteaze zagotavlja atraktivno tarčo za protivirusno terapijo. Glej Mitsuya, Nature 325 775 (1987).

Zmožnost inhibirati virusno proteazo zagotavlja metodo za blokiranje virusne replikacije in zato ima zdravljenje za virusne bolezni, kot je AIDS, lahko manj stranskih učinkov, je lahko bolj učinkovito in je manj nagnjeno k rezistenci na zdravilo, ko ga primerjamo s sedanjimi zdravljenji. Kot rezultat tega se sedaj na trgu prodajajo trije inhibitorji proteaze HIV, Rochejev saquinavir, Abbottov ritonavir in Merckov indinavir in klinično preizkušajo številne potencialne proteazne inhibitorje, npr. Vertexov VX-478, Agouronov nelfinavir, Japan Energyjev KNI-272 in Ciba-Geigyjev CGP 61755.

Kot je razvidno po proteaznih inhibitorjih, ki so sedaj prisotni na trgu, so v kliničnih preizkusih proučili široko paleto potencialnih inhibitorjev proteaze HIV. Eno jedro, ciklične sečnine, je bilo deležno precejšnje pozornosti. Na primer v PCT prijavi številka VVO94/19329, Lam s sod., splošno opisuje ciklične sečnine s formulo:

O

R‘

HO OH in metode priprave teh sečnin. Čeprav so pričujoče spojine v obsegu opisa Lama s sod., v omenjeni PCT prijavi te spojine niso specifično razkrite.

Vzporedno s sedanjim uspehom proteaznih inhibitorjev so ugotovili, da lahko pacienti z virusom HIV postanejo rezistentni na posamezen proteazni inhibitor. Tako je zaželeno, da se razvije dodatne proteazne inhibitorje za nadaljnjo borbo s HIV okužbo.

POVZETEK IZUMA

V skladu s tem je en predmet pričujočega izuma zagotoviti nove proteazne inhibitorje.

-4Drug predmet pričujočega izuma je zagotoviti farmacevtske sestavke s proteazo inhibirajočo aktivnostjo, ki obsegajo farmacevtsko sprejemljiv nosilec in terapevtsko učinkovito količino vsaj ene od spojin pričujočega izuma ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.

Drug predmet pričujočega izuma je zagotoviti novo metodo za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, terapevtsko učinkovito količino vsaj ene od spojin pričujočega izuma ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.

Drug predmet pričujočega izuma je zagotoviti novo metodo za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, terapevtsko učinkovito kombinacijo (a) ene od spojin pričujočega izuma in (b) ene ali več spojin, izbranih iz skupine, ki je sestavljena iz inhibitorjev reverzne transkriptaze HIV in inhibitorjev proteaze HIV.

Drug predmet pričujočega izuma je zagotoviti metodo inhibiranja HIV, prisotnega v vzorcu telesne tekočine, ki obsega obdelavo vzorca telesne tekočine z učinkovito količino spojine pričujočega izuma.

Drug predmet pričujočega izuma je zagotoviti komplet ali embalažo, ki vsebuje vsaj eno od spojin pričujočega izuma v količini, ki je učinkovita za uporabo kot standard ali reagent pri testu ali preskusu za določitev zmožnosti potencialnega farmacevtika, da inhibira proteazo HIV, rast virusa HIV ali oboje.

Ti in drugi predmeti, ki bodo postali razvidni med sledečim podrobnim opisom, so bili doseženi z odkritjem izumiteljev, da so spojine s formulama I in II:

II ali njihove oblike farmacevtsko sprejemljivih soli ali predzdravil, učinkoviti proteazni inhibitorji.

PODROBEN OPIS PREDNOSTNIH IZVEDB

Tako v prvi izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo spojino s formulama I ali II:

ali njeno obliko farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.

V prednostni izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo spojino s formulo I.

V drugi prednostni izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo spojino s formulo II.

V drugi izvedbi pričujoči izum zagotavlja nov farmacevtski sestavek, ki obsega farmacevtsko sprejemljiv nosilec in terapevtsko učinkovito količino spojine s formulama I ali II ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo I.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo II.

-6V tretji izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo metodo za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, terapevtsko učinkovito količino spojine s formulama I ali II ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo I.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo II.

V četrti izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo metodo za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, v kombinaciji, terapevtsko učinkovito količino:

(a) spojine s formulama I ali II; in, (b) vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz inhibitorjev reverzne transkriptaze HIV in inhibitorjev proteaze HIV.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo I.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo 11.

V drugi prednostni izvedbi je inhibitor reverzne transkriptaze, nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze.

V drugi bolj prednostni izvedbi nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze izberemo iz AZT, 3TC, ddl, ddC in d4T in proteazni inhibitor izberemo iz saquinavir, ritonavir, indinavir, VX-478, nelfinavir, KNI-272, CGP-61755 in U-103017.

V še bolj prednostni izvedbi nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze izberemo iz AZT in 3TC in proteazni inhibitor izberemo iz saguinavir, ritonavir in indinavir.

V Še nadaljnji prednostni izvedbi je nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze AZT.

-7V drugi še nadaljnji prednostni izvedbi je proteazni inhibitor indinavir.

V peti izvedbi pričujoči izum zagotavlja farmacevtski komplet, uporaben za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega terapevtsko učinkovito količino:

(a) spojine s formulama I ali II; in, (b) vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz inhibitorjev reverzne transkriptaze HIV in inhibitorjev proteaze HIV, v eni ali več sterilnih embalažah.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo I.

V drugi prednostni izvedbi ima spojina formulo II.

V šesti izvedbi pričujoči izum zagotavlja novo metodo inhibiranja HIV, prisotnega v vzorcu telesne tekočine, ki obsega obdelavo vzorca telesne tekočine z učinkovito količino spojine s formulama I ali II.

V sedmi izvedbi pričujoči izum zagotavlja dodatek, komplet ali embalažo, ki obsega spojino s formulo I ali II v količini, ki je učinkovita za uporabo kot standard ali reagent pri testu ali preskusu za določitev zmožnosti potencialnega farmacevtika, da inhibira proteazo HIV, rast HIV ali oboje.

DEFINICIJE

Kot je tu uporabljeno imajo sledeči termini in izrazi navedene pomene. Upoštevali bomo, da imajo spojine pričujočega izuma asimetrično substituiran ogljikov atom in jih lahko izoliramo v optično aktivnih ali racemnih oblikah. V stroki je dobro poznano, kako pripraviti optično aktivne oblike, kot s stopitvijo racemnih oblik ali s sintezo iz optično aktivnih izhodnih materialov. Predvidene so vse kiralne, diastereomeme in racemne oblike in vse oblike strukture geometrijskih izomer, razen, če je specifična stereokemija ali izomema oblika specifično pokazana.

-8Kot je tu uporabljeno, inhibitor reverzne transkriptaze HIV je mišljeno, da se nanaša tako na nukleozidne kakor nenukleozidne inhibitorje reverzne transkriptaze (RT) HIV. Primeri nukleozidnih inhibitorjev RT vključujejo, toda niso omejeni na A2T, ddC, ddl, d4T in 3TC. Primeri nenukleozidnih inhibitorjev RT vključujejo, toda niso omejeni na, viviradin (Pharmacia in Upjohn U90152S), TIBO derivate, BI-RG-587, nevirapin, L-697,661, LY 73497 in Ro 18,893 (Roche).

