SE523243C2 - Antimikrobiellt preparat för behandling av profylax - Google Patents

Description

lO l5 20 25 30 35 523 243 2 rester erhållas. Vid làga pH-värden har dessa en omfat- tande positiv laddning.

Ytorna av mikrober täckes även av negativt laddade polymersubstanser, och ett stort antal vetenskapliga pub- likationer och patent beskriver användningen av kitosan och/eller kitosanderivat i olika formuleringar för av- lägsnande av mikrober (exempelvis bakterier) fràn infek- terad vävnad, ytor och lösningsmedel. Denna teknik har tillämpats inom födoämnesindustrin (exempelvis antimikro- biella folier för att skydda födoämnen), medicinskt omrä- de (exempelvis sàrkompresser) och för rening av kontami- nerade lösningar (exempelvis vatten). Egenskapen hos ki- tosan som utnyttjas i ovan beskrivna tillämpningar är dess förmåga att immobilisera bakterier genom bindning till dess negativt laddade ytor.

I motsats härtill beskrives vid föreliggande uppfin- ning en teknik, där mammaliecellerna skyddas före mikro- biell invasion.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning har som huvudändamàl att åstadkomma ny teknik för att förhindra infektion genom att förhindra mikrobiell adhesion till celler. Detta àstadkommes genom behandling av ytan av mammaliecellerna med en positivt laddad polymer, som företrädesvis är av naturligt ursprung. Polymeren bör vara biodegraderbar in vivo till ogiftiga lägmolekylära fragment. Den totala po- sitiva laddningen beror pà pH-värdet hos den beredning som användes vid behandlingen, ävensom densiteten av de positiva laddningarna pà polymeren. Naturliga polysacka- kan substitueras rider, såsom cellulosor och stärkelser, med aminofunktioner pà i och för sig känt sätt, och sàda- na substituerade naturliga polysackarider är även använd- bara vid föreliggande uppfinning. Ehuru många positivt laddade kolhydratpolymerer är användbara vid uppfinningen kommer den vidare illustrationen av uppfinningen att gö- ras med hänvisning till kitosan av varierande grad av N- 10 15 20 25 30 35 enn nnn n n nn n nn nnnn n n n n 9 n n n n n u nn n n n no nn nn n n rv nn n n n n n anno n n n o enn :nn n n n o n 1 n n nu n n o o n v n n n n n n n n o n n n n a n n: nn nn :nn -øo men 3 avacetylering. Detta skall dock ej tolkas som en begräns- ning av uppfinningens omfattning.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att använda ett överskott av kitosan i mediet. Mikroberna immobilise- ras sålunda genom bindning till kitosan - till deras ne- gativt laddade cellyta och behandlingens effektivitet förbättras.

Den positivt laddade polymeren som användes vid fö- religgande läkemedel är företrädesvis en-aminerad poly- mer, exempelvis kitosan, med en molekylvikt av från 2 till 100 kD. Som nämnts är det genom reglering av den al- kaliska behandlingen av kitin i produktionsprocessen möj- ligt att framställa kitosan med varierande proportioner D-glukosamin- och N-acetyl-D-glukosaminrester. Kitosan nedbrytes in vivo med enzymer, såsom lysozym, kitinas, glukosaminidaser etc. Nedbrytningsprodukterna är ogiftiga (mono-, di- och/eller oligomerer innehållande D- glukosamin och N-acetyl-D-glukosamin).

De fysikaliska och kemiska egenskaperna hos kitosan påverkas av molekylvikten, motjonen och förhållandet D- glukosamin- och N-acetyl-D-glukosaminrester; det senare beskrives som graden av N-avacetylering. Även fördelning- en (godtycklig, regelbunden eller block) av N-acetyl- grupper längs kedjan är väsentlig för de fysikaliska och biologiska egenskaperna (exempelvis enzymatisk nedbryt- ning, viskositet etc.) hos polymererna. Det är föredraget vid användningen av föreliggande uppfinning att kitosan har en grad av N-avacetylering av minst ca 50% och före- trädesvis mellan ca 70 och ca 90%, och en molekylvikt va- rierande från 10 kD till 250 kD. Motjonerna är företrä- desvis endera Cl' eller OAc'.

