SE190881C1 - - Google Patents

Description

Uppfinnare: AV Kaufmann och K Bauer Prioritet begiird !ran den 24 september 1959 (Forbundsrepubliken Tysk.land) Det har foreslagits, att framstalla 6-aminopenicillansyra darigenom, att man later sus-pensioner eller extrakt av sadana penicillinspaltande bakterier, vilka foretradesvis angripa amidbindningen I 6-stallning i penicillinmolekylen, inverka pa penicilliner.

Med hansyn till lampligheten av den for penicillinspaltningen erforderliga bakteriemassan, är det ells inte likgiltigt, under vilka betingelser organismerrta kultiverm Om man inympar en naringslosning med ett pHvarde av 7,0, som forutom de for odlingen av mikroorganismerna erforderliga jonerna som N-kalla innehaller ammoniumjoner, kaseinhydrolysat eller klittpepton och som energioch C-kalla innehaller glykos, laktos eller sackaros, med en. lamplig bakteriestam, sa erhailer man efter kultivering under luftning vid c :a ° C visserligen ett relativt Mgt utbyte av bakteriecellmaterial, men dessa cellers penicillinspaltande formaga dr dock liten. En viss okninig av den onskade enzymatiska aktiviteten erhaller man vid anvandning av glycerin eller salter av organiska syror, sasom mjolksyra eller barnstenssyra som energioch C-kalla.

Det har visat sig, all man kan hop: den penicillinspaltande aktiviteten hos bakterier, vilka, innan an i bakteriecellvaggarna fast bundna enzymerna bringas inverka pa penicillin, ladles under luftning i narlosningar, vilka endast innehalla obetydliga mangder forjasbara kolhydrater, dvs. icke hogre halt av sadarta kolhydrater an den som forefinnes i 2-procentig majsstopvatska, om odlingen genomfores i narvaro av fenylattiksyra eller derivat darav och far fortga till .dess att en vasentlig mangd av enzymerna alstrats.

Dupl. kl. 6 a: 22/04; 6 b: 16/03 Fenylattiksyran eller dess derivat anvandes harvid i mangder av 0,002-2 Vo.

I enlighet med fOreliggande uppfinning 1-ter sig bakteriecellmassa med bra penicillinspaltningsformaga utvinnas darigenom att man som huvudsaklig energi- och kvavekalla anvander aminosyrablandningar i form av aggvitehydrolysat eller peptidblandningar i form av peptoner eller annu hOgmolekylarare proteiner for framstallning av narlosningen. Det ãr andamalsenligt, att forsatta sadana narlosningar, forutom med de vanliga oorga- niska jonerna, sasomPO4---, Mr, K+, Na, Cl, aven med en vitamin- och tillvaztamnesblandning, t. ex. jastvatten, i mindre mangd.

Genom tillsats av fenylattiksyra, dess salter och derivat till nArlosningen, kan man hoja den Onskade enzyrnatiska aktiviteten hos bakterierna. Dessutom kan man ytterligare hoja bakteriemassans penicillinspaltningsformaga genom att man i sadana kulturer under bakterietillvaxten forutom luft aven inledcr kol- Enligt uppfinningen anvandes foretradesvis majsstopvatska som huvudsaklig bestandsdel i narbadden. Majsstopvatskan innehaller val lampade energi- och kvavekallor, vitaminer och tillvaxtamnen jamte de ovannamnda oorganiska jonerna. Denna grundnaringslosning forsattes i enlighet med uppfinningen med fenylattiksyra, fenylacetamid, fenacetursyra, fenacetylglutaminsyra eller andra derivat av fenylattiksyra. Koldioxiden kan antingen blandas med den for kulturernas syreforsiirjning erforderliga luften eller ocksa separat inledas i de vaxande kulturerna. Temperaturen I kulturerna kan uppga till 20-45° C. Lamp- 2— — ligen later man kulturerna VaXa under 12-20 timmar vid 30-35° C.

Efter denna tid avskiljas lampligen bakteriecellerna och tvattas. Darefter kan man lata cellerna inverka pa penicillin. Eftersom det penicillinspaltande enzymet ãr fast bundet till bakteriernas cellvaggar och inte som cyto- plasmatisk bestandsdel i cellerna, kan man efter avslutad inverkan atervinna ensymmaterialet ur penicillinspaltningsblandningarna och Her anvanda detsamma for ytterligare satser.

