NL8004290A

NL8004290A - Werkwijze voor een immunoproef-techniek.

Info

Publication number: NL8004290A
Application number: NL8004290A
Authority: NL
Original assignee: Technion Res & Dev Foundation
Priority date: 1979-03-11
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1982-02-16
Also published as: GB2103790B; SE442785B; FR2451582B1; JPS55160855A; DE3009154A1; US4645747A; CA1140463A; GB2103790A; SE8005658L; IL56839A0; FR2451582A1

Description

i rv , H.o. 29.305 < Werkwijze voor een immuno-proef-techniek.

De uitvinding heeft betrekking op een immunoproef-techniek en in het bijzonder op een eenvoudige, nauwkeurige en doelmatige werkwijze, welke kan worden toegepast bij specifieke bindingsproeven voor het scheiden van het vrije 5 ligand van het aan het anti-lichaam gebonden ligand.

Zoals bekend zijn specifieke bindingsproeven gebaseerd op het principe van het met behulp van een gemerkte component volgen van specifieke bindingsreacties, waarbij de mate van binding afhankelijk is van het onbekende aanwezi-10 ge ligand. Van de bekende methoden kunnen de volgende vijf specifieke bindingsproeven worden genoemd: radioimmunoassay (ΒΙΑ), metalloimmunoassay (MIA), free radical assay technique (FEAT), hemaglutination inhibition (HI) en enzyme multiplied immonoassay technique (EMIT). Bij de 15 eerste twee technieken laat men zich een evenwicht instellen in het mengsel van het ongemerkte ligand; gemerkte ligand en anti-lichaam en het aan het anti-lichaam gebonden ligand wordt afgescheiden van het vrije ligand. Bij de radioimmunoassay wordt het ligand gemerkt met een radio-20 actieve isotoop, terwijl bij de metalloimmunoassay het ligand wordt gemerkt met een metaal bevattend reagens dat tevens een geschikte functionele groep bevat, met behulp waarvan het metaal bevattende reagens kan worden gebonden aan het te onderzoeken hapteen. Een volledige beschrijving 25 hiervan wordt gegeven in het Britse octrooischrift 1.550.54-0.

De werkwijze voor het afscheiden van de vrije van de gebonden fractie is van groot belang en de nauwkeurigheid ervan bepaalt de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de ge-30 hele specifieke bindingsproef. Bij het bepalen van een geschikte werkwijze voor het afscheiden dienen de kriteria te worden beschouwd waaraan moet worden voldaan om het gewenste resultaat te verkrijgen. De volgende belangrijke vereisten voor een ideale scheiding kunnen worden genoemd: 35 (a) Een volledige scheiding van de gebonden en de vrije fractie moet plaats vinden binnen een brede foutenmarge onder de voor de scheiding toegepaste omstandigheden. Dit .· houdt in dat de methode de primaire bin- 800 42 90

* V

2 •f ' dingsreactie niet mag storen.

(b) Het voorschrift moet eenvoudig, snel en goedkoop zijn en er moeten bekende reagentia en beschikbare apparatuur kunnen worden gebruikt.

5 (c) De proef moet niet nadelig vrorden beïnvloed door het gebruikte ligand omdat anders moeilijkheden worden ondervonden bij de standarisering.

Een aantal scheidingswerkwijzen zijn bekend en in het onderstaande wordt daarvan een korte beschrijving gegeven: 10 - Adsorptiemethoden. Meestal wordt de vrije fractie gead sorbeerd; de adsorptiemiddelen worden gewoonlijk gebruikt voor kleine peptiden, steroid-en thyroid-hormonen. De adsorptie wordt door veel factoren bepaald, zoals het relatieve oppervlak van het adsorptiemiddel, grootte en lading 15 van het antigen, aard en concentratie van de concurrerende proteïnen, temperatuur, ionensterkte en pH. Het is noodzakelijk dat de omstandigheden voor de toepassing van de adsorptiemethoden voor elk antigen experimenteel worden geoptimaliseerd. Voorbeelden van de meestal gebruikte adsorp-20 tiemiddelen zijn kool en silicaten. Het probleem is dat kool altijd een hoeveelheid niet-geactiveerd materiaal bevat, dat in sterke mate niet-specifiek is met betrekking tot het binden van een groot aantal stoffen, zodat zowel de gebonden als de vrije fractie kan worden geadsorbeerd. Bo-25 vendien kan kool het gebonden antigen verwijderen, in het bijzonder wanneer een bindingsmiddel met een geringe bin-dingsbereidheid wordt gebruikt. Het nadeel van silicaten is dat de adsorptie afhankelijk is van het aanwezige proteïne, zodat de optimale relatieve hoeveelheden adsorptie-30 middel en serum voor elk antigen experimenteel moeten worden bepaald.

- G-efractioneerde precipitatie met neutrale zouten of organische oplosmiddelen, waarbij de vrije fractie in oplossing wordt gelaten. De krachten die dit effect bepalen 35 zijn in sterke mate elektrostatisch en kunnen door veel factoren worden beïnvloed, zoals temperatuur, pH, pro-teïne-concentratie en dielektrische constante van het medium. Optimale omstandigheden moeten experimenteel worden vastgesteld, waarbij moet worden gelet op de volgende pa-40 rameters: pH, buffer-, proteïne- en zout-concentratie. De 800 4 2 90 4 + 5 \ < toepasbaarheid -van deze eenvoudige precipitaties is in hoofdzaak afhankelijk van de eigenschappen van het vrije antigen. Ammoniumsulfaat is met succes gebruikt bij proeven met plasma- en urine-extract voor veel kleine peptiden.

