SE431028B - Forfarande for framstellning av biologiska kompositioner till anvendning som referensmaterial vid diagnostisk analys - Google Patents

Description

7eoz492~2 biologiskt aktiva substansen följt av i det närmaste om än in- te total avvattning vid reducerat tryck. Den frystorkade, bio- logiskt aktiva substansen kan förvaras som fast substans under varierande tidsperioder beroende på dess sammansättning. Sålun- da kan exempelvis sådana dehydratiserade material som blodserum eller blodplasma lagras under ett till tvâ år vid förvaring vid 2 - s°c.

För närvarande rekonstitueras dehydratiserade, frystor- kade, biologiska referenskompositioner med destillerat vatten kort före användningen.

När de väl är rekonstituerade ligger brukstiden vanligen mellan 3 och 24 timmar vid förvaring i vätskeform vid 2 - 8oC.

Stabilitetens längd beror av det biologiska materialets natur. šmâ biologiska molekyler, t.ex. elektrolyter, är bland de mest stabila, medan stora molekyler, såsom enzymer, är bland de minst _stabila. Sålunda kan vätefosfatas sönderdelas inom de två förs- ta timmarna efter rekonstitueringen med vatten från det frys- torkade, dehydratiserade tillståndet, medan natrium och kalium kan vara stabila under flera dagar.

Vanligtvis måste den icke använda delen av de frystor- kade, rekonstituerade, biologiska referenskompositionerna antin- gen åter frysas till fast form eller kastas bort vid slutet av varje arbetsdag. Den första metoden att förlänga brukstiden är både dyr (energikrävande), eftersom åternedfrysning kräver en temperatur mellan -20 och -30°C och dessutom tidsödande på grund av den tid som åtgår för upptiningen. Den andra metoden innebär uppenbart slöseri och är sålunda dyrbar. Förfarandet enligt uppfinningen innebär en billig och smidig lösning på ovannämnda problem.

Förfarandet enligt uppfinningen kännetecknas av de sär- drag som framgår av kravet 1.

Genom uppfinningen utsträcks brukstiden för rekonsti- tuerade, frystorkade, biologiska referenskompositioner på ett ekonomiskt sätt och gör det möjligt att förvara dem vid mellan -ZOOC och 8°C och mellan 2 och 8°C i vätskeform under perioder om t.ex. 4-5 veckor, varigenom man inte bara undviker instabili- tetsproblem i samband ned kylskåpsförvaring (vid 2 - 8°C) av kompositioner rekon- r. 7905492-2 stituerade i enlighet med känd teknik utan även undviker beho- vet av åternedfrysning till fast form för förvaring (vid -200 C) och återupptining för användning. Betydande förbättringar i brukstiden vid 2 - 80 C hos frystorkade, rekonstituerade, bio- logiska referenskompositioner har uppnåtts och instabiliteten upphävts hos sådana kompositioner innehållande urinsyra, glukos, bilirubin, ett flertal enzymer, t.ex. alkaliskt fos- fatas med flera med användning av det förbättrade förfarandet enligt uppfinningen.

Framställningen och användningen av biologiska refe- renskompositioner är i allmänhet väl dokumenterad i littera- turen. Exempelvis uppges i nedan angivna tre publikationer inom den professionella analytiska kemin hur sådana komposi- tioner vanligen framställas och/eller utvärderas: Teasdale, P.R. Beamount; D & Pakee, J.; "Dialized pooled serum and control" Clinica Chemica Acta 30, 535 (l970); Hanok, A. Kuo, J.

"The Stability of a reconstituted serum for the assay of 15 chemical constituents,“ linical Chemistry, 14, 58 (l968); och G. N. Bowers, R. W. Burnett & R. B. McComb, “Preparation and use of Human control materials for monitoring precision in Clinical Chemistry“; Clinical Chemistry, 21, l830 (1975).

