SE442785B - Radio- eller metallimmunanalysforfarande der separation av bunden fran fri fraktion genomfores med losningsmedelsextraktion - Google Patents

Description

8005658-3 2 b) Den bundna fraktionen separeras från den fria frak- tionen och c) mängden märksubstans antingen i den bundna eller den fria fraktionen bestämmes; Det är känt att specifika bindningsförsök är baserade på principen att styra vissa bindningsreaktioner, i vilka graden av bindningen är en funktion av närvarande okänd ligand medelst en betecknad komponent. Bland kända förfaran- den kan nämnas följande fem specifika typer av bindförsöks- teknik: Radioimmunoförsök (RIA), metallinmmunoförsök (dšA), fri radikal försöksteknik (FRAT), hemaglutinerad inhibition (HI) och enzymmångfaldigad immunoförsöksteknik (EMIT). De två första slagen av förfaranden innebär, att man låter en bland- ning, som består av obetecknad ligand, betecknad ligand och antikropp, nå jämvikt och antikroppsbunden ligand separeras från fri ligand. Vid radioimmunoförsök markeras liganden med en radioaktiv isotop, under det att ligand vid metallimmuno- försök markeras med ett metall innehållande reagens, som även innehåller en lämplig funktionell grupp, medelst vilken man kan fästa metallreagenser vid den hapten, som man önskar under- söka. En fullständig beskrivning av detta lämnas i GB 1 550 540.

Förfarandet för att skilja den fria fraktionen från den bundna fraktionen är av stor betydelse och dess exakthet bestämmer känslighet och precision hos hela den specifika bindande försökstekniken. Vid val och genomförande av ett separeringsförfarande är det tillrådligt att bestämma de kri- teria, som skall uppfyllas för erhållande av det önskade resultatet. Följandehuvudkrav för en ideal separering må nämnas: a) en fullständig separering mellan de bundna och den fria fraktionen skall erhållas med bred marginal för fel i de be- tingelser, som användes för separeringen. Detta innebär;;att förfarandet ej får påverka de primära bindningsreaktionerna, b) förfarandet skall vara enkelt, snabbt och tydligt och man, skall kunna använda kända reagenser och tillgänglig utrust- ning, 8005658-3 3 c) förfarandet skall vara genomförbart med använd ligand, eftersom eljest det uppträder svårigheter med standardise- ringen. Ett antal separeringsförfaranden är kända på tek~ nikens ståndpunkt och i det följande skall lämnas en kort. beskrivning av detuæ Adsorptionsförfaranden: vanligen adsorberas den fria fraktionen. Adsorbenterna användes vanligen för små peptider, steroida och tyroida hormoner.

Adsorptionen bestämmas av många faktorer, såsom den relativa ytan på adsorbenten, storlek och laddning hos antigenet, kravet på en koncentration av konkurrerande proteiner, temperatur, jonstyrka och pH. Det är av väse2t~ lig betydelse, att betingelserna för användning av adsorp- tionsförfarandena optimeras på experimentell väg för varje antigen. Exempel på vanligen använda adsorbenter är träkol och silikater. Det huvuåækliga problemet består i att träkol alltid innehåller en viss mängd oaktiverat material, som har hög ospecificerad reaktionsförmåga med ett stort område av ämnen, så att såväl den bundna som den fria fraktionen kan adsorberas. Dessutom kan träkol avlägsna bundet antigen, i synnerhet när man använder ett bindeämne med låg reaktions- förmåga. Nackdelen med silikat är att se i att adsorptíonen är beroende på närvarande protein, så att de optimala, rela- tiva proportionerna av adsorbens och serum måste bestämmas experimentellt för varje antigen.

Fraktionsvis utfällning med neutrala salter eller « organiska låsningsmedel, som lämnar den fria fraktionen i lösning. De krafter, som bestämmer denna effekt, är i hög grad elektrostatiska och kan påverkas av många faktorer, t.ex. temperatur, pH, proteinkoncentration samt ämnets dielektriska konstant. Optimala betingelser måste bestämmas på experimentell väg med uppmärksamheten riktad på följande parametrar: pH, buffert, protein- och saltkoncentrationer.

Tillämpningen av dessa enkla utfällningar beror i huvudsak på egenskaperna hos det fria antigenet; ; Ammoniumsulfat har med framgång kunnat användas vid försök med plasma och urinextrakt för många små pepsider.

Etanol är kanske mera anpassningsbart och är lämpligt för en stor mängd pepsider. Polyetylenglykol har visat sig vara 8005658-5 tillfredsställande för försök med insulin och kan vara användbart för utfällning av peptidhormoner, som ej binder vid standardsorbenter. Alla de i detta avsnitt beskrivna förfarandena är behäftade med den nackdelen, att de kräver åtminstone ett centrifugeringssteg.

Gelfiltrering. Eftersom bundna komplex har avsevärt större molekylvolym än de fria antigelerna, kan de klart separeras genom användning av en lämplig grad av gel, t.ex. Sephadek. Gelet har använts på två sätt för fas- separering. Inkubatet kan matas genom en kolonn uíder rätta betingelser, så att den bundna delen utspädes och lämnar den fria delen i gelet. Ett andra mycket använt förfarande vid konkurrerande proteinbindande teknik är med gelutjämning. Gelet är närvarande under hela inkuba- tionen och kan fördispenseras i balans med sökarbindlös- ningen. Den fria delen i gelets porer står sålunda i jämv- vikt med delen utan. När testprovet tillsättes gelsuspen- sionen, återupprättas snabbt jämvikten, eftersom bind- ningen av sökarämnen vid gelet är reversibel. Efter det att gelpartiklarna har tillåtits att avsätta sig, kan man ta ett prov av moderluten, som omfattar den bundna fraktionen, och rähn denna. Papperkromatoelektrofores.

Ett lämpligt papper väljes, som adsorberar den fria hap- tenen vid dess anväd-ningsplats, under det att den bundna fraktionen förskjutes från sitt ursprungsläge under påverkan av en elektrisk ström och en buffertström, som förorsakas genom avdunstning. Nackdelen med detta för- farande är, att det är allt för komplicerat, tidskrä- vande och kostnadskrävande för att kunna användas som rutin och det lämpar sig ej heller med lätthet för auto- matisering. Även papper och antigener varierar till sina affinitetskarakteristikor, vilket försvårar redu- cerbarheten. 8005658-5 Med tanke pâ nackdelarna hos de ovan beskrivna, kända förfarandena har det sedan länge förelegat behov av ett förbättrat förfarande för att separera den fria fraktionen från den bundna fraktionen med den specifika bindförsökstekniken. Uppfinningen avser därför en för- bättring av den specifika bindmetoden för att pröva ett ämne med avseende på en ligand och förfarandet omfattar följande förfarandesteg: Detta förfarande kännetecknas därav, att separeringen av den bundna fraktionen från den fria fraktionen genomföres medelst lösningsmedelsextraktion under användning av ett organiskt lösningsmedel, som är något blandbart med vatten eller helt oblandbart med vatten och som har egenskapen att selektivt extrahera fri markeringsbeståndsdel i form av märkt antigen, varvid den bundna och/eller fria fraktionen analyseras utan faktisk separering mellan faserna in i olika kärl, eller kan en faktisk separation av de båda faserna genomföras genom att endera fasen immobiliseras i en härför särskilt ägnad fast matris eller båda faserna immobiliseras i fasta matriser, som bringas i nära kontakt med varandra.

Förfarandetär tillämpligt för alla slag av immuno- försöksteknik (t.eX. radioimmunoförsök, fri radikal försöksteknik och metallimmunoförsök, såsom beskrivas i GB 1 550 540, vilket kräver ett separeringsförfarande mellan den bundna och den fria fraktionen). Även om huvud- principerna för lösningsmedelsextraktion har varit välkända under lång tid, har användning av lösningsmedelsextraktion för denna separering ej kommit till användning för immuno- försöksteknik. Den huvudsakliga orsaken till detta ligger i den förväntade inverkan av lösningsmedel på den immuno- logiska reaktionen antingen genom skada, som förorsakas på 4 8005658-3 det specifika bindproteinet av lösningsmedlet eller genom drastiska förändringar, som förorsakas av lösningsmedlet i jämviktsreaktionen mellan antikropp och antigen vid tidpunkten för separeringen av den bundna och den fria fraktionen genom lösningsextraktionsförfarandet. Det är därför icke förvånande, att den omfattande litteraturen på detta område avseende immunoförsök ej rapporterar något lyckat exempel på användning av lösningsmedelsextraktions- teknik för separering av den bundna och den fria fraktißnen vid rutinimmunoförsöksteknik. Användningen av en sciptil- leringsvätska, som innehåller toluen, har föreslagits för extrahering av tritiumbetecknad aldosteron genom upprepade förfaranden för efterföljande mätning i scintillerings- räknaren, men detta komplicerade förfarande (J.P. Jowett et.al. Clinical Science and Molecular Medicine, 1973, sid. 607-623) har ej angivit någon möjlighet för allmän tillämpning. Det var därför oväntat, när det enligt före- liggande uppfinning visade sig, att enligt uppfinningen man genom användning av lämpligt lösningsmedel kunde åstadkomma ett generellt förfarande för separering av bundna och fria ligand i immunoförsök utan ofördelaktig påverkan av vare sig bindförmâgan nos det bindande proteiner eller jämvikten hos bindande proteinligand. Dessutom kan förfarandet enligt uppfinningen komma till vidsträckt allmän användning vid radioimmunoförsök liksom vid andra immunoförsök under användning av nonisotopa betecknande ämnen för märkning av de haptener, som skall analyseras. En av de fördelar som utmärker förfarandet enligt uppfinningen, är dess anpass- ningsbarhet och variationsmöjligheterna av utformandet av det vätske-vätskesystem, som kan utnyttjas för uppnäende av den önskade separeringen av fri och bunden ligand.

Förutom det vanliga vätske-vätskesystemet kan man tänka sig andra kombinationer, i vilka vätska-lösningsmedlet och/eller 8005658-3 7 det vattenhaltiga ämnet för den immunologiska reaktionen immobilïseras i en fast matris. Sålunda kan förfarandet tillämpas vid ett vätske-vätskesystem, fast ämne-vätske- system och t.o.m. med fast ämne-fast ämnesystem.

I ett vätska-vätskesystem kan den immunologiska reaktionen tillatas fortskrida på vanligt sätt i det vattenhaltiga mediet. Efter uppnående av jämvikt i reaktionen kan man tillsätta rätt mängd av ett lämpligt lösningsmedel och efter omsorgsfull blandning tillåts de* två faserna separera, varvid fri ligand överföres till det extraherande lösningsmedlet. Om man har använt en 3'-strålande radioisotop för haptenmärkning, försiggàr separeringen i zoner spontant och den bundna och/eller den fria fraktionen bestämmas utan verklig separering av den vattenhaltiga och den lösningsmedelshaltiga fasen till olika kärl. Detta är i och för sig en viktig fördel i synnerhet för märkta radioaktiva element, eftersom däri- genom minskas antalet förfarandesteg. Om det skulle anses önskvärt att åtskilja den vattenhaltiga och den lösnings- medelshaltiga fasen, kan detta genomföras med vilka som helst vanliga förfaranden omfattande användning av membransystem.

En annan utformning för separering av den fria fraktionen från den bundna fraktionen är att se i ett fast ämne-vätskesystem, i vilket vätskan hälles i en fast matris. När den immunologiska reaktionen har genom- förts på vanligt sätt i en vattenlösning och den erforder- liga inkubationstiden för uppnående av jämvikt har för- flutit, tillföres ett lämpligt lösningsmedel och bringas till intim kontakt med vattenbasen. Efter omsorgsfull blandning kan de två faserna (vattenhaltig och lösnings-_¿ medelshaltig) separeras och ett lämpligt hydrofobt men lösningsmedel adsorberande material i form av en remsa 8005658-3 eller med annan lämplig form, införes_i reaktionsbland- ningenf Adsorptionen av lösningsmedlet i det fasta materialet medför fri ligand. Bunden ligand i vatten- fasen och/eller fri ligand, som adsorberas med lösnings- medlet i den fasta fasen, kan mätas medelst en lämplig analysmetod, vilken väljes i överensstämmelse med typen av markeringsämne, som användes för märkning av hapten.

Vid en modifikation av den ovan angivna ut- föringsformen får vattenfasen av den immunologiska f reaktionen efter den erforderliga inkubationstiden passera genom en porös cell, t.ex. genom ett poröst spiralrör, som är omgivet av lösningsmedlet. Genom val av lämplig längd på spiralrör och lämpligt lösningsmedel kommer vid passerandet från rörets ena ände till dess andra all fri ligand att extraheras in i lösningsmedlet och att kvarlämna vattenfasen, som innehåller blott bunden ligand. Fri ligand, som extraherats in i lösnings- medelscellen och/eller bunden ligand, som införts i den vattenhaltiga fasen, kan bestämmas medelst ett lämpligt analyuförfaranuc, vilket skall väljas i överensstämmelse med det markcringsämne, som används för markering av hapten. Den beskrivna utföringsformen lämpar sig på utmärkt sätt för automatisering av hela förfarandet.

' En annan utföringsform är användningen av fast ämne-fast ämnesepareringssystem, medelst vilka erhålles ytterligare anpassningsbarhet och avsevärd förenkling genom att utforma föreliggande uppfinning med lösnings- medelsextraktion för separering av bunden och fri ligand i immunologiska reaktioner. I detta fall hålles de båda vätskorna (lösningsmedel och immunologiskt system) i två fasta matriser, som kan vara olika eller samma. En remsa_~ av lämpligt hydrofobt material kan exempelvis impregneras med det vattenhaltiga medlet i den immunologiska reaktionen 8005658-3 ooh bindemedel och ligand adsorberas i detta medel och får inkubera till jämvikt. En andra remsa av lämpligt hydrofobt material och impregnerat med lämpligt lösnings- medel föres till intim kontakt med den första hydrofila remsan. Tack vare denna fördelning av reaktionsämnena över den mycket stora ytan på de två remsorna blir extrak- tionen av fri ligand från de hydrofila remsorna till lösningsmedlet i den hydrofoba remsan mycket snabb och fullständig. Ãtskiljande av de två remsorna möjliggör J sedan bestämning av märkt hapten såväl i den bundna som den fria fraktionen. Denna utföringsform lämpar sig synnerligen väl för automatisering utan krav på kompli- cerad hjälputrustning.

