SE1250380A1 - Känsligt högeffektivt förfarande för DNA-skada och - reparation - Google Patents

Abstract

Uppfinningen avser ett högeffektivt förfarande för snabbsàllning av ett flertal genotoxiska amnen för att bestammagraden och typen av genotoxicitet, varvid förfarandet inne-fattar följande steg: (a) tillsatta en volym dsDNA till testbrunnarna (b) tillsatta en volym genotoxiska amnen som ska utvarderastill testbrunnarna (c) tillsatta dsDNA-specifikt fargamne och referensfargamnetill testbrunnarna (d) mata detekterbar fluorescent signal som sands ut fråntestbrunnarna under DNA-smaltning med anvandning av en real-tidstermocykler (e) analysera smaltkurvor för initial fluorescens, initial smalthastighet och initial smalttemperatur.Uppfinningen avser vidare en anordning för sàllning av ett flertal genotoxiska amne med anvandning av det beskrivna förfarandet. 1250380-1 (120025SE sv översättn rättzuidocx, 2013-04-18

Description

15 20 25 30 nen för att mäta ökningar i DNA-koncentration under tempera- turcykling. När amplifiering är slutförd möjliggör dessa färgämnen verifiering av Tm genom efter-PCR-småltningskurvor som ett test på amplifieringsspecificitet. Eftersom DNA smäl- ter inom ett snävt temperaturområde (några få °C) kräver smältkurvackvisition de bildanalys- och temperaturkontroll- förmågor som tillhandahålles av en realtidstermocykler.

Sådana DNA-smältkurvor är möjliga på grund av att dessa färg- ämnen fluorescerar företrädesvis då de interkaleras till dubbelsträngat, men inte enkelsträngat, DNA. När DNA denatu- rerar är färgämnet inte längre stabiliserat genom den nega- tivt laddade DNA-grundstommen och fluorescensen dämpas. Denna mekanism är vanlig i de flesta DNA-bindande färgämnen; graden av dubbelsträngad specificitet är emellertid en egenskap hos varje färgämne. Om smältkurvorna föregås av amplifiering krävs inte någon stor mängd av specificitet eftersom amplifi- eringssteget reducerar vilken icke-specifik bindning som helst till nivåer lägre än bruströskeln. Om ingen amplifie- ring emellertid genomförs måste detta färgämne vara mycket specifikt för dubbelsträngat DNA (dsDNA) (mer än 100-faldigt över enkelsträngat DNA (ssDNA) och RNA)).

Hittills har bestämning av genotoxicitet varit extremt lågeffektiv sållning. Många tillgängliga analyser mäter an- tingen bakteriell celltillväxt eller däggdjurscelltillväxt i medium behandlade med potentiella mutagener. Andra cellbase- rade analyser tar ett geninduktionsbaserat tillvägagångssätt, med användning av reporteranalyser för att mäta induktion av nyckel-DNA-skadande proteiner i däggdjurscellinjer, såsom reparerande enzym. Det cellulära maskineriet för att laga DNA-dubbelsträngbrott, -enkelsträngbrott och nukleotidbasska- dor är emellertid väldigt olika, vilket framtvingar separata test. Dessutom finns det överhörning mellan vägarna som medi- 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 erar signalinduktion, vilka kan leda till falska positiva och falska negativa test. Försöka att öka sållning av cellbase- rade analyser med användning av mikrotiterplattläsare har trasslat till sig eftersom det ar svårt att säkra kvaliteten hos dessa analyser mellan plattor. Befintliga genotoxicitets- test in vitro, såsom kometanalyser och 8-hydroxi-2- deoxiguanosinframställning, ignorerar vissa former av DNA- skada, såsom adduktbildande och DNA-strängtvärbindning, till förmån för andra. I slutänden måste multipla analyser utföras och olika data måste jämföras. Ingen av dessa tekniker låter sig enkelt testa multipla föreningar vid samma tidpunkt och användningen av komprimering år vital då man testar ett bibliotek innehållande miljoner föreningar.

Tre grupper har använt mycket specifika dsDNA-bindande färg- ämnen för att kvantifiera DNA-skada genom smältkurvanalys 1997; 2007; 1999).

(Singer et al., 1999; Kailasam et al., Rogers et al., Batel et al. Den första gruppen mätte ändringar- na i graden av dsDNA-denaturering vid högt pH och korrelerade detta till strålningsexponering. Denna teknik kräver emeller- tid att hela DNA:t kommer från samma sekvens och längd och buffertens pH måste bestämmas exakt, vilket gör den opraktisk för användning som en högeffektiv sållningsanalys. Den andra gruppen använde temperatur för att denaturera strålningsska- dat dsDNA, deras metodologi var emellertid bristfällig. De utförde mätningar efter värmning av DNA:t till endast tre temperaturer i ett vattenbad och krävde att fluorescens av det DNA-bindande färgämnet, i detta fall PicoGreen, skulle bestämmas omedelbart innan DNA:t kunde återhärdas. Återigen kräver denna teknik att DNA:t kommer från samma sekvens och längd och går inte att köras i en högeffektiv sållning. Den tredje gruppen mätte förlust av fluorescens efter lyckad smältning och återhärdande qPCR-cykler. Denna minskning i fluorescens härstammar från förlusten av små DNA-fragment 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 vilket är ett resultat från strålningsskada. Medan denna ändpunktsanalys är den mest högeffektiva sållningen av de tre teknikerna kvantifierar den ändå endast DNA-strängbrott ef- tersom den inte mäter hela smältkurvan, utan endast det ini- tiala värdet på varje cykel. Den kvantifierar inte heller DNA-strängbrott felfritt, eftersom de stora DNA-fragmenten som bildats fortfarande kan återhärdas (US Patent nr. 4,407,942 lO/1983 och 5,863,753 l/1999).

I ljuset av det föregående skulle det vara av signifikant fördel för tekniken om ett kvantitativt förfarande for att detektera genotoxicitet utvecklades som samtidigt kunde göra skillnader på olika former av bildade DNA-skador. Det skulle vara en ytterligare fördel om en sådan analys kunde dra nytta av högeffektiva sållningstekniska utvecklingar såsom fluidik- automatisering och täta mikrotiterformat för att skapa Ett snabba, korrekta resultat utan att vara arbetsintensiva. sådant förfarande är beskrivet häri.

Sammanfattning av uppfinningen Denna uppfinning övervinner nackdelarna med de tidigare ge- notoxicitetsanalyserna genom att tillhandahålla en högeffek- tiv sållningsundersökningsanalys för DNA-skadande agens, i vilket graden och typen av DNA-skada detekteras samtidigt.

Det primära syftet med uppfinningen är att tillhandahålla en fluorometrisk DNA-smältanalys in vivo for att identifiera och kvantifiera många former av genotoxicitet. Denna analys inne- fattar ett dsDNA-specifikt färgämne, ett referensfärgämne, dsDNA och det experimentella systemet, varvid nämnda dsDNA exponeras för de experimentella genotoxiska ämnena, dsDNA och referensfärgämnen. Proven förseglas och laddas i en realtids- termocykler för att analysera smältkurvorna. Kurvor från experimentella prov jämförs med de från kontrollprov i tre 1250380-1 (120025SE sv översätm râttaàdocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 parametrar. Potentiella medel att detektera genotoxicitet inkluderar: 1) initial fluorescens, eftersom dubbelsträng- brott ökar antalet DNA-molekyler medan DNA-interkalerande agens tävlar om DNA-bindning med färgämnet, 2) initial smält- grad, eftersom strängbrott och monofunktionell alkylering ökar mängden tidig DNA-smältning, medan tymintvärbindning och bifunktionell alkylering minskar den initiala smältgraden och 3) temperaturen vid vilken initial smältning sker (Ti), ef- tersom strängbrott och monofunktionell alkylering kommer att DNA- minska Ti, medan bifunktionell alkylering, strängtvärbindning och interkalering ökar Ti. Genotoxiska ämnen kan ha mer än en verkansmekanism; t.ex. är cisplatin ett kemoterapeutika som fungerar både som ett interkalerande ämne och ett bifunktionellt alkyleringsagens. Denna analys är lämplig for vilken standardiserad mikrotiterplatta som helst från Society of Biomolecular Screening och kan enkelt anpas- sas för högre densitetsformat inkluderande mikrofluidik- och matrisbaserade system.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett högeffektivt sållningsförfarande för att identifiera nya antineoplastiska föreningar, antiproliferativa föreningar och antimikrobiella föreningar.

Ett ytterligare syfte är att tillhandahålla ett högeffektivt sållningsförfarande för att identifiera potentiella mutagener i farmaceutiska läkemedelsföreningsbibliotek.

Ett ytterligare syfte är att kvantifiera genotoxiciteten som resulterar direkt eller indirekt från metabolism av vilken förening som helst. 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 Ett ytterligare syfte är att mäta den genotoxiska aktiviteten nedströms om vilken kemisk, biologisk, protein, enzym eller signalerande molekyl som helst.

Ett ytterligare syfte är att identifiera genotoxicitet resul- terande från ändringar i det cellulära maskineriet, speciellt DNA-reparationsmaskineriet.

Ett ytterligare syfte är att kvantifiera genetik (enkla nuk- leotidpolymorfismer, muteringar, etc.) eller epigena ändring- ar i DNA (övertvinning, metylering etc.).

Kort beskrivning av ritningarna Fig. l visar en schematisk ritning av smältkurvorna för DNA med representativa typer av DNA-skada.

Fig.2 visar effekten av ökade koncentrationer av fenantrenki- non på DNA-smältkurvor.

Fig.3 visar effekten av ökade koncentrationer av hexestrol på DNA-smältkurvor.

Fig.4 visar effekten av ökade koncentrationer av 2- hydroxiestradiol på DNA-smältkurvor.

Fig.5 visar bristen på effekt av ökade koncentrationer av kamptotecin på DNA-smältkurvor.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande förfarande tillhandahåller ett förfarande för att söka efter föreningar som modulerar DNA-smältkurvor.

Identifiering av sådana föreningar har signifikäns för både den farmaceutiska och medicinska industrin. Föreningar som orsakar genotoxicitet är mutagena och karcinogena och deras terapeutiska användning ska undvikas, förutom för användning i specifika sjukdomar såsom cancer. Omvänt har föreningar med potential för antingen förebyggande eller stimulering av 1250380-1 (120025SE sv översättn râttaàdocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 reparation flera användningsområden, inkluderande medicine- ring av cancer i förebyggande syfte och hjälpterapeutika.

På liknande sätt kan förmågan att detektera DNA-skada pålit- ligt och snabb vara användbart i vissa diagnostiska procedu- rer; såsom vid detektering av DNA-skada som uppkommit innan cancer, genotoxicitet som ett resultat av en speciell terapi eller DNA-oskadat tillstånd innan uppmaning av en terapi.

Förfaranden för att pålitligt bestämma både typen (eller typerna) av DNA-skada och graden av genotoxiciteten i ett högeffektivt sållningssätt har inte varit tillgängligt förrän föreliggande uppfinning.

För ändamålet att beskriva denna uppfinning är följande ut- tryck till hjälp och har följande betydelser: Definitioner Uttrycket ”specifik struktur” som det används häri avser vilken nukleinsyrastruktur som helst som inte känns igen som dubbelsträngat DNA.

Uttrycket ”DNA” avser deoxiribonukleinsyra. Det kommer att förstås av fackmännen på området att då manipulation beskrivs häri som avser DNA går de också att använda på andra speci- fika DNA- eller RNA-strukturer. dsDNA avser dubbelsträngad DNA. ssDNA avser enkelsträngad DNA.

Såsom det används häri avser uttrycket ”interkalering” infö- rande mellan lagren i DNA-basparstegen.

Uttrycket ”mutationer” avser ändringar i sekvensen hos en nukleinsyra av vildtyp eller ändringar i sekvensen hos en peptid. Sådana mutationer kan vara punktmutationer såsom 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 övergångar eller tvärgångar. Mutationerna kan vara avlägs- ningar, införanden eller dupliceringar.

Såsom det används häri avser ”DNA-skada” eller ”specifik DNA- skada” DNA som inte normalt är närvarande i en intakt cell under fysiologiska tillstånd under interfas. Strängbrott på grundstommen i DNA skapas till exempel inte normalt i en interfascell. Strängbrott skapas emellertid av vissa läkeme- del och ultraviolett eller joniserande strålning. För denna uppfinnings syfte anses alla störningar i grundstommen som strängbrott. Andra DNA-skador kan inkludera den kovalenta bindningen av kemiska delar till DNA, baspar-interkalering eller en kombination av DNA-skadetillstånd.

Uttrycket ”genotoxiskt ämne” såsom det används häri avser en genotoxisk förening, kemikalie, enzym såsom DNAse eller en biologisk missreglering såsom misslyckad DNA-reparation eller en biologisk process, varvid det genotoxiska ämnet resulterar från en kemisk, biologisk eller fysikalisk process. Källan för det genotoxiska ämnet kan variera mycket beroende på undersökningsområdet av intresse.

Uttrycket ”genotoxicitet” avser, såsom det används häri, bildandet av DNA-skada eller störningen av normal nukleinsy- rastruktur, vilket kan resultera i DNA-muteringar.

Såsom det används häri avser uttrycket ”smältkurva” denature- ringen eller återhärdningen av DNA som svar på ändringar i ureakoncentration eller organiskt temperatur, pH, jonstyrka, innehåll.