Kot je tu uporabljeno, inhibitor proteaze HIV je mišljeno, da se nanaša na spojine, ki inhibirajo proteazo HIV. Primeri vključujejo, toda niso omejeni, saquinavir (Roche, Ro318959), ritonavir (Abbott, ABT-538), indinavir (Merck, MK-639), VX-478 (Vertex/Glaxo VVellcome), nelfinavir (Agouron, AG-1343), KNI-272 (Japan Energy), CGP-61755 (CibaGeigy) in U-103017 (Pharmacia in Upjohn). Dodatni primeri vključujejo ciklične proteazne inhibitorje, razkrite v WO 93/07128, WO 94/19329, WO 94/22840 in PCT prijavi številka US96/03426.

Kot je tu uporabljeno, se farmacevtsko sprejemljive soli nanašajo na derivate razkritih spojin, pri čemer je matična spojina modificirana z izdelavo njenih soli s kislinami ali bazami. Primeri farmacevtsko sprejemljivih soli vključujejo, toda niso omejeni na soli mineralnih ali organskih kislin bazičnih ostankov, kot so amini; alkalijske ali organske soli kislih ostankov, kot so karboksilne kisline; in podobno. Farmacevtsko sprejemljive soli vključujejo konvencionalne netoksične soli ali kvartarne amonijeve soli matične spojine, ki so tvorjene, na primer, iz netoksičnih anorganskih ali organskih kislin. Na primer, take konvencionalne netoksične soli vključujejo soli, ki izhajajo iz anorganskih kislin, kot klorovodikove, bromovodikove, žveplene, sulfamske, fosforne, dušikove in podobnih; in soli pripravljene iz organskih kislin, kot ocetne, propionske, jantarne, glikolne, stearinske, mlečne, jabolčne, vinske, citronske, askorbinske, pamojske, maleinske, hidroksimaleinske, fenilocetne, glutaminske, benzojske, salicilne, sulfanilne, 2acetoksibenzojske, fumame, toluensulfonske, metansulfonske, etan disulfonske, oksalne, izetionske in podobnih.

Farmacevtsko sprejemljive soli pričujočega izuma lahko sintetiziramo iz matične spojine, ki vsebuje bazičen ali kislinski del, po konvencionalnih kemijskih metodah. Na splošno

-9take soli lahko pripravimo z reakcijo prostih oblik kislin ali baz teh spojin s stehiometrično količino primerne baze ali kisline v vodi ali v organskem topilu ali v njuni zmesi; na splošno so prednostni nevodni mediji, kot eter, etil acetat, etanol, izopropanol ali acetonitril. Sezname primernih soli najdemo v Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mačk Publishing Company, Easton, PA, 1985, str. 1418, katerih razkritje je s tem vključeno z referenco.

Izraz farmacevtsko sprejemljiv je tu uporabljen, da se nanaša na tiste spojine, materiale, sestavke in/ali odmerjene oblike, ki so v obsegu pametne zdravniške presoje primerni za uporabo v stiku s tkivi ljudi in živali, brez prekomerne toksičnosti, vnetja, alergičnega odziva ali drugega problema ali komplikacije, sorazmerno z razumnim razmerjem med koristnostjo in tveganjem.

Predzdravila so mišljena, da vključujejo katerekoli kovalentno vezane nosilce, ki sprostijo aktivno matično zdravilo po formulah I ali 11 ali drugih formulah ali spojinah pričujočega izuma in vivo, ko je tako zdravilo dano sesalskemu subjektu. Predzdravila spojine pričujočega izuma, na primer formula (I), pripravimo z modifikacijo funkcionalnih skupin, ki so prisotne v spojini na tak način, da se modifikacije cepijo do matične spojine bodisi pri rutinski manipulaciji ali in vivo. Predzdravila vključujejo spojine pričujočega izuma, v katerih je hidroksi ali amino skupina vezana na katerokoli skupino, ki se, ko predzdravilo damo sesalskemu subjektu cepi, da se tvori prosti hidroksil oziroma prosti amino. Primeri predzdravil vključujejo, toda niso omejeni na, acetatne, formatne ali benzoatne derivate alkoholnih in aminskih funkcionalnih skupin v spojinah s formulama I ali II; fosfatne estre, dimetilglicinske estre, aminoalkilbenzil estre, aminoalkil estre in karboksialkil estre alkoholnih funkcionalnih skupin v spojinah s formulama I ali II; in podobno. Dodatni primeri vključujejo spojine v katerih se dve hidroksi skupini iz formul I ali II spojita, da se tvori epoksid; -OCH2SCH2O-; -OC(=O)O-; -OCH2O-; -OC(=S)O-; -OC(=O)C(=O)O-; -OC(CH₃)₂O-; -OC((CH2)3NH₂)(CH₃)O-; -00(ΟΟΗ₃)(ΟΗ₂ΟΗ₂ΟΗ₃)0; ali -OS(=O)O-.

-10Stabilna spojina in stabilna struktura je mišljeno označiti spojino, ki je dovolj robustna, da do uporabne stopnje čistosti prestane izolacijo iz reakcijske zmesi in formulacijo v učinkovito terapevtsko sredstvo. S pričujočim izumom pričakujemo samo stabilne spojine.

Substituiran je mišljeno, da označuje, da je eden ali več vodikov na atomu v izrazu označenem z uporabo substituiran zamenjan z izborom iz navedene skupine(skupin), pod pogojem, da normalna valenca označenega atoma ni presežena in da substitucija rezultira v stabilni spojini. Ko je substituent keto (npr., =0) skupina, potem sta na atomu zamenjana 2 vodika.

Terapevtsko učinkovita količina je mišljeno, da vključuje količino spojine pričujočega izuma ali količino kombinacije spojin za katere se trdi, da so učinkovite za inhibicijo okužbe s HIV, ali da v gostitelju zdravijo simptome okužbe s HIV. Kombinacija spojin je prednostno sinergistična kombinacija. Sinergija, kot jo na primer opisujeta Chou in Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984) se pojavi, ko je učinek (v tem primeru inhibicija replikacije HIV) spojin, kadar so dane v kombinaciji, večji kot skupni učinek spojin, kadar so dane same ali kot posamezno sredstvo. Na splošno se sinergistični učinek najbolj jasno kaže pri suboptimalnih koncentracijah spojin. Sinergijo lahko, z nižjo citotoksičnostjo, povečanim protivirusnim učinkom ali katerim drugim ugodnim učinkom kombinacije, primerjamo s posameznimi komponentami.

Druge značilnosti izuma bodo postale razvidne med sledečimi opisi ponazorilnih izvedb, ki so dane za pojasnitev izuma in niso mišljene kot njegova omejitev.

Primeri

V primerih uporabljene okrajšave so definirane kot sledi: °C za stopinje Celzija, d za dublet, dd za dublet dubletov, ekv za ekvivalent ali ekvivalente, g za gram ali grame, mg za miligram ali miligrame, mL za mililiter ali mililitre, H za vodik ali vodike, h za uro ali ure, m za multiplet, M za molaren, min za minuto ali minute, MHz za megahertz, MS za masno spektroskopijo, nmr ali NMR za nuklearno magnetno resonančno spektroskopijo, t za triplet in TLC za tankoplastno kromatografijo.

-11PRIMER 1

Priprava (4R, 5S, 6S, 7R)-heksahidro-1-f5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-dihidroksi-4,7bis[fenilmetil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-ona (I).

Spojino 1 lahko pripravimo po znanih metodah. Na primer, priprava spojine 1 je prikazana v Shemi 1 Rossano-ja s sod. (Tetr. Lett. 1995, 36(28), 4967, 4968), katere vsebina je s tem vključena z referenco. Dodatna metoda priprave spojine 1 je prikazana v Primeru 6 U.S. patenta št 5,530,124, katerega vsebina je s tem vključena z referenco.