En annan enkel utföringsform av fast ämne-fast ämneextraktionssystem för tillämpning vid föreliggande uppfinning består i framställningen av två tvinnade remsor, av vilka en är framställd av hydrofilt material och den andra av hydrofobt material. De vattenhaltiga immunologiska reagensämnena tillsättes den hydrofila delen av den tvinnade remsan. Efter den erforderliga inkubations- perioden tillsättes det extraherande lösningsmedlet till den hydrofila delen. Detta lösningsmedel kommer därvid att snabbt vandra över till den hydrofoba delen. Under denna vandring kommer lösningsmedlet att utöva sin extra- herande verkan och därvid medföra fri ligand till den hydrofoba delen. Särskiljandet av de två sammantvinnande remsorna möjliggör analys av bunden och/eller fri markerad ligand.

Förfarandet är även användbart för enzymimmuno- försök och är framför allt lämpligt, när markeringsämnet utgöres av en fluorosoent markering och mätningarna _ genomföras med en lämplig spektrometer. När markeringsämnet i serien utgöres av en gammastrålande radioisotop, t.ex. 8005658-3 10 jod 125 och den övre fasen utgöres av ett organiskt lösningsmedel, kommer vattenfasen efter lösningsmedlets extraktion att innehålla antíkropp-antigen-komplexet.

Sålunda kommer den nedre fasen att bestämmas av gamma- räknaren.

Förfarandet kan även användas vid de olika utrustningar, som är tillgängliga på marknaden för immunoförsök, vilket skall framgå av de försök, som skall beskrivas i vissa av exemplen.

Förfarandet enligt uppfinningen är även använd- bart vid separering av fritt antigen från bundet antigen- -antikropp-komplex, när det är fråga om proteiner, celler och andra föreningar med hög molekylvikt, om man använder två vattenlösligà men inbördes oförenliga polymerer för att åstadkomma oblandbarhet. Härigenom genereras två vattenfaser, mellan vilka olika ämnen kan fördelas. Ett sådant fenomen har beskrivits i litteraturen (P.A.

Albertson et.al., Nature, 184, 1465, 1959; G.Johanson etai., rurfJ. aint-tenn, vä, "fi-a, 1915). oföreniiga par av polymerer finns det gott om (se t.ex. A. Dobry et.al., J. Polym., Soi 2, 90, 1947). Förfarandet enligt upp- finningen är tekniskt enkelt, går snabbt att genomföra och är föga kostnadskrävande och bör anses som ett ideellt förfarande inom immunoförsökstekniken. För att understryka det länge kända behovet av den ovan beskrivna tekniken, skall det påpekas, att från en välkänd fackbok "Principles of competitive protein-binding assays" (W.D. Odell and W.H. Daughaday, Editors), J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Toronto, 1971, Chapter XI, page 303:"That fact that so many different separation techniques have been proposed is indication of some díssatisfaction with existing methodsfii Det är uppenbart att tekniken enligt föreliggande uppfinning kommer närmare de krav, som kan ställas på ett 8005658-3 11 ideellt förfarande, än något av de tidigare kända förfarandena.

Förfarandet är användbart vid det specifika bindningsförsöksförfarandet för bestämning av små koncentrationer av kemiska ämnen i biologiska fluider.

Från den kända nomenklaturen för dessa kemiska ämnen kan följande grupper tänkas komma att behöva analyseras: Alkaloider, t.ex.: morfin, kodein, dihydrokodein, heroin, oximorphon, metopon, folkodin osv. * Barbiturater, t.ex.: veronal, luminal, sekonal, fenobarbital, barbital osv.

Steroider, östrogener, t.ex.: ÄB-estradiol, estron, estriol, 17åßetiny1, estradiol osv. androgen, progestogener, adrenokortiala hormoner osv.

Kannabinioder och deras metaboliter.

Vitaminer, t.ex.: karoten, riboflavin, tiamin, niacin, askorbinsyra, tocoferol, fytyl-1,4- -naftokinon osv.

Aminosyror och polypeptider.

Sockerarter, omfattande sackarider och polysackarider.

Lugnande medel, t.ex. meprobamat, Valium, oxazepam, fenotiaziner osv.

