SE445456B - 6/alfa-(4-etyl-2,3-dioxo-1-piperazino-karboxamido)alfa-3,4-dihydroxifenyl-acetamido/penicillamat - Google Patents

Description

7908528-s vari R är väte eller hydroxi, beskrivs bl.a. i den ameri- kanska patentskriften 4 087 424 (se exempelvis exemplen ll, 13 och 22-24 samt spalt 45). Hänvisning sker även till den amerikanska patentskriften 4 112 090.

Föreliggande uppfinning avser ett penicillinderivat enligt formeln med D-konfiguration i 6-sidokedjanï och farmaceutiskt god- tagbara salter och vissa lätthydrolyserade eller fysiolo- giskt hydrolyserade estrar därav.

De farmaceutiskt godtagbara salterna innefattar-ogiftiga metallsalter, såsom natrium-, kalium-, kalcium- och magne- siumsalter, ammoniumsalter och substituerade ammoniumsalter, exempelvis salter av sådana ogiftiga aminer som trialkylami- ner (exempelvis trietylamin), prokain, dibensylamin, N-ben- syl-Å?-fenetylamin, l-efenamin, N,N'-dibensyletylendiamin, dehydroabietylamin, N,N'-bis(dehydroabietyl)etylendiamin, N-(lägre a1kyl)piperidin (exempelvis N-etylpiperidin) och andra aminer, som har använts för framställning av farma- ceutiskt godtagbara salter av penicilliner och cefalospori- ner. De mest föredragna salterna är alkalimetallsalterna, dvs. natrium- och kaliumsalterna. 7908528-8 De lätthydrolyserade eller fysiologiskt hydrolysefade estrarna är acetoximetyl-, pivaloyloximetyl-, metoxi~ metyl-, ftalidylë och 5-indanylestrarna och i synnerhet föredras acetoximetyl-, metoximetyl- och pivaloyloxi- metylestrarna.

Penicillinet enligt formeln x Q H H *H-É-Nn- H3 L- 3 .Cfi 0 NH C/ ooH _ w .7908528-8 framställs enligt ett förfarande genom att man omsätter en förening enligt formeln O H *H-É-ux- i m2 / ooH 1,1 eller ett salt eller lätt spjälkningsbar ester därav med ett acylerande medel enligt formeln III eller med ett reaktivt acylerande derivat därav och att man, om reaktionsprodukten innehåller en lätt spjälkningsbar es- terskyddande grupp, eventuellt avlägsnar skyddsgruppen me- delst i och för sig kända förfaranden och att man, om så önskas, medelst i och för sig kända metoder omvandlar (a) produkten i form av en fri syra till ett farmaceutiskt godtag- bart salt eller fysiologiskt hydrolyserad ester därav eller (b) produkten i form av ett salt till den fria syran eller ett farmaceutiskt godtagbart salt eller fysiologiskt hydro- lyserad ester därav. Ovan angivna acyleringsreaktion kan ut- föras medelst metoder, som i sig är kända inom tekniken, ex- empelvis frân syntesen av peptider, penicilliner och cefalo- sporiner.

Penicillinutgångsmaterialen enligt formeln II är kända för- eningar. Framställningen av den acylerande utgångssyran III 7908528-8 beskrivs närmare nedan.

Vid acylering av GL-aminogruppen i penicillinet enligt for- mel II kan karboxylsyran enligt formel III användas som så- dan, i vilket fall det är föredraget att använda ett enzym eller ett kondensationsmedel. Lämpliga kondensationsmedel innefattar N,N'~dimetylkloroformiminiumklorid, en N,N'-karbonyl~ diimidazol eller en N,N'-karbonylditriazol, ett karbodi- ' imid-reagens (speciellt N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, N,N'- -diisopropylkarbodiimid eller N-cyklohexyl-N'-(2-morfolino- etyl)karhodiimid, ett alkylamin-reagens, ett isoxazolium- salt-reagens, ett ketenimin-reagens, hexaklorcyklotrifosfa- triazin eller hexabromcyklotrifosfatriazin, difenylfosforyl- azid (DPPA), dietylfosforylcyanid (DEPC), difenylfosfit el- ler N-etoxikarbonyl-2-etoxi-1,2-dihydrokinolin (EEDQ).

Såsom ett alternativ till att använda karboxylsyran III vid ovan angivna förfarande kan man även utnyttja reaktiva acy- lerande derivat av syran III, dvs. funktionella ekvivalenter av syran såsom acyleringsmedel för en primär aminogrupp. Ex- empel på reaktiva acylerande derivat av karboxylsyran inne- fattar syrahalider (exempelvis syrakloriden eller syrabro- midenl, syraanhydrider innefattande blandanhydrider (exem- pelvis alkoximyrsyraanhydrider), syraazider, aktiva estrar (exempelvis p-nitrofenylestern) och aktiva tioestrar. Ett annat reaktivt derivat av syran är en motsvarande azolid, dvs. en amid av syran, vars amidkväve ingår i en kvasiaro- matisk femledad ring innehållande minst två kväveatomer, ex- empelvis imidazol, pyrazol, triazolerna, bensimidazol, ben- sotriazol och deras substituerade derivat. Det allmänna för- farandet för framställning av azolider beskrivs exempelvis i den amerikanska patentskriften 3 910 900.

Ovan har nämnts användningen av enzymer för koppling av den fria syran med förening II. Inom ramen för dylika förfaran- den faller användningen av en ester, exempelvis metylestern, av nämnda fria syra med enzymer, som tillhandahålls av olika 7908522-s mikroorganismer, exempelvis de som beskrivs i J. Am. Chem.

Soc. 2g(ll) (1972) 4035-4037, J. Antibiotics (Japan) 2å(5) (l97l) 321-323 och den amerikanska patentskriften 3 682 777.

Acylering med karboxylsyran III eller ett reaktivt acyle- rande derivat därav kan utföras på penicillansyran enligt formeln II eller ett salt (exempelvis ett alkalimetall- el- ler aminsalt) eller lätt spjälkningsbar ester därav.

Med uttrycket "lätt spjälkningsbar ester“ avses i förelig- gande sammanhang derivat avgænicillansyran, i vilka 3-karb- oxylgruppen är skyddad medelst någon av de kända ester- skyddsgrupper som efter acyleringsreaktionen kan avlägsnas exempelvis genom kemisk eller enzymatisk hydrolys, behand- ling med kemiska reduktionsmedel under milda betingelser, bestrålning med ultraviolett ljus eller katalytisk hydre- ring, vilka metoder icke resulterar i någon märkbar förstö- ring av den övriga delen av molekylen. Exempel på lämpliga "lätt spjälkningsbara estrar" innefattar trialkylsilyl (ex- empelvis trimetylsilyl)-estrar och andra estrar härledda från silylalkohol eller stannylalkohol, vilka kan avlägs- nas genom solvolys med ett lösningsmedel innehållande hydr- oxylgrupper, t-butoxikarbonyl-, benshydryl-, bensyl-, p- -nitrobensyl-, p-metoxibensyl-, 2,2,2-trikloretyl-, fenacyl-, acetonyl-, p-bromfenacyl och lägre alkylestrar, såsom met- yl-, etyl- och p-butylestern, samt ovannämnda fysiologiskt hydrolyserade estrar. De allmänna metoderna för framställ- ning av dylika estrar och för avlägsnande av estergrupperna beskrivs i litteraturen och är välkända för fackmannen.

Acyleringsförfarandet utförs i ett reaktionsinert lösningsme- delssystem, som kan vara vattenhaltigt eller vattenfritt.

Lämpliga reaktionsinerta lösningsmedel innefattar exempel- ~ vis vatten, aceton, tetrahydrofuran, dioxan, acetonitril, dimetylformamid, dimetylsulfoxid, metylenklorid, kloroform, bensen, toluen, metylisobutylketon och blandningar av ovan- nämnda organiska lösningsmedel med vatten. Valet av lösnings- medel, dvs. i synnerhet om ett vattenhaltigt eller vatten- fritt lösningsmedel skall användas, är beroende av de spe- 7908528-8 ciellt använda utgångsmaterialen i fråga. Om exempelvis pe- nicillinutgångsmaterialet II således används i den form där 3-karboxylgruppen är skyddad med en estergrupp, som avspjäl- kas av hydroxyliska lösningsmedel, exempelvis en silyl- el- ler stannylester, används i synnerhet ett aprotiskt orga- niskt lösningsmedel. När vidare penicillinet enligt formel II används i sin saltform används företrädesvis vatten el- ler ett vattenhaltigt, organiskt lösningsmedelssystem. Det mest fördelaktiga lösningsmedelssystemet för de använda spe- ciella reagensen i fråga kan fastställas genom rutinförsök.

Acyleringsreaktionens varaktighet och temperatur är icke kritiska. Temperaturer inom intervallet från ca -30°C till ca +50°C används vanligtvis under reaktionstider, som varie- rar från mindre än l timme upp till l dygn eller däröver. Ehu- «ru det ursprungliga sammanförandet av reaktanterna företrä- desvis sker vid en temperatur av ca OOC i syfte att ned- bringa bildningen av biprodukter är det vanligtvis önskvärt att efter några minuters omröring låta reaktionsblandningen anta rumstemperatur till dess reaktionen har fullbordats.

Reaktanterna enligt formlerna II och III används normalt i ungefärligen ekvimolära mängder, ehuru ett överskott av en- dera reaktanten kan användas, om så önskas.

Om en karboxylskyddande grupp är närvarande i acyleringsre- aktionsprodukten kan denna elimineras, om så önskas, på i och för sig känt sätt för framställning av det önskade 3- -karboxylsyrapenicillinet eller ett salt därav, Acyleringsprodukten isoleras på konventionellt sätt såsom den fria syran, såsom ett salt eller såsom en fysiologiskt hydrolyserad ester (om den lämpliga estergruppen i fråga har använts vid acyleringsförfarandet). Den fria syran kan om- vandlas till ett farmaceutiskt godtagbart salt därav genom behandling med en lämplig organisk eller oorganisk bas.

Karboxylatsalterna kan omvandlas till de fria syrorna ge- 7908528-8 8 nom behandling med en syra eller ett lämpligt jonbytarharts, Produkten i form av den fria syran eller ett salt därav kan även omvandlas med kända metoder till en motsvarande fy- siologiskt hydrolyserad ester, såsom pivaloyloximetyl-, acetoximetyl-, ftalidyl, 5-indanyl- eller metoximetylestern.