DEL A: K suspenziji spojine 1 (10.0 g; 27.3 mmol) v 1,2-dikloroetanu (100 mL) smo dodali metiltriflat (3.4 mL, 30 mmol). Po segrevanju pri temperaturi refluksa preko noči, smo reakcijsko zmes sprali z nasičenim NaHCO3, nasičenim NaCI, posušili (Na2SO4) in evaporirali, da je ostalo 12.5 g rumenega olja. Kolonska kromatografija (flash S1O2; 25% EtOAc v heksanu) je dala 7.86 g spojine 2 kot bledo rumeno olje, ki je kristaliziralo, ko smo ga pustili stati (75% dobitek). Tališče = 97-100°C. MH⁺ = 381.

-12DEL B: K raztopini izosečnine 2 (4.43 g; 11.7 mmol) in 3-ciano-4-fluorobenzil bromida (5.00 g; 23.3 mmol) v DMF (50 mL) s temperaturo 0°C smo dodali NaH (60% v mineralnem olju; 1.40 g; 35.0 mmol). Po segrevanju na sobno temperaturo in mešanju preko noči smo reakcijsko zmes dodali k 25% Et2O/EtOAc. Organsko fazo smo sprali z vodo (3X), nasičenim NaCl, posušili (Na2SO4) in evaporirali, da je ostalo rumeno olje. Kolonska kromatografija (flash SiO2! 25% EtOAc v heksanu) je dala 5.55 g 3 kot brezbarvno olje (92% dobitek) MH⁺ = 514.

DEL C: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[(3-ciano-4-fluorofenil)metil]-5,6-0-izopropiliden-4,7bis-(4-fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-on (4).

Raztopino izosečnine 3 (2.78 g; 5.41 mmol) in benzil bromida (1.93 mL; 16.2 mmol) v acetonitrilu (15 mL) smo preko noči segrevali pri temperaturi refluksa. Reakcijsko zmes smo evaporirali in jo podvrgli kolonski kromatografiji (flash S1O2; 20% EtOAc v heksanu), da smo dobili 3.02 g 4 kot belo peno (95% dobitek). MH⁺ = 590.

DEL D: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-O-izopropiliden-4,7bis-(4-fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-on (5).

-13Raztopino nitrila 4 (3.02 g; 5.13 mmol) v n-BuOH (30 mL) in hidrazin hidrata (6 mL) smo preko noči segrevali pri temperaturi refluksa. Reakcijsko zmes smo dodali k EtOAc in sprali z 10% citronsko kislino (2X), nasičenim NaCI, nasičenim NaH003, nasičenim NaCI, posušili (NaSO4) in evaporirali, daje ostalo 3.09 g 5 kot bela pena (100% dobitek). MH⁺ = 602.

DEL E: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-dihidroksi-4,7-bis(fenilmetil)-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-on (I).

Raztopino spojine 5 (3.09 g; 5.14 mmol) v 3 N HCI (10 mL) in THF (40 mL) smo mešali preko noči. Reakcijsko zmes smo dodali k EtOAc in sprali z nasičenim NaHCO3, nasičenim NaCI, posušili (NaSO4) in evaporirali, da je ostalo oranžno olje. Kolonska kromatografija (flash SiO2, 7% MeOH/CHgC^ in 0.8% NH4OH) je dala 2.15 g rožnate steklaste trdne snovi. Kristalizacija iz 3:1 CH2CI2/ Et20 je dala 1.7 g (I) kot bledo rožnate kristale, ki smo jih preko noči sušili pod visokim vakuumom pri 85°C. Tališče = 134 139°C.

PRIMER 2

Priprava (4R,5S,6S,7R)-heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-dihidroksi-4,7-bis[(4metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-ona (II).

DEL A: (2R,3S,4S,5R)-2,5-Bis(2,2-dimetilhidrazino)-1,6-bis(4-metilfenil)-3,4-Oizopropilidenheksandiol (10).

-14Izhodni hidrazon lahko pripravimo po metodi Rossano-ja s sod. (glej Formulo 3a na strani 4968 v Tetr. Lett. 1995, 36(28), 4967-70), katere vsebina je s tem vključena z referenco.

K p-ksilenu (57 mL, 464 mmol) smo pri 15°C dodali sek-butillitij (95 mL, 123 mmol, 1.3 M v cikloheksanu) po kapljicah v teku 5 min. Raztopino smo ohladili na -15°C in po kapljicah dodali THF (30 mL). Po mešanju 1 h smo po kapljicah dodali hidrazon (10.2 g, 42 mmol) v THF (30 mL). Reakcijsko zmes smo mešali 20 min in jo segreli na 0°C. Raztopino smo previdno zmešali z vodo in ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo ekstrahirali z 1N HCI in združene vodne frakcije naredili močno bazične s 50% vodnim NaOH. Nastalo zmes smo ekstrahirali z EtOAc, sprali s slanico in posušili (MgSOzj). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom, da smo dobili bis-hidrazin 10 kot olje (19.25 g, 99%): ¹H NMR (CDCI3) δ 7.08 (s, 8 H), 4.09 (s, 2 H), 3.02 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.67 (m, 4 H), 2.31 (s, 6 H), 2.17 (s, 12 H), 1.43 (s, 6 H); IR (KBr) v 2980, 2940, 1680, 1510, 1240 cm'¹; LRMS (ESI) m/z: 455 (M+H⁺, 6%), 228 (M+2H⁺, 100%); HRMS izrač. za C27H43N4O2 (M+H⁺) 455.3386; ugotovljeno 455.3393.

DEL B: (2R,3S,4S,5R)-2,5-Diamino-1,6-bis(4-metilfenil)-3,4-O-izopropilidenheksandiol (11).

K raztopini bis-hidrazina 10 (18.64 g, 41 mmol) v metanolu (150 mL) smo dodali Raney nikelj (20 g, 50% gošča). Suspenzijo smo nasitili z vodikom (17.24 bar) in segrevali pri 100°C 16 h. Suspenzijo smo ohladili, filtrirali preko celita in topilo odstranili pod znižanim tlakom. Kromatografija (silikagel, 10% metanola v CH2CI2) je dala diamin 11 kot olje (12.49 g, 83%): ¹H NMR (CDCI3) δ 7.08 (ab, J = 8.1 Hz, Av = 15.2 Hz, 8 H), 4.01 (s, 2 H), 2.94 (m, 2 H), 2.77 (A od ΑΒΧ, J_AB = 13.4 Hz, J_AX = 4.6 Hz, 2 H), 2.51 (B od ΑΒΧ, J_AB =

-1513.4 Hz, Jgx = 9.7 Hz, 2 H), 2.32 (s, 6 H), 1.45 (s, 6H); IR (KBr) v 2980, 2920,1510 cm’¹; LRMS (ESI) m/z: 369 (M+H⁺, 16%), 185 (M+2H⁺, 100%); HRMS izrač. za C23H33N2O2 (M+H⁺) 369.2542; ugotovljeno 369.2534.

DEL C: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-5,6O-izopropiliden-4,7-bis[(4-metilfenil)metil]-2H-1,3diazapin-2-on (12).