Såsom det används häri avser uttrycket ”fysiologiska till- stånd” temperatur, pH, jonstyrka, viskositet och liknande biokemiska parametrar som är kompatibla med en livskraftig 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 organism och/eller som typiskt existerar intracellulärt i en livskraftig odlad jästcell eller däggdjurscell. Exempelvis är de intracellulära betingelserna i en jästcell som odlats under typiska laboratorieodlingsbetingelser fysiologiska tillstånd. Lämpliga reaktionsbetingelser in vitro for tran- skriptionscocktails in vitro är i allmänhet fysiologiska tillstånd. I allmänhet innefattar fysiologiska tillstånd in pH 6,5-8,5, 20-45°C och 0,001-10 mM divalent katjon (Mgß, Caßå; foreträdesvis om- pH 7,2-7,6, vitro 50-200 mM NaCl eller KCl, kring 150 mM NaCl eller KCl, 5 mM divalent katjon och inkluderar ofta 0,01-1,0 procent icke-specifikt protein (t.ex. BSA). (Tween, NP-40, Triton X- 100) till 2%, En nonjonisk detergent kan ofta vara närvarande, vanligtvis vid omkring 0,001 typiskt 0,05-0,2% (volym/volym). Speciella vatten- haltiga tillstånd som kan väljas av utovaren enligt konvent- ionella förfaranden.

Uttrycket ”mikrotiterplatta” avser, såsom det används häri, den fysiska länken mellan åtminstone två kärl. Oftare inne- fattar en mikrotiterplatta den fysiska länken mellan flera kärl, såsom 96 kärl i ett matrisformat. En mikrotiterplatta kan ha minde, eller mer än 96 brunnar.

Uttrycket ”lågdensitetsformat” avser, såsom det används häri, användningen av individuella testror eller en mikrotiter- platta med 6, 12, 24 eller 48 brunnar. såsom det används häri, 384 eller 1536 Uttrycket ”hogdensitetsformat” avser, användningen av en mikrotiterplatta med 96, brunnar. eller mikrofluidikchip betyder 10 000 eller 100 000 eller Ett ultrahogt densitetsformat på en mikromatris fler reaktionskärl per matris.

Realtids-DNA-smältanalys 1250380-1 (120025SE sv översätm râttaàdocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 10 Komponenter i denna analys inkluderar l) ett reaktionskärl fritt från DNAse och RNAse, 2) ett dsDNA-specifikt färgämne, 3) ett referensfärgämne, 4) dsDNA och 5) det genotoxiska ämnet eller de genotoxiska ämnena. I detta fall ar det dsDNA- specifika färgämnet PicoGreen, referensfärgämnet är ROX, dsDNA kommer från kalvtymus och har modifierats för att upp- visa olika kända typer av DNA-skada. När provet värms i real- tidstermocyklern smälter dsDNA:t och blir enkelsträngat.

Enkelsträngat DNA stödjer inte längre PicoGreen-fluorescens, den relativa mängden PicoGreen till ROX-fluorescens minskar således proportionerligt med förlusten av DNA-basparning.

Reaktionskärlen fria från DNAse och RNAse som kan användas i denna analys inkluderar en behållare med förmåga att hålla vilken volym som helst, tillverkad av konventionella eller okonventionella material inkluderande till) (men inte begränsade polystyren, polyvinylklorid, polykarbonat, metall eller glas. Ytan på reaktionskärlen kan behandlas, derivatiseras eller beläggas. Ofta utgörs kärlen för högeffektiva såll- ningsanalyser av mikrotiterplattor. I en utföringsform är dsDNA:t derivatiserat till brunnarna i en mikrotiter-PCR- platta eller ett ultrahögeffektivt sållningschip. I en annan är PCR-plattor cellodlingsbehandlade för att försäkra cellu- lär vidhäftning.

En kvantitet av dsDNA tillsätts sedan till något tomt reakt- ionskärl. dsDNA:t kan vara från vilken källa som helst, an- tingen syntetisk, bakteriell, virus, växt eller djur; och kan vara av vilken sekvens eller längd som helst. dsDNA:t kan tidigare vara skårat, skuret, amplifierat eller bearbetat genom vilken procedur som helst är känd för en fackman på området. 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 ll DNA:t behandlas sedan med det genotoxiska ämnet, vilket kan användas oberoende eller administreras tillsammans med nägot inkluderande behandlingssystem, (men inte begränsat till) vilket metaboliserat enzym, cellfraktion, co-faktor eller organism som helst som ändrar, förhöjer eller förbättrar potentialen hos DNA-skada. Behandling med det gentoxiska ämnet kan ske under vilken tidslängd som helst före, under eller efter tillsats av fluorescent färgämne (eller fluore- scenta färgämnen).

Efter behandling med det genotoxiska ämnet tillsätts en cock- tail av dsDNA-specifika färgämnen och referensfärgämnen till reaktionskärlet. Vilken indikator som helst med selektivitet för dsDNA kan användas med eller utan en referensindikator för normalisering. När färgämnet har tillsätts förseglas reaktionskärlet och utsätts för smältkurvanalys.

Smältkurvanalys utförs typiskt i ett realtidstermocyklerin- strument. Denna anordning har fördelarna med utomordentligt känslig provtemperaturkontroll liksom även ett fluorescensde- tekteringssystem. En fackman på området kan emellertid an- vända vilket lämpligt system som helst för att utföra DNA- smältanalysen. Utdata från sådana instrument är den uppmätta utdatan från en eller flera fluorescensövergångar och tempe- raturen vid vilken fluorescensen bestämdes.

I en utföringsform är den räa dsDNA-specifika fluorescensen normaliserad till motsvarande referensfluorescens vid varje temperaturpunkt för att korrigera för minskad färgfluore- scens, direkt resulterande från den ökade lösningstemperatu- ren. Denna normaliserade fluorescens plottas sedan som funkt- ion av temperaturen för att skapa smältkurvan. Initial fluo- rescens frän denna kurva används för att bestämma omfattning- en av dubbelsträngbrott. Den första derivatan av denna smält- 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 l2 kurva plottas sedan och används för att bestämma bäde den initiala smälttemperaturen och smälthastigheten över hela temperaturgradienten. Jämförelse av dessa data med negativ kontrolldata (ingen DNA-skada) och positiv kontrolldata (prov med känt gentoxiskt ämne) samanalyserade på samma platta avslöjar typen och graden av DNA-skada. Schematisk represen- tation av de typiska smältkurvorna visas i figur l, varvid DNA-dissociation ökar med ökat pH, salthalt eller temperatur, vilket resulterar i en minskning i relativ fluorescens. Typen och kvantiteten av DNA-skada ändrar väsentligen kännetecknen för denna smältkurva, så att denna analys kan användas för att kvalitativt och kvantitativt beskriva den genotoxiska potentialen hos okända föreningar.

Förfarandet enligt denna uppfinning kan exempelvis användas i detekteringen av DNA-skada för att kvalificera eller diskva- lificera DNA för ytterligare analys, inkluderande, men inte begränsat till: (a) genetisk analys eller genomanalys av en enkel cell eller en population av celler men inte (b) gen- eller genomsekvensering, inkluderande, begränsat till, mälsökande sekvensering, exomsekvensering, helgenomsekvensering, NextGen-sekvensering och ChIP- sekvensering (c) genotypning, inkluderande, men inte begränsat till, de- tektering av enkla nukleotidpolymorfismer eller helgenom- genotypning inkluderande, (d) genuttryckningsanalys, men inte begränsat till realtids-PCR eller kvantitativ PCR, mikrofluidik-, chip- eller matrisbaserad högeffektiv uttryckningsanalys men inte begrän- (e) reproduktionsnummeranalys, inkluderande, sat till, bestämning av reproduktionsnummervariation mellan individuella celler eller organismer. 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 l3 Förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan vidare använ- das i detekteringen av DNA-skada för att kvalificera eller diskvalificera DNA för att diagnostiskt testa användningar, inkluderande, men inte begränsade till: (a) DNA härstammande från helblod, serum eller vilken annan biologisk källa som helst (b) friflödande DNA.

Förfarandet enligt någon av de beskrivna utföringsformerna kan användas för att identifiera genotoxiska ämnen för att utveckla ett förfarande för att behandla ett tillstånd, en sjukdom eller en störning i människor eller djur genom att utveckla en DNA-bindande förening innefattande: (a) sållning av föreningar enligt analysen redogjord för i denna ansökan; (b) val av de föreningar som uppvisar störst effektgrad på DNA-smältning; (c) formulering av en farmaceutisk komposition innefattande en eller flera av vilka som helst av dessa föreningar; och (d) administrering av den farmaceutiska kompositionen till en individ i behov av sådan behandling.

Föreningarna nämnda i steg (a) kan vara samma genotoxiska eller kan vara föreningar som nämnts i början av paragrafen, andra på grund av att de är terapeutiska.

En anordning att användas i förfarandena beskrivna i denna uppfinning för sållning av ett flertal genotoxiska ämnen kan innefatta: (a) ett flertal testbrunnar till vilka en volym dsDNA kan tillsättas, och (b) utrustning för övervakning av DNA-smältning, inklude- rande, men inte begränsat till, utrustning använd för att 1250380-1 (120025SE sv översätm râttaàdocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 14 detektera DNA med användning av nativ absorption, eller fluo- rescenta eller spektrofotometriska DNA-färgämnen, företrädesvis (c) utrustning för analysering av smältkurvor, en termocykler.

Testbrunnarna i anordningen kan vidare innefatta en behållare med förmågan att hålla vilken volym som helst, tillverkade av konventionella eller okonventionella material, inkluderande, men inte begränsat till, polystyren, polyvinylklorid, po- lykarbonat, metall eller glas, och varvid testbrunnarna val- fritt är behandlade, derivatiserade eller belagda.

Exempel Flera farmakologiskt viktiga genotoxiska ämnen är kända att existera. Många av dessa genotoxiska ämnen används som anti- neoplastiska och antiproliferativa terapeutiska ämnen, och skrivs ut som kemoterapeutika och antibiotika. Det är emel- lertid inte alla kemoterapeutiska och antibiotiska behand- lingar som använder sina effekter genom en genotoxisk mekan- ism. Test av en genotoxisk analys mot kända neoplastiska och antiproliferativa farmakologiska ämnen representerar således ett användbart bevis för konceptet.

Förmågan att detektera DNA-skadande ämnen undersöktes först under betingelse under vilka endast det farmaceutiska ämnet tilläts interagera med dsDNA:t. Figurer 2-5 visar exempel på effekterna av kemikalier som modifierar DNA på DNA- smältprofiler.

Figur 2 visar effekten av fenantrenkinon på DNA-smältkurvor. dsDNA (1000 ng/ml), behandlad med ökande koncentrationer av det alkylerande ämnet fenantrenkinon, inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX-referensfärgämnet. Prov analyserade med användning av en ABI 7300 realtidstermocykler över ett 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 l5 temperaturomräde av 4°C till 99°C. Data presenteras som PicoGreen-fluorescens normaliserad till ROX. Dessa data visar att Ökande dsDNA-alkylering orsakar en Ökning i den initiala smälttemperaturen.

Dessa data visar att ökad dsDNA-alkylering orsakar en ökning i den initiala smälttemperaturen. Detta betyder att okning i initial smälttemperatur jämfört med kontroll indikerar dub- belsträngad DNA-alkylering.

Figur 3 visar effekten av hexestrol på DNA-smältkurvor. dsDNA (l000 ng/ml), behandlad med ökande koncentrationer av det interkalerande ämnet hexestrol, inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX-färgämnet. Proven analyserades med användning av ABI 7300 realtidstermocykler över ett temperaturomräde av 4°C till 99°C. Data presenteras som PicoGreen-fluorescens norma- liserad till ROX. Dessa data visar att okände dsDNA- interkalering orsakar en minskning av den initiala smälttem- peraturen.

Dessa data visar att ökande dsDNA-interkalering orsakar en minskning i fluorescens. Detta betyder att det finns en minskning av den initiala smälttemperaturen for dsDNA och indikerar närvaron av ett interkalerande ämne.

Figur 4 visar effekten av 2-hydroxiestradiol på DNA- smältkurvor. dsDNA (1000 ng/m), behandlad med ökande koncent- rationer av det DNA-strängklippande agenset 2- hydroxiestradiol, inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX- referensfärgämnet. Prov analyserades över ett temperaturom- räde av 4°C till 99°C med användning av en ABI 7300 realtids- termocykler. Data presenteras som PicoGreen-fluorescens nor- maliserad till ROX. Dessa data visar att ökande dsDNA- klippning orsakar en ökning i initial smälttemperaturlutning 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 W ß Z) 25 30 16 på grund av enkelsträngbrott. Då enkelsträngbrott befinner sig i nära anslutning till varandra kan följden bli dubbel- Detta visas ovan som en ökning i initial fluore- strängbrott.

SCGÛS.

Figur 5 visar effekten av kamptotecin på DNA-smältkurvor. dsDNA (lOOO ng/ml) behandlades med icke-genotoxiska koncent- rationer av kamptotecin och inkuberades med PicoGreen och rodamin-ROX-referensfärgämnet. Prov analyserades med anvand- ning av en ABI 7300 realtidstermocykler över ett temperatur- område av 4°C till 99°C. Data presenteras som PicoGreen- fluorescens normaliserad till ROX. Dessa data visar att det icke-genotoxiska kamptotecinet inte ändrar DNA-smältning.

För en fackman på området kan föreliggande uppfinning appli- ceras som en sållning av nya antineoplastiska, antiprolifera- tiva och antimikrobiella terapeutika. Dessa föreningar uppvi- sar ofta sina antineoplastiska, antiproliferativa och antimi- krobiella egenskaper via ett genotoxiskt verkningssätt. Före- liggande uppfinning kan användas som en högeffektiv sällning för att identifiera potentiella nya antineoplastiska, anti- proliferativa och antimikrobiella terapier från läkemedels- bibliotek innehållande många miljoner föreningar. Medan för- mågan att skada DNA kan vara en viktig egenskap för dessa speciella läkemedelsklasser, är mutagenicitet i allmänhet ansedd som en oönskad egenskap hos en läkemedelskandidat.

Mutagener avancerar ofta till dyra prekliniska tester innan dessa egenskaper identifieras och läkemedlet avlägsnas från kandideringen; det är därför extremt önskvärt att identifiera dåliga ledande föreningar tidigare i läkemedelsutvecklings- processen. För en fackman på området kan föreliggande uppfin- ning användas för att söka i hela bibliotek med föreningar för att identifiera potentiella mutagener eller föreningar som metaboliserar till mutagener innan de går in i preklinisk 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 17 utveckling. I det senare fallet kan föreningar placeras i analysen efter att de har behandlats med enzym som kan göra dem metaboliserade. Exempelvis kan föreningar först behandlas med mikrosomala fraktioner som ar kända att mediera metabol- ism eller cytokrom P450-enzymer. Föreningarna kan sedan till- sättas till analyserna för att utvärdera DNA-skada. I en utföringsform för den högeffektiva sållning kan enzymer som medierar metabolism tillsättas direkt till reaktionskärlen samtidigt med DNA:t vilket sedan kan analyseras för dess fluorescensegenskaper.

På liknande sätt kan föreliggande uppfinning utsträckas till vilken DNA-källa som helst, inkluderande den som kan isoleras från celler eller vävnader. Det skulle därför vara enkelt för en fackman på området att utsträcka föreliggande uppfinning till att detektera DNA-skada resulterande från behandlingen av dessa celler och vävnader. Denna analys kan därmed använ- das för att detektera genotoxicitet resulterande frän änd- ringar i cellulärt maskineri, eller vilken sådan aktivitet som helst nedströms om vilken kemisk, biologisk, protein, enzym eller signalerande molekyl som helst, eller slutligen resulterande från vilken genetisk eller epigenetisk ändring i DNA:t som helst.

Referenser Singer YL, Jones LJ, Yue ST, Haugland RP., “Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.”, Anal Biochem. 249:228-238 (l997).

Kailasam S, Rogers KR., “A fluorescence-based screening assay for DNA damage induced by genotoxic industrial chemicals.”, Chemosphere. 66:l65-l7l (2007). 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 l8 Rogers KR and Apostol A, “Detection of low dose radiation induced DNA damage using temperature differential fluores- cence assay”, Anal Chem 7l: 4423-4426 (l999).

Batel et al., “A microplate assay for DNA damage determina- tion (fast micromethod) in cell suspensions and solid tis- sues”, Anal. Biochem. 270:l95-200 (l999).

US-patent nr. 4,407,942 l0/l983 US-patent nr. 5,863,753 l/l999 Wittwer CT., “High-resolution DNA melting analysis: advance- ments and limitations.”, Hum Mutat. 30:857-859 (2009).

Garritano et al., “Determining the effectiveness of High Resolution Melting analysis for SNP genotyping and mutation scanning at the TP53 locus.”, BMC Genet. l0:5, (2009).

Shi MM., “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technolo- gies.”, Clin Chem. 47:l64-l72 (2001).

US-patent med publiceringsnummer US 2006/00789ll Al, Molecu- lar Probes: The Handbook, Parts l-3 (2009).

Persil O et al., “Harnessing DNA intercalation”, Trends Bio- technol., 25:433-436 (2007). 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18

Claims (22)

10 15 20 25 30 l9 PATENTKRAV

1. l. Högeffektivt förfarande för snabb sållning av ett flertal genotoxiska ämnen för att bestämma graden och typen av ge- notoxicitet, innefattande stegen att: (a) tillsätta en volym dsDNA till testbrunnar (b) tillsätta en volym genotoxiska ämnen som ska utvärderas till testbrunnarna (c) tillsätta dsDNA-specifikt färgämne och referensfärgämne till testbrunnarna (d) mäta detekterbar fluorescent signal utsänd från testbrun- narna under DNA-smältning med användning av en realtidstermo- cykler (e) analysera smältkurvor för initial fluorescens, initial smälthastighet och initial smälttemperatur.

2. Förfarande enligt krav l, varvid tillsatsen av genotoxiska ämnen i steg b) görs tillsammans med ett annat behandlingssy- stem, vilket behandlingssystem kan vara vilket metabolise- rande enzym, cellfraktion, cofaktor, organism som helst som ändrar, ökar eller förbättrar potential för DNA-skada, och/eller varvid exponeringen av det genotoxiska ämnet inklu- derar användningen av epigena regulatorer eller modulatorer.