Ett alternativt förfarande för framställning av penicilli- nerna enligt formel I innebär att man omsätter 6-aminopeni- cillansyra eller ett salt eller en lätt spjälkningsbar es- ter därav med ett acylerande medel enligt formeln Ho H ëa-t-on 'o o * H ' Iv czfls-N =o med D-konfiguration vid GÅ-kolatomen eller ett reaktivt acy- lerande derivat därav och att man, om reaktionsprodukten in- nehåller en lätt spjälkningsbar esterskyddande grupp, even- tuellt avlägsnar skyddsgruppen medelst i och för sig kända metoder samt att man, om så önskas, medelst i och för sig kända metoder omvandlar (a) produkten i form av den fria sy- ran till ett farmaceutiskt godtagbart salt eller en fysiolo- giskt hydrolyserad ester därav eller (b) produkten i form av ett salt till den fria syran eller ett farmaceutiskt godtagbart salt eller en fysiologiskt hydrolyserad ester därav.

Uttrycken "lätt spjälkningsbar ester", "reaktivt acyleran- 7908528-8 de derivat", "farmaceutiskt godtagbart salt" och “fysiolo- giskt hydrolyserad ester" vid beskrivning av ovan angivna alternativa förfarande har de tidigare angivna betydelser- 218..

Acyleringsbetingelserna, dvs. lösningsmedel, temperatur, molförhållanden och isoleringsteknik, vid detta alterna- tiva förfarande är i huvudsak desamma som ovan har beskri- vits i samband med det förstnämnda förfarandet. i Ehuru, såsom har angivits ovan, penicillinderivaten enligt föreliggande uppfinning är användbara antibakteriella rea- gens i sig är de speciellt användbara vid användning i kom- bination med aminoglykosidantibiotikumet amikacin (eller ett farmaceutiskt godtagbart syraadditionssalt därav), som exempelvis avslöjas i den amerikanska patentskriften 3 781 268. Penicillinderivaten enligt uppfinningen kan således ingå i en farmaceutisk komposition, som innefattar (A) ett penicillinderivat enligt formeln I ovan eller ett farmaceutiskt godtagbart salt eller fysiologiskt hydrolyserad ester därav och (B) aminoglykosidantibiotikumet amikacin (l-[E- (-) -ï -amino- cl -hydroxibuturyljkanamycin A) eller ett farmaceutiskt godtagbart syraadditionssalt därav,' eventuellt i blandning med en farmaceutiskt godtagbar bära- re eller utspädningsmedel.

Med uttrycket "farmaceutiskt godtagbart syraadditionssalt“ i samband med hänvisningen till amikacin avses sådana farma- ceutiskt godtagbara syraadditionssalter som avslöjas i den amerikanska patentskriften 3 781 268 och vilka faller inom ramen för föreliggande uppfinning. Lämpliga salter av ami- kacin innefattar således mono-, di-, tri- och tetrasalter, som framställs av farmaceutiskt godtagbara syror såsom ät- tiksyra, klorvätesyra, svavelsyra, maleinsyra, fosforsyra, salpetersyra, bromvätesyra, askorbinsyra, äpnelsyra och citronsyra. Ett synnerligen föredraget amikacinsalt är ami- kacindisulfat (amikacinsulfat).- 7908528-s 10 Farmaçeutiska kompositioner innefattande både ett peni- cillin enligt formel I (eller ettfarmaceutiskt godtag- bart salt eller fysiologiskt hydrolyserad ester därav) och amikacin (eller ett farmaceutiskt godtagbart'syraadditions- salt därav) uppvisar många fördelar jämfört med komposi- tioner, som innefattar endast den ena av de två nämnda an- tibiotiska komponenterna. Således kan man uppnå ett bred- dat antibakteriellt spektrum, eftersom amikacin är anti- bakteriellt effektivt med avseende på organismer, som icke påverkas av penicillinet, och omvänt. De potentiella nevro- toxicitets- och ototoxicitetsproblem som är förknippade med aminoglykosidantibiotika kan reduceras genom administrering av en synergistisk antibakteriell kombinationsprodukt, som medger en lägre dosering av aminoglykosiden för uppnående av samma terapeutiska effekt. Reducerade amikacindoser, som möjliggörs genom den synergistiska kombinationsprodukten, kan även utnyttjas för behandling av patienter, som lider av Pseudomonas-infektioner, med denna synnerligen effektiva antibiotiska komposition under en längre tidsperiod än vad som för närvarande rekommenderas för amikacinterapi (för närvarande rekommenderas högst 15 dagars administrering).

De terapeutiska penicillin-aminoglykosid-kompositionerna kan administreras till däggdjur, inklusive människa, genom injektion. Kompositionerna kan eventuellt innehålla farmaceutiskt godtagbara fasta eller flytande bärare eller utspädningsmedel av standardtyp. Andra lämpliga doseringsenhetsformer kan framställas enligt inom den farmaceutiska industrin känd teknik.

De relativa mängderna av de aktiva beståndsdelarna i kombinationen kan variera inom vida gränser beroende på den speciella organism i fråga som skall behandlas och på läkarens 'val huruvida den ena eller den andra av de antibiotiska komponenterna vid behandling av en speciell patient skall gynnas. Ett föredraget vikt- förhållande mellan komponenterna, vilket förhållande har vi- 7908528-8 ll sat sig ge synergistiska bakterieida resultat med avseende på ovannämnda fyra stammar av Pseudomonas aeruginosa, ligger mellan ca 1:2 (amikacin:penioillin) och l:l00. Kompositio- ner med sammansättningar utanför detta föredragna intervall ger emellertid även fördelaktiga resultat.