K raztopini diamina 11 (12.48 g, 33.9 mmol) v 1,1,2,2-tetrakloroetanu (130 mL) smo dodali 1,1'-karbonildiimidazol (5.67 g, 35.0 mmol). Po 10 min smo raztopino po kapljicah v teku 45 min dodali k 1,1,2,2-tetrakloroetanu (600 mL) pri refluksu. Raztopino smo ohladili, sprali z vodo, slanico in posušili (MgSO4). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek kromatografirali (silikagel, 33% etilacetata v heksanu), sledila je rekristalizacija (etil acetat/heksan), da smo dobili ciklično sečnino 12 kot belo trdno snov (6.18 g, 46%): tal. 228-230°C; ¹H NMR (CDCI3) δ 7.12 (brs, 8 H), 4.93 (d, J = 6.2 Hz, 2 H), 4.25 (s, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.01 (razviden d, J = 13.2 Hz, 2 H), 2.78 (razviden t, J = 11.8 Hz, 2 H), 2.33 (s, 6 H), 1.54 (s, 6 H); IR (KBr) v 3260, 2930, 1670, 1090 cm‘¹; LRMS (ESI) m/z: 395 (M+H⁺, 100%); HRMS izračunano za C24H31N2O3 (M+H⁺) 395.2335; ugotovljeno 395.2333.

DEL D: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-5,6-O-izopropiliden-4,7-bis[(4-meti!fenil)metil]-1 fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-on (13).

-16Μ<

Me

K raztopini ciklične sečnine 12 (3.0 g, 7.6 mmol) in benzil bromida (1.59 g, 9.3 mmol) v THF (300 mL) smo pri 0°C dodali kalijev f-butoksid (8.4 mL, 8.4 mmol, 1.0 M v THF) po kapljicah v teku 30 min. Raztopino smo pustili segreti na sobno temperaturo in jo mešali preko noči. Reakcijsko zmes smo razredčili s slanico in jo ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo sprali s slanico in posušili (MgSO4). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek kromatografirali (silikagel, 25% etil acetata v heksanu), da smo dobili ciklično sečnino 13 kot steklo (2.57 g, 70%): ¹H NMR (CDCI3) δ 7.28 (m, 3 H), 7.15 (m, 10 H), 5.12 (d, J = 14.6 Hz, 1 H), 4.88 (d, J = 6.6 Hz, 1 H), 4.23 (m, 1 H), 3.75 (m, 2 H), 3.47 (m, 1 H), 3.01 (m, 3 H), 2.86 (d, J = 14.6 Hz, 1 H), 2.66 (m, 1 H), 2.37 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.45 (s, 3 H), 1.40 (s, 3 H); IR (KBr) v 2930, 1650, 1240, 1090 cm'¹; LRMS (ESI) m/z: 485 (M+H⁺, 100%); HRMS izrač. za 03^37^03 (M+H⁺) 485.2804; ugotovljeno 485.2789.

DEL E: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[(3-ciano-4-fluorofenil)metil]-5,6-O-izopropiliden4,7-bis[(4-metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-on (14).

CN

Me

Me

-17K raztopini ciklične sečnine 13 (2.30 g, 4.75 mmol) in 3-ciano-4-fluorobenzil bromida (1.07 g, 5.0 mmol) v THF (200 mL) smo pri 0°C dodali kalijev f-butoksid (4.8 mL, 4.8 mmol, 1.0 M v THF). Raztopino smo segreli na sobno temperaturo in mešali preko noči. Reakcijsko zmes smo razredčili s slanico in ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo sprali s slanico in posušili (MgSO4). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek kromatografirali (silikagel, 25% etil acetata v heksanu), da smo dobili ciklično sečnino 14 kot steklo (2.43 g, 82%): ¹H NMR (CDCI3) 8 7.33 (m, 5 H), 7.13 (d, J = 7.7 Hz, 4 H), 6.95 (m, 7 H), 4.89 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 4.46 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 3.97 (m, 1 H), 3.78 (m, 3 H), 3.65 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 3.07 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 2.83 (m, 4 H), 2.36 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.44 (s, 3 H), 1.38 (s, 3 H); IR (KBr) v 2980, 2930, 2240,1630,1230 cm'¹; CIMS (NH4) m/z: 635 (M+HH4⁺, 100%); HRMS izrač. za C39H41N3O3F (M+H⁺) 618.3132; ugotovljeno 618.3119.

DEL F: (4R,5S,6S,7R)-Heksahidro-1 -[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-O-izopropiliden-4,7bis[(4-metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2 H-1,3-diazapin-2-on (15).

K raztopini ciklične sečnine 14 (2.40 g, 3.89 mmol) v n-butanolu (40 mL) smo dodali hidrazin monohidrat (19.8 g, 395 mmol) in nastalo raztopino preko noči segrevali pri temperaturi refluksa. Reakcijsko zmes smo razredčili z vodo in ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo sprali s slanico in posušili (MgSO₄). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek kromatografirali (silikagel, 10% metanola v metilen kloridu), da smo dobili aminoindazol 15 kot belo trdno snov (2.34 g, 95%): tališče 120-124 °C; ¹H NMR (CDCI3) δ 7.25 (m, 12 H), 6.97 (t, J = 7.7 Hz, 4 H), 4.98 (dd, J = 14.3, 2.0 Hz, 2 H), 3.80 (S, 2 H), 3.76 (m, 2 H), 3.27 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 3.09 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 2.86 (m, 4 H), 2.35 (s, 6 H), 1.32 (s, 6 H); IR (KBr) v 3310, 2930, 1630, 1430, 1230 cm'¹;

-18CIMS (NH₄) m/z: 630 (M+H⁺, 100%); HRMS izrač. za C39H44N5O3 (M+H⁺) 630.3444; ugotovljeno 630.3428.

DEL G: Priprava (4R,5S,6S,7R)-heksahidro-1-[5-(3-aminoindazol)metil]-5,6-dihidroksi4,7-bisi(4-metilfenil)metil]-3-fenilmetil-2H-1,3-diazapin-2-ona (Ii).

Ciklično sečnino 15 (1.90 g, 3.02 mmol) smo raztopili v 10% konc. HCI v metanolu (40 mL). Po 2 h smo dodali nasičen vodni Na2CO3 in suspenzijo ekstrahirali z EtOAc. Združene organske plasti smo sprali s slanico in posušili (MgSO4). Topilo smo odstranili pod znižanim tlakom in preostanek kromatografirali (silikagel, 10% metanola v metilen kloridu), da smo dobili naslovno spojino kot belo trdno snov (1.71 g, 96%): tališče 142-146 °C; ¹H NMR (CD3OD) δ 7.37 (s, 1 H), 7.28 (m, 3 H), 7.22 (s, 2 H), 7.15 (m, 6 H), 6.94 (m, 4 H), 4.77 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 4.72 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 3.59 (m, 2 H), 3.51 (br s, 2 H), 3.11 (d, J = 14.3 Hz, 1 H), 2.93 (m, 5 H), 2.31 (br s, 6 H); IR (KBr) v 3330, 2920, 1610, 1470, 1230 cm'¹; CIMS (NH3) m/z: 590 (M+H⁺, 100%); HRMS izrač. za C36H4₀N₅O3 (M+H⁺) 590.3131; ugotovljeno 590.3132; Anal. (C3₆H3₉N₅O3) C, H, N.

Koristnost

Spojine s formulama I in II imajo inhibitomo aktivnost za proteazo HIV in so zato uporabne kot protivirusna sredstva za zdravljenje okužbe s HIV in z njim povezanih bolezni. Spojine s formulama I in II imajo inhibitomo aktivnost za proteazo HIV in so učinkovite kot inhibitorji rasti HIV. Zmožnost spojin pričujočega izuma, da inhibirajo virusno rast ali infektivnost je nazorno prikazana s standardnim preskusom virusne rasti oziroma infektivnosti, na primer, z uporabo preskusa, ki smo ga opisali spodaj.

