SE468962B - Saett att analysera med avseende paa en analyt i ett vaetskeprov - Google Patents

Description

Ci; xfl 10 15 20 25 30 35 0\ ND Man inser att SPR-baserade immunassays för substanser med låg molekylvikt eller som uppträder i låga koncentra- tioner, som t ex haptener, är problematiska på grund av de mycket små förändringar i brytningsindex som orsakas när analyten binder till eller frigörs från den antikroppsbe- lagda mätytan._ Försök att undanröja detta problem vid SPR-immunassays har beskrivits i EP, A, 276 142 och wo 90/11525 (varvid den förstnämnda specifikt utnyttjar den ovannämnda Wood's effekt och den sistnämnda utnyttjar Kretschmann-effekten).

Bägge publikationerna beskriver konjugering av ett reagens (t ex analyten eller en analytanalog vid en konkur- rerande assay) med en brytningsindexhöjande komponent eller sond. En sådan sond kan t ex vara en molekyl eller en par- tikel med högt brytningsindex och/eller stor storlekf Möj- liga substanser inbegriper tunga substanser (såsom me- talljoner eller högre halogener), höggradigt elektroniskt delokaliserade föreningar (såsom polycykliska aromater el- ler färgämnen), metall- eller metalloxidpartiklar (som titandioxidpartiklar), eller organiska föreningar med högt brytningsindex (som ferritin). Substansen kan alternativt vara en sådan med lägre brytningsindex än omgivningens in- till mätytan. Substansen kan även vara ett enzym som or- sakar bildning av en reaktionsprodukt som avsätts pà mät- ytan och som har ett brytningsindex som är högre eller läg- re än det material som förekommer i det tunna skiktet vid mätytan. ' Emellertid är det svårt att bland organiska substanser finna molekyler som har högre brytningsindex än ca 1,6-1,7.

Oorganiska substanser kan å andra sidan ha brytningsindex på ca 2-3, men istället kan de vara svåra att kombinera ke- miskt med proteiner. Möjligheterna att i betydande utsträckning öka SPR-signalerna, såsom föreslås av de två anförda publikationerna, är därför tämligen begränsade, såvida man förstås inte använder ytterst stora och därige- nom opraktiska sonder. Problemet med otillräcklig känslig- het för vissa slag av analyter vid de ovannämnda typerna av analyser finns därför kvar. 10 15 20 25 30 35 468 9622 Följaktligen syftar föreliggande uppfinning till att övervinna de ovannämnda problemen och väsentligt öka känsligheten vid SPR-analyser liksom vid varje annan analys som är baserad på mätning av brytningsindexförändringar vid en mätyta. I I enlighet med uppfinningen uppnås detta genom att man utnyttjar det faktum att brytningsindex år i hög grad beroende av våglängden. Detta har inte insetts eller an- tytts i de ovan båda diskuterade tidigare referenserna, där brytningsindex tvärtom behandlas som en indifferent materialkonstant.

Således avtar brytningsindex för de flesta substanser mycket långsamt med ökande våglängd inom det synliga och nära infraröda omrâdet (normal dispersion). I närheten av resonansvåglängder, dvs vid ljusabsorptionstoppar, varierar emellertid brytningsindex kraftigt, ett fenomen kallat ano- mal dispersion. I detta område är brytningsindex i stort sett en funktion av negativa derivatan av absorptiviteten (extinktionskoefficienten) med avseende på våglängden. Vid något högre våglängd än resonansváglångden uppnår således brytningsindex ett maximum, dvs där negativa derivatan för absorptiviteten har sitt maximum.

I enlighet med föreliggande uppfinning uppnår man där- för en betydande ökning av analyskänsligheten, om mätvåg- längden matchas med absorptivitetsmaximum för den brytningsindexhöjande komponent som används vid analyserna i fråga, och närmare bestämt så att mätvåglängden motsvarar_ maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våglängden. Detta kan åstadkommas antingen ge- nom att den brytningsindexhöjande komponenten väljs så att den är förenlig med mätvåglängden för ett speciellt instru- ment eller en speciell användning, eller genom att mätvåg- längden väljs så att den är förenlig med en speciell bryt- ningsindexhöjande komponent.