Såsom exempel på en före- _ _ slagen dos för människa kan man använda ett parenteralt pre- parat innefattande 200 mg amikacinsulfat och 400 mg av ett penicillin enligt formeln I. Kapselinnehållet_av amikacin och penicillin upplöses i sterilt vatten och administreras därefter genom injektion såsom en enkeldos av den antibio- tiska kombinationen. Denna föreslagna enkeldos kan administre- ras ca 2 gånger dagligen såsom en föreslagen dagsdosering för människa. Den speciella dosering i fråga som väljs be- stäms naturligtvis av läkaren mot bakgrund av patientens ål- der, vikt och tillstånd och kan fastställas av fackmannen på basis av de data som återges i denna beskrivning ooh på ba- sis av erfarenheten av andra kända kombinationer av peni- cillin och aminoglykosider.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande utförings- exempel, vari temperaturangivelserna avser Celsiusgrader.

Exempel 1 i; K Hconr- H3 H3 ff 0 NH O/P* ooH EtN - =Q BB-P66l 79na52ssa 120 D- êå- (4-etyl-2 , 3-dioxo-l-piperaz inokarboxamido) - bl -3 , 4- * ~dihydroxifenylättiksyra (ga) 1111 en kyla een omrörd lösning av 5,4 g (o,o3 mel) 0<-)~ -3,4-dihydroxifenylglycin i 60 ml lN natriumhydroxid sat- tes droppvis vid en temperatur av 0-50 en lösning av 7,36 g (0,036 mol) 4-etyl-2,3~dioxo-l-piperazinyl-karb-' onylklorid i 70 ml torr tetrahydrofuran (THF). Blandning- en omrördes vid 5-100 under 30 minuter, under vilken tids- -period den hölls vid ett pa av 8-9 genom tillsats av l N natriumhydroxid. Reaktionsblandningen koncentrerades till 70 ml, surgjordes med koncentrerad saltsyra och extrahera- des med 400 ml av en l0:l-blandning av etylacetat och n- -butanol. Extrakten torkades över magnesiumsulfat. Efter avdrivning av lösningsmedlet kromatograferades återstoden (ca 6 g) på silikagel (Wako-gel C-100, 150 g) genom elue- ring med kloroform och därefter med kloroform-metanol. De önskade fraktionerna tillvaratogs och indunstades till torr- het, varvid man erhöll 870 mg (8 %) av den i rubriken angiv- na föreningen za. /of/šz = -s4° (0 = l, ston). smp. zoo - 2os° (söna.). ir; 1; gg: 1710, 1670, 1610, 1520, 1400, 1310, 1290, 1190 emfl. nv= 2 âïífert (PH7) 221 mn (âhllsoo), 277 nm (¿ï, 4700).

Analys Ber. för Cl5Hl7N3O7-H2O= C 48,78 H 5,18 N 11,28 Funnet: C 48,68 H 4,58 N 10,87 BB-P 661; Natrium 6-¿ñ>al-(4-etyl-2,3-a10x0-1-n1perazin0- karboxamido) -Ql-(S , ll-dihydroxifenyl) acetalnidrfl penicillanat (ga) Till en kyld och omrörd suspension av 351 mg (l mmol) av föreningen 2a och 224 mg (2,2 mmol) N-metylmorfolin i 10 ml torr THF sattes droppvis vid en temperatur av -50 en lösning av 130 mg (1,2 mmol) etylklorformiat i 5 ml torr THF g790as20-s 13 och blandningen omrördes vid en temperatur av från -5 till -100 under l timme. Till blandningen sattes i en portion vid -100 en lösning av 432 mg (2 mmol) 6-APA (6-aminopeni- ncillansyraï och 303 mg (3 mmol) trietylamin 1 10 ml av en 50%-ig vattenlösning av THF och blandningen omrördes vid -50 under 15 minuter och därefter vid rumstemperatur un- der 30 minuter. Reaktionsblandningen koncentrerades till en volym av 5 ml och koncentratet surgjordes med 6 N saltsyra och extraherades med 100 ml etylacetat. Extrakten tvätta- des med en mättad natriumkloridlösning, torkades över mag- nesiumsulfat och koncentrerades till en volym av 30 ml.

Till koncentratet sattes 1 ml 1 M SEH (natrium-2-etylhexano~ at) i etylacetat och det erhållna precipitatet tillvaratogs genom filtrering, tvättades med etylacetat, följt av eter, och torkades i vakuum över fosforpentoxid, varvid man erhöll 202 mg (35 %) av föreningen BB-P 661 med smältpunkten 170- -1s0° (sönaeraenlinq) . 1r= 1)' 1770, 1710, 1680, 1610, 1510, 1400, 1380, 1260, 1190 cnfl. uv; a. :ïffert (PHÜ 220 nm, sk (E, 14000), 265 nm, sk (6, 4600).

Jämförelseföreningar OCH Et~N - =0 *MVG 1313-966 0 7908528~8 14 L-fiá- (etyl-Z , 3-dioxo-l-piperazinokarboxamido) - 61-3 , 4-di- lhydroxifenylättiksyra (gg) Till en kyla och Qmröra lösning av 2,66 g (0,02 moi) L- -(+)-3,4-dihydroxifenylglycin i 40 ml l N natriumhydroxid sattes droppvis vid 0-50 en lösning av 4,5 g (0,022 mol) 4-etyl-2,3-dioxo-l-piperaåiny1-karbonylklorid i 50 ml torr THF. Blandningen omrördes vid 0-50 under 30 minnter, under vilken tidsperiod den hölls vid pH 8-9 genom tillsats av l N natriumhydroxid. Reaktionsblandningen koncentrerades till 40 ml, surgíordes med koncentrerad klorvätesyra och extra- herades med 300 ml av en lml-blandning av etylacetat och N-butanol.

Extraktet torkades över magnesiumsulfat och indunstades till torrhet. Den oljiga återstoden (ca. 4 g ) kromatogra- ferades på silikagel (C-200, 70 g) genom eluering med klo- roform och därefter med kloroform-metanol. De önskade frak- tionerna tillvaratogs och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 1,52 g (2l,5 %) av den i rubriken angivna för- eningen 2b med smältpunkten 200-2050 (sönderdelning). /aå/šz = +79°_ (c = 1, Eton).

, KBr -l ir: max 1710, 1670, 1610, 1520, 1400, 1370, 1290, 1190 cm _ av; 71. âïífert (PH 7) 221 nm (g, 10000), 277 nn (6, 4000) Analys Ber. för Cl5Hl7N3O73/2H20: C 47,62, H 5,33 N ll,ll Funnet: C 47,45 H 5,16 N 9,21 BB-P 660; Natrium-jör-ß- Q- (4-etyl-2 , B-dioxo-l-piperazino- karboxamido)-ul-3,4-dihydroxifenylacetamid§7penicillanat (åg) En lösning av l30 mg (1,2 mmol) etylklorformiat i l0 ml torr THF sattes droppvis vid -50 till en kyld och omrörd suspen- 'sion av 351 mg (l mmol) av föreningen 2b och 224 mg (2,2 mmol) N-metylm0rfolin i 10 ml torr THF, och blandningen omrördes “7908528-8 15 vid en temperatur av från -5 till -l0O under l timme. Till blandanhydridlösningen sattes i en portion vid ~l0° en lös- ning av 432 mg (2 mmol) 6-APA och 303 mg (3 mmol) trietyl- amin i l0 mg av en 50%-ig vattenlösning av THF, och bland- ningen omrördes vid -50 under 10 minuter ooh vid rumstempe- ratur under 20 minuter. Reaktionsblandningen koncentrerades till 10 ml och koncentratet tvättades med eter, surgjordes med utspädd klorvätesyra och extraherades med 100 ml etyl- adcetat. Extraktet tvättaaes med en Hfiittad-vattenlösning av na- triumklorid, torkades över vattenfritt magnesiumsulfat och koncentrerades till en volym av 30 ml. Till koncentratet sat- tes O,9 ml (0,9 mmol) SEH i etylacetat, varvid man erhöll en fällning, som tillvaràtogs genom filtrering, tvättades med etylacetat och eter och torkades i vakuum över fosforpent- oxid för erhållande av 230 mg (50%) av föreningen BB-P660 med smältpunkten 170-1s0° (sönaeraelning). 1r= 1; 1770, 1720, leïo, 1610, 1510, 1400, 1375, 1260, 1190 cm' . uv; 71, Buffeft (Pm) 220 nm (. 6, 13000), 265 nm (6, 3800). maX H i s H Hconn- H 3 o oi NH oou II Em' -_ =o _ BB-P652 DL-fll~(4-etyl-2,3-dioxo-1-piperazinokarboxamido)-0l-3,4- dihydroxifenylättiksyra (Zc) Till en kyld och omrörd lösning av 2,7 g (0,0l5 mol) DL-ø¿- ~amino-då-3,4~dihydroxifenylättiksyra i l5 ml av en l N natriumhydroxidlösning sattes droppvis vid 5-lOo en lösning QUALITY 7900520-s 1 A 16 av 3,1 g (0,0l4 mol) 4-etyl-2,3-dioxopiperazin-l-karbonyl- klorid i 5 ml torr THF. Blandningen omrördes l timme vid l0-200, medan reaktionsblandningen hölls vid pH 8-9 genom portionsvis tillsats av 15 ml l N natriumhydroxid. Bland- ningen koncentrerades till 20 ml, surgjordes med koncentre- rad klorvätesyra och extraherades med 400 ml av en l0:l- -blandning av etylacetat och n-butanol. Extraktet torkades över magnesiumsulfat och indunstades till torrhet. Återsto- den triturerades med eter, varvid man erhöll 1,8 g råprodukt, som kromatograferades på silikagel (C-200,70g) genom elue- ring i tur och ordning med kloroform och en 20:l-blandning av kloroform och metanol. Det önskade eluatet tillvaratogs och indunstades till torrhet. Återstoden triturerades med eter, varvid man erhöll l,2l g (23 %) av den rena produkten 2c med smältpunkten 1400 (sönderdelning). ir: 13 ÉÉ: 1710, 1680, 1520, 1400, 1370, 1290, 1190 cm'1. uv; 2, âäífert (Pm) 225 nm (E, 11800), 277- nm (E, 4600) -(1 - - nmr= 5 ëëâo 1,07 (sn, t, 7,5 Hz, cnzggs), 3,35 (25, q, 2,5 Hz, cgzca3), 3,3 - 3,7 (211, m, N-cnz), 2,7 - 4,1 (211, m, N-cnz), 5,03 (1H,'a, 7 Hz, CH-CO), 6,62 (2H, s, fenyl-H), 6,67 (m, s, fenyl-H), 0,5 - 9,1 (2H,Übr, om, 9,5 (111, a, 7 Hz, NH). ' i Analys Ber. för Cl5Hl7N3O7-l/ZHZO: C 50,00 H 5,03 N ll,96 Funnet: C 50,40 H 4,87 N ll,62.

BB-P 652: Natrium-6-ÅfiL-0¿-(4-etyl~2,3-dioxo-l-piperazino- -karboxamido)-06-3,4-dihydroxifenylacetamidqfpenicillanat (âg) V Till en kyld och omrörd suspension av 176 mg (0,0 mmol) av föreningen 2c och ll2 mg (l,l mmol) N-metylmorfolin i 10 ml torr THF sattes vid -l0° en lösning av 65 mg (0,6 mmol) etyl- klorformiat i 5 ml torr THF, och blandningen omrördes vid en 7908528-8- 17 temperatur av från -5 tillf-109 under l timme, Reaktions- blandningen blev en klar lösning. Till lösningen sattes i en portion en lösning av 216 mg (l mmol)6-APA och 150 mg Q,5nmo1) trietylamin i,l0 ml av en 50%-ig vattenlösning av THF. Blandningen omrördes vid -l0° under 15 minuter och vid rumstemperatur under 30 minuter. Efter koncentrering av_ det torkade filtratet till 5 ml surgjordes vattenlösningen .med utspädd klorvätesyra och extraherades med 100 ml etyl- acetat.-Extraktet tvättades med vatten och därefter med en mättad vattenlösning av natriumklorid, torkades över magnesi- umsulfat och koncentrerades till en volym av 50 ml. Till koncentratet sattes 0,6 ml (0,5 mmol) SEH i etylacetat. Den erhållna fällningen tillvaratogs genom filtrering, tvätta- des med etylacetat och eter och torkades i vakuum över fos- forpentoxid, varvid man erhöll 180 mg (63%) av föreningen BB-P 652 med smältpunkten 170-1600 (sönaerdelning) . ir: 1; 1770, 1710, 1680, 1610, 1510, 1400, 1370, 1260, 1190 cm* i uv: fl, ïäfífert (PH 7) 220 mn (E, 12000), 270 mn (f, 2600).

Data avseende biologisk aktivtet Minimuminhiberingskoncentrationerna (MIK) för föreningarna BB-P 652, BB-P 660 och BB-P 661 fastställdes genom den två- faldiga agarutspädningsseriemetoden under användning av Steers apparat och Mueller-Hinton agarplattor med avseende på S. aureus (6 stammar), cefalotin-känsliga gramnegativa organismer (Gn-I. 13 stammar), cefalotinreistenta gramnega- tiva stammar (Gn-II, 6 stammar) och Ps.aerugin0sa (64 stam- mar. Resultaten återges i tabellerna l och 2 nedan tillsam- mans med resultaten för piperacillin och karbenicillin. Ta- bell l visar MIK-värdena för representativa stammar utvalda från de använda testorganismerna och tabell 2 visar den ge- nomsnittliga procentuella relativa aktiviteten av penicil- linerna med avseende på karbenicillin, vilken relativa akti-I vitet beräknades utgående från de geometriska medelvardena 7900528-0 .186 for MIK-värdena i varje grupp av testorganismerna.

Med avseende på grampositiva bakterier var föreningarna BB-P 652, BB-P 660 och BB-P 661 praktiskt taget lika ak- tiva men mindre potenta än piperaciilin. Den gramnegativa aktiviteten av dihydroxipenicillinerna är beroende av kon- figurationen hos 01-kolatomen i 6-acylsidokedjan. D-isome- ren (BB-P 661) var den mest aktiva av de tre isomererna och L-isomeren (BB-P 660) uppvisade avsevärt mindre aktivitet.

Föreningen BB-P 661 var ca 8 gånger aktivare än piperacillin med avseende på cefalotin-känsliga gramnegativa organismer och något mindre aktiv med avseende på Pseudomonas och ce- falotin-resistenta stammar.

~ Tabe11 1. Aktivitet_ín vítro av anti-pseudomonaïa peniciïïíner fast- stä11d mede1st agarutspädningsteknik (Mue11er-Hinton-agar).

MIK (pg/mU ' _ ' _ 5 Pipera- Karbe- Offlfllflßmefl _, :as-P 652 nB-P 660 :as-p 661 6111111 61611116 _s_. 5155533 smith 'i 6,3 6,3. 6,3 Ã- 0,8 0,2 5., 6563 :ax-mas 12,5 12,5 12,5 3,1 3,1 g, 361100111 0,5 6,3 0,4 1,6 3,1 g. Eneumaniae »_5977 0,05 0,0 0,025 ' 0,6 1,6 g. miràbilis-Assoo ß 0,8 12,5 0,4 0,0 0,5 _1>_. vfiigaris 119559 ' - 0,5 >100,0 0,4 0,4 1,6 g. 6166656 119656 1,6 12,5 1,6 1,6 1,6 g. 6656516666 1115150 50,0 >100,0 1.5.,5 3,1 25,0 g. aefugixíasa A984: 3,1 >100,0 0,0 6,3 100,0 g. aeruginosa A207l7 6,3 >l00,0 0,8 25,0 >l00,0 19 7908528-8 Tabe11 2; Genomsnitt1ig procentue11 re1ativ aktivitet av BB-P 652, BB-P 660 och BB-P 661 .Genomsnittlig procentue11 re1ativ Genomsnitt1ig procentue11 re1.akt. aktivitet (karbenici11in = 100%) Anta1 BB-P BB-P BB-P Pipèra- Grupp av organismer - stammar 652 660 661 _pi11in S.-aureus 6 , 25 22 22 56 aGram-negativa (Gn-I) 13 1780 200 3030 360 ' Gfam-negativa (Gn-II) 6 112 6 178 224 Ps. aeruginosa 64 271 26 418 637 Karbe- ci11jg 100 ~ 100 100 100 _ geóm. mede1v. av NIK f. karbenici11in X 100 _ çeøm. mede1v. av MIK för testfören. 7908528-a Tabe11 3.

ArrCfl~CONH” (1) píperacíïlín (T0yama's T-1220) (2) subkutant u _ Éßlodnïvä "' PD50 (HWSS, lm) (lm, 20mg/kg) Kod- â- alšæä 3- æLi. 2.8.- .__.sfleru - :epp- :gl-iv Ar beteckninq smith .mm A984: °"°- 1 ' mq/kq _ mg/kq IIIs/kg ps /ml min ©- _ BB-P 606m (n) 10: 1_ o,a 3,3 ss 4,9 414m' 10: 2 as I zs 6,2 som _ 2 'let s 40 9 _ 29 n mæ-P ssz 4,5 1,8 ' so 8,3 32 (DL) 24,5 39 H 2 , H 33-11» sso 7,3 1,2 >1oo 4 39 (L) H . n :aa-P 661, 6,25 1,8 zsí 4 28 (D) - - - 79085-628-8 21 Tabeii 4 Bakteriostatisk och baktericid aktivitet av BB-P 661 oehépiperaciilin med avseende på 32 Enterobacteriaceae i Mueiier-Hinton-odïingsmedium - Stan BB-Pøbl Pineracillln Organism - A Ng, MIK MBK MIK MBK - :iii-___- Escherichia colie 15119 1 ""'“"“ ' “" 9660 0, 20102 2 20081 2 20766 2 21214 2 2 l vn care Én 15 NNfD-F-'IDOI-J 21219 Klebsiella pneumoniae 9977 ' 20452 20465 b! ull-J l\_)|\)0\4=-4=':-J 'Enterobacter cloacae 20650 3 r~ .

OHHNH Hwm nanm mmmmmmw mmwFmwH :mm æmmmmmw mmmwm Enterobacter aerogenes 21155 Proteus mirabilis 9900 n. w ~ ~ s |\)|\)[Û\Y|\.n \fl\n\n .25 D.) U1 O l-' O\ l-*OO l-JNW OOOOO' -FF-P' FFIÜGJ (I) Proteus vulgaris 21557 N UT -P-'O Proteus rettgeri 9657 IDI-'O Q_O_O l-fll-Ith OOOOO 4='4=-4=' r: uiluo Uiul MIK = minimuminhiberingskonc. (pg/mi). MBK = minsta baktericida konc. (pg/mi), beräknad på basis av en 99 9% avdödning utgående från en genomsnittïig initi- e11 ce11popu1ation av Zxiüà ceiier/mi. 7@oas2a=e 22 _ B1odnivåer hos möss med avseende på BB-P 661 och piperaci11in efter intramusku1är administrering av 40 mg/kg kroppsvikt B1odnivå (pg/m1) 15 30j 45 60 90 Förening minuter efter administrering BB-P 611 20,7 11,5 15.- '_¿5 "¿5 Piperaci11in 12,8 5,9 1,5 451,3' 111,3 Värdena avser mede1värden av minst tvâ försök .Utsöndring av BB-P 661 och piperaci11in i urinen hos råtta efter intramusku1är administrering av 10 mg/kg Procentue11 utsöndring (%) Förening 0,3 _ 3-6 s-24 0-24 _ timmar efter administrering BB-P 611 27,3 _ 0,8 421,21 .28,1 Piperaci11in -23,9 _ 0,1 '41 0,6 24,0 Värdena avser mede1värden av tvâ försök.

Testorganism: S. 1utea ATCC 9341 7968528-8 _ , m mâw w» S Wmx x www w M .x M mONH w» w x www w “__ .x mx MW. xxx x N OH % E. x mw mmä M2 x w xmwwmfi ßm Ma :OH x N mmofiflwsamß .m Qmx x NM 36 än H w RM w m m w mm mx 2.0 Qwx 9.6 www x M m. x xx xx x xxxš. Ä mic 3 x m o 4 ß _ md m6 mñø x WS x .x xäwßw _ M m H oowA wfi OONA mm nofi ä a mmwmmmm%m%IwM QowA _ _ x OONA w xwfi N www % M mæficbE§m% mß Mum æooâ Boö .å w w mwm _ z _ mm 3 å. mm Mm , _ m ».wx\.mE, ^.~fi\m1v” ».wx\.wsw. ^.Hfl\mnv nxwamwc Emflmmwno w=*::š;wn\o mm m=Ib=m=wn\o am ¥H: -mage Føpcxv Qfifififiomhmmfim floomsmfl _ wøvm=ovP#m+=H Lmewwcmmxo «>vpmmw:EøLm zuo w>~p«moqsm>m ax -www wwe wvm-~xE@L+ mwms mo; Lw=owp¥ww=w w-m»=wE«LwQxw mm wv=www>m uwe :@F~wo@xmuwQ :oo Fww @|mm >~ pxwmww xwwpswnmxww 07908528-s 24 Behandlingsschema: Möss infekterade med stammarna P. aerugi- nosa A9843a, A20543, A20599 och P.mirabilis A9900, A2l369 behandlades intramuskulärt 0 och 2 timmar efter infektion, medan de som var infekterade med stammarna S. pyogenes A9604, S. pneumoniae A9585, K. pneumoniae A9867, Al5l3O och E. coli A9660, Al5ll9 behandlades intramuskulärt l och 3,5 timmar efter infektion.

Exempel 2 Framställningen av föreningen BB-P66l, dvs. 6-¿§-0l-(4-et- yl-2,3-dioxo-l-piperazinokarboxamido)-ul-(3,@-dihydroxifen- yl)-acetamid§7penicillanat, medelst blandanhydridmetoden be- skrivs i exempel l ovan. Nyligen företagen HPLC-analys har avslöjat att produkten innehöll minst 5 komponenter. Den önskade produkten har med framgång isolerats genom prepara- tiv HPLC. ' Rening av oren BB-P66l genom HPLC Eftersom ett orent prov av föreningen BB-P 611 (l9,8 g), som hade framställts medelst den i exempel l angivna blandan- hydridmetoden, uppvisade fem toppar A, B, C, D och E i ett analytiskt HPLC-kromatogram fraktionerades provet i fem por- tioner medelst preparativ HPLC (Waters' System 500, patron pCl8, lösningsmedel: CH3CN/H20 = 10/90). Resultaten visas nedan Fraktion nr. Égpp Mängd (g) Fraktion l A, (B, mindre del) 0,67 Fraktion 2 B 1,9 BB-P66l Fraktion 3 C 1,7 Fraktioin 4 D 1 , 3 Fraktion 5 E 2,8 Av de erhållna fraktionerna uppvisade fraktionerna 2 och 4 antipseudomonal aktivitet. Fraktion 2 lyofiliserades för er- hållande av 1,9 g av den önskade produkten (BB-P66l, som smäl- te vid 205-2100 under gradvis sönderdelning). 7908528-8 25, _- Do I ' nm1= 5 pšm 1,17 (3H, t, 7,5 Hz, N-cH2gg3), 1,43 c 6 H, S, 2-cH3), 3,25-3,75 <4H, m, N-gg2cH3 och N-cnz-), 3,7s+4,1o (2H, m, N-CH2-), 4,16 (lfl, S, 3-H), 5,25-5,50 (3H, m, 5-H, 6~H 0Ch CÉCO), 6,80*7,00 (3H, m, fènyl-H).

Exemgel 3 Aktivestermetoden under utnyttjande av N-hydroxisuccinimid (NOS) applicerades på framställningen av BB~P66l för erhål- lande av ett bättre utbyte än vid blandanhydridmetoden.

Framställning medelst aktivestermetoden - u “J u xcoon “°° 3 arm-E... I _ mi* a. G-APA o o m* oofl I C235- Å) 5235- .lg g, aa-s661 En blandning av 42,1 g (o,12 mol) D-q¿-(4-ety1-2,3-aioxo-1- -piperazinokarboxamido)-dl-(3,4-dihydroxifenyl)-ättiksyra (1), 16,56 g (0,l44 mol) N-hydroxisuccinimid och 29,7 g (0,l44 mol) dicyklohexylkarbodiimid (DCC) i 600 ml torr tetrahydrofuran (THF) omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar och den utfällda karbamiden avlägsnades genom filtre- ring. Filtratet sattes i en portion till en kyld och omrörd lösning av 38,9 g (0,l8 mol) 6~aminopenicillansyra och 33 ml (0,234 mol) trietylamin i 400 ml vatten. Blandningen om- rördes vid rumstemperatur under 3-timmar och koncentrerades till 400 ml i syfte att avlägsna huvuddelen av THF. Koncen- tratet behandlades med aktivt kol och filtratet surgjordes med 40%-ig fosforsyra till pH 3, varvid man erhöll produkten såsom ett oljigt precipitat, som avskiljdes och triturerades med vatten. Det resulterande fasta materialet tillvaratogs genom filtrering, tvättades med vatten och torkades i va- 7998528-8 26 ' kuum över PZÖ5 för erhållande av 29,0 g av råprodukten (2).

Moderluten extraherades med 2 x 500 ml etylacetat. De kombi- nerade extrakten tvättades i tur och ordning med vatten och en mättad vattenlösning av natriumklorid, torkades över vat- tenfritt magnesiumsulfat och indunstades till torrhet. Åter- stoden triturerades med eter för erhållande av en ytterligare mängd (4,8 g) av produkten 2. En gortion av râprodukten (1,3. g) kromatograferades på silikagel (wakoeqel C-200,30G) och eluering skedde i tur och ordning med kloroform och en 10:1- -blandninq av kloroform och metanol. De önskade fraktionerna tillvaratogs och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 420 mg av produkten 2, som uppvisade en enda topp vid HPLC- -analys.

Uppfinningen kan tillämpas industriellt.

Claims (2)

10 15 20 , .V......._.-......._..... ___ _, 7908528-8 Patentkrav

1. Penicillansyran enligt formeln CZHS-N med D-konfiguration i 6-sidokedjan och farmaceutiskt god- tagbara salter och dess lätthydrolyserade pivaloyloxi- metyl-, acetoximetyl-, metoximetyl-, 3-ftalidyl- och 5-indanylestrarß

2. Natrium- och kaliumsaltet av penicillansyran enligt krav 1. ...__.._..._... ___... ,,..__..............._--...--_-»...._. . .,. An....,~..........__.~ . .,- _...