Spojine pričujočega izuma s formulama I in II so uporabne tudi za inhibicijo HIV v ex vivo vzorcu, ki vsebuje HIV ali za katerega pričakujemo, da bo izpostavljen virusu HIV. Tako spojine pričujočega izuma lahko uporabimo, da inhibirajo HIV, prisoten v vzorcu telesne tekočine (na primer, vzorcu seruma ali sperme), ki vsebuje ali za katerega se sumi, da vsebuje ali, da bo izpostavljen virusu HIV.

-19S tem izumom zagotovljene spojine so tudi koristne kot standardi ali referenčne spojine za uporabo pri testih ali preskusih za določanje zmožnosti nekega sredstva, da inhibira replikacijo virusnega klona in/ali proteazo HIV, na primer v farmacevtskem raziskovalnem programu. Tako se spojine pričujočega izuma lahko uporabljajo kot kontrolna ali referenčna spojina pri takih preskusih in kot standard za kontrolo kvalitete. Spojine pričujočega izuma so lahko zagotovljene v komercialnem kompletu ali embalaži za uporabo kot tak standard ali referenčna spojina.

Ker spojine pričujočega izuma kažejo specifičnost za proteazo HIV, so spojine pričujočega izuma lahko koristne tudi kot diagnostični reagenti v diagnostičnih preskusih za odkrivanje proteaze HIV. Tako bi inhibicija proteazne aktivnosti v preskusu (kot so preskusi, ki so tu opisani) s spojino pričujočega izuma kazala na prisotnost proteaze HIV in virusa HIV.

Kot je tu uporabljeno pg pomeni mikrogram, mg pomeni miligram, g pomeni gram, pL pomeni mikroliter, mL pomeni mililiter, L pomeni liter, nM pomeni nanomolaren, pM pomeni mikromolaren, mM pomeni milimolaren, M pomeni molaren in nm pomeni nanometer. Sigma je Sigma-Aldrich Corp. Iz St. Louisa, MO.

HIV RNA preskus

DNA plazmidi in in vitro kopije RNA:

Plazmid pDAB 72, vsebujoč tako gag kakor pol sekvence od BH10 (bp 113-1816), kloniran v PTZ 19 R, smo pripravili po Erickson-Viitanen s sod. AIDS Research and Human Retroviruses 1989, 5, 577. Plazmid smo linearizirali z Bam HI, pred izdelovanjem in vitro kopij RNA, z uporabo kompleta Riboprobe Gemini system II (Promega) s polimerazo RNA T7. Sintetizirano RNA smo očistili z obdelavo z RNaze prosto DNazo (Promega), ekstrakcijo z zmesjo fenola in kloroforma in obarjanjem z etanolom. Kopije RNA smo raztopili v vodi in shranili pri -70°C. Koncentracijo RNA smo določili iz A26O·

Sonde:

-20Biotinilirane lovilne sonde smo očistili s HPLC po sintezi na DNA sintetizatorju Applied Biosystems (Foster City, CA) z dodatkom biotina na 5' terminalen konec oligonukleotida z uporabo biotin-fosforamiditnega reagenta Cocuzza, Tet. Lett. 1989, 30, 6287. Biotinilirana lovilna sonda gag (5-biotin-CTAGCTCCCTGCTTGCCCATACTA 3') je bila komplementarna nukleotidom 889-912 od ΗΧΒ2 in biotinilirana lovilna sonda pol (5*-biotinCCCTATCATTTTTGGTTTCCAT 3') je bila komplementarna nukleotidom 2374-2395 od ΗΧΒ2. Z alkalno fosfatazo združeni oligonukleotidi, ki smo jih uporabili kot sporočilne sonde, so bili pripravljeni v podjetju Syngene (San Diego, CA). Sporočilna sonda pol (5* CTGTCTTACTTTGATAAAACCTC 3') je bila komplementarna nukleotidom 2403-2425 od ΗΧΒ2. Sporočilna sonda gag (5‘ CCCAGTATTTGTCTACAGCCTTCT 3') je bila komplementarna nukleotidom 950-973 od ΗΧΒ2. Vse nukleotidne pozicije so tiste iz GenBank banke podatkov genetskih sekvenc (GenBank Genetic Sequence Data Bank), kot so dostopne preko genetskega računalniškega programskega paketa za analizo skupin sekvenc (Genetics Computer Group Sequence Analysis Softvvare Package), (Devereau Nucleic Acids Research 1984, 12, 387). Sporočilne sonde smo pripravili v 2 x SSC (0.3 M NaCI, 0.03 M natrijev citrat), 0.05 M Tris pH 8.8, 1 mg/mL BSA, kot 0.5 μΜ raztopine na zalogi. Biotinilirane lovilne sonde smo pripravili v vodi, kot 100 μΜ raztopine na zalogi.

S streptavidinom obložene plošče:

S streptavidinom obložene plošče smo dobili iz podjetja Du Pont Biotechnology Systems (Boston, MA).

Zaloge celic in virusov:

Celice MT-2 in MT-4 smo vzdrževali v RPMI 1640, ki smo mu dodali 5% fetalni telečji serum (FCS) za celice MT-2 oz. 10% FCS za celice MT-4, 2 mM L-glutamin in 50 μg/mL gentamicina, vse iz Gipco. RF HIV-1 smo razmnožili v celicah MT-4 v istem mediju. Zaloge virusov smo pripravili približno 10 dni po akutni okužbi celic MT-4 in jih kot alikvote shranili pri -70°C. Kužni titri zalog (RF) HIV-1 so bili 1-3 x 10? PFU (lehe formirajočih enot) /mL, kot smo izmerili s preskusom na lehe (angl. plague assay) na celicah MT-2

-21(glej spodaj). Vsak alikvot zaloge virusa, ki smo ga uporabili za okužbo, smo odtajali samo enkrat

Za vrednotenje protivirusne učinkovitosti smo celice, ki smo jih potem okužili, en dan pred okužbo gojili v več vzporednih kulturah. Na dan okužbe smo celice ponovno suspendirali

6 pri 5 x 10 celic/mL v RPMI1640, 5% FCS za obsežnejše okužbe ali pri 2 x 10 celic/mL v Dulbeccovem modificiranem mediju Eaglesa s 5% FCS za okužbo na mikrotitrskih ploščah. Dodali smo virus in z gojenjem nadaljevali 3 dni pri 37°C.

HIV RNA preskus:

Celične lizate ali očiščeno RNA v 3 M ali 5 M GED smo zmešali s 5 M GED in lovilno sondo na končno koncentracijo gvanidinijevega izotiocianata 3 M in končno koncentracijo biotin oligonukleotida 30 nM. Hibridizacijo smo izvajali v zaprtih ploščah za tkivne kulture s 96 jamicami z U dnom (Nune ali Costar) 16-20 ur pri 37°C. Reakcijske zmesi, v katerih je potekala reakcija hibridizacije RNA, smo trikrat razredčili z deionizirano vodo na končno koncentracijo gvanidinijevega izotiocianata 1 M in alikvote (150 pL) prenesli v jamice s streptavidinom obloženih mikrotitrskih plošč. Vezanje lovilne sonde in lovilna sonda-RNA hibrida na imobiliziran streptavidin smo pustili potekati 2 uri pri sobni temperaturi, potem smo plošče 6-krat sprali z DuPontovim ELISA pufrom za spiranje plošč (s fosfatom zapufrana slanica (PBS), 0.05% Tween 20). Drugo hibridizacijo sporočilne sonde na imobiliziran kompleks lovilne sonde in hibridizirane tarčne RNA smo izvedli v sprani, s streptavidinom obloženi jamici, z dodatkom 120 pl hibridizacijskega koktajla, ki je vseboval 4 X SSC, 0.66% Triton X 100, 6.66% deioniziran formamid, 1 mg/mL BSA in 5 nM sporočilno sondo. Po eni uri hibridizacije pri 37°C smo ploščo ponovno 6-krat sprali. Aktivnost imobiiizirane alkalne fosfataze smo določili z dodatkom 100 pL 0.2 mM 4metilumbeliferil fosfata (MUBP, JBL Scientific) v pufru δ (2.5 M dietanolamin pH 8.9 (JBL Scientific), 10 mM MgCl2, 5 mM cinkov acetat dihidrat in 5 mM Mhidroksietil-etilendiamin-triocetna kislina). Plošče smo inkubirali pri 37°C. Fluorescenco pri 450 nm smo merili z uporabo mikroploščnega fluorometra (Dynateck) z vzburjanjem pri 365 nm.