Lampligheten for utvalda bakterier att genomfora spaltningen kan undersokas pa Rdjande enkla satt under anvandning av en till teknikens standpunkt horande metod (P. R. Bachelor, E. P. Doyle, J. H. C. Mayler & G. N. Robinson, Nature, London, 183 (4656), 257 av den 24 juni 1959). ml av en fosfatbuffertlosning med pH = 7,0, innehallande 10000 I. E. penicillin G/ml, forsattes med samma volymmangd av en baktieriesuspension i en fosfatbufferNsning med pH = 7,0, och forvaras, efter tillsats av 0,2 % toluen, under 5 timmar vid en temperatur av 37° C.

Bakteriesuspensionen framstalles pa foljande satt. 100 ml narbuljong inympas i en renkultur av den bakterie, som skall provas, och odlas skakmaskin under 18 timmar vid en temperatur av 28-32° C. Darefter a.veentrifugeras bakterierna, tvattas i 40 ml fosfatbuffertlosning med pH = 7,0 och omsuspenderas i 10 ml fosfatbuffertlosning med pH = 7,0.

Efter det att bakteriecellerna under 5 timmar fatt inverka pa penicillin G bestammes i den till cellfrihet centrifugerade losningen den kvarvarande penicillinhalten pa mikrobiologisk vag.

For olika bakteriestammar visar det sig harvid, att losningen innehaller hela den ursprungliga aktiviteten. I detta fall ha bakterie- cellerna icke utvecklat nagon enzymatisk verkan med avseende pa penicillin G. Bakterierna aro av derma anledning icke lampade att anvanda fOr framstallning av penicillinspaltande enzym, att losningen är inaktiv eller uppvisar en starkt reducerad aktivitet. I detta fall later man under iskylning och under samtidig tillsats av natriumbikarbonat 500 mg fenylacetylklorid inverka pa lOsningen. Losningen under-sakes darefter pa nytt. Om man vid denna undersOkning icke finner flagon okning i aktivitet jamforelse med den icke acylerade losningen, sa kan man harav draga den slutsatsen, att penicillinet under inverkan av penicillinas eller liknande enzyrn nedbrutits irreversibelt, finner en fullstandig reaktivering av penicillinverkan till 10000 I. E./m1 losning, sd framgar det av forsoket, att penicillin G un der enzyminverkan spaltats pa sadant sat, att 6-aminopenicillansyra och fenylattiksyra bildats. De i ,detta fall provade bakterierna lam-pa sig pa ett framtradande salt for enzymatisk utvinning av 6-aminopenicillansyra fran firmer endast delvis reaktivering av den ursprungliga penicillinaktiviteten av 10 000, I.E./m1 losning, sa framgar det av detta forsok, att foratom det fenylattiksyran avspaltande enzymet aven penicillinas var fOr handen i bakterierna. Sadana bakterier aro lampade for framstallning av 6-aminopenicillansyra_ endast i sadana fall, da det fOreliggande penicillinaset endast inaktiverar en liten del av penicillinet eller da det lyckas att i vittgaende grad selektivt eliminera penicillinasaktiviteten.

Det ovan beskrivna provningsforfarandet kan ocksa komma till anvandning i modifierad form genom att man undersoker den enzymatiska aktiviteten i forhallande till penicillin G i cellfria kulturfiltrat.

Exempel 1. 160 liter 2-volymprocentig majsstopvatska injusteras med KOH till pH 7,0 och upphettas under 30 minuter 120° C. Efter avkylning klaras losningen genom centrifuge-ring och steriliseras, efter tillsats av 0,% glykos, under 40 minuter vid 110° C i jaskarlet. Denna narlosning inympas efter avkylning med 400 ml av en 18-timmars skakningskultur av E.coli ATCC 11105. Den vatskeformiga blandningen: luftas darefter med 150 liter luft per minut vid en omroringshastighet av 150 varv/minut och kultiveras under 17 timmar vid 31° C.