I den amerikanska patentskriften 3 875 375 beskrives ett förfarande för framställning av referenskompositioner som är lagringsstabila genom en sekvens av åtgärder som innebär (l) partiell avvattning (avlägsnande av 20 - 40 vikt-% vatten) och (2) tillsats av C2 - C5 - alkylenpolyol för ersättande av borttaget vatten.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning skiljer sig från förfarandet enligt den amerikanska patentskriften 3 876 375 i två avgörande avseenden (som gör att de två förfa- randena sinsemellan utesluter varandra), nämligen att (l) förfarandet enligt uppfinningen kräver att den biologiska referenskompositionen är i huvudsak helt avvattnad (cirka 98 - 99 vikt-% av den ursprungliga mängden vatten av- lägsnas) och (2) vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning företas rekonstituering med en komposition innehållande cirka 79903 492- 2 f- 20 - 50 vikt-% av en C2 - C5 - alkylenpolyol.med resten utgö- rande vatten.

I enlighet med föreliggande uppfinning kan det i hu- vudsak fullständigt avvattnade biologiska referensmaterialet lagras och transporteras i sitt avvattnade tillstånd, varige- nom transportkostnaderna hålls nere.

Ur sammansättningsynpunkt skiljer sig de nyfram- ställda kompositionerna erhållna vid tillämpningen av förfa- randet enligt uppfinningen ej vid analys från de som beskri- vits i den amerikanska patentskriften 3 876 375. Kompositio- nerna innehåller sålunda vad det gäller de icke biologiska komponenterna cirka 50 - 80 vikt-% vatten och cirka 20 - 50 vikt-% av en alkylenpolyol med 2 - 5 kolatomer, varvid resten huvudsakligen utgöres av minst ett naturligt biologiskt mate- rial valt bland sådana exempel på substanser som human- eller animalserum eller -plasma, enzymer, proteiner, hormoner, meta- boliter med flera. I Lämpliga alkylenpolyoler som kan användas är etylen- glykol, propylenglykol, butylenglukol, pentandiol och glycerol.

Alkylenpolyolmaterialet är företrädesvis etylenglykol men and- ra alkylenpolyoler kan användas var för sig eller i blandning med etylenglykol.

Vanligen innehålla dessa vattenhaltiga biologiska kompositioner i sina icke biologiska komponenter cirka 60 - 80 vikt-% vatten, cirka 20 - 40 vikt-% av en alkylenpolyol av ovan beskriven typ och resten utgöres i huvudsak av ovannämn- da biologiska material.

I vissa fall är det önskvärt att använda olika kom- binationer av alkylenpolyoler. Sålunda är det önskvärt att an- vända kompatibla blandningar av etylenglykol och/eller propylenglykol och glycerol. Även om glycerol ofta är överläg- set etylenglykol vad beträffar möjligheten att hålla proteiner i lösning ger den viss icke önskvärd höjning av viskositeten på den biologiska vätskan. Eftersom viskösa vätskor är svåra att pumpa och föra in i viss utrustning, såsom pipetter, rör etc. leder användningen av etylenglykol till låg viskositet och samtidigt att man uppnår en god sänkning av fryspunkten som tillåter lagring vid låga temperaturer i vätsketillstånd. 7903492-2 Vid användning av etylenglykol i koncentrationer i huvudsak över 33 volym-% tenderar emellertid det protein som finns i sådana labila biologiska material att utfällas.

Förfarandet enligt uppfinningen belyses närmare ne- dan i anslutning till hur representativa plasma- och serum- referensmaterial framställes för övervakande precision inom den kliniska kemin, d.v.s. användning som referenssera vid analyser, på vilka diagnoser baseras. Den metod som tillämpats är den som beskrivits i Clinical Chemistry volym Zl, sid. l830 (1975) från Bowers & Co. Publishers.

Restplasma eller serum uppsamlades i en nedfryst be- hållare (hållen vid mellan -5 och -20° C) rymmande 25 - 35 liter. Termen "restplasma" användes här för att beteckna från off. flera tusen sjukhuspatienter överlämnade serumprover vardera på 2 - 5 ml och sammanförda i en gemensam "pool". Denna pool avfrostades därefter (vid en temperatur mellan 10 och 250 C under en period av 10 - 24 timmar) och partikelformigt mate- rial filtrerades bort från det avfrostade poolmaterialet. Bio- logiska föreningar, såsom glukos, karbamid, enzymer med flera, sattes därefter till poolmaterialet för att man skulle uppnå "uppställda aritmetiska värden" tillsammans med stabilisatorer, såsom natriumazid med flera och sålunda framställt poolmate- rial fördelas därefter i 10 ml medicinflaskor (totalt 2500), som därefter frystorkades vid en temperatur mellan -l0 och ° och l0 timar vid reducerat a.. -200 C under en period av mellan tryck (för torkning) av mellan cirka l och 20 mm Hg och före- trädesvis mellan cirka 5 - 10 mm Hr. Efter torkning tillprop- pades flaskorna och förvarades vid en temperatur mellan cirka 2 och s° c.

Kommersiella referensmaterial framställas på liknan- de sätt. Dehydratiserade och igenproppade rör kan sedan förva- ras vid en temperatur av 2 - 80 C under upp till 2 år. I en- lighet med gängse praxis löses det torkade provet upp i en- bart vatten och utnyttjas omedelbart eller kastas bort vid slu- tet av arbetsdagen. Enligt acceptabel praxis tillåts endast en åternedfrysning av rekonstituerat serum, eftersom upprepad nedfrysning och upptining snabbt förändrar den kvantitativa 79413492- 2 sammansättningen på serumreferensmaterialet. Att hålla prover nedfrysta är oekonomiskt liksom det är att kasta bort rekon- stituerade prover, som stått oanvända sama dag eller inom nå- agon dag efter den dag som de rekonstituerats.

Nämnda slöseri elimineras väsentligen med tillämp- ning av förfarandet enligt uppfinningen eftersom oanvända pro- ver kan lagras under upp till 4 ä 5 veckor vid 2 - 8° C utan att man behöver frysa ned dem på nytt. Exempelvis fås vid re- konstituering av frystorkat serum med enbart vatten en refe- rensprodukt med två dagars brukstid vid förvaring i kylskåp (cirka 40 C) för glukosbestämning, vilket skall jämföras med 4 ä 5 veckor när serum från samma frystorkade poolmaterial re- konstitueras med en blandning innehållande 33 vikt-% etylen- glykol i vatten. Vidare kan sama etylenglykol-vattenrekonsti- tuerade referenskompositioner lagras vid -200 C utan att bli fasta, varigenom behovet av tidsödande avfrostning elimineras.

Detta innebär en uppenbar fördel i det jäktiga dagliga arbe- tet i laboratorier.

Nutida krav att komplettera laboratorieanalyser med kliniska undersökningar har lett fram till krav på automatise- rade klinisk-kemiska metoder i stället för manuella metoder med de senares inbyggda och kumulativa analytiska fel. Automa- tiserade metoder har tagits fram, vid vilka de möjliga variab- la parametrarna noggrant reglerats genom att exempelvis ersät- _ta proteinutfällning med dialys, kombinera testvätska och rea- gens i rinnande flöden, noggrant reglera upphettnings- och re- aktionstider och genomströmningen samt dubbelstrålkolorimetrar samankopplade med skrivare. Exempel på sådana automatiserade analytiska anordningar är de på marknaden förekommande Technicon Autoanalyzers från Technicon Instruments Corporation, Chauncey, New York.

Operationssekvenserna vid automatiserad analys är likartade de vid manuellt arbete och inbegriper uppmätning av provmängder, avlägsnande av protein, tillsats av reagenser, upphettnings- och reaktionstidskontroll, kolorimetriska mät- ningar och uträkning av resultat. I automatiserade system an- vänds en pumpmetod, varvid plaströr med olika inre diameter 79Û3492~2 Walternerande trycks samman och frikopplas med en uppsättning rullar, varigenom peristaltiska rörelser imiteras. Eftersom rullarna förflyttas över rören med konstant hastighet kommer den faktiska volymen av transporterad vätska att bero av rö- rets kaliber. Separation av ett prov från nästföljande åstad- koms genom inmatning av luftbubblor i flödet och detta medför också viss "skrubbande" verkan, som minskar risken för upp- blandning av ett prov med efterföljande. Segmenteringen av vätskeflödena på detta sätt tillåter också samanblandning ge- nom att flödet matas genom en styv glasspiral monterad hori- sontellt, i vilken varje liten del vätska upprepat staplas allt eftersom den passerar genom slingan.

Avskiljandet av protein från proverna åstadkoms ge- nom dialys. Dialysapparaten består av två plattor och i en yta hos varje platta är med maskin skuret ett mycket noggrant spi- ralspâr, som bildar en kontinuerlig kanal med halvcirkulär tvärsektion. När de två plattorna sammanföres med de graverade ytorna mot varandra och ett mycket tunt cellofanmembran mellan dem bildas en kontinuerlig kanal med cirkulär tvärsektion de- lad utmed hela sin längd av membranet. Den totala längden på kanalen utgör cirka 221 cm. Om serum flyter i ena halvan av kanalen och ett reagens eller annan vattenhaltig vätska i den andra halvan kommer dialyserbara komponenter i serumet att pas- sera genom membranet och in i flödet av reagens. Sådana sub- stanser som karbamid, glukos, kreatinin, urinsyra, fosfat, kalcium, natrium, kalium och klorid kan på detta sätt avlägs- nas från serumet och de stora, icke dialyserbara proteinmole- kylerna blir över och kan kastas bort. Det bör framhållas att endast en del av de små molekylerna och jonerna överförs från provflödet till reagensflödet men eftersom inom vissa gränser samma proportioner av beståndsdelarna i en standardlösning också överföras upprätthålles förhållandet mellan provkon- centrationen och standardlösningskoncentrationen. Det automa- tiserade instrumentet utför den exakta mätningen av detta för- hållande och reaktioner behöva ej gå till fullbordan som vid manuella metoder och därför kan reaktionstiderna förkortas utan att noggrannheten går förlorad. l | 7993-492- 2 Om proceduren kräver ett upphettnings- eller inkuba- tionssteg uppnås detta genom att mata blandningen av reagens och provdialysat genom en fast glasspiral nedsänkt i ett lämp- ligt värmebad. Upphettnings- eller inkubationsfasen bestäms exakt av den tid som det tar för vätskorna att passera genom slingan när de pumpas med konstant hastighet. Baden är helt inneslutna och omrörs kontinuerligt för åstadkomande av exakt temperaturreglering.

De färgade lösningar, som är ett resultat av reak- tionen mellan provdialysatet eller standarddialysatet och rea- gensen matas in i en cell av flödestyp i en dubbelstrålekolo- rimeter, i vilken utnyttjas ett filter med smalt band (cirka l7 mfnn). Luftbubblorna avlägsnas genom ett lämpligt tapphål och absorbansen hos den färgade lösningen överföras till en elektrisk signal via en fotocell. En andra fotocell, som i förväg inställts på 100 % transmittans med en potentiometer tjänstgör som referens. Skillnaden i ljusabsorbans mellan de två strålarna förstärks och matas till skrivaren, som visar den som en toppkurva. Genom att jämföra höjden på den av pro- vet alstrade toppen med den som erhålles med ett standardprov kan man räkna fram provets koncentration.

Det ökade behovet av exakt kemisk analys av flera komponenter i biologiska kroppsvätskor har lett till utveck- landet av automatiska flerkanalsanalysanläggningar. Dessa maskiner behövde också kunna arbeta i sekvens för att hantera de stora volymer av analytiska prover som önskas analyseras.

Eftersom varje enskild analys (kanal) måste utföras kolori- metriskt i jämförelse med en standardlösning av känd koncent- ration (genom oberoende analys) blev det önskvärt att använda en referensvätska innehållande var och en av komponenterna som man försökte analysera. Exempelvis är det idag praxis att ana- lysera människoblod med avseende på 17 - 18 komponenter, vil- kas koncentrationer rapporterats i följande enheter: total- mängd protein "T. Protein" (gram-%); albumin (gram-%); kalcium "Ca" (milligram-%); fosfor "P" (milligram-%); kolesterol (milligram-%); urinsyra (milligram-%); kreatinin (milligram-%); totalmängd bilirubin "T. Bili." (milligram-%); 7903492-2 F alkaliskt fosfatas (internationella enheter per ml); mjölk- syradehydrogenas "LDH" (internationella enheter per ml); glutaminsyra-oxaloättiksyratransaminas "GOT" (internationella enheter per ml); kreatininfosfokinas "CPK" (internationella enheter per ml); klorid "Cl" (milliekvivalenter per liter); koldioxid "C02" (milliekvivalenter per liter); kalium "K" (milliekvivalenter per liter); natrium "Na" (milliekviva1en- ter per liter); blodureakväve "BUN" (milligram-%) och glukos (milligram-%).

De enligt uppfinningen framställda vätskeformiga, biologiska referenslösningarna (sera) användas i kommersiellt tillgängliga flerkanals differentialanalysanläggningar basera- de på kolorimetri eller spektrofotometri genom att serumlös- ningen (av kända koncentration med avseende på varje kompo- nent genom separat oberoende analys) i ett av provflaskorna i maskinen, som gör det möjligt att den kan löpa genom hela maskinen, varefter skrivaren manuellt sätts på känd koncentra- tion för varje komponent i enlighet med som framkommit genom oberoende analys. Följaktligen har varje standardiserad kompo- nent sin egen färgintensitet eller optiska densitet och kan fungera som referens för varje analys (kanal). När väl opaci- teten, frånvaron av ljus eller intensiteten hos färgen jäm- ställts med ett matematiskt koncentrationsenhetsvärde för var- je komponent kan analysen av de olika okända materialen förlö- pa automatiskt och man får analytiska utskrivna resultat för ett stort antal okända komponenter i följd. Användningen av ett referensserum enligt uppfinningen innebär en avsevärd för- bättring eftersom det möjliggör användning av en stabil refe- rens med en sammansättning, som ligger mycket nära den som återfinns i människokroppen.

Eæilnel 10 liter humanserum erhållet i fruset tillstånd från uppsamlingsstationer omrördes noggrant, pressades genom flera skikt av gasväv och filtrerades vid ett tryck av 0,l775 MPa.

För att uppnå olika koncentrationsnivåer för serum- komponenterna försattes serummaterialet med följande kemika- lier av reagenskvalitet, nämligen glukos, litiumkarbonat, urin- 79133492-2 10 F syra, bilirubin, urea, dinatriumfosfat, kreatinin och fosfor- syra. Följande enzympreparat tillsattes också, nämligen mjölk- syradehydrogenas (från nötkreaturshjärtan), aspartatamino- transferas (från nötkreaturshjärtan), kreatinfosfokinas (från nötkreaturshjärtan) och alkaliskt fosfatas (av vegetabiliskt ursprung). l Poolmaterialet om 10 liter fördelades på l0 ml medi- cinflaskor, vilket gjorde att man hade totalt 1090 flaskor.

Dessa frystes därefter ned till -200 C till fast tillstånd. 98 - 99 vikt-% av det närvarande vattnet avlägsnades under vakuum från det frusna serumet. Flaskorna korkades därefter igen under vakuum och förvarades i kylskåp vid 40 C.