Na mikroploščah osnovano vrednotenje spojin v celicah MT-2, okuženih s HIV-1:

-22Spojine smo za ovrednotenje raztopili v DMSO in razredčili v mediju za gojenje kultur, na dvakratno najvišjo koncentracijo, ki smo jo testirali, in maksimalno DMSO koncentracijo

2%. Nadaljnje trikratne serijske razredčitve spojin v gojilnem mediju smo izvedli direktno v jamicah mikrotitrskih plošč z U dnom (Nune). Po razredčitvi spojin smo dodali celice MT-2 5 5 (50 pL), da smo dobili končno koncentracijo 5x10 na mL (1 x 10 na jamico). Celice smo inkubirali s spojinami 30 min pri 37°C v CO2 inkubatorju. Za vrednotenje protivirusne učinkovitosti smo primemo razredčitev virusne zaloge (RF) HIV-1 (50 pL) dodali v jamice za gojenje kultur, ki so vsebovale celice in razredčitve testnih spojin. Končen volumen v vsaki jamici je bil 200 pL. Osem jamic na vsaki plošči smo pustili neokuženih z dodanimi 50 pL medija namesto virusa, medtem ko smo osem jamic okužili v odsotnosti katerekoli protivirusne spojine. Za vrednotenje toksičnosti spojin je na paralelnih ploščah gojenje potekalo brez okužbe z virusom.

Po 3 dneh gojenja pri 37°C v vlažilni komori znotraj CO2 inkubatorja smo iz s HIV okuženih plošč odstranili vse razen 25 pL medija/jamico. Sedemintrideset pL 5 M GED, ki je vseboval biotinilirano lovilno sondo, smo dodali h koloniziranim celicam in preostali medij v vsako jamico do končne koncentracije 3 M GED in 30 nM lovilne sonde. Hibridizacijo lovilne sonde na RNA HIV v celičnem lizatu smo izvedli v isti jamici mikroplošče, kot smo jo uporabili za gojenje virusa, ob zaprtju plošče s ploščno zaporo (Costar) in inkubiranju 16-20 ur v inkubatorju pri 37°C. V vsako jamico smo potem dodali destilirano vodo, da smo trikrat razredčili reakcijsko zmes s potekajočo hibridizacijsko reakcijo in 150 pL te razredčene zmesi prenesli na s streptavidinom obloženo mikrotitrsko ploščo. RNA HIV smo kvantitativno določili kot je opisano spodaj. Standardno krivuljo, pripravljeno z dodajanjem poznanih količin pDAB 72 in vitro kopije RNA v jamice, vsebujoče lizirane neinficirane celice, smo izvedli na vsaki mikrotitrski plošči, da bi določili količino med okužbo izdelane virusne RNA.

Zato, da bi standardizirali virusni inokulum, ki smo ga uporabili pri vrednotenju spojin za protivirusno aktivnost, smo izbrali razredčitve virusa, ki so za dideoksicitidin (ddC) imele IC90 vrednost (koncentracija spojine, ki je potrebna za 90% zmanjšanje nivoja RNA HIV) 0.2 pg/mL. Vrednosti IC90 drugih protivirusnih spojin, tako bolj kakor manj močnih kot

-23ddC, smo lahko ponovno izvedli ob uporabi posameznih zalog (RF) HIV-1, ko smo sledili 5 temu postopku. Ta koncentracija virusa je ustrezala ~3 x 10 PFU (izmerjeno s preskusom na lehe na celicah MT-2) na testno jamico in je tipično producirala približno 75% maksimalnega nivoja virusne RNA, dosegljivega pri vsakem virusnem inokulumu. Za RNA HIV preskus smo vrednost ICgg določili iz procenta redukcije neto signala (signal iz vzorcev okuženih celic minus signal iz vzorcev neokuženih celic) v RNA preskusu, relativno na neto signal iz okuženih, neobdelanih celic na isti plošči s kulturami (povprečje iz osem jamic). Pravilno izvršitev posamezne okužbe in testov RNA preskusa smo presojali po treh kriterijih. Zahtevano je bilo, da bi morala virusna infekcija dajati signal RNA preskusa, ki bi bil enak ali višji kot signal generiran iz 2 ng pDAB 72 in vitro kopije RNA. IC90 za ddC, določena v vsakem potekajočem preskusu, bi morala biti med 0.1 in 0.3 pg/mL. Končno bi najvišji nivo virusne RNA, izdelane ob učinkovitem inhibitorju proteaze, moral biti manj kot 10% nivoja, doseženega pri neinhibirani okužbi. Spojino smo imeli za aktivno, če je bila njena ICgo vrednost manj kot 1 μΜ.

Za teste protivirusne učinkovitosti smo vse manipulacije v mikrotitrskih ploščah, ki so sledile začetnemu dodajanju 2X koncentrirane raztopine spojine v posamezno vrsto jamic, izvedli z uporabo Perkin Elmer/Cetus Propette.

Odmerjanje in formulacija

Protivirusne spojine tega izuma lahko dajemo kot zdravljenje za virusne okužbe na kakršenkoli način, ki doseže stik aktivnega sredstva z mestom delovanja sredstva, to je virusno proteazo, v telesu sesalca. Lahko jih dajemo na kakršenkoli konvencionalen način, ki je primeren za uporabo v povezavi s farmacevtiki, bodisi kot posamezna terapevtska sredstva ali v kombinaciji terapevtskih sredstev. Lahko jih dajemo same, toda prednostno jih damo s farmacevtskim nosilcem, izbranim na osnovi izbrane poti dajanja in standardne farmacevtske prakse.

Dano odmerjanje bo seveda variiralo odvisno od poznanih faktorjev, kot farmakodinamične karakteristike posameznega sredstva in njegovega načina in poti dajanja; starosti, zdravja in teže prejemnika; narave in obsega simptomov; vrste

-24hkratnega zdravljenja; pogostosti zdravljenja; in želenega učinka. Pričakujemo lahko, da bo dnevno odmerjanje aktivne sestavine okoli 0.001 do okoli 1000 miligramov na kilogram telesne teže, s prednostnim odmerkom, ki bo okoli 0.1 do okoli 30 mg/kg.

Odmerjene oblike sestavkov, primernih za dajanje, vsebujejo od okoli 1 mg do okoli 100 mg aktivne sestavine na enoto. V teh farmacevtskih sestavkih bo aktivna sestavina navadno prisotna v količini od okoli 0.5-95 ut.% glede na celotno težo sestavka. Aktivno sestavino lahko dajemo oralno v trdnih odmerjenih oblikah, kot kapsulah, tabletah in praških, ali v tekočih odmerjenih oblikah, kot eliksirjih, sirupih in suspenzijah. Lahko jo dajemo tudi parenteralno v sterilnih tekočih odmerjenih oblikah.

Želatinske kapsule vsebujejo aktivno sestavino in uprašene nosilce, kot laktozo, škrob, celulozne derivate, magnezijev stearat, stearinsko kislino in podobne. Podobna razredčila lahko uporabljamo za izdelavo stisnjenih tablet. Tako tablete kakor kapsule lahko izdelamo kot produkte z zadržanim sproščanjem, da zagotovimo kontinuirno sproščanje zdravila tekom nekaj ur. Stisnjene tablete so lahko sladkorno obložene ali filmsko obložene, da prekrijemo kakršenkoli neprijeten okus in zaščitimo tableto pred atmosfero, ali enterično obožene za selektivno dezintegracijo v gastrointestinalnem traktu. Tekoče odmerjene oblike za oralno dajanje lahko vsebujejo barvilo in aromo, da jih pacienti bolje sprejmejo.

Na splošno so voda, ustrezno olje, slanica, vodna dekstroza (glukoza) in sorodne sladkorne raztopine in glikoli, kot propilen glikol ali polietilen glikoli, primerni nosilci za parenteralne raztopine. Raztopine za parenteralno dajanje prednostno vsebujejo v vodi topno sol aktivne sestavine, primerna stabilizacijska sredstva in, če je potrebno puferske substance. Antioksidacijska sredstva, kot natrijev bisulfit, natrijev sulfit, ali askorbinska kislina, bodisi sama ali kombinirana, so primerna stabilizacijska sredstva. Uporabljajo se tudi citronska kislina in njene soli in natrijeva EDTA. Poleg tega parenteralne raztopine lahko vsebujejo varovalna sredstva, kot benzalkonijev klorid, metil- ali propil-paraben in klorobutanol. Zgoraj navedeni primerni farmacevtski nosilci so opisani v Remington‘s Pharmaceutical Sciences, standardnem referenčnem tekstu na tem področju.

-25Uporabne farmacevtske odmerjene oblike za dajanje spojin tega izuma lahko ponazorimo kot sledi:

Kapsule

Veliko število enotnih kapsul lahko pripravimo s polnjenjem standardnih dvokosovnih trdih želatinskih kapsul, vsake s 100 mg uprašene aktivne sestavine, 150 mg laktoze, 50 mg celuloze in 6 mg magnezijevega stearata.

Mehke želatinske kapsule

Lahko pripravimo zmes aktivne sestavine v prebavljivem olju, kot sojinem olju, olju bombaževca ali olivnem olju in jo s pomočjo pozitivne izpodrivne črpalke injiciramo v želatino, da se tvorijo mehke želatinske kapsule, vsebujoče 100 mg aktivne sestavine. Kapsule moramo potem sprati in posušiti.

Tablete

Veliko število tablet lahko pripravimo s konvencionalnimi postopki tako, da je odmerjena enota 100 mg aktivne sestavine, 0.2 mg koloidnega silicijevega dioksida, 5 mg magnezijevega stearata, 275 mg mikrokristalinične celuloze, 11 mg škroba in 98.8 mg laktoze. Da povečamo okusnost ali preprečimo absorpcijo, lahko nanesemo primerne obloge.

Suspenzija

Vodno suspenzijo lahko za oralno dajanje pripravimo tako, da vsakih 5 ml vsebuje 25 mg fino porazdeljene aktivne sestavine, 200 mg natrijeve karboksimetil celuloze, 5 mg natrijevega benzoata, 1.0 g sorbitolne raztopine, U.S.P. (ameriška farmakopeja) in 0.025 mg vanilina.

-26Iniekciiske raztopine

Parenteralen sestavek, ki je primeren za dajanje z injekcijo, lahko pripravimo z mešanjem

1.5 utežnih % aktivne sestavine v 10 volumskih % propilen glikola in vode. Raztopino steriliziramo po splošno uporabljanih tehnikah.

Kombinacija komponent (a) in (b)

Vsaka komponanta terapevtskega sredstva tega izuma je lahko neodvisno v katerikoli odmerjeni obliki, kot so tiste opisane zgoraj, in jo tudi lahko dajemo na različne načine, kot je opisano zgoraj. V sledečem opisu je potrebno razumeti, da komponenta (b) predstavlja eno ali več sredstev, kot smo jih že prej opisali. Tako, če bosta komponenti (a) in (b) obdelani enako ali neodvisno bo vsako sredstvo komponente (b) tudi lahko obdelano enako ali neodvisno.

Komponenti (a) in (b) pričujočega izuma sta lahko formulirani skupaj v posamezni odmerjeni enoti (to je združeni skupaj v eni kapsuli, tableti, prašku, tekočini, itd.) kot kombiniran produkt. Kadar komponenti (a) in (b) nista formulirani skupaj v posamezni odmerjeni enoti, potem komponento (a) lahko damo istočasno kot komponento (b) ali v kateremkoli vrstnem redu; na primer, komponento (a) tega izuma lahko damo prvo, nato sledi dajanje komponente (b), ali pa ju lahko damo v obratnem vrstnem redu. Če komponenta (b) vsebuje več kot eno sredstvo, npr., en inhibitor reverzne transkriptaze in en inhibitor proteaze, ju lahko damo skupaj ali v kateremkoli vrstnem redu. Kadar ju ne damo istočasno, potem prednostno dajanje komponente (a) in (b) izvedemo v razmiku manj kot ene ure. Prednostno je pot dajanja komponente (a) in (b) oralna. Izrazi oralno sredstvo, oralni inhibitor, oralna spojina ali podobni, kot so tu uporabljeni, označujejo spojine, ki jih lahko dajemo oralno. Čeprav je prednostno, da spojino (a) in spojino (b), obe damo po isti poti (to je, na primer, obe oralno) ali v isti odmerjeni obliki, če je zaželeno, lahko vsako damo po različnih poteh (to je, na primer, eno komponento kombiniranega produkta lahko damo oralno in drugo komponento lahko damo intravenozno) ali v različnih odmerjenih oblikah.

-27Kot oceni zdravnik, ki je strokovnjak na tem področju, odmerjanje kombinirane terapije izuma lahko variira odvisno od različnih faktorjev, kot farmakodinamičnih karakteristik določenega sredstva in njegovega načina in poti dajanja, starosti, zdravja in teže prejemnika, narave in obsega simptomov, vrste hkratnega zdravljenja, pogostosti zdravljenja in želenega učinka, kot je opisano zgoraj.

Primemo odmerjanje komponent (a) in (b) pričujočega izuma bo zdravnik, strokovnjak na tem področju, ki bo imel za osnovo pričujoče razkritje, zlahka določil. Kot splošno navodilo bo tipično dnevno odmerjanje lahko okoli 100 miligramov do okoli 1.5 gramov vsake komponente. Če komponenta (b) predstavlja več kot eno spojino, potem je tipično dnevno odmerjanje lahko okoli 100 miligramov do okoli 1.5 gramov vsakega sredstva komponente (b). Kot splošno navodilo, kadar so spojine komponente (a) in komponente (b) dane v kombinaciji, lahko odmerjanje količine vsake komponente zmanjšamo za okoli 70-80% relativno na običajno odmerjanje komponente, ko je komponenta dana sama, kot posamezno sredstvo za zdravljenje okužbe s HIV.

Kombinirani produkti tega izuma so lahko formulirani tako, da čeprav so aktivne sestavine kombinirane v posamezni odmerjeni enoti, je fizični stik med aktivnimi sestavinami minimiziran. Da bi minimizirali stik je, na primer, kjer produkt damo oralno, ena aktivna sestavina lahko enterično obložena. Z enterično oblogo ene od aktivnih sestavin je možno, ne samo minimizirati stik med kombiniranimi aktivnimi sestavinami, ampak je tudi možno kontrolirati sprostitev ene od teh komponent v gastrointestinalnem traktu tako, da se ena od teh komponent ne sprosti v želodcu, ampak se rajši sprosti v črevesju.

Druga izvedba tega izuma, kjer je zaželeno oralno dajanje, zagotavlja kombiniran produkt, pri čemer je ena od aktivnih sestavin obložena z materialom za zadržano sproščanje, ki vrši zadržano sproščanje skozi ves gastrointestinalen trakt in služi tudi za minimiziranje fizičnega stika med kombiniranimi aktivnimi sestavinami. Razen tega je lahko komponenta za zadržano sproščanje dodatno enterično obložena tako, da do sproščanja te komponente pride samo v črevesu. Še drugačen pristop bi vključeval formulacijo kombiniranega produkta, v kateri je ena komponenta obložena s polimerom za zadržano in/ali enterično sproščanje in druga komponenta je tudi obložena s polimerom, kot

-28hidroksipropil metilcelulozo nizke viskoznosti ali drugimi primernimi materiali, ki so poznani na tem področju, da bi nadalje ločili aktivni komponenti. Polimerna obloga služi za tvorbo dodatne ovire ob interakciji z drugo komponento. V vsaki formulaciji, v kateri je preprečen kontakt med komponentama (a) in (b) preko obloge ali kakšnega drugega materiala, je lahko preprečen tudi kontakt med posameznimi sredstvi komponente (b).

Odmerjene oblike kombiniranih produktov pričujočega izuma, pri čemer je ena aktivna sestavina enterično obložena, so lahko v obliki tablet, tako, da sta enterično obložena komponenta in druga aktivna sestavina pomešani skupaj in potem stisnjeni v tableto ali tako, da je enterično obložena komponenta stisnjena v eno plast tablete in je druga aktivna sestavina stisnjena v dodatno plast. Opcijsko, da bi nadalje ločili dve plasti, sta lahko prisotni tudi ena ali dve placebo plasti, tako, da je placebo plast med plastema aktivnih sestavin. Poleg tega so lahko odmerjene oblike pričujočega izuma v obliki kapsul, pri čemer je ena aktivna sestavina stisnjena v tableto ali v obliki množice mikrotablet, delcev, granul ali nevtralnih pelet, ki so potem enterično obloženi. Te enterično obložene mikrotablete, delce, granule ali nevtralne pelete potem damo v kapsulo ali stisnemo v kapsulo skupaj z granulacijo druge aktivne sestavine.

Ti, kakor tudi drugi načini minimiziranja stika med komponentama kombiniranih produktov pričujočega izuma, ki sta bodisi dani v posamezni odmerjeni obliki ali pa sta dani v ločenih oblikah, toda istočasno ali hkrati na enak način, bodo zlahka razvidni strokovnjakom na tem področju, ob opiranju na pričujoče razkritje.

Farmacevtski kompleti, uporabni za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsegajo terapevtsko učinkovito količino farmacevtskega sestavka, obsegajočega spojino komponente (a) in eno ali več spojin komponente (b), v eni ali več sterilnih embalažah, so tudi v obsegu pričujočega izuma. Sterilizacijo embalaže lahko izvedemo z uporabo konvencionalne metodologije sterilizacije, ki je strokovnjakom na tem področju dobro poznana. Komponenta (a) in komponenta (b) sta lahko v isti sterilni embalaži ali v ločenih sterilnih embalažah. Sterilne embalaže materialov lahko obsegajo ločene embalaže, ali eno ali več mnogodelnih embalaž, kot je to zaželeno. Komponenta (a) in komponenta (b) sta lahko ločeni ali fizično združeni v posamezni odmerjeni obliki ali enoti, kot je opisano zgoraj.

-29Taki kompleti lahko nadalje vključujejo, če je zaželeno, enega ali več različnih konvencionalnih farmacevtskih komponent kompleta, kot na primer, enega ali več farmacevtsko sprejemljivih nosilcev, dodatne viale za mešanje komponent, itd., kot bo zlahka razvidno strokovnjakom na tem področju. Navodila, bodisi kot priloge ali kot nalepke, ki navajajo količine komponent, ki jih je potrebno dati, navodila za dajanje in/ali navodila za mešanje komponent so tudi lahko vključena v komplet.

Očitno so v luči zgornjih tehnik možne številne modifikacije in variacije pričujočega izuma. Zato je potrebno razumeti, da se v obsegu priloženih zahtevkov, izum lahko prakticira drugače, kot je tu specifično opisano.

Claims (19)

1. ZAHTEVKI

   1. Spojina s formulama I ali II:

   NH2

   II ali njena oblika farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.
2. 2. Spojina po zahtevku 1, pri čemer ima spojina formulo I.
3. 3. Spojina po zahtevku 1, pri čemer ima spojina formulo II.
4. 4. Farmacevtski sestavek, ki obsega farmacevtsko sprejemljiv nosilec in terapevtsko učinkovito količino spojine po zahtevku 1 ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.
5. 5. Sestavek po zahtevku 4, pri čemer ima spojina formulo I.
6. 6. Sestavek po zahtevku 4, pri čemer ima spojina formulo II.
7. 7. Uporaba spojine s formulama I ali II

   II

   H

   -31za izdelavo zdravila za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, terapevtsko učinkovito količino navedene spojine ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila.
8. 8. Uporaba po zahtevku 7, pri čemer ima spojina formulo I.
9. 9. Uporaba po zahtevku 7, pri čemer ima spojina formulo II.
10. 10. Uporaba (a) spojine s formulama I ali II ali njene oblike farmacevtsko sprejemljive soli ali predzdravila; in, (b) vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz inhibitorjev reverzne transkriptaze HIV in inhibitorjev proteaze HIV za izdelavo zdravila za zdravljenja okužbe s HIV, ki obsega dajanje gostitelju, ki potrebuje tako zdravljenje, v kombinaciji, terapevtsko učinkovitih količin.
11. 11. Uporaba po zahtevku 10, pri čemer ima spojina formulo I.
12. 12. Uporaba po zahtevku 10, pri čemer ima spojina formulo II.
13. 13. Uporaba po zahtevku 10, pri čemer je inhibitor reverzne transkriptaze, nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze.
14. 14. Uporaba po zahtevku 13, pri čemer nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze izberemo iz ΑΖΓ, 3TC, ddl, ddC in d4T in inhibitor proteaze izberemo iz saquinavir, ritonavir, indinavir, VX-478, nelfinavir, KNI-272, CGP-61755 in U-103017.

    -3215. Uporaba po zahtevku 14, pri čemer nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze izberemo iz AZT in 3TC in inhibitor proteaze izberemo iz saquinavir, ritonavir in indinavir.
15. 16. Uporaba po zahtevku 15, pri čemer je nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze AZT.
16. 17. Uporaba po zahtevku 15, pri čemer je inhibitor proteaze indinavir.
17. 18. Farmacevtski komplet, ki je uporaben za zdravljenje okužbe s HIV, ki obsega terapevtsko učinkovito količino:

    (a) spojine po zahtevku 1; in, (b) vsaj ene spojine, izbrane iz skupine, ki je sestavljena iz inhibitorjev reverzne transkriptaze HIV in inhibitorjev proteaze HIV, v eni ali več sterilnih embalažah.
18. 19. Komplet po zahtevku 18, pri čemer je komponenta (a) spojina s formulo I.
19. 20. Komplet po zahtevku 18, pri čemer je komponenta (a) spojina s formulo II.