Bakteriecellerna avcentrifugeras Iran kulturlosningen, tvattas i 16 liter 1/15-m fosfatbufferilosning med pH 6,0 °eh omsuspenderas efter aveentrifugeringen i 16 liter 1/5-m fosfatbuffertlasning med pH 7,0. I denna suspension upploses torr penicillin G till en lioncentration av 5000 IE per ml varjamte 0,4 % toluen tillsattes. Ansattningen forvaras under 12 timmar vid 37° C och innehaller efter denna tid fortfarande 4200 IE penicillin G per ml suspension. Filtratet fran ett prov av denna suspension omsattes enligt i och for sig kanda metoder med fenylacetylklorid och later sig pa sd satt ateraktiveras upp till 4850 IE penicillin G/ml.

Exempel 2. 160 liter steril majsstOpvatska, framstalld pa samma satt som i exempel 1, dock utan tillsats av glykos, inympas med 400 ml av en 18-timmars skakningskultur av E.coli ATCC 11105. Den vatskeformiga blandningen luftas med 150 liter luft per minut vid en omroringshastighet av 150 varv/minut och kultiveras under 17 timmar vid 31° C.

Bakteriecellerna avcentrifugeras frail kulturlOsningen, tvattas i 16 liter 1/15-m fosfatbuffertlosning med pH 6,0 och omsuspenderas, efter avcentrifugering, i 16 liten 1/5-m fosfatbuffertlosning av pH 7,0. I denna suspension — —3 upploses torr penicillin G upp till en koncentration av 5000 IE per ml, varjamte 0,4 % toluen tillsattes. Den vatskeformiga bland- ningen Hiles under 5 timmar vid 37° C och innehaller efter denna tid fortfarande 600 IE penicillin G per ml suspension. Filtratet fran ett prov av denna suspension omsattes enligt i och for sig kanda forfaranden med fenylacetylklorid och later sig pa sa satt ateraktiveras upp till 4650 IE penicillin. G/ml.

Av ovanstaende exempel framgar, att man med lag glykoshalt erhaller relativt h8g spalt- ning av penicillinet och aven relativt hogt utbyte av reaktiverat penicillin om man nojer sig med att spalta relativt sma mangder.

De ytterligare forbattrade resultat, som i enlighet med foreliggande uppfinning erhallas genom att &Bingen av bakterierna genom- fOres i narvaro av fenylattiksyra eller derivat darav, framga av nedanstaende exempel.

Exempel 3. 160 liter steril majsstopvatska, framstalld pit samma satt som i exempel 2, dock med tillsats av 0,2 % kaliumfenylacetat, inympas med 400 ml av en 18-timmars skakningskultur av E. cob. ATM 11105. Den vats- keformiga blandningen luftas med 150 liter luft per minut vid en omroringshastighet av 150 varv/minut och kultiveras under 17 timmar vid 31° C.

Bakteriecellerna avcentrifugeras fran kulturlosningen, tvattas i 16 liter 1/15-m fosfat- buffertlosning av pH 6,0 och omsuspenderas, efter avcentrifugering, i 16 liter 1/15-m fosf atbuffertlOsning av pH 7,0. I denna suspension upploses torrt penicillin G till en koncentra- tion av 10 000 IE per ml, varjamte 0,4 % toluen tillsattes. Den vatskeformiga bland- ningen Mlles under 5 timmar vid 30° C och innehaller efter derma tid fortfarande 1500 IE penicillin G per ml suspension. Filtratet frail ett prov av denna suspension omsattes enligt I och for sig kanda forfaranden med fenylacetylklorid och later sig pa sit salt ateraktiveras upp till 9500 IE penicillin G/ml.

Exempel 4. 160 liter steril majsstopvatska, framstalld pa gamma salt som i exempel 2, dock med tillsats av 0,2 % kaliumfenylacetat, inympas med 400 ml av en 18-timmars skakningskultur av E.coli ATCC 11105. Den vatske- formiga blandningen luftas med 150 liter luft per minut vid en omroringshastighet av 150 varv/minut och kultiveras nuder 17 timmar vid 31° C titan overtryek. Under den sammanlagda tillvaxttiden inledas genom en fran luftledningen i jaskarlet skild ledning 5 liter koldioxid per minut i kulturen.