5 Ethanol heeft misschien een groter toepassingsgebied omdat het geschikt is voor veel peptiden. Polyethyleenglycol blijkt te voldoen voor insuline-proeven en kan worden gebruikt voor de precipitatie van peptide-hormonen die niet worden gebonden aan gebruikelijke adsorptiemiddelen. Alle 10 in deze alinea beschreven methoden hebben het nadeel dat ten minste eenmaal moet worden gecentrifugeerd.

- Gel-filtratie.'Omdat gebonden complexen een aanzienlijk groter moleculair volume hebben dan de vrije antigenen kunnen ze worden afgescheiden met behulp van een geschikte 15 gel zoals Sephadex. De gel wordt op twee manieren voor fase-scheiding gebruikt; het geïncubeerde materiaal kan onder geschikte omstandigheden door een kolom worden geleid zodat het gebonden deel wordt geelueerd waarbij het vrije deel in de gel achterblijft. Een tweede, vaak toegepaste werkwijze 20 bij bindingstëchnieken voor concurrerende proteïnen is een methode waarbij wordt gebruik gemaakt van een gel-evenwicht. Het gel is tijdens de gehele incubatie aanwezig en kan te voren in evenwicht worden gebracht met de merker ("tracer") bevattende bindingsoplossing. Het vrije deel in de poriën 25 van de gel is dus in evenwicht met het deel er buiten. Wanneer het te onderzoeken monster wordt toegevoegd aan de gelsuspensie, dan wordt het evenwicht snel opnieuw ingesteld omdat de binding van de merker met de gel omkeerbaar is. Nadat de geldeeltjes zich hebben afgezet kan een mon-30 ster van de bovenstaande vloeistoflaag, dat de gebonden fractie bevat, worden verwijderd en geteld.

- Papier-chromatoelektroforese. Er wordt een geschikte papiersoort gekozen, die het vrije hapteen adsorbeert op de plaats waar het wordt toegepast, terwijl de gebonden frac- 35 tie vanaf de oorsprong beweegt onder invloed van een elektrische stroom en een door verdamping tot stand gebrachte bufferstroom. Het nadeel van deze methode is dat deze te ingewikkeld, te veel tijd vergend en te duur is om te kunnen worden gebruikt als een routine-proef en zich ook niet 40 makkelijk leent tot automatisering. Bovendien variëren de 800 42 90 > % 4 • affiniteitseigenschappen van de papiersoorten en antigenen waardoor reproduceerbaarheid moeilijk wordt.

Met het oog op de nadelen van de bovenbeschreven bekende werkwijzen blijkt er sterke behoefte te bestaan aan 5 een verbeterde werkwijze voor het afscheiden van de vrije fractie van de gebonden fractie bij de specifieke bindings-proef. De uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor een specifieke immuno-proef voor het bepalen van een ligand in een medium, waarbij deze werkwijze de volgende 10 trappen omvat: (a) Het in aanraking brengen van het medium met reagens, dat een gemerkt bestanddeel bevat, bestaande uit een conjugaat van een merkstof en een bindingscomponent, en die met het te bepalen ligand een bindingsreactie-15 systeem vormt'.waarbij een gebonden fractie en een vrije fractie van het gemerkte bestanddeel wordt verkregen, waarbij de hoeveelheid merkstof in de gebonden fractie afhankelijk is van de hoeveelheid in het vloeibare medium gebonden ligand, 20 (b) het afscheiden van de gebonden fractie van de vrije fractie; en (c) het bepalen van de hoeveelheid merkstof in de gebonden fractie of de vrije fractie, gekenmerkt doordat het afscheiden van de gebonden fractie 25 van de vrije fractie wordt uitgevoerd door oplosmiddel-extractie met behulp van een organisch, met water niet-mengbaar oplosmiddel, dat de eigenschap bezit het evenwicht tussen de vrije fractie en de gebonden fractie te bevriezen. Deze werkwijze kan worden toegepast voor elke 30 immunoproef (bijvoorbeeld radioimmunoassay, free radical assay en metalloimmunoassay, welke zijn beschreven in het Britse octrooischrift 1.550-54-0), waarbij een scheiding moet plaatsvinden tussen de gebonden en de vrije fractie. Zelfs hoewel de algemene principes van oplosmiddel-extrac-35 tie reeds zeer lang bekend zijn is de toepassing van op-losmiddel-extractie voor deze scheiding niet gebruikt bij immunoproef-technieken. De belangrijkste reden hiervan ligt in de verwachte nadelige invloed van het oplosmiddel op de immunologische reactie, ofwel door beschadiging van 40 het specifieke bindende proteïne door het oplosmiddel of- 800 4 2 90 * i 5 wel door door het oplosmiddel veroorzaakte drastische veranderingen in de antilichaam-antigen evenwichtsreactie tijdens het afscheiden van de gebonden en de vrije fracties door oplosniddel-extractie. Het is derhalve niet verrassend 5 dat de uitgebreide literatuur over immunoproef-technieken geen enkel succesvol voorbeeld geeft van het toepassen van oplosmiddel-extractie-technieken voor het afscheiden van gebonden en vrije fracties bij technieken voor routine-immunoproeven. Het gebruik van een tolueen bevattende 10 scintillatie-vloeistof is voorgesteld voor het herhaald extraheren van met tritium gemerkt aldosteron, waarbij later in de scintillatie-teller wordt gemeten, maar het beschreven, moeilijk te hanteren voorschrift (J.P. Jowett c.s., Clinical Science and Molecular Medicine, 1975? biz.

15 607-623) geeft geen enkele mogelijkheid van algemene toe pasbaarheid aan. Het was derhalve verrassend en onverwacht toen volgens de onderhavige uitvinding werd gevonden dat door toepassing van een geschikt oplosmiddel en geschikte omstandigheden een algemene werkwijze kon worden verschaft 20 voor het afscheiden van de gebonden en vrije liganden bij immuno-proeven zonder het bindingsvermogen van het bindende proteïne of het evenwicht tussen het bindende proteïne en het ligand nadelig te beïnvloeden. Bovendien kan de werkwijze volgens de uitvinding op grote schaal en algemeen 25 worden toegepast voor radioimmunoproef-systemen alsmede voor andere immuno-proeven waarbij geen isotopen bevattende merkstoffen worden gebruikt voor het merken van de te analyseren haptenen. Een van de kenmerkende voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding is de veelzijdigheid ervan 30 en de veelzijdigheid van de configuraties van de vloeistof-vloeistof-systemen die kunnen worden toegepast ter verkrijging van de gewenste scheiding van het gebonden ligand.

Naast de gebruikelijke vloeistof-vloeistof-systemen kunnen verschillende configuraties worden toegepast waarbij het 35 vloeistof-oplosmiddel en/of het water bevattende medium van de immunologische reactie worden geïmmobiliseerd in een vaste matrix. De werkwijze zou dus kunnen worden toegepast in een vloeistof-vloeistof-systeem, een vaste stof-vloei-stof-systeem en zelfs in een vaste stof-vaste stof systeem.

40 In een vloeistof-vloeistof-systeem zal men de immuno- 800 42 90 » w 6 logische reactie op de gebruikelijke wijze in het water bevattende medium laten verlopen. Na instellen van het reac-tie-evenwicht wordt een geschikte hoeveelheid van een geschikt oplosmiddel toegevoegd en na grondig mengen laat men 5 de twee fasen scheiden, waarbij het vrije ligand is overgegaan in het extractie-oplosmiddel. Wanneer voor het merken van het hapteen een /-straling uitzendende radio-isotoop is gebruikt, dan vindt de scheiding in zones spontaan plaats, waarbij de gebonden en/of de vrije fractie 10 wordt bepaald zonder feitelijke scheiding van de water bevattende fase en de oplosmiddel-fase in verschillende vaten. Dit is op zichzelf een belangrijk voordeel, in het bijzonder voor gemerkte radioactieve elementen, omdat het aantal werkwijze-trappen erdoor wordt verminderd. Indien het wense-15 lijk wordt geacht de water- en oplosmiddel-fase te scheiden, dan kan dit volgens elk gebruikelijk voorschrift worden gedaan, met inbegrip van de toepassing van membraan-systemen.

Een volgende uitvoeringsvorm voor het afscheiden van de vrije fractie van de gebonden fractie is een vaste stof-20 vloeistof-systeem, waarbij de vloeistof in een vaste matrix wordt gehouden. Nadat de immunologische reactie op de gebruikelijke wijze in een water bevattende oplossing is uitgevoerd en de vereiste incubatie-periode voor het instellen van een evenwicht is verstreken, wordt een geschikt 25 oplosmiddel toegevoegd en in innige aanraking met de water bevattende fase gebracht. Na grondig mengen laat men de twee fasen (water- en oplosmiddelfase) scheiden en een geschikt hydrofoob, maar oplosmiddel adsorberend materiaal in de vorm van een strook of in een andere geschikte vorm 30 wordt in het reactiemengsel gebracht. Het vrije ligand in het oplosmiddel wordt aan het vaste materiaal geadsorbeerd. Het gebonden ligand in de waterfase en/of het met het oplosmiddel op de vaste fase geadsorbeerde vrije ligand kunnen worden gemeten volgens een geschikte analyse-35 methode, die afhankelijk van de aard van het voor het merken van het hapteen gebruikte middel wordt gekozen.

Volgens een variatie van de bovenbeschreven uitvoeringsvorm wordt de waterfase van de immunologische reactie na de noodzakelijke incubatie-periode door een poreuze cel 4-0 geleid, zoals bijvoorbeeld door een poreuze spiraalvormige 800 4290 # *· 7 tiuis, die is omgeven door het oplosmiddel. Door het kiezen van de geschikte lengte van de spiraalvormige buis en het geschikte oplosmiddel wordt bij het doorleiden van het ene eind van de buis naar het andere eind de totale hoeveelheid 5 vrij ligand in het oplosmiddel geëxtraheerd, waarbij de waterfase enkel het gebonden ligand bevat. Het in de oplosmid-delcel geëxtraheerde vrije ligand en/of het in de waterfase aanwezige gebonden ligand kunnen worden bepaald volgens een geschikte analysemethode, die afhankelijk van het voor het 10 merken van het hapteen gebruikte middel wordt gekozen. De bovenbeschreven uitvoeringsvorm is in hoge mate geschikt voor het automatiseren van de gehele werkwijze.

Een verdere uitvoeringsvorm betreft de toepassing van vaste stof-vaste stof-scheidingssystemen, waarbij volgens 15 de uitvinding een zeer veelzijdige en eenvoudige werkwijze wordt toegepast voor oplosmiddelextractie voor het scheiden van gebonden en vrije liganden bij immunologische reacties.

In dit geval worden de beide vloeistoffen (oplosmiddel en immunologisch systeem) in twee vaste matrices, die gelijk 20 of verschillend kunnen zijn, gehouden. Een strook ge schikt hydrofiel materiaal wordt bijvoorbeeld geïmpregneerd met het water bevattende medium van de immunologische reactie en de bindende materialen en liganden worden in dit medium geadsorbeerd en geincubeerd tot een evenwicht is inge-25 treden. Een tweede strook geschikt hydrofoob materiaal, geïmpregneerd met het geschikte oplosmiddel, wordt in innige aanraking met de eerste hydrofiele strook gebracht. Dankzij de verdeling van de reagentia over het zeer grote oppervlak van de twee stroken zal de extractie van het vrije ligand 30 uit de hydrofiele stroken door het oplosmiddel in de hydrofobe stroken buitengewoon snel en volledig zijn. Hierna vindt het scheiden van de twee stroken plaats en wordt het gemerkte hapteen in de gebonden en vrije fractie bepaald.

Deze uitvoeringsvorm is ook zeer geschikt voor automatise-35 ring zonder dat ingewikkelde extra apparatuur vereist is.

Een verdere eenvoudige uitvoeringsvorm van het vaste stof-vaste stof-extractiesysteem, toegepast volgens dé werkwijze van de uitvinding, omvat de vervaardiging van twee in elkaar gedraaide stroken, waarbij de ene strook be-40 staat uit hydrofiel en de andere bestaat uit hydrofoob ma- 800 4 2 90 * 8 teriaal. De water bevattende immunologische reagentia worden toegevoegd aan het hydrofiele deel van de tweelingstrook. Na de noodzakelijke incubatieperiode wordt de extractievloei-stof aan het hydrofiele deel toegevoegd. Dit oplosmiddel zal 5 dan snel overgaan in het hydrofobe deel. Tijdens dit bewe-gingsproces zal het oplosmiddel zijn extraherende werking uitoefenen en zo het vrije ligand naar het hydrofobe deel meenemen. Na scheiding van dé twee iii elkaar gedraaide stroken kan analyse plaatsvinden van het gebonden en/of het 10 vrije gemerkte ligand.

De werkwijze kan ook worden gebruikt voor enzym-immuno-proeven en is bijzonder geschikt wanneer als merkstof een fluorescerende stof wordt gebruikt, waarbij de metingen worden uitgevoerd met een geschikte spectrometer. Wanneer de 15 merkstof bij de proef een /-straling uitzendende radioiso-toop is, zoals jood - 125, en de bovenste fase een organisch oplosmiddel is, dan zal de water bevattende fase na oplos-middelextractie het antilichaam-antigen-complex bevatten. De onderste fase wordt dan onderzocht met behulp van de /-tel-20 Ier.

De werkwijze kan ook worden gebruikt voor de verschillende in de handel verkrijgbare uitrustingen voor immuno-proeven, hetgeen uit een aantal voorbeelden zal blijken.

De werkwijze volgens de uitvinding kan ook worden toe-25 gepast voor het afscheiden van het vrije antigen van het gebonden antigen-antilichaam-complex in het geval van proteïnen, cellen en andere verbindingen met een hoog molecuul-gewicht, wanneer twee met water mengbare maar onderling niet-verenigbare polymeren worden gebruikt ter verkrijging 30 van ontmenging. Dit levert twee water bevattende fasen waartussen verschillende materialen kunnen worden verdeeld. Een dergelijk fenomeen is beschreven in de literatuur P.A. Albertson c.s., Nature, 184, 1465* 1959; G. Johanson c.s., Eur. J. Biochem., 22* 379, 1973). Er zijn zeer veel 35 onverenigbare polymeerparen (zie bijv. A. Dobry c.s., J. Polym. Sci. 2, 90, 1947).

De werkwijze volgens de uitvinding is technisch eenvoudig, gemakkelijk en goedkoop en moet worden beschouwd als een ideale methode in de immunoproef-techniek. Ter illustra-40 tie van de lang gevoelde behoefte aan de bovenbeschreven 800 4 2 90 9 techniek kan het volgende citaat worden gegeven uit het bekende boek "Principles of competitive protein-binding assays" (W.D. Odell en W.H. Daughaday, Editors), J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Toronto, 1971, hoofd-5 stuk XI, blz. 303: "The fact that so many different separation techniques have been proposed is indication of some dissatisfaction with existing methods".

De techniek volgens de onderhavige uitvinding blijkt 10 het meest te voldoen aan de vereisten van de ideale methode, vergeleken met elk van de bekende methoden.

De methode kan worden gebruikt voor de specifieke bin-dingsproefmethode voor het bepalen van geringe concentraties van chemische stoffen in biologische vloeistoffen.

13 Van de bekende nomenclatuur van deze chemische stoffen kunnen de volgende groepen worden geanalyseerd:

Alkaloïden, zoals: morfine, codeïne, dihydrocodeïne, heroïne, oxymorfon, metopon, folcodine, enz. Barbituraten, zoals: Veronal, luminal, seconal, fenobarbital, 20 barbital, enz.

Steroïden, estrogenen zoals: β-estradiol, estron, estriol, 17^-ethynyl-estradiol enz., androgenen, progestogenen; adrenocorticale hormonen, enz.

25 Cannabinoïden en de metabolieten ervan.

Vitaminen, zoals caroteen, riboflavine, thiamine, niacine, ascorbinezuur, tocoferol, fytyl-1,4,-nafto-chinon, enz.

Aminozuren en polypeptiden 30 Suikers, alsmede sacchariden en polysacchariden,

Ataractica, zoals meprobamaat, valium, oxazepam, fenothia- zinen, enz.

Behalve de bovengenoemde haptenen kunnen ook andere gemengde materialen volgens de werkwijze van de uitvinding 35 worden onderzocht, zoals cocaïne, prostaglandin'e, antibiotica zoals penicilline, chloormycetine, actinomycetine en nucleïne zuren en nucleotiden, insecticiden, fungiciden, bactericiden en nematociden, zoals malathion, earbamaten, enz.. In het algemeen kunnen antigenen, haptenen en de anti-40 lichamen ervan, hormonen, vitaminen, geneesmiddelen, meta- goo 4 2 90 10 bolieten en de receptoren ervan en bindende materialen volgens de werkwijze van de uitvinding worden bepaald.

Yan de bijzondere te bepalen bestanddelen kunnen de volgende worden genoemd: 5 Gecompenseerd T^ (gebonden T^ opname (gebonden trijood- thyroxine) thyronine

Cortisol Insuline;

Digoxine; Trijoodthyronine;

Polaat; Thyroxine (totaal T^); 10 h G H (human growth hormone) T S H (thyroid stimulating hormone)

De volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken organische oplosmiddelen moeten voldoen aan de volgende eisen: (a) Ze moeten in geringe mate mengbaar of volledig niet- 15 mengbaar met water zijn.

(b) Ze moeten een duidelijk selectief extractievermogen ten opzichte van het antigen bezitten.

(c) Ze moeten geen specifieke storende interactie met enig bestanddeel van het systeem hebben.

20 Organische oplosmiddelen voor het extraheren van anti- genen als zodanig zijn zeer talrijk en de meeste ervan zijn ongeschikt voor toepassing volgens de onderhavige uitvinding. Dus alle organische oplosmiddelen die volledig of in aanzienlijke mate mengbaar zijn met water kunnen niet worden 25 gebruikt, bijvoorbeeld ethanol, aceton, enz.. In de literatuur wordt echter een groot aantal organische oplosmiddelen gegeven die aan de bovengenoemde kriteria voldoen. In het algemeen zullen als organische oplosmiddelen worden gebruikt: koolwaterstoffen, halogeenkoolwaterstoffen, zuurstof 50 bevattende derivaten van koolwaterstoffen, stikstof bevattende derivaten van koolwaterstoffen, fosfor bevattende-derivaten van koolwaterstoffen, waarbij het koolwaterstofdeel 3-20 koolstofatomen kan bevatten. Voorbeelden van dergelijke organische oplosmiddelen zijn: methylisobutylketon, 35 chloroform, dichloormethaan, koolstoftetrachloride, tert.amylalcohol, benzylalcohol, ethylacetaat, tert.butyl-methylether, hexaan, heptaan, isooctaan enz.. De keuze van het voor elk systeem bij voorkeur gebruikte oplosmiddel wordt bepaald door in elk geval een eenvoudige proef uit te 40 voeren, zoals in het onderstaande nader zal worden toege- 3 00 4 2 90 11 licht.

In de volgende tabel A worden de gegevens vermeld van een aantal "bruikbare oplosmiddelen met betrekking tot de bovengenoemde kriteria bij een proef voor het kiezen van een 125 5 geschikt oplosmiddel voor oestriol. ^I-oestriol werd gekozen als ligand en de extractie ervan werd onderzocht bij aanwezigheid van 250 mg/ml ongemerkt oestriol en zonder deze stof.

label A

Oplosmiddel % geëxtraheerd oestriol % oplosbaar- merker enkel met heid in water _250 ng/ml_ methylisobutyl- keton 91”94 90-94 1,9 ethylacetaat 90-94 90-92 5»3 tolueen 85-91,5 90,5 0,05 triethylamine 86-91 86-90 1,5 benzylchloride 78-80 78-78 0,05 tert.amylalcohol 78-82 80-85 12,5 (afgeschei den na centrifugeren) chloroform 52-53 53-54 1,01 dichloormethaan 45-47 52-5'i 2 koolstoftetrachloride 35-38 58-40 0,08

In de volgende voorbeelden wordt de werkwij'ze voor de 10 scheiding volgens de uitvinding nader toegelicht aan de hand van oestriol-digoxine en T-4 als liganden en de. verkregen resultaten worden vergeleken met de bekende werkwijzen door middel van precipitatie of met behulp van een chromatogra-fische kolom.

15 Voorbeeld I - Oplosmiddelextractiemethode voor Digoxine RIA Materialen en methoden

Na de incubatieperiode werd de geschikte hoeveelheid oplosmiddel in elke reageerbuis (polypropeen) gebracht, de buizen werden afgesloten en gedurende 30 seconden gedraaid 20 (of alle buizen werden krachtig geschud door ze gedurende 2 minuten om te keren). Men liet alle buizen gedurende enige minuten (5 - 10) staan en de helft van de hoeveelheid oplosmiddel (of water) bevattende oplossing werd in nieuwe reageerbuizen overgebracht voor het tellen.

800 4 2 SO

12

Er werden ook proeven uitgevoerd om de "fysische" scheiding (het overgaan van een bepaald volume na fase-scheiding) te voorkomen.

Een "well liner" met een koperen mantel werd gebruikt 5 voor het bedekken van de bovenste fase (meestal het oplosmiddel) en elke reageerbuis werd op zodanige wijze in de /-teller gebracht dat slechts het onderste deel van de buis (dat de water bevattende fase met de gebonden fractie bevatte) kon worden geteld. De zich in de uitrusting bevin-10 dende digoxine-componenten werden opnieuw samengesteld volgens de bij de uitrusting behorende gebruiksaanwijzing.

Het reactiemengsel bevatte 200^ul antiserum (nr. 9002), 400/Ul Digoxine-derivaat (nr. 9007)» lOO^ul standaardmateriaal (nr. 9902) of controle sera (DADE controle sera 15 van drie niveau's) en alle uit de uitrusting afkomstige componenten bevatten EDTA-fosfaatbuffer (pH 7- 0,1).

De reactie werd gedurende 50 minuten bij* omgevingstemperatuur uitgevoerd en er werd 2 ml methylisobutylketon aan elke buis toegevoegd waarna de buizen gedurende 50 seconden 20 werden gedraaid. De scheiding was in 5 - Ί0 minuten voltooid en de water bevattende fase werd geteld met behulp van een GAMMACOBD II met toepassing van een van een mantel voorziene "well liner" ("spacer" van 15 mm).

Besultaten en conclusies 25 In fig. 1 wordt de verkregen standaard-kromme weerge geven, uitgezet als logit gebonden materiaal/totaal materiaal (B/T) tegen log digoxine-concentratie. Totale delta % retentie (helling tussen 0,54 en 4,6 ng/ml) is 50 %. De waarden van de controle sera (fig. 1) geven aan dat er een 50 goede correlatie is met in de handel verkrijgbare uitrustingen voor digoxine-bepaling.

In fig. 2 wordt een vergelijking van een oplosmiddel-extractie met een methode met chromatografie-buizen weergegeven.

55 Voorbeeld II - Oplosmiddel extractie-methode voor T-4 BIA (T=thyroxine)

Materialen en methoden ^^I-T-4 nr. 0047* dat 5 mg/ml 8-anilino-naftaleen sulfonzuur (ANS) in tris-maleaat buffer pH 7>3 - 0,1 (tris 40 1,47 g, maleïnezuur 0,62 g, dinatrium EDTA 0,22 g) in 80 0 4 2 90 13 150 ml tweemaal gedestilleerd water bevatte.

Antiserum nr. 0007 werd weer samengesteld met dezelfde buffer. T-4 standaard-materiaal, bereid in bufferoplos-sing, reactiemengsel dat 200yUl opnieuw samengesteld 5 ^^I-M-^OyUl standaard-materiaal of serummonsters en 400yul antiserum werd gedurende 50 minuten bij omgevingstemperatuur geïncubeerd. Drie controle sera (ïRI-Rac -nr. RCS-16) niveau. I, niveau- II en niveau III werden eveneens met behulp van de standaard-kromme bepaald.

10 Ra het incuberen werden 200^ul verzadigde ammoniumsul- faatoplossing en 1 ml tert.amylalcohol aan elke reageerbuis toegevoegd. Alle reageerbuizen werden afgesloten en gedurende twee minuten geroteerd (onderste boven). De waterfase werd geteld met behulp van een GAMMACORD II (y-teller) met 15 toepassing van een van een mantel voorziene "well liner” (er was geen fysische scheiding vereist).

Resultaten en conclusies

De resultaten werden uitgedrukt als % gebonden materiaal, berekend over de hoeveelheid ongebonden materiaal 20 (B/Bo), en worden weergegeven in de grafiek van fig. 3. De waarden van de controle-sera werden berekend en worden ook in fig. 3 weergegeven. Deze waarden kunnen worden vergeleken met de waarden verkregen met behulp van de Ames T-4 uitrustingen (Tetralute en Seralute T-4 RIA).

25 Uit de verkregen resultaten blijkt dat de helling tus sen de 1 - 5 mcg/dl standaard en de 24 mcg/dl standaard 43 % is.

De waarden van de controle sera correleren goed met de met behulp van de in de handel verkrijgbare uitrustingen 30 verkregen waarden. Dit houdt in dat het systeem onderscheid kan maken tussen waarden van normaal- en hyperthyroid en hypothyroid.

Voorbeeld III - Oplosmiddelextractie-methode voor oestriol RIA

35 Materialen en methoden Buffer:

Oestriol RIA systeem werd uitgevoerd in EDTA-fosfaat-buffer (0,01 M, pE 7*4·)·

Antisera: 40 Er werden twee verschillende bronnen voor antisera ge- 80 0 4 2 90 v 14 bruikt: (1) antiserum, geproduceerd door konijnen die waren geïnjecteerd met oestriol 6-0 carboxymethyl BSA (R-68, verkregen bij Ames Yissum Research Laboratories, ge- 5 bruikt als ruw antiserum).

(2) Antisera, geproduceerd door konijnen die waren geïnjecteerd met oestriol-3-0BSA (R-63, R-64, R-65, bereid door Technion, Haifa, en gebruikt als gezuiverde immu-noglobulines) precipitatie met 36 % ammoniumsulfaat.

10 Oestrogeen-merkers:

12S

-Ι-oestriol bereid door Ames-Yissum Laboratories, ^ïï-oestriol gekocht bij New England Nuclear (N.E.N.) %-oestron en %-oestadiol ook gekocht bij N.E.N.

Oestrogeen en oestrogeenderivaten: 15 Oestrol (Merck), oestradiol (sigma), oestron (Sigma).

Oestriol-3-0 Carboxymethyl (bereid door Technion).

A. Bepaling van de standaardkromme 100/Ul van de merker in EDTA-fosfaatbuffer (die 0,2 gew.% polyvinylalcohol, P.V.A., bevat), 200yUl Oestriol-20 standaard (in dezelfde buffer) en 100^ul antiserum (onder toepassing van de geschikte verdunning) werden gedurende 60 - 90 minuten bij omgevingstemperatuur ge-incubeerd.

Na de incubatieperiode werd het gebonden oestriol af-25 gescheiden van het vrije materiaal door verschillende scheidingsmethoden toe te passen en de radioactiviteit van de vrije fracties werd bepaald. De standaard-krom-me werd verkregen door het vrije materiaal uit te zetten tegen de log oestriol-concentratie (ng/ml).

30 B. Scheidingsmethoden 1. Sephadex-kolommen: men bracht reactiemengsel (200^ul) boven op een G-10 Sephadex-kolom en liet dit in de kolom dringen. Vervolgens werden de kolommen gewassen met 3 ml EDTA-fosfaatbuffer ter verwijdering 35 van de gebonden fractie.

2. Oplosmiddel-extractie

Na de incubatie werden 200^ul van het reactiemengsel geëxtraheerd met 400^ul oplosmiddel (zie de resultaten) door gedurende 30 seconden te draaien 40 (onder toepassing van afsluitbare reageerbuizen van 800 4 2 90 15 polypropeen). Na fase-scheiding werd 20Cyul van het oplosmiddel overgebracht in proefbuizen en geteld. Resultaten en conclusies

De resultaten van de oplosmiddel-extractiemethode wer-5 den berekend als % vrij materiaal ten opzichte van de log oestriol-concentratie en worden weergegeven in fig. 4·. Deze waarden kunnen worden vergeleken met de resultaten die worden verkregen bij de scheiding van de gebonden en de vrije fracties met behulp van Sephadex kolommen. Zoals uit deze 10 vergelijking blijkt kan de oplosmiddel..extractiemethode met RIA worden gebruikt voor de bepaling van oestriol in biologische vloeistoffen.

Voorbeeld IV - Oplosmiddelextractie-methode voor digoxine

RIA

^ Er werd op dezelfde wijze gewerkt als in voorbeeld I

met toepassing van de in de handel verkrijgbare Digoxine RIA uitrusting (van Becton Dickinson). Alle componenten van de uitrusting werden als zodanig gebruikt behalve de ^^I-Digoxine-merker, die speciaal voor deze proef werd be-20 reid door Becton Dickinson research laboratory, zodat de geschikte hoeveelheid radioactiviteit aanwezig was in hoeveelheden van 0,1 ml in plaats van 1 ml zoals in de oorspronkelijke uitrusting.

DADE-controle-sera (I, II en IV) werden samengesteld 25 en samen met de uitrusting volgens de gebruiksaanwijzing daarvan onderzocht. Na de bovenbeschreven incubatie-perio-de werd 1,0 ml tert,amylalcohol aan elke buis toegevoegd, gedraaid om het vrije digoxine te extraheren en na fase-scheiding werd 150yul van de waterfase gebruikt voor het 30 tellen van de radioactiviteit. De voor de standaard-kromme verkregen resultaten (uitgedrukt als % B/Bo) en die van de controle-sera (uitgedrukt als % B/Bo en mg digoxine/ml) worden weergegeven in tabel B.

800 42 90 16

(Tabel B

Digoxine B/Bo DADA CONTROLE SERA ng/ml digoxine (ng/ml)_{%}_%B/Bo_gevonden verwacht 0,5 74,0 niveau I 61,1 0,72 0,71-1,06 1.0 49,0 1,5 35,0 niveau II 52,3 1,78 1,55-2,17 2.0 27,5 3.0 20,0 niveau III 20,2 2,90 2,64-3,49 5.0 12,0

Voorbeeld Y - Oplosmiddelextractie-methode voor RIA-oestradiol 173

Een in de bandel verkrijgbare (¾) RIA uitrusting voor oestradiol (van Isopac) werd op de volgende wijze vol-5 gens de oplosmiddel-extractiemethode onderzocht:

Alle componenten van de uitrusting werden bereid volgens de gebruiksaanwijzing daarvan.

Eén proef (A) werd precies volgens de gebruiksaanwijzing van de uitrusting uitgevoerd. Een tweede parallel-proef 10 (B) werd tot en met de incubatie-trap volgens de gebruiks aanwijzing van de uitrusting uitgevoerd. Na de incubatieperiode werd bij proef B 1,6 ml oplosmiddel (een 1 : 1 mengsel van tert-amylalcohol en tert.butylmethylether, vooraf verzadigd met bij de proef gebruikte buffer) aan 15 alle buizen toegevoegd en gedurende 20 seconden gedraaid.

Na fase-scheiding (ongeveer 10 minuten) werd de bovenste oplosmiddelfase, die het vrije oestradiol bevatte, overgebracht in scintillatie-flesjes waarin 5 ml scintillatie-vloeistof (Instagel II, Packard) was gebracht en werd de 20 radioactiviteit bepaald. In tabel C worden de resultaten weergegeven, die zijn berekend als % B/Bo voor de twee parallelle proeven. Wanneer volgens het voorschrift van de uitrusting de resultaten worden uitgezet op een logit-log grafiek-papier, dan wordt voor beide proeven een lineaire 25 grafiek verkregen, m'aar de resultaten van proef B (onder toepassing van de oplosmiddelextractie-methode) vertoonden een stijle standaardkromme en duiden dus op een meer gevoelige proef.

800 42 90 17 t

Tabel C

Oestradiol % B/Bo % B/Bo

standaard proef A proef B

pg/ml (uitrusting) (oplosmiddelextractie) 12,5 96,0 98,0 25,0 89,0 89,0 50,0 85,0 76,0 100.0 59,0 40,0 200.0 40,0 25,0 400,0 21,0 14,0

Voorbeeld VI - Oplosmiddelextractie-methode voor RIA -fenobarbiton

De voor een fenobarbiton BIA gebruikte componenten waren een (¾) fenobarbiton-merker (N.E.N.), een fenobarbi-5 ton antiserum R-66X (Technion) en tris-maleaat proefbuffer (pH 7,5, 0,078 M tris, 0,035 maleïnezuur) die 0,1 % PVP (polyvinylpyrrolidon) bevatte.

De merker, 100^ul (ongeveer 10 nono Ci/buis) werd toegevoegd aan reageerbuizen waarna 50^ul van de fenobarbiton 10 standaard materialen en 100^ul verdund antiserum werden toegevoegd. Alle buizen werden gedurende de nacbt bij 4°C ge-incubeerd. Na het incuberen werden 0,5 ml oplosmiddel (tert.butylmethylether, TBME bij een proef en MIBK bij een parallel-proef) aan elke proefbuis toegevoegd en gedurende 15 20 - 30 seconden gedraaid. Na fase-scheiding werd de water fase overgebracht in scintillatie-flesjes ter bepaling van de radioactiviteit. In tabel D worden de belangrijkste waarden als % B/Bo weergegeven.

Tabel D

Fenobarbiton TBME % B/Bo

standaard (tert.butylmethyl- MIBK

ng/ml_ether) _(methylisobutylketon) 5 96,5 75,0 10 79,0 63,0 25 ' 52,0 45,0 50 30,0 30,0 100 23,0 19,0 0 0 0 4 2 90 * 18

Voorbeeld VII - Oulosmiddelextractie-methode voor RIA-THC Een proef met toepassing van de oplosmiddelextrac.tie-methode werd uitgevoerd met tetrahydrocannabinol (THC)-metabolieten onder toepassing van een (^H)-THC merker 5 (Amersham). Alle bij de proef gebruikte componenten werden bereid in tris-maleaat-buffer (pH 7j3)j die 0,2 % PVP en 0,1 % Triton X450 bevatte. lOO^ul van de (^H)-THC merker werd gemengd met 50^ul van de THC standaard en 100^ul verdund anti-THC-antiserum, R-4lVa (bereid door Technion) en 10 gedurende een nacht bij 4°C geïncubeerd. Er werden drie parallel-proeven uitgevoerd. Bij één proef werd de scheiding van de vrije en de gebonden fracties uitgevoerd volgens de werkwij’ze met toepassing van een met dextran beklede kool en de twee andere proeven werden uitgevoerd met 15 toepassing van de oplosmiddelextractie-methode, waarbij’ tert-amylalcohol bij de ene en MIBK bij’ de andere proef werden gebruikt. Het oplosmiddel, 500^ul, werd toegevoegd aan de proefbuizen en gedurende 20 - 50 seconden gedraaid. Ha fase-scheiding (10 - 20 minuten) werd 150y-ul van de wa-20 terfase overgebracht in scintillatie-flesjes ter bepaling van de radioactiviteit. In tabel E worden de resultaten weergegeven, uitgedrukt als % B/Bo voor de drie proeven.

Tabel E

THC standaard °/o B/Bo ng/ml_tert.amylalcohol MIBK__Kool 1 90 98 98 2 86 84 · - 4 77 68 86 10 56 50 55 20 15 18 ' 32 40 6 8 21 800 4 2 §0

Claims

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als immunoproefmethode de radio-immunoproef-, vrije radikalenproef-, enzymproef-, fluorescent! eproef- of metalloimmunoproeftechniek gebruikt. 30 3· Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men de scheiding uitvoert van vrij antigen van gebonden antigen-antilichaam-complex, aanwezig in proteïnen, cellen of verbindingen met een hoog molecuulge-wicht.
4. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men de gebon den en/of de vrije fractie analyseert zonder feitelijke scheiding van de fasen in verschillende vaten.
5. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande con-40 clusies, met het kenmerk, dat men verschil- 800 4 2 SO lende uitvoeringsvormen voor de scheiding toepast waarbij men de vloeistof immobiliseert in een vaste matrix en zo toepast in een vaste stof-vloeistof-systeem of een vaste stof-vaste stof-systeem.
6. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men na instel len van het evenwicht tussen de twee vloeistoffasen een hydrofoob en oplosmiddel adsorberend vast materiaal toevoegt, waarbij het oplosmiddel het vrije ligand bevat dat 10 wordt geadsorbeerd op het vaste materiaal.
7. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men als orga nisch oplosmiddel koolwaterstoffen, halogeenkoolwaterstoffen, zuurstof bevattende derivaten van koolwaterstoffen, 15 stikstof bevattende derivaten van koolwaterstoffen en/of fosfor bevattende derivaten van koolwaterstofen gebruikt, waarbij het koolwaterstofdeel 3-20 koolstofatomen bevat.
8. Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel methyl- 20 isobutylketon gebruikt.
9. Werkwijze volgens conclusie 7* met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel chloroform gebruikt.
10. Werkwijze volgens conclusie 7» met het 25 kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel dichloor-methaan gebruikt.
11. Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel koolstof-tetrachloride gebruikt. 30 12, Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel tert.amyl-alcohol gebruikt.
13. Werkwijze volgens conclusie 7? met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel benzyl- 35 alcohol gebruikt.
14. Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel ethylace-taat gebruikt.
15· Werkwijze volgens conclusie 7» met het 40 kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel hexaan 800 42 90 » gebruikt.
16. Werkwijze volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel isooctaan gebruikt. 5 17· Werkwijze volgens conclusie 7? met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel tert.butyl-methylether gebruikt.
18. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men de werk- 10 wijze op automatische wijze uitvoert.
19. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men als ligand antigenen, hormonen, barbituraten, steroïden, vitaminen, ataractica, geneesmiddelen en/of alkaloïden gebruikt.
20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat men als ligand digoxine gebruikt.
21. Werkwijze volgens conclusie 19» met het kenmerk, dat men als ligand oestriol gebruikt.
22. Werkwijze volgens conclusie 19» met het 20 kenmerk, dat men als ligand thyroxime (T-4·) gebruikt.
23. Werkwijze volgens conclusie 19» met het kenmerk, dat men als ligand oestradiol-17P gebruikt.
24. Werkwijze volgens conclusie 19» met het kenmerk, dat men als ligand fenobarbiton gebruikt.
25. Werkwijze volgens conclusie 19» met het kenmerk, dat men als ligand tetrahydrocannabinol gebruikt . ******* 800 4 2 90