Det kan i detta sammanhang nämnas att användning av mätning vid eller nära absorptivitetsmaximum för kromogena kronetrar i optokemiska sensorer baserade på SPR har före- slagits av J. van Gent et al. i Sensors and Actuators, 17 .o i CO 10 15 20 25 30 35 \Q ox PD (1989) 297-305. I detta tidigare kända fall är emellertid den kromogena kronetermolekylen (ett konjugat mellan en kroneter och en kromofor) avsedd att användas som avkän- nande molekyl för kalcium- och bariumjoner genom påvisande av den stora färgförändring som uppträder vid komplexbild- ning med metalljonerna, dvs ett koncept som skiljer sig helt från föreliggande uppfinning, såsom också kommer att framgå av det följande.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller således ett sätt att analysera med avseende på en analyt i ett vätske- prov, där närvaro av analyten påvisas genom bestämning av den resulterande förändring i brytningsindex vid en fast optisk yta i kontakt med provet som orsakas av att analyten medför eller påverkar inbindning eller frisättning av en ibrytningsindexhöjande komponent till eller från den optiska ytan, vilket kännetecknas av att bestämningen utförs med ljus som har en våglängd vid eller nära maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våg- längden hos den brytningsindexhöjande komponenten.

I enlighet med uppfinningen skall mätningen således utföras vid, eller så nära maximet för den negativa deriva- tan av absorptiviteten med avseende på våglängden som möj- ligt. Om mätvåglängden väljs på högvåglängdssidan av maxi- met för den negativa derivatan av absorptiviteten med av- seende på våglängden, skall avståndet mellan mätvåglängden och maximet företrädesvis vara mindre än 100 nm (motsvarande en ökning med minst ca 5 gånger på massbasis), och mer föredraget mindre än 50 nm (motsvarande en ökning på minst ca 10 gånger på massbasis). Om mätvåglängden väljs på lågvåglängdssidan av maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våglängden, måste mät- våglängden ligga mycket nära maximet, eftersom brytningsin- dex åter minskar när man närmar sig våglängden för absorp- tivitetsmaximum.

Vidare skall absorptiviteten (extinktions- koefficienten) för den brytningsindexhöjande komponenten vara så hög som möjligt, företrädesvis högre än 50 lg'1cm'1r och mer föredraget högre än 100 lg'1cm'1. illu- 10 15 20 25 30 35 is 1 \ CU xfl CN ax- 5 Genom lämpligt val av den brytningsindexhöjande kompo- nenten eller sonden kan man således uppnà mycket högt brytningsindex. Vilken specifik mätvàglängd som skall väljas för en speciell indexhöjande komponent eller sond, eller vice versa, beror givetvis på bl a den speciella son- den och kan lätt fastställas av fackmannen när han väl fått kännedom om föreliggande uppfinning.

För syftena med föreliggande uppfinning är eller in- kluderar den brytningsindexhöjande komponenten företrädes- vis en färgämnes- eller kromofor molekyl. Vanligtvis är en färgämnesmolekyl konjugerad med en annan molekyl, såsom ett protein eller en polypeptid (t ex en antikropp eller frag- ment därav). Exempel på färgämnen är sådana av azin-, tiazin-, oxazin-, cyanin-, merocyanin-, styryl-, trifenyl- metan-, klorofyll- och ftalocyanintyp.

De optokemiska metoder för vilka föreliggande uppfin- ning kan användas är, som tidigare nämnts, inte begränsade till SPR-metoder utan utsträcker sig till varje analysmetod som mäter en förändring av brytningsindex som tecken pá närvaro av en analyt. Sådana metoder inbegriper metoder ba- serade på såväl intern som extern reflexion, t ex ellipso- metri och evanescent vàgspektroskopi, varvid den sistnämnda innefattar Brewster-vinkelreflektometri, kritisk vinkel-re- flektometri, evanescent vàgellipsometri, spridd total in- tern reflektion (STIR), optiska vàgledarsensorer, etc.

Kontakten mellan vätskeprovmediet och den optiska ytan kan vara statisk eller, företrädesvis, dynamisk, dvs genom att mätytan eller -ytorna anordnas i något slags flödes- cell.

Lämpliga analysformer för utnyttjande av föreliggande uppfinning innefattar, men är givetvis inte begränsade pà något sätt till de som beskrivs i de ovannämnda WO 90/11525 och EP, A, 276 142, inbegripande konkurrerande analyser, förträngningsanalyser och analyser av sandwichtyp. Vid en konkurrerande analys konkurrerar sonden med analyten om bindningen till mätytan, medan vid en förträngningsanalys sonden är bunden till mätytan och undanträngs av analyten.

Vid en sandwich-assay binds sonden till analyten, antingen -f-*ß- CÉÄ CC! 10 15 20 25 30 35 Q? gx NJ innan analyten binds till mätytan eller sedan den bundits till mätytan.