Vid pH-värden mellan 4,5 och 6,8 är kitosaner posi- tivt laddade och har förmåga att binda till de negativt laddade kolhydraterna på mammaliecellernas yta. Det före- dragna pH-intervallet för en beredning använd kliniskt med optimal effekt för att skydda mot mikrobiell infek- tion är 4,5-6. Vid pH-värden under 4,5 är en beredning 10 15 20 25 30 35 523 243 a. v.. 4 helt allmänt skadlig mot levande vävnad i det långa lopp- et. Ett speciellt föredraget pH-intervall är från ca 5,5 till ca 6,8.

Koncentrationen av den positivt laddade polymeren i läkemedlet vid föreliggande uppfinning kan variera inom vida gränser, ehuru en praktisk undre gräns är ca 0,005 viktprocent räknat på läkemedlet i dess helhet. Ett före- draget intervall är 0,01 till 2 viktprocent, såsom 0,01 till 1 viktprocent. Den övre gränsen sättes praktiskt ge- nom svårigheter att erhålla polymerkoncentrationer högre än 2 viktprocent.

Läkemedlet för användning för att förhindra infek- tionssjukdom genom mikrobiell adhesion kan tillhandahål- las i olika fysikaliska former, exempelvis som pulver, salvor, geler, pastor, suspensioner, emulsioner, lösning- ar eller filmer. Den beredning som användes är naturligt- vis avpassad till karaktären av den åkomma som behandlas.

Genom val av en lämplig beredning kan dermis, korne- ayta, oronasofaryngeala och andra mukosala membran (dvs i orala kaviteten, anogenitala området och gastrointesti- nalt lumen) behandlas för att inhibera infektioner föror- sakade av ett stort antal patogener.

Uppfinningen innefattar även ett förfarande för att förhindra infektioner av mammalieceller, varvid behand- lingen består i administrering av en farmaceutiskt effek- tiv mängd av ett läkemedel innehållande ett positivt lad- dat kolhydrat. Sådan behandling resulterar i att man för- hindrar infektion av mammaliecellerna genom att de skyd- das mot infektion genom interaktion med det positivt lad- dade kolhydratet.

Föreliggande uppfinning kommer i det följande att ytterligare beskrivas i icke inskränkande exempel. I des- sa exempel avser procenttal och delar vikten om ej annat anges. Exemplen hänvisar till bilagda ritningar, vari: Figurerna l och 2 illustrerar inhibitorisk aktivitet av kitosan mot HSV-1 respektive HSV-2 som en funktion av kitosankoncentrationen; 10 l5 20 25 30 35 u - - . »a 523 243 ~ - ' | .e 5 Figur 3 visar effekten av graden av kitosanavacety- lering pà HSV-l- och HSV-2-infektivitet; och Figurerna 4 och 5 visar effekten av kitosan pà HSV- l- respektive HSV-2-infektivitet vid varierande pH.

Sàsom redan nämnts binder mikrober till negativt laddade kolhydratpolymerer på ytan av mammaliecellen, ex- empelvis till polymerer innehållande heparansulfat och/eller sialinsyra. Denna bindning kan förhindras genom adhesion av en positivt laddad polymer före mikrobens in- fektion. I de följande exemplen har denna mekanism veri- fierats och exemplifierats genom studier in vitro med ki- tosanderivat som positivt laddad polymer och herpes simp- och HSV-2 genital lex-virus (HSV-1, orolabial herpes, herpes) som mikrober. Denna mekanism är emellertid gene- rell och gäller för mànga olika bakterier, virus och pa- rasiter. Effektiviteten av den positivt laddade polyme- rens bindning till den negativt laddade cellytan visas i exemplen vara beroende pà mediets pH-värde (Exempel 6), kitosanets koncentration (Exempel 3) och antalet positivt laddade funktionella grupper i kitosanmolekylerna (Exem- pel 5).

Exempel l Framställning av lösningar av kitosan med hög grad av N- avacetylering Hydrokloridsaltet av kitosan (5,87 g) med en grad av N-avacetylering av 84% och en viskositet av 130 mPas (Protasan Cl 210, Pronova Biopolymers, Oslo, Norge) upp- (144 g) till bildning av en 3% lösning av kitosan, och omröring upp- löses i sterilt filtrerat destillerat vatten ràtthàlls till dess att en klar "84"-lösning erhölls.