Bakteriecellerna avcentrifugeras frail kulturlosningen, tvattas i 16 liter 1/15-m fosfatbuffertlosning av pH 6,0 och omsuspenderas, efter fornyad avskiljning i 16 liter 1/5-m fosfatbuffertlOsning av pH 7,5, som innehaller 100 000 IE penicillin G per ml och 0,4 % toluen. Den vatskeformiga blandningen Mlles under 7 timmar yid 30° C. Under denna tic! Mlles reaktionsblandningens pH-varde, vilket sitsom en foljd av den enzymatiskt fran peni- cillinmolekylen avspaltade fenylattiksyran forskjutas mot sura sidan, genom upprepade tillsatser av koncentrerad Na2CO3-16sning mel- la.n 7,0 och 7,5. Efter 7 timmars reaktion innehaller den vatskeformiga blandningen fort- farande 12000 IE penicillin G per ml suspen- sion. Filtratet fran ett prov av denna suspension omsattes enligt i och for sig kanda forfaranden med fenylacetylklorid och later sig pa sit salt atera.ktiveras upp till 91000 IE penicillin G/ml.

Den vid detta tillvagagangssatt bildade 6- aminopenicillansyran kan med bra utbyte isoleras i form av ett farglOst, kristallint pulver.

Exempel 5. 160 liter steril majsstOpvatska, framstalld pa samma salt som i exempel 2, dock med tillsats av 0,2 % kaliumfenylacetat, inympas med 400 ml av en 18-timmars skakningskultur av E.coli ATCC 9637. Den vatske- formiga blandningen luftas med 150 liter luft per minut vid en omroringshastighet av 150) vary per minut och kultiveras under 17 tim- mar vid 310 C utan overtryck. Under den sammanlagda tillvaxttiden inledas genom en frail luftledningen i jaskarlet skild ledning 10 liter koldioxid per minut i kulturen.

Bakteriecellerna avcentrifugeras fran kulturlosningen, tvattas 1 16 liter 1/15-m fosfat- buffertlosning av pH 6,0 oeh omsuspenderas, efter fornyad avskiljning, i 16 liter 1/5-m fosfatbuffertlosning av pH 7,5, som innehaller 50000 IE penicillin G per ml och 0,4 % toluen.

Den vatslreformiga blandningen Hiles under 3 timmar vid 30° C. Under denna tid halles reaktionshlandningens pH-varde, vilket sasom en f8ljd av den enzymatiskt frail penicillinmolekylen avspaltande fenylattiksyran forskju- tes mot sura sidan, genom upprepade tillsatser av koncentrerad Na2CO3-losning mellan 7,0 och 7,5. Efter 3 tinunars reaktion innehaller den vatskeformiga blandningen fortfarande 4700 IE penicillin G per ml suspension. Filtratet fran ett prov av denna suspension omsat- tes enligt i och for sig kanda forfaranden med fenylacetylklorid och later sig darigenom geraktiveras upp till 46500 IE penicillin G/ml.

Den vid denna ansattning bildade 6-aminopenicillansyran kan flu med bra utbyte isoIeras i form av ett farglOst, kristallint pulver.

Liknande resultat erhaller man ocksa vid anvandning av foljande stammar om man gar tillvaga pa liknande satt som beskrivits i ovanstaende exempel.

Proteus, Aerobacter aerogenes, salmonellaoch shigellaarter, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fluorescerts, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Serratia marcescens, Micrococcus roseus, Microccoccus lysodeicticus, Sarcina lutea. — —

Claims (4)

Patentansprik:

1. Satt vid framstallning av enzymer med formaga att ur penicillin G avspalta 6-aminopenicillansyra, varvid penicillinspaltande bakterier under luftning odlas i narlosningar, vilka endast innehalla obetydliga mangder forjasbara kolhydrater, dvs. icke hogre halt av sadana kolhydrater an den soil flirefinnes i 2-procentig majsstdpvatska, kannetecknat darav, att odlingen genomfores i narvaro av fenylattiksyra eller derivat darav och att odlingen far fortga till dess att en vasentlig mangd av enzymerna alstrats.

2. Sat enligt patentanspraket 1, kanne tecknat darav, att fenylattiksyran eller derivaten darav anvandes i mangder av 0,002-2 procent.

3. Salt enligt patentanspraket 1 eller 2, kannetecknat darav, att under odlingen koldioxid inledes i nallosningarna.

4. Satt enligt patentanspraken 1-3, kannetecknat darav, att som huvudsaklig bestandsdel i narliisningarna anvandas majsstiipvatska. Anforda publikationer: