SE468962B

SE468962B - Method of analyzing with regard to an analyte in a liquid sample

Info

Publication number: SE468962B
Application number: SE9102397A
Authority: SE
Inventors: A Hanning
Original assignee: Pharmacia Biosensor Ab
Priority date: 1991-08-20
Filing date: 1991-08-20
Publication date: 1993-04-19
Also published as: SE9102397D0; SE9102397L

Abstract

A method of analyzing with regard to an analyte in a liquid sample comprises indicating the presence of the analyte by determining the resultant change in the refractive index at a fixed optical surface in contact with the sample, which change is caused by the analyte bringing about or influencing the binding or release of a refractive index-increasing component to or, respectively, from the optical surface. According to the invention, the determination is effected using light which has a wavelength at or close to the maximum for the negative derivative of the absorptance with regard to the wavelength of the refractive index-increasing component in order to obtain maximum sensitivity. <IMAGE>

Description

Ci; xﬂ 10 15 20 25 30 35 0\ ND Man inser att SPR-baserade immunassays för substanser med låg molekylvikt eller som uppträder i låga koncentra- tioner, som t ex haptener, är problematiska på grund av de mycket små förändringar i brytningsindex som orsakas när analyten binder till eller frigörs från den antikroppsbe- lagda mätytan._ Försök att undanröja detta problem vid SPR-immunassays har beskrivits i EP, A, 276 142 och wo 90/11525 (varvid den förstnämnda specifikt utnyttjar den ovannämnda Wood's effekt och den sistnämnda utnyttjar Kretschmann-effekten). Ci; x ﬂ 10 15 20 25 30 35 0 \ ND It is recognized that SPR-based immunoassays for low molecular weight substances or which occur in low concentrations, such as haptens, are problematic due to the very small changes in refractive indices caused when The analyte binds to or is released from the antibody-coated measuring surface. Attempts to eliminate this problem in SPR immunoassays have been described in EP, A, 276 142 and wo 90/11525 (the former specifically utilizing the aforementioned Wood's effect and the latter utilizing Kretschmann effects).

Bägge publikationerna beskriver konjugering av ett reagens (t ex analyten eller en analytanalog vid en konkur- rerande assay) med en brytningsindexhöjande komponent eller sond. En sådan sond kan t ex vara en molekyl eller en par- tikel med högt brytningsindex och/eller stor storlekf Möj- liga substanser inbegriper tunga substanser (såsom me- talljoner eller högre halogener), höggradigt elektroniskt delokaliserade föreningar (såsom polycykliska aromater el- ler färgämnen), metall- eller metalloxidpartiklar (som titandioxidpartiklar), eller organiska föreningar med högt brytningsindex (som ferritin). Substansen kan alternativt vara en sådan med lägre brytningsindex än omgivningens in- till mätytan. Substansen kan även vara ett enzym som or- sakar bildning av en reaktionsprodukt som avsätts pà mät- ytan och som har ett brytningsindex som är högre eller läg- re än det material som förekommer i det tunna skiktet vid mätytan. ' Emellertid är det svårt att bland organiska substanser finna molekyler som har högre brytningsindex än ca 1,6-1,7.Both publications describe conjugation of a reagent (eg the analyte or an analyte analog in a competing assay) with a refractive index enhancing component or probe. Such a probe may be, for example, a molecule or particle with a high refractive index and / or large size. Possible substances include heavy substances (such as metal ions or higher halogens), highly electronically delocalized compounds (such as polycyclic aromatics or dyes), metal or metal oxide particles (such as titanium dioxide particles), or high refractive index organic compounds (such as ferritin). The substance may alternatively be one with a lower refractive index than the surrounding in- to measuring surface. The substance can also be an enzyme which causes the formation of a reaction product which is deposited on the measuring surface and which has a refractive index which is higher or lower than the material present in the thin layer at the measuring surface. However, it is difficult to find molecules among organic substances that have a higher refractive index than about 1.6-1.7.

Oorganiska substanser kan å andra sidan ha brytningsindex på ca 2-3, men istället kan de vara svåra att kombinera ke- miskt med proteiner. Möjligheterna att i betydande utsträckning öka SPR-signalerna, såsom föreslås av de två anförda publikationerna, är därför tämligen begränsade, såvida man förstås inte använder ytterst stora och därige- nom opraktiska sonder. Problemet med otillräcklig känslig- het för vissa slag av analyter vid de ovannämnda typerna av analyser finns därför kvar. 10 15 20 25 30 35 468 9622 Följaktligen syftar föreliggande uppfinning till att övervinna de ovannämnda problemen och väsentligt öka känsligheten vid SPR-analyser liksom vid varje annan analys som är baserad på mätning av brytningsindexförändringar vid en mätyta. I I enlighet med uppfinningen uppnås detta genom att man utnyttjar det faktum att brytningsindex år i hög grad beroende av våglängden. Detta har inte insetts eller an- tytts i de ovan båda diskuterade tidigare referenserna, där brytningsindex tvärtom behandlas som en indifferent materialkonstant.Inorganic substances, on the other hand, can have a refractive index of about 2-3, but instead they can be difficult to combine chemically with proteins. The possibilities of significantly increasing the SPR signals, as suggested by the two cited publications, are therefore rather limited, unless, of course, one uses extremely large and thereby impractical probes. The problem of insufficient sensitivity for certain types of analytes in the above-mentioned types of analyzes therefore remains. Accordingly, the present invention aims to overcome the above-mentioned problems and substantially increase the sensitivity of SPR assays as to any other assay based on measuring refractive index changes at a measuring surface. In accordance with the invention, this is achieved by taking advantage of the fact that the refractive index is highly dependent on the wavelength. This has not been realized or hinted at in the previous references discussed above, where the refractive index is on the contrary treated as an inert material constant.

Således avtar brytningsindex för de flesta substanser mycket långsamt med ökande våglängd inom det synliga och nära infraröda omrâdet (normal dispersion). I närheten av resonansvåglängder, dvs vid ljusabsorptionstoppar, varierar emellertid brytningsindex kraftigt, ett fenomen kallat ano- mal dispersion. I detta område är brytningsindex i stort sett en funktion av negativa derivatan av absorptiviteten (extinktionskoefficienten) med avseende på våglängden. Vid något högre våglängd än resonansváglångden uppnår således brytningsindex ett maximum, dvs där negativa derivatan för absorptiviteten har sitt maximum.Thus, the refractive index of most substances decreases very slowly with increasing wavelength within the visible and near infrared range (normal dispersion). However, in the vicinity of resonant wavelengths, ie at light absorption peaks, the refractive index varies greatly, a phenomenon called anomal dispersion. In this range, the refractive index is largely a function of the negative derivatives of the absorptivity (extinction coefficient) with respect to the wavelength. At a slightly higher wavelength than the resonant wavelength, the refractive index thus reaches a maximum, ie where the negative derivatives for the absorptivity have their maximum.

I enlighet med föreliggande uppfinning uppnår man där- för en betydande ökning av analyskänsligheten, om mätvåg- längden matchas med absorptivitetsmaximum för den brytningsindexhöjande komponent som används vid analyserna i fråga, och närmare bestämt så att mätvåglängden motsvarar_ maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våglängden. Detta kan åstadkommas antingen ge- nom att den brytningsindexhöjande komponenten väljs så att den är förenlig med mätvåglängden för ett speciellt instru- ment eller en speciell användning, eller genom att mätvåg- längden väljs så att den är förenlig med en speciell bryt- ningsindexhöjande komponent.Accordingly, in accordance with the present invention, a significant increase in assay sensitivity is obtained if the measurement wavelength is matched with the maximum absorbance of the refractive index enhancing component used in the assays in question, and more particularly so that the measurement wavelength corresponds to the maximum of the negative derivativity of the absorbance. on the wavelength. This can be accomplished either by selecting the refractive index raising component to be compatible with the measurement wavelength of a particular instrument or use, or by selecting the measurement wavelength to be compatible with a particular refractive index raising component.

Det kan i detta sammanhang nämnas att användning av mätning vid eller nära absorptivitetsmaximum för kromogena kronetrar i optokemiska sensorer baserade på SPR har före- slagits av J. van Gent et al. i Sensors and Actuators, 17 .o i CO 10 15 20 25 30 35 \Q ox PD (1989) 297-305. I detta tidigare kända fall är emellertid den kromogena kronetermolekylen (ett konjugat mellan en kroneter och en kromofor) avsedd att användas som avkän- nande molekyl för kalcium- och bariumjoner genom påvisande av den stora färgförändring som uppträder vid komplexbild- ning med metalljonerna, dvs ett koncept som skiljer sig helt från föreliggande uppfinning, såsom också kommer att framgå av det följande.It may be mentioned in this context that the use of measurement at or near the absorptivity maximum for chromogenic crown ethers in optochemical sensors based on SPR has been proposed by J. van Gent et al. i Sensors and Actuators, 17 .o i CO 10 15 20 25 30 35 \ Q ox PD (1989) 297-305. In this prior art case, however, the chromogenic crown ether molecule (a conjugate between a crown ether and a chromophore) is intended to be used as a sensing molecule for calcium and barium ions by detecting the large color change that occurs during complex formation with the metal ions, i.e. a concepts which are completely different from the present invention, as will also be apparent from the following.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller således ett sätt att analysera med avseende på en analyt i ett vätske- prov, där närvaro av analyten påvisas genom bestämning av den resulterande förändring i brytningsindex vid en fast optisk yta i kontakt med provet som orsakas av att analyten medför eller påverkar inbindning eller frisättning av en ibrytningsindexhöjande komponent till eller från den optiska ytan, vilket kännetecknas av att bestämningen utförs med ljus som har en våglängd vid eller nära maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våg- längden hos den brytningsindexhöjande komponenten.Thus, the present invention provides a method of assaying for an analyte in a liquid sample, wherein the presence of the analyte is detected by determining the resulting change in refractive index at a solid optical surface in contact with the sample caused by the analyte causing or affecting binding. or releasing a refractive index raising component to or from the optical surface, characterized in that the determination is performed with light having a wavelength at or near the maximum of the negative derivative of the absorptivity with respect to the wavelength of the refractive index raising component.

I enlighet med uppfinningen skall mätningen således utföras vid, eller så nära maximet för den negativa deriva- tan av absorptiviteten med avseende på våglängden som möj- ligt. Om mätvåglängden väljs på högvåglängdssidan av maxi- met för den negativa derivatan av absorptiviteten med av- seende på våglängden, skall avståndet mellan mätvåglängden och maximet företrädesvis vara mindre än 100 nm (motsvarande en ökning med minst ca 5 gånger på massbasis), och mer föredraget mindre än 50 nm (motsvarande en ökning på minst ca 10 gånger på massbasis). Om mätvåglängden väljs på lågvåglängdssidan av maximet för den negativa derivatan av absorptiviteten med avseende på våglängden, måste mät- våglängden ligga mycket nära maximet, eftersom brytningsin- dex åter minskar när man närmar sig våglängden för absorp- tivitetsmaximum.Thus, in accordance with the invention, the measurement should be performed at, or as close to, the maximum of the negative derivative of the absorptivity with respect to the wavelength as possible. If the measuring wavelength is selected on the high wavelength side of the maximum for the negative derivative of the absorbance with respect to the wavelength, the distance between the measuring wavelength and the maximum should preferably be less than 100 nm (corresponding to an increase of at least about 5 times by mass), and more preferably less than 50 nm (corresponding to an increase of at least about 10 times on a mass basis). If the measuring wavelength is selected on the low wavelength side of the maximum for the negative derivative of the absorptivity with respect to the wavelength, the measuring wavelength must be very close to the maximum, since the refractive index decreases again as one approaches the wavelength for maximum absorbance.

Vidare skall absorptiviteten (extinktions- koefficienten) för den brytningsindexhöjande komponenten vara så hög som möjligt, företrädesvis högre än 50 lg'1cm'1r och mer föredraget högre än 100 lg'1cm'1. illu- 10 15 20 25 30 35 is 1 \ CU xﬂ CN ax- 5 Genom lämpligt val av den brytningsindexhöjande kompo- nenten eller sonden kan man således uppnà mycket högt brytningsindex. Vilken specifik mätvàglängd som skall väljas för en speciell indexhöjande komponent eller sond, eller vice versa, beror givetvis på bl a den speciella son- den och kan lätt fastställas av fackmannen när han väl fått kännedom om föreliggande uppfinning.Furthermore, the absorptivity (extinction coefficient) of the refractive index raising component should be as high as possible, preferably higher than 50 lg'1cm'1r and more preferably higher than 100 lg'1cm'1r. illu- 10 15 20 25 30 35 is 1 \ CU x ﬂ CN ax- 5 By suitable selection of the refractive index raising component or probe, a very high refractive index can thus be obtained. The specific measuring wavelength to be selected for a particular index-raising component or probe, or vice versa, depends, of course, on the particular probe and can be easily determined by the person skilled in the art once he has become aware of the present invention.

För syftena med föreliggande uppfinning är eller in- kluderar den brytningsindexhöjande komponenten företrädes- vis en färgämnes- eller kromofor molekyl. Vanligtvis är en färgämnesmolekyl konjugerad med en annan molekyl, såsom ett protein eller en polypeptid (t ex en antikropp eller frag- ment därav). Exempel på färgämnen är sådana av azin-, tiazin-, oxazin-, cyanin-, merocyanin-, styryl-, trifenyl- metan-, klorofyll- och ftalocyanintyp.For purposes of the present invention, the refractive index enhancing component is preferably a dye or chromophore molecule. Usually, a dye molecule is conjugated to another molecule, such as a protein or a polypeptide (eg, an antibody or fragment thereof). Examples of dyes are those of the azine, thiazine, oxazine, cyanine, merocyanine, styryl, triphenylmethane, chlorophyll and phthalocyanine types.

De optokemiska metoder för vilka föreliggande uppfin- ning kan användas är, som tidigare nämnts, inte begränsade till SPR-metoder utan utsträcker sig till varje analysmetod som mäter en förändring av brytningsindex som tecken pá närvaro av en analyt. Sådana metoder inbegriper metoder ba- serade på såväl intern som extern reflexion, t ex ellipso- metri och evanescent vàgspektroskopi, varvid den sistnämnda innefattar Brewster-vinkelreflektometri, kritisk vinkel-re- flektometri, evanescent vàgellipsometri, spridd total in- tern reflektion (STIR), optiska vàgledarsensorer, etc.The optochemical methods for which the present invention can be used are, as previously mentioned, not limited to SPR methods but extend to any analysis method that measures a change in refractive index as a sign of the presence of an analyte. Such methods include methods based on both internal and external reflection, such as ellipsoometry and evanescent wave spectroscopy, the latter including Brewster angle reflectometry, critical angle reflectometry, evanescent wave ellipsometry, scattered total internal STR reflection. , optical waveguide sensors, etc.

Kontakten mellan vätskeprovmediet och den optiska ytan kan vara statisk eller, företrädesvis, dynamisk, dvs genom att mätytan eller -ytorna anordnas i något slags flödes- cell.The contact between the liquid sample medium and the optical surface can be static or, preferably, dynamic, ie by arranging the measuring surface or surfaces in some kind of flow cell.

Lämpliga analysformer för utnyttjande av föreliggande uppfinning innefattar, men är givetvis inte begränsade pà något sätt till de som beskrivs i de ovannämnda WO 90/11525 och EP, A, 276 142, inbegripande konkurrerande analyser, förträngningsanalyser och analyser av sandwichtyp. Vid en konkurrerande analys konkurrerar sonden med analyten om bindningen till mätytan, medan vid en förträngningsanalys sonden är bunden till mätytan och undanträngs av analyten.Suitable assays for utilizing the present invention include, but are of course not limited to, those described in the aforementioned WO 90/11525 and EP, A, 276 142, including competing assays, displacement assays and sandwich type assays. In a competitive analysis, the probe competes with the analyte for binding to the measuring surface, while in a displacement analysis, the probe is bound to the measuring surface and is displaced by the analyte.

Vid en sandwich-assay binds sonden till analyten, antingen -f-*ß- CÉÄ CC! 10 15 20 25 30 35 Q? gx NJ innan analyten binds till mätytan eller sedan den bundits till mätytan.In a sandwich assay, the probe binds to the analyte, either -f- * ß- CÉÄ CC! 10 15 20 25 30 35 Q? gx NJ before the analyte is bound to the measuring surface or after it has been bound to the measuring surface.

En konkurrerande analys för exempelvis en hapten, t ex teofyllin, kan således utföras genom att man konjugerar en lämplig sond till teofyllin och, vid eller nära sondens ab- sorptivitetsmaximum, mäter den utsträckning i vilken provet vid blandning med sonden påverkar, dvs konkurrerar med, bindningen av det konjugerade teofyllinet till måtytan.A competing assay for, for example, a hapten, eg theophylline, can thus be performed by conjugating a suitable probe to theophylline and, at or near the probe's absorptivity maximum, measuring the extent to which the sample when mixed with the probe affects, ie competes with, the binding of the conjugated theophylline to the measuring surface.

För att demonstrera genomförbarheten för analysmetoden enligt föreliggande uppfinning utfördes följande försök med ett kommersiellt SPR-baserat biosensorinstrument.To demonstrate the feasibility of the assay method of the present invention, the following experiments were performed with a commercial SPR-based biosensor instrument.

EXEMPEL Färgämnet HITC (l,l',3,3,3',3'-hexametylindo- trikarbocyaninjodid, 94% renhet, Sigma H0387) löstes i koncentrationerna 0, 0,25, 0,5 resp 0,75 mM i en blandning av 50% etanol och 50% citratbuffert (pH 3, 0,1 M citrat, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20). Lösningarna injicerades i ett BIAcoreTM-instrument (marknadsfört av Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige) med en mätváglängd av 760 nm. Ren citratbuffert användes som eluermedel, och brytningsindexsvaret för varje puls avlästes. Två testse- rier kördes på en och samma mätyta (Sensor ChipTM CM5).EXAMPLE The dye HITC (1,1 ', 3,3,3', 3'-hexamethylindotricarbocyanine iodide, 94% purity, Sigma HO387) was dissolved in concentrations of 0, 0.25, 0.5 and 0.75 mM, respectively, in a mixture. of 50% ethanol and 50% citrate buffer (pH 3, 0.1 M citrate, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20). The solutions were injected into a BIAcoreTM instrument (marketed by Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) with a measuring wavelength of 760 nm. Pure citrate buffer was used as eluent, and the refractive index response for each pulse was read. Two test series were run on one and the same measuring surface (Sensor ChipTM CM5).

Repeterbarheten var god.The repeatability was good.

I Fig. l är svaret (i resonansenheter, RU) avsatt mot HITC-koncentration. Som framgår av kurvan är den linjära passningen god (r>0,999). I kombination med pulsernas fyr- kantsutseende visar detta att endast bulkbrytnings- indexförändringar inträffar och att ingen adsorption av HITC till mätytan sker.In Fig. 1, the response (in resonance units, RU) is plotted against HITC concentration. As can be seen from the curve, the linear fit is good (r> 0.999). In combination with the square appearance of the pulses, this shows that only bulk refractive index changes occur and that no adsorption of HITC to the measuring surface takes place.

Det molära brytningsindexinkrementet befanns vara 2540 RU/mM. Med molekylvikten 537 g/mol, och 1 RU ß l0'6 bryt- ningsindexenheter, blir det beräknade massbaserade bryt- ningsindexinkrementet 4,73 ml/g (2,540 l-mol'1/537 g-mol'1). Eftersom proteiner i allmänhet har ett värde pà 0,185 ml/g, är förstärknings- eller ökningsfaktorn vid detta ooptimerade försök ca 25X. En förstärkningsfaktor på, "äg, SOX skulle därför utan vidare förefalla möjlig att uppnå. 'ﬁi 4-68 962 Ett absorptionsspektrum i intervallet 500 till 900 nm mättes med l mM HITC spädd till 4 uM med etanol/citrat.The molar refractive index increment was found to be 2540 RU / mM. With a molecular weight of 537 g / mol, and 1 RU ß of 10'6 refractive index units, the calculated mass-based refractive index increment becomes 4.73 ml / g (2,540 l-mol'1 / 537 g-mol'1). Since proteins generally have a value of 0.185 ml / g, the amplification or increase factor in this unoptimated experiment is about 25X. A gain of "own, SOX" would therefore readily appear to be achievable. 'Fi in 4-68 962 An absorption spectrum in the range of 500 to 900 nm was measured with 1 mM HITC diluted to 4 μM with ethanol / citrate.

Absorptivitetsmaximum låg vid 743 nm øch var 250.000 cm"1M'1 eller 470 lg“1cm'1. Den negativa absorptivitetsderivatan hade sitt maximum vid 760-770 nm . och var -7.500 cm'lM'lnm'1, eller -14 lg"lcm'1nm'1. Det er- hållna spektrumet överensstämde väl med tidigare publice- rade data.The maximum absorptivity was at 743 nm and was 250,000 cm -1 "1M" or 470 lg "1 cm -1. The negative absorptivity derivative had its maximum at 760-770 nm. And was -7,500 cm -1 / lm / l -1, or -14 lg" lcm'1nm'1. The spectrum obtained was in good agreement with previously published data.

Claims

10 15 20 25 30 35 uâ Ox ha PATENTKRAV

A method of analyzing for an analyte in a liquid sample, wherein the presence of the analyte is detected by determining the resulting change in refractive index at a fixed optical surface in contact with the sample, which change is caused by the analyte causing or affecting binding. releasing or releasing a refractive index raising component to and from the optical surface, respectively, characterized in that the determination is performed with light having a wavelength at or near the maximum of the negative derivative of the absorptivity with respect to the wavelength of the refractive index raising component.

Method according to claim 1, characterized in that when the measuring wavelength is on the high wavelength side of the maximum, the distance between the measuring wavelength and the maximum is less than 100 nm, more preferably less than 50 nm, and that when the measuring wavelength is on the low wavelength side, - the near maximum.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the refractive index enhancing component comprises a protein or a polypeptide conjugated to a chromophore or a dye.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the refractive index raising component comprises a hapten conjugated to a chromophore or a dye.

Method according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the determination is based on internal reflection.

Method according to claim 5, characterized in that the determination is based on surface plasmon resonance.

Method according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the determination is based on external reflection. 468 962

Method according to one of Claims 1 to 7, characterized in that the analysis is chosen from competing analyzes, displacement analyzes and sandwich-type analyzes.

Method according to one of Claims 1 to 8, characterized in that the assay is an immunoassay.