Exempel 2 Framställning av lösningar av kitosan med làggradig N- acetylering Detta utfördes sàsom beskrives i Exempel 1 bortsett ifràn att hydrokloridsaltet av kitosan med en grad av N- 5 lO l5 20 25 30 - - « . .v 523 243 6 avacetylering om 65% och en viskositet av 142 mPas (Pro- tasan Cl 211, Pronova Biopolymers, Oslo, Norge) användes ,resulterande i en kitosan "65"-lösning.

Exempel 3 Effekt av kitosan pä HSV-1-infektivitet. Differentiell adhesion av kitosan och virus till cellerna.

Förkortningar: PBS: Fosfatbuffrad koksaltlösning GMK: Celler av Green Monkey Kidney AH1 HSV-1: Herpes simplex typ 1 (orolabial herpes) HSV-2: Herpes simplex typ 2 (genital herpes) PFU: Plackbildande enhet=infektionsviruspartiklar RT: Rumstemperatur EMEM: Eagle's Minimum Essential Medium GMK-AHl-celler, (Holland et al. 1983) och HSV-2 stam 333 erhölls fràn Virologiska Laboratoriet, Guldhedsgatan 10B, Göteborg, Celler odlades vid 37°C i 5% C02 i 6-brunnplattor, HSV-1 stam KOS 321 Sverige. yta 9cnF/brunn (TPP, Schweiz) vid en koncentration av ca 400 000 celler/cmz. Tvättnin utföres enom assering av 9 9 P mediet fràn sidan av varje brunn över cellytorna, lätt viktning i 30 sek och sedan tömning av brunnen.

Diluent: 1. Cellodling PBS (137 mM NaCl, 2,7 KCl, 8,1 mM Na2HPO4 , 1,5 mM KH2PO4 , l mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, O,l% D~ glukos och ca 1,1 ml 3M HCl per 500 ml PBS) till ett pH av 5,5.

Celler: Kitosanlösning framställd sàsom i Exempel 1 (kitosan 84- GMK AH1~celler, 3 dygn gamla, 6 brunnplattor. lösning). 10 l5 20 25 . - - v nu 523 243 Virus: Hsv-i, Kos 321, cicer; ~ sx1o7 m1, utspädning till bild- ning av ca 200 PFU/100 ul 100 ul virus + 10 ml diluent, 100 ul av föregående ut- spädning + 10 ml diluent.

HSV-2, 333, = titer: ~ 3x107/ml, utspädning till bildning av ca 200 PFU/100 ul 100 ul virus + 10 ml diluent, sedan 100 ul av föregående utspädning + 10 ml diluent Procedur: Utspäd kitosan-84-lösningen i 10 ml rör enligt följande 1 ml av baslösning + 10 ml av respektive pH- diluentzutspädning 1:10 2 ml av föregående utspädning + 8 ml av ibid 1:50 2 ml av föregående utspädning + 8 ml av resp pH-diluent:utspädning 1:250 2 ml ibid + 8 ml ibid 1:1250 2 ml ibid + 8 ml ibid 1:6250 0 ml + 8 ml ibid kontroll Procedur: kitosanlösningen satt till celler: i 30 min före tillsats av virus, cellerna tvättas se- dan före tillsats av virus ii 30 min före tillsats av virus, cellerna tvättas ej sedan före tillsats av virus iii vid tidpunkten för virustillsats iv 30 min efter tillsats av virus 1.Tvätta cellerna med 2 ml diluent 2. Tillsätt 1 ml per brunn av kitosanutspädningen (4 brunnar per varje utspädning (i) och (ii) 3. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur 4.Tvätta cellerna (i) en gång med 2 ml utspädning, till- sätt 1 ml diluent 5.Till brunnarna (iv) sätt 1 ml diluent 10 15 20 25 30 35 u a n . .- S23 243 8 6.Till brunn utspädning och omedelbart efter ca 200 PFU av HSV-1 eller HSV-2 i 100 pl diluent. Sätt samma virusbered- (i), 7.Inkubera i 30 min vid rumstemperatur (i), av diluenten och sedan med 2 ml EMEM, tillsätt 3 ml EMEM, vikt/vol) 9.Tvätta cellerna (iv) en gäng med 2 ml diluent och (iii) tillsätt l ml av respektive kitosan- ningar till brunnarna (ii) och (iv) 8.Tvätta cellerna (ii) och (iii) en gäng med 2 ml tillsätt 3 ml metylcellulosalösning (l% tillsätt sedan 1 ml av kitosanutspädningen 10. Inkubera i 30 timmar vid rumstemperatur ll. Tvätta cellerna (iv) en gäng med 2 ml diluent och sedan gäng med 2 ml EMEM, tillsätt 3 ml metylcellulo- salösning.

Efter 2-3 dygns inkubering färgas cellerna med kris- tallviolett och virala placker räknas under ljusmikroskop (Trybala 1997).

Resultaten beskrives i bilagda Figur l och visar att maximalt skydd fràn infektion uppnås om kitosanlösningen tillsättes 30 min före tillsats av virus och verkar fort- farande (om ej borttvättas) på cellytan när viruset till- sättes.

Resultat Såsom framgår av diagrammet i bilagd Figur l uppnås maximal skyddseffekt mot infektion om kitosanlösningen sättes till GMK-cellerna 30 min före tillsatsen av viru- <--->. viruset har föga eller ingen effekt, vilket indikerar att set Tvättning med buffertlösning före tillsats av den elektrostatiska bindningen av kitosan till ytan av (-0-). sättes till cellerna samtidigt skyddar kitosan fràn in- mammaliecellerna är stark Om virus och kitosan fektion men ej sà effektivt som om kitosan tillsatts före tillsatsen av viruset (- -). Om viruset kunnat binda till heparansulfatmolekylerna pà GMK-cellytan har efterföljan- 10 15 20 25 30 i523 243 .. nu 9 de behandling med kitosan föga eller ingen effekt (-I-).

Exempel 4 Exempel 3 upprepas under användning av HSV-2. Resul- taten visas pà bilagda Figur 2.

Exempel 5 Effekt av graden av N-avacetvlerinq av kitosan pà HSV-l- och HSV-2-infektivitet Försöket utfördes genom liknande procedur som den i Exempel 3 beskrivna. GMK-cellerna behandlades med kito- sanlösningar fràn baslösningar som beretts sàsom beskri- vits i Exemplen 1 resp. 2. Kitosan sattes till cellerna 10-15 min före tillsats av viruset och hölls pà cellytor- na under l h av viral adsorption. Som framgàr av diagram- met är ett stort antal fria aminogrupper väsentlig för effektiv bindning och skydd av GMK-cellerna från infek- (~I- Resultaten visas pà bilagda Figur 3. -0-) är effektivare än kitosan 65 tion. Kitosan 85 V-E -O-).

Exempel 6 Effekt av kitosan 84 på HSV-1- och HSV-2-infektivitet vid olika pH-värden Försöken utfördes i huvudsak såsom i Exempel 5.

(PBS) 6,75, resp. 5,75 med 3 M HCl. Resultaten beskrives pà bilagda Cellodlingsmedia justerades till pH 7,3, 6,25 Figurer 4 och 5 och visar att vid lägre pH-värden ett större antal -NH3*-funktionella grupper är närvarande i varje kitosanmolekyl, vilket i sin tur resulterar i en bättre bindning till de negativt laddade heparansulfatmo- lekylerna pà cellytan av njurceller av Green Monkeys.

Claims (8)

10 15 20 25 u 1 n u va nu 523 2430 H u- 10 PATENTKRAV

1. Användning av en positivt laddad kolhydratpolymer för framställning av ett läkemedel för att förhindra in- fektion genom att skydda mammalieceller med sådan posi- tivt laddad polymer, kännetecknad därav att nämnda posi- tivt laddade polymer är kitosan, och att nämnda polymer är närvarande i beredningar med ett pH varierande från ca 4,5 till ca 6,8.

2. Användning enligt patentkravet 1, vari kitosanet har en grad av N-avacetylering om minst ca 50%.

3. Användning enligt patentkravet l eller 2, vari nämnda pH-intervall är från ca 4,5 till ca 6,0.

4. Användning enligt patentkravet 1 eller 2, vari nämnda pH-intervall är från ca 5,5 till ca 6,8.

5. Användning enligt något av de föregående patent- vari nämnda läkemedel tillhandahàlles i form av kraven, en gel, en film, ett pulver, en suspension, en pasta el- ler en salva.

6. Användning enligt något av de föregående patent- kraven, vari läkemedlet innehåller en lämplig farmaceu- tiskt acceptabel bärare eller excipient.

7. Användning enligt något av patentkraven 2 till 5, vari kitosanet har en grad av N-avacetylering av fràn ca 70 till ca 90%.

8. Användning enligt något av de föregående patent- kraven, vari polymeren är närvarande i läkemedlet i en mängd av minst ca 0,005 viktprocent.