För att jämföra stabiliteten hos det med glykol-vat- ten rekonstituerade serumet med ett rekonstituerat prov av en- bart destillerat vatten företogs rekonstituering av ett antal flaskor med en blandning av 33 % etylenglykol i vatten till den ursprungliga volymen 10 ml. Jämförelseproven rekonstitue- rades med enbart destillerat vatten.

Rören igensattes med gummiproppar och delades upp i tre lika stora kvantiteter, nämligen (a) för förvaring vid rumstemperatur, (b) för förvaring i kylskåp vid 40 C och (a) för förvaring i frysskåp vid -zo° c.

För analys togs ett rör ut av var och en av grupper- na. Proverna undersöktes med avseende på l7 komponenter, näm- ligen totalmängd protein, albumin, kalcium, oorganiskt fosfor, kolesterol, urinsyra, kreatinin, totalmängd bilirubin, alka- liskt fosfatas, kreatinfosfokinas, mjölksyradehydrogenas, aspartataminotransferas, klorid, kalium, natriumureakväve och glukos. En på marknaden förekommande apparatur "Hycel 17 Analyzer“ (tillverkad och försâld av Hycel Inc., Houston, Texas) kalibrerades med “Hycel“ referensserum och användes för ovannämnda undersökningar. Proven kördes från början med unge- fär l dags och l veckas intervall. Som resultat av dessa un- dersökningar visade det sig att en 33-procentig koncentration av etylenglykol i vatten var ett i praktiken optimalt värde troligen till viss del beroende på det faktum att den sålunda rekonstituerade produkten hade en viskositet likartad den hos humanserum. ll Tabell 1 7903492-2 (Stabilitet hos serum vid rumstemperatur) vecka analyt från början 1 2 3 4 kreatinin mg% 2,9 3,5 2,5 3,1 3,0 kalcium mg% 10,2 9,8 9,7 8,5 ß,o mjölksyradehydrogenas (I.U.) 175 198 190 187 -- fosfor mg% 6,8 6,8 7,3 7,7 8,0 kreatinfosfokinas (I.U.) 91 70 60 75 50 triglycerider mg% 136 108 154 160 110 transaminas (I.U.) SS 75 62 57 40 alk. fosfatas (I.U.) 24 31 32 33 -- totalmängd bilirubin mg% 3,6 3,4 2,9 2,4 -- natrium mekv/1 148 151 154 152 152 kalium mekv/1 5,6 5,2 5,5 5,5 5,6 klorid mekv/1 112 110 lll 110 -- kolesterol mg% 200 185 202 193 200 urinsyra mg% 8,0 7,7 7,7 7,7 8,0 totalmängd protein g% 6,9 6,6 7,1 7,0 6,8 globulin 9% 2,7 2,7 2,8 2,6 2,7 ureakväve mg% 28 27 27 27 26 glukos mg% 186 179 181 187 185 _..._.....-.,_....._...___... 719103492- 2 12 Tabell 2 (Stabilitet hos serum vid 2 - 80 C) vecka analyt från början 1 1, 2 3 4 kreatinin mg% 4,0 3,2 2,6 4,2 3,5 kalcium mg% 9,9 10,0 10,2 10,0 9,9 mjölksyraåehydrogenas (I.U.) 196 200. 191 190 200 fosfor mg% 6,7 6,5 6,5 6,5 6,7 kreatinfosfokinas (I.U.) 97 101 68 73 65 triglycerid mg% 154 98 138 138 140 transaminas (I.U.) 73 78 68 68 70 alk. fosfatas (I.U.) 25 26 27 27 27 totalmängd bilirubin (I.U.) 3.7 3.7 3.7 3.5 3.2 natrium mekv/1 153 149 154 156 154 kalium mekv./1 5,4 5,1 5,4 5,7 5,4 " klorid mekv/1 108 107 110 107 110 kolesterol mg% 188 187 199 190 188 urinsyra mg% 8,1' 7,5 7,6 7,7 7,5 totalmängä protein g% 6,7 6,8 6,9 6,7 6,7 globulin 9% 2,8 2,7 2,7 2,6 2,7 ureakväve mg% 31 27 28 27 27 glukos mg% 185 173 178 187 177 I.- 13 Tabell 3- 7903492-2 (stabilitet hos serum vid -13° till -2o° c) vecka analys från början 1 2 3 4 kreatinin mg% 3,0 3,2 2,6 3,4 3,0 kalcium mg% 10,3 10,0 10,2 10,9 10,2 mjölksyradehydrogenas (I.U.) 180 188 180 184 180 fosfor mg% 6,9 6,8 6,5 6,8 6,5 kreatinfosfokinas (I.U.) G9 70 68 84 70 triglycerid mg% lll 100 132 134 130 transaminas (I.U.) 68 72 70 69 71 alk. fosfatas (I.U.) 24 27 24 23 24 totalmängd bilirubin (I.U.) 3,6 .,8 3,7 3,5 3,- natrium mekv/1 148 148 153 151 150 kalium mekv/1 5,2 5,2 5,4 5,3 5,2 klorid mekv/1 107 110 111 -- -- kolesterol mg% 190 190 193 179 180 urinsyra mg% 8,0 7,5 7,5 7,3 -- totalmängd protein g% 6,8 6,5 6,6 6,1 -- globulin g% 2,8 2,8 2,7 2,4 -- ureakväve mg% 27 29 28 27 -- glukos mg% 185 182 169 165 7903492-2 14 Kompositioner framställda såsom beskrivits i detta exempel testades med avseende på stabilitet vid förvaring i kylskåp på basis av etablerade tillåtna gränser för avvikel- ser och resultaten framgår av nedanstâende tabell 4.