En konkurrerande analys för exempelvis en hapten, t ex teofyllin, kan således utföras genom att man konjugerar en lämplig sond till teofyllin och, vid eller nära sondens ab- sorptivitetsmaximum, mäter den utsträckning i vilken provet vid blandning med sonden påverkar, dvs konkurrerar med, bindningen av det konjugerade teofyllinet till måtytan.

För att demonstrera genomförbarheten för analysmetoden enligt föreliggande uppfinning utfördes följande försök med ett kommersiellt SPR-baserat biosensorinstrument.

EXEMPEL Färgämnet HITC (l,l',3,3,3',3'-hexametylindo- trikarbocyaninjodid, 94% renhet, Sigma H0387) löstes i koncentrationerna 0, 0,25, 0,5 resp 0,75 mM i en blandning av 50% etanol och 50% citratbuffert (pH 3, 0,1 M citrat, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20). Lösningarna injicerades i ett BIAcoreTM-instrument (marknadsfört av Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige) med en mätváglängd av 760 nm. Ren citratbuffert användes som eluermedel, och brytningsindexsvaret för varje puls avlästes. Två testse- rier kördes på en och samma mätyta (Sensor ChipTM CM5).

Repeterbarheten var god.

I Fig. l är svaret (i resonansenheter, RU) avsatt mot HITC-koncentration. Som framgår av kurvan är den linjära passningen god (r>0,999). I kombination med pulsernas fyr- kantsutseende visar detta att endast bulkbrytnings- indexförändringar inträffar och att ingen adsorption av HITC till mätytan sker.

Det molära brytningsindexinkrementet befanns vara 2540 RU/mM. Med molekylvikten 537 g/mol, och 1 RU ß l0'6 bryt- ningsindexenheter, blir det beräknade massbaserade bryt- ningsindexinkrementet 4,73 ml/g (2,540 l-mol'1/537 g-mol'1). Eftersom proteiner i allmänhet har ett värde pà 0,185 ml/g, är förstärknings- eller ökningsfaktorn vid detta ooptimerade försök ca 25X. En förstärkningsfaktor på, "äg, SOX skulle därför utan vidare förefalla möjlig att uppnå. 'fii 4-68 962 Ett absorptionsspektrum i intervallet 500 till 900 nm mättes med l mM HITC spädd till 4 uM med etanol/citrat.

Absorptivitetsmaximum låg vid 743 nm øch var 250.000 cm"1M'1 eller 470 lg“1cm'1. Den negativa absorptivitetsderivatan hade sitt maximum vid 760-770 nm . och var -7.500 cm'lM'lnm'1, eller -14 lg"lcm'1nm'1. Det er- hållna spektrumet överensstämde väl med tidigare publice- rade data.

Claims (9)

10 15 20 25 30 35 uâ Ox ha PATENTKRAV

1. Sätt att analysera med avseende på en analyt i ett vätskeprov, där närvaro av analyten påvisas genom att man bestämmer den resulterande förändringen i brytningsindex vid en fast optisk yta i kontakt med provet, vilken föränd- ring orsakas av att analyten medför eller påverkar inbind- ning eller frisättning av en brytningsindexhöjande kompo- nent till respektive från den optiska ytan, kännetecknat av att bestämningen utförs med ljus som har en våglängd vid eller nära maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våglängden hos den brytningsindexhöjande komponenten.

2. Sätt enligt patentkravet 1, kännetecknat av att när mätvåglängden ligger pá högvåglängdssidan av maximet, så är avståndet mellan mätvàglängden och maximet mindre än 100 nm, mer föredraget mindre än 50 nm, och att när mätvåg- längden ligger på lågvåglängdssidan, så ligger mätvågläng- den nära maximet.

3. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att den brytningsindexhöjande komponenten innefattar ett protein eller en polypeptid konjugerad med en kromofor el- ler ett färgämne.

4. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att den brytningsindexhöjande komponenten innefattar en hapten konjugerad till en kromofor eller ett färgämne.

5. Sätt enligt något av patentkraven 1-4, kännetecknat av att bestämningen är baserad på intern reflexion.

6. Sätt enligt patentkravet 5, kännetecknat av att bestämningen är baserad på ytplasmonresonans.

7. Sätt enligt något av patentkraven 1-4, kännetecknat av att bestämningen är baserad på extern reflexion. 468 962

8. Sätt enligt något av patentkraven 1-7, kännetecknat av att analysen är vald bland konkurrerande analyser, för- trängningsanalyser och analyser av sandwichtyp.

9. Sätt enligt något av patentkraven 1-8, kännetecknat av att analysen är en immunassay.