' Förutom dc ovan nämnda haptenerna kan andra olika föreningar såsom kokain, prostaglandin, antibiotika, t.ex. penicillin, kloromycetin, aktinomycetin samt nuklein- syror och nukleotider; insekticider, fungicider, bakteriocider och nematocider, t.ex. malation, karbamater osv. prövas med förfarandet enligt föreliggande uppfinning. Helt generellt kan antigener, haptener och deras antikroppar, hormoner, vitaminer, narkotika, %etaboliter, samt deras receptorer_' och bindematerial bestämmas under utnyttjande av förfarandet enligt föreliggande uppfinning. 8005658-3 12 Bland speciella beståndsdelar, som kan bestämmas, må följande nämnas: Kompenserad T4; T5~upptagning; Kortisol; Insulin; Digoxin; Triidotyronin; Foiat; myroxin (Total T4); h G H; T S H; De organiska lösningsmedel, som lämpar sig att använda enligt föreliggande uppfinning, måste uppfylla J följande krav: a) Medlet skall vara något blandbart med vatten eller fullständigt oblandbart med vatten. b) Medlet måste uppvisa betydande-selektiv extraktions- förmåga gentemot antigen. c) Medlet får ej utöva någon speciell inverkan på någon beståndsdel i systemet. _ Organiska lösningsmedel för extraktion av antigen som sådan förefínnes i stort antal men de flesta av åem är mindre lämpliga för utövande av föreliggande uppfinning.

Sålunda kan nâgra organiska lösningsmedel, som är full- ständigt eller i hög grad blandbara med vatten, ej komma till användning, t.ex. etanol, aceton osv. Emellertid är - förefintlig litteratur rikhaltig och anger ett stort antal organiska lösningsmedel, som faktiskt företer ovan angivna kriteria. Vanligen skall de organiska lösningsmedlen väljas bland kolväten, halogenkolväten, syrederivat av kolväten, kvävederivat av kolväten, fosforderivat av kolväten, där kolvätedelen kan variera från G5 - C20. Typiska exempel på sådana organiska lösningsmedel är metylisobutylkeon, kloroform, diklormetan, koltetraklorid, t-amylalkohol, bensylalkohol, etylacetat, tertbutylmetyleter, hexan, heptan, isooktan osv. Valet av lämpligt lösningsmedel för varje system bestämmas genom att man genomför ett enkelt försök för varje 8005658-5 13 fall på i det följande förklarat sätt. _ I nedanstående tabell 1 anges data för användbara lösningsmedel med avseende på de ovan angivna kriteria vid ett försök för val av lämpligt lösningsmedel för estriol. 1251 estriol valdes som ligand och undersöktes med avseende på sin extraktion i närvaro av 250 ng/ml omarkerad estriol och utan sådan.

Tabell 1 % % - N . Extraherad estriol Löslighet Losnlngsmedel Sökare blott med 250 ng/ml i vatten Metyl isobutylketon 91-94 90-94 1,9 Etylacetat 90-94 90-92 3,3 TOluen _ ' vs Trietyl-amin 86-91 86-90 1,5 Bensylklorid 78-80 76-78 0,05 Tert-amyl 78-82 80-85 12,5 (separerad alkohol l först efter_ , U centrifugering) Kloroform 52-55 55-54 1,01 Diklorometan 45-47 52-51 2 Koltetra- 55-58 58-40 0,08 klorid' Separeringsförfarandet enligt uppfinningen skall i'det följande åskådliggöras med estriol digoxin och T-4 använda som lígand och de erhållna resultaten jämfördes med kromatografiska kolonn- eller utfällningsförfaranden.

Exempel 1 - Lösningsmedelsextraktionsförfarande för digoxin RIA Material och förfaranden Efter inkubationstiden tillsattes en lämplig mängd av lösningsmedel till varje provrör (polypropen), varefter provrören tillslöts och centrifugerades i 30 sek. (ellerd skakades alla provrör tillsammans kraftigt genom att vändas i två minuter). Samtliga provrör fick stå i några minuter 8005658-3 14 (5-10 min.) och halva mängden av lösningsmedelssystemet (eller vattensystemet) överfördes till nya provrör för räkning. _ Försök har även genomförts för undvikande av den "fysiska" separeringen (överföring av en bestämd volym efter fasseparering).

Ett kopparavskärmat pumplopp användes för att skydda den övre fasen (vanligen lösningsmedlet) och varje provrör infördes i gammaräknaren, så att blott den nedre delen av provröret (som innehöll den vatten- haltiga fasen med den bundna fraktionen) kunde räknas.

Digoxinutrustningskomponenterna rekonstituerades enligt bruksanvisningen för utrustningen- Reaktionsblandningen innehöll 200,uJ antiserum (sats m- 9002), 4001111 1251 aigoxinaerivat (sats nr 9007), 100,ul Standard (sats 9902) eller kontrollserum (DADE 5-nivåkontrollsera). Alla utrustningskomponenterna innehöll EDTA-fosfatbuffert (pH 7,4 i 0,1). Reaktionen genomfördes under 50 minuter vid rumstemperatur och 2 ml metylisobutyl- keton tillsattes till varje provrör och eentrifugerades i 30 sek. Separeringen åstadkoms på 5-10 minuter och vattenfasen räknades på en GAMMACORD Ii under användning av ett av- . skärmat pumplopp (15 mm mellanrum).

Resultat och slutsatser g På bifogad ritning visas 1 fig. 1 den erhållna standardkurvan, vilken inprickats som logit bunden/total (B/T) mot log Digoxinkoncentration. Total delta-% retention (lutningen mellan 0,54 och 4,6 ng/ml) uppgår till 50%. Kontrollserumvärdena (fig. 1) anger god sam- verkan med kommersiellt tillgängliga utrustningar för digoxinbestämning. i Ä Fig. 2 visar en jämförelse mellan lösninga- medelsextraktion och kromatografrörmetoden. 8005658-3 15 Exempel 2 - Lösningsmedelsextraktionsförfarande för T-4 RIA (T=t1roxin) Material och förfarande 1251-T-4 sats nr 0047, som innehöll 3 mg/ml 8-anilin-naftalen-sulfonsyra (ANS) i tris-maleatbuffert med pH 7,3 E 0,1 (tris 1,47 g, maleinsyra 0,62 g. Disodium EMA 0,22 g) i 150 mi aubbeiaestiiierat vatten.

Antiserum, sats nr 0007, rekonstituerades med; samma buffert. T-4 standard som framställts i buffrad lösning, varvid reaktionsblandningen innehöll 200,ud rekonstituerad 1251-T-4, 50«ul standard eller serumprover och 400xul antiserum inkuberades i 30 min. vid rumstemperatur.

Tre kontrollsera,(TRl-Rao - sats nr RCS-16), nivå I, nivå IJ och nivå II] prövades även med standardkurvan.

Efter inkubationen tillsattes 200Ahl mättad lösning av (NH4)2SO4 och 1 ml tertamylalkohol till varje provrör. Alla provrör tillslöts och roterades (uppochned- vändes) under 2 min. Vattenfasen räknades på GAMMACORD Il (Ef-räknare) under användning av avskärmat pumplopp (någon fysikalisk separering erfordrades ej).

Resultat och slutsatser _ Resultaten beräknades som procent bundet gentemot bundet noll (B/Bo) och återges på den bifogade kurvan (fig. 5). Kontroliseravärden beräknades likaledes och åskádliggjordes. Dessa värden jämfördes med de värden vilka erhölls med Ames T-4 utrustning (Tetralute och Seralute T-4 RIA).

Av de erhållna resultaten framgår det, att lut- ningen mellan 1 - 5 meg/di standard och 24 mcd/dl standard uppgår till 45%.

Kontrollseravärdena överensstämmer väl med de värden, som kunde erhållas med kommersiell utrustning.

Detta innebär, att systemet kan skilja mellan normala och hypertyroida och hypotyroida värden. 8005658-3 16 Exempel 5 - Lösningsmede]sextraktionsförfarande för estriol RIA Material och förfarande Buffert: Estríol RIA system genomfördes i EDTA fosfatbuffert (0,01 M, pH 7,4).

Antisera: Två olika källor för antisera kom till _ användning. t 1) antiserum, som producerats av kaniner, vilka injioerats med Estriol 6-O karboximetyl BSA (R-68, levererat av Ames Yissum Research Laboratories och använt som råantiserum). 2) antïsera, vilka producerats av kaniner, som injicerats med Estriol-3-OBSA (R-63, R-64, R-65, som framställts vid Technion, Haifa, och använt som renad immunoglobulin) 56% ammoniumsulfatutfällning. Östrogensgårämnen 135lTEstríol framställt vid Ames Yissum Laboratories, jfl Estriol, som levereras från New England Nuclear (N.I~;.N.) (511 Estrou och än Estraaioi, som också erhållits från N.E.N. Östrogen och östrogenderivat Estriol (Merck), Estradiol (Sigma), Estrone (Sigma). Estriol-3-O karboximetyl (framställt vid Tecynion).

A. Bestämning av standardkurva 100/ul av spårämnet i EDTA fosfatbuffert (som innehåller 0,2% polyvinylalkohol, P.V.A.), 200;u1 'Estriol standard (i samma buffert) och 100,01 antiserum (under användning av lämpligt utspädningsmedel) inkube- - rades under 60-90 min. vid rumstemperatur. Efter inkuba- tionstiden separerades bunden Estriol från fri under användning av olika separeringsförfaranden och man bestämde 8005658-3 17 radioaktiviteuen hos de fria fraktionerna. Standardkurvan inpriokades som fri gentemot log för estriolkoncentrationen (ng/ml).

B. Separeringsförfaranden 1. sephadex koionn - neaktionsblandning (zoom) anbragtes ovanpå en G-10 Sephadex kolonn och fick tränga in i kolonnen. Kolonnerna sköljdes därefter med 3 ml EDTA fosfatbuffert för avlägsnande av den bundna fraktionen. 2. Lösningsmedelsextraktion 4 Efter inkubationen extraherades 200,ul av reaktionsblandningen med 400,ul lösningsmedel (se resul- taten) genom centrifugering 30 sek. (under användning av polypropen, tillslutna provrör). Efter fassepareringen överfördes 200¿nl av lösningsmedlet till provrören och räknades.

Resultat och slutsatser Lösningsmedelsextraktionsförfarandets resultat beräknades som % fri i förhållande till log estriolkon- centration och åskådliggöres i fig. 4. Dessa värden jämfördes med de resultat, som erhölls vid separeringen av de bundna och fria fraktionerna i Sephadexkolonnen.

Såsom framgår av denna jämförelse kan lösningsmedelsextrak- tionsförfarandet med RIA användas för bestämning av estriol i biologiska fluider.

Emempel 4 - Lösningsmedelsextraktionsförfarande för Digoxin RIA Ett försök liknande det enligt exempel 1 genom- fördes med den på marknaden tillgängliga digoxin RIA-utrust- ningen, vilken levererades av Becton Dickinson. Alla komponenterna i utrustningen användes oförändrade med undantag för 1251-digoxin-sökaren, vilken var special- preparerad för detta försök av Becton Dickinsons forsk- ningslaboratorium, så att den lämpliga mängden radioaktivitet fanns i 0,1 ml portioner i stället för i de 1 ml portioner, som levereras med origínalutrustningen. 8005658-5 18 DADE kontrollsera (I, II, IV) rekonstituerades och prövades tillsammans med utrustningen enligt den till utrustningen hörande bruksanvisningen. Efter den föreskrivna inkubationstiden tillsattes 1,0 ml t-amyl- alkohol till varje rör, centrífugerades för extrahering av fri digoxin, och efter fassepareringen överfördes 150«ul av vattenfasen för radioaktivitetsräkning. De erhållna resultaten på standardkurvan (uttryckt som % B/Bo) samt resultaten för kontrollsera (uttryckt som % J B/Bo och mg digoxin/ml) har sammanförts i nedanstående tabell 2.

Tabell 2 Digoxin B/Bo DADA Kontrollsera (ng/ml) (%) ' %B/Bo ng/ml Digoxin Funnet Förväntat 0,5 74,0 Nivå l 61,1 0,72 0,71-1,06 1,0 49,0 1,5 55,0 Nivå Il 32,3 1,78 1,55-2,17 2,0 27,5 3,0 20,0 Nivå III 20,2 2,90 2,64-3,49 5,0 12,0 Exempel 5 - Lösningsmedelsextraktíonsförfarande för RIA- -Estradiol 17Ã En på marknaden tillgänglig (5H) RIA utrustning för estradiol, som levereras av Isopac prövades medelst lösningsmedelextraktionsförfarandet på följande sätt.

Alla komponenter till utrustningen förbereddes enligt bruksanvisningen för utrustningen. Ett experiment (A) genomfördes exakt enligt utrustningsprotokollet. Ett andra parallellt experiment (B) utfördes enligt utrust- ningsprotokollet ända till och omfattande inkubationen.

Efter inkubationstiden vid försök B tillsattes 1,6 ml 8005658-3 19 löoniugsmedel (en 1:1 blandning av tertamylalkohol och tertbutvlmetyleter, som mättats i förväg med försöks- bufferten) till alla rören och centrifugerades i 20 sek. Efter fassepareringen (efter ca 10 min.) över- fördes den övre lösningsmedelsfasen, som innehöll fri estradiol till scintillationsampuller, till vilka sattes ä ml scintillationsvätska (Instágel II, Packard) och radioaktiviteten bestämdes. Nedanstående tabell 3 visar resultaten, vilka beräknades som % B/Bo för de två parallella experimenten. Vid inprickningen i en logit-log kurva enligt utrustningens instruktioner erhölls en lineär .i kurva för båda försöken men resultaten från resultatet B (under användning av förfarandet för lösningsmedelsextrak- tion) företer en brantare standardkurva och möjliggör 0 sålunda en känsligare prövning.

Tabell_ä Estradiol % B/Bo ' % B/Bo standard försök A (utrustning) Försök B (lösningsmedels- g/mi extraktion) 12,b~ 9u,0 98,0 25,0 H9,0 89,0 50,0 235,0 76,0 100,0 99,0 40,0 200,0 40,0 25,0 400,0 21,0 14,0 Exempel 6 - Lösningsmedelsextraktionsförfarande för RIA fenobarbiton Komponenterna, som användes för RIA fenobarbiton, utgjordes av en (jfl) fenobarbitonsökare (N.E.N.), ett fenobarbitonantiserum-R-66X (Technion) och tris-maleat-för- söksbuffert (pH 7,3, 0,078 M Tris, 0,035 M maleinsyra), som innehöll 0,1 % PVP (polyvinylpyrrolidon). 8005658-3 zo Sökaren, 1OOAul (ca 10 nono Ci/rör) tillsattes till provrören och därefter tillsattes 5011 fenobarbiton standard och 1004ul utspätt antiserum. Alla provrör inkuberades under natten vid 406. Efter inkubationen tillsattes 0,5 ml lösningsmedel (tertbutylmetyleter, mans vid ett försök een MIBK vid ett peralieliföreök) till varje försöksrör och centrifugerades i 20-30 sek.

Efter fasseparering genom stillastående överfördes vattenfasen till scintilleringsampuller för bestämning 2 av radioaktivitet. Nedanstående tabell 4 summerar genom- snittsvärdena (av duplikat) uttryckt som % B/Bo.

Tabell 4 Fenobarbiton _ ' % B/Bo standard ' TBME MIBK ng/ml (tertbutylmetyleter) (metylisobutylketon) 5 96,5 73,0 10 7910 63,0 25 52,0 45,0 50 50,0 30,0 100 _ 25,0 19,0 Exempel 7 - Lösningsmedelsextraktionsförfarande för , RIA-THC Ett försök under användning av lösningsmedels- extraktionsförfarandet utvecklades för tetrahydrokannabiol (THC) metaboliter under användning av en (3H)-THC sökare (Amersham). Alla försökskomponenterna preparerades i tris-maleatbuffert (pH 7,3), som innehöll 0,2% PVP och 0,196 triten x45o. (am-Tao ezskeren, 100111, blandades med 5OAhl THC standard och 100.hl utspätt anti-THC-antiserum,_ R-41Va (preparerad vid Technion) och inkuberad över natt 6 vid 400. Tre försök genomfördes parallellt. Vid ett försök genomfördes separering av den fria och den bundna fraktionen 8005658-3 21 medelst det dextranbelagda träkolsförfarandet och vid de två andïa försöken användes 1ösningsmedelsextraktionsför- farandet, med tevamylalkohol vid det ena och MBK vid det andra. Lösningsmedlet, 500uMl, tillsattes till provrören och centrifugerades under 20-50 sek. Efter fassepareringen (10-20 min.) överfördes 150,u1 av vattenfasen till scintilleringsampuller för bestämning av radioaktiviteten.

I nedanstående tabell summeras resultaten, uttryckta som % B/Bo för de tre försöken. z 2ÉÉÉÄÄ_â % B/30 THC standard t-amylalkohol MIBK Träkol ng/ml _ 9Ü '98 98 2 86 84 - 4 77 68 86 TÛ 36 50 55 2Û 15 18 32 40 6 8 21

Claims (9)

8005658-3 ll P A T E N T K R Å V

1. Radio- och metallimmunanalysförfarande för specifik bindningsanalys för analysering av ett vätskeprov med avseende på en ligand, varvid man genomför följande steg: a) nämnda prov bringas till kontakt med ett reagensmedel, i vilket ingår dels en markeringsbeståndsdel, bestående av ett konjugat av en märksubstans och ligand, dels en bindnbngskomponent, företrädesvis en antikropp, vilket reagensmedel tillsammans med den ligand, som skall bestäm- mas, bildar ett bindningsreaktionssystem, där markerings- beståndsdelen fördelas i en bunden fraktion och en fri fraktion, varvid den mängd märksubstans, som erhålles i den bundna fraktionen är en funktion av den mängd ligand, vilken är närvarande i vätskan; b) den bundna fraktionen separeras från den fria fraktionen och c) mängden märksubstans antingen i den bundna eller den fria fraktionen bestämmes; k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att separeringen av den bundna fraktionen från den fria fraktionen genomföres medelst lösningsmedelsextraktion under användning av ett organiskt lösningsmedel, som är något blandbart med vatten eller helt oblandbart med vatten och som har egenskapen att selektivt extrahera fri markeringsbeståndsdel i form av märkt antigen, varvid den bundna och/eller fria fraktionen analyseras utan faktisk separering mellan faserna in i olika kärl, eller kan en faktisk separation av de båda faserna genomföras genom att endera fasen immobiliseras i en härför särskilt ägnad fast matris eller båda faserna immobiliseras i fasta matriser, som bringas i nära kontakt med varandra. 8005658-3 23

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att efter det att jämvikten uppnåtts mellan de tvâ vätskefaserna tillföres ett hydrofobt och lösningsmedlet adsor- berande, fast material och att lösningsmedlet, innehållande fri ligand, absorberas på detta material.

3. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d ä r a v, att det organiska lösningsmedlet väljes ur den grupp, som består av kolväten, halogenerade kolvätení syrederivat av kolväten, kvävederivat av kolväten samt fosfor- derivat av kolväten, där kolvätedelen utgör mellan C3 - C20.

4. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t .d á r a v, att ligand utgöres av digoxin.

5. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d a r a v, att ligand utgöres av Estriol.

6. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d ä r a v, att ligand utgöres av Tyroxin (T-4).

7. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d ä r a v, att ligand utgöres av Estradiol 17/9;

8. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d ä r a v, att ligand utgöres av fenobarbiton.

9. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k- n a t d ä r a v, att ligand utgöres av tetrahydrokannabinol.