Tabell 4 Tillåtna gränser för avvikelse komponent normalområde _ 1. , 1 8%: .5SR$2 T. protein 6,0-8,0 g% 0,2 0,3 0,16 0,22 albumin 3,5-5,0 g% 0,2 0,2 0,12 0,15 Ca 8,5-10,5 mg% 0,3 0,4 0,16 0,04 P 2,5-4,5 mg% 0,2 0,3 0,16 0,2 kolesterol 150-300 mg% 10,0 18,0 12,00 17,00 urinsyra 2,5-8,0 mg% 0,3' 0,6 0,44 0,57 kreatinin 0-1,4 mg% 0,1 0,2 0,11 -- T. bili. 0,2-1,0 mg% -- 0,2 0,06 -- alk. fos. 30-85 mU/ml 5,0 3,0 4,40 -- CPK 25-145 mU/m1 -- 8,0 9,60 -- LDB 100-225 mU/ml 16,0 16,0 10,00 -- GOT 7-40 mU/ml '2,0 2,0 2,60 -- C1 95-105 meg/1 3,0 4,0 0,80 0,9 C02 24-32 meg/1 2,0 2,0 0,64 0,8 K 3,5-5,0 meg/1 0,2 0,2 0,12 0,14 Na 135-145 meg/1 3,0 4,0 0,80 0,5 BUN 10-20 mg% 1,0 1,0 0,80 1,5 glukos 65-110 mg% 6,0 11,0 3,60 4,5 x Ad Hoc Advisory Committee NIH (National Institute of Health) "Guidelines for Preparation of Control Materia1s": Class A reference material guide line “95% confidence interval does not exceed 8% of the 95% normal range". ß cotiove :aarris e. svillialns. elin. chem. 16 1028 (1979) .5SR“to1erab1e analytic variability" 1 "acceptable devia- tions listed for two commercial lyophilized products". 7903492-2 15 Om resultat uppnådda vid analys av de rekonstitue- rade referensserumvätskorna låg nära eller inom ovan angivna gränser kunde man dra slutsatsen att komponenterna var stabi- la. Att prover var grumliga (vilket undersöktes periodiskt ge- nom visuell inspektion) innebar inga analytiska problem efter- som proven förblev klara upp till den angivna stabilitetsnivån.

Förutom för plasma och serum kan förfarandet enligt upp- finningen tillämpas för att utsträcka brukstiden (d.v.s. för- varingstiden i kylskåp) hos hemoglobinstandardlösningar, urin- prover och andra biologiska referenslösningar eller standard- prover för förbättrad stabilitet och samtidigt eliminering av behovet av förnyad nedfrysning till fast tillstånd efter rekonstituering.

Det beskrivna stabila, vätskeformiga, i en pool sammanförda och rekonstituerade referensserumet är lämpligt att använda som kalibreringsstandard eller referensprov vid klinisk-kemisk analys i såväl manuella som automatiserade analysanläggningar med möjlighet att analysera flera okända blod- eller serumprover.

Ovan har beskrivits ett förfarande för framställ- ning av ett stabilt referensserum ur humanserum och ett för- bättrat förfarande för automatiserad kemisk analys med an- vändning av sådant serum. Även om uppfinningen har beskrivits i huvudsak i anslutning till humanblodserum kan den tillämpas på andra bio- logiskt aktiva humana eller animala substanser, såsom sub- stanser som kan återfinnas i serum, t.ex. enzymer, hormoner, elektrolyter och biologiskt aktiva metaboliter som i stor om- fattning används vid diagnos av sjukdomar av såväl human som nonhumant slag och andra naturligt förekomande biologiska vätskor för användning som analytiska referensmaterial eller standard, vilket lätt inses av fackmannen.

Claims (3)

7903492-2 l-(ö Patentkrav

1. Förfarande för beredning av en stabil, vätskeformig biologisk referenskomposition ur biologiskt material vilken komposition är stabil under lång tid vid temperaturer mellan -2000 och 8°C och är avsedd att användas vid analys av natur- ligt förekommande, biologiskt likartade okända material varvid nämnda biologiska material har likartad sammansättning som och innehåller samma komponentmaterial som den okända substansen, som skall analyseras, och överförts i frystorkat, dehydratise- rad fast form genom att det biologiska materialet frysts ned under en period av ca 10 - 2N timmar och befriats från 98 - 99 vikt% av ingående mängd vatten, k ä n n e t e c k n a t av att den frystorkade, dehydratiserade, fasta substansen innan den används för analysändamål rekonstitueras med en vattenhal- tig komposition innehål1ande20 - 50 vikt% av minst en alkylen- polyol med 2 - 5 kolatomer i en koncentration i huvudsak lika med den vattenhalt, som i infrysningssteget tagits bort. 4

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den rekonstituerade kompositionen innehåller 20 - 35 vikt% alkylenpolyol.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av att alkylenpolyolen är vald bland etylenglykol, pro- pylenglykol, glycerol, butylenglykol och pentandiol. H. Förfarande enligt något av krav 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a t av att det biologiskt likartade okända materia- let utgöres av blodserum. 7903492-2 Sammandrag Ett förfarande för beredning av en stabil, vätskeformig biolo- gisk referenskomposition ur biologiskt material, vilken kompo- sition är stabil under làng tid vid temperaturer mellan -20oC och 8°C och är avsedd att användas vid analys av naturligt fö- rekommande, biologiskt likartade okända material, varvid nämnda biologiska material har likartad sammansättning som och innehål- ler samma komponentmaterial som den okända substansen, som skall analyseras, och överförts i frystorkat, dehydratiserad fastform genom att det biologiska materialet frysts ned under en period av ca 10-24 timmar och befriats från 98-99 vikt-% av ingående mängd vatten, som kännetecknas av att dem frystorkade, dehydra- tiserade, fasta substansen innan den används för analysändamål rekonstitueras med en vattenhaltig komposition innehållande 20- 50 vikt-% av minst en alkylenpolyol med 2-5 kolatomer i en kon- centration i huvudsak lika med den vattenhalt, som i infrysnings- steget tagits bort.