3. Förfarande enligt något av kraven l eller 2, varvid det genotoxiska ämnet är (a) en eller flera kemiska produkter, antingen syntetiska eller naturliga; eller (b) ett biologiskt ämne, antingen protein, lipid, kolhydrat, nukleinsyra eller en kombination av dessa; eller (c) en fysikalisk eller kemisk process; eller eller och (d). (d) ett bibliotek av genotoxiska föreningar; vilken kombination som helst av (a), (b), (c) 1250380-1 (120025SE sv översätm râttaàdocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 20

4. Förfarande enligt något av kraven l, 2 eller 3, varvid åtminstone ett av stegen utförs med hjälp av robot.

5. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid dsDNA:t härstammar från vilken källa eller form som helst, syntetisk eller naturlig.

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid genotoxiciteten är ett direkt eller indirekt resultat av en biologisk ändring eller process, inkluderande de som resulte- rar från syntetisk manipulering.

7. Förfarande enligt något av de föregående kraven, utfört i innefattande enkla antingen låg- eller högdensitetsformat, rör, mikrotiterplattor, chip och mikrofluidikmatriser.

8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, antingen föregånget eller följt av DNA-amplifiering.

9. Förfarande enligt något av de föregående kraven, med an- vändning av vilket cellulärt, biologiskt eller syntetiskt DNA som helst, med eller utan lys- eller reningssteg som källan för dsDNA.

10. Förfarande enligt något av de föregående kraven, med användning av DNA isolerad från celler eller vävnader expone- rade eller oexponerade för genotoxiska ämnen.

11. ll. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid vilken lämplig teknik som helst används för att övervaka DNA- men inte begränsat till, en fluore- smältning, inkluderande, scent teknik. 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 21

12. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid ett fårgåmne eller någon komponent i förfarandet år kovalent eller icke-kovalent bunden till vilken yta, analyskomponent eller molekyl som helst.

13. Förfarande enligt något av de föregående kraven varvid en termocykler eller annan låmplig vårme-, pH- eller salthalt- skålla anvånds för att smålta DNA:t och/eller registrera fluorescens.

14. Förfarande enligt något av de föregående kraven för dia- gnostisk, klinisk eller terapeutisk anvåndning.

15. Förfarande enligt något av de föregående kraven för att söka efter farmakologiska aktiviteter inkluderande, men inte begrånsat till, antineoplastiska och antiproliferativa akti- viteter och/eller antimikrobiella aktiviteter; såsom antibak- teriella, antiprotozoala, antisvamp-, antivirala och anti- helmintiska egenskaper.

16. Förfarande enligt något av de föregående kraven för an- våndning i detekteringen och regleringen av genotoxiska åmnen luft, pestici- innefattande de som återfinns i mat, vatten, der, konsumentprodukter och vilka andra bostads-, jordbruks-, miljö- eller industritillåmpningar som helst.

17. Förfarande enligt något av de föregående kraven för an- vändning i detekteringen av DNA-skada för att kvalificera eller diskvalificera DNA för ytterligare analys, inklude- rande, men inte begrånsat till: (a) genetiska analyser eller genomanalyser av en enkel cell eller en population av celler (b) gen- eller genomsekvensering inkluderande, men inte be- grånsat till, målsökande sekvensering, exomsekvensering, 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 30 22 helgenomsekvensering, NextGen-sekvensering och ChIP- sekvensering (c) genotypning inkluderande, men inte begränsat till, detek- tering av enkelnukleotidpolymorfismer eller helgenomgenotyp- ning (d) genuttryckningsanalys inkluderande, men inte begränsat till, realtids-PCR eller kvantitativ PCR, mikrofluidik-, chip- eller matrisbaserad högeffektiv uttryckningsanalys inkluderande, (e) reproduktionsnummeranalys, men inte begrän- sat till, bestämning av reproduktionsnummervariation mellan individuella celler eller organismer.

18. Förfarande enligt något av de tidigare kraven för använd- ning i detekteringen av DNA-skada för att kvalificera eller diskvalificera DNA för diagnostiska testappliceringar, inklu- derande men inte begränsat till: (a) DNA härstammande från helblod, serum eller vilken annan biologisk källa som helst (b) friflödande DNA.

19. Förfarande enligt något av de föregående kraven för an- vändning i identifiering av genotoxiska ämnen för att skapa nya molekylära samlingar inkluderande, men inte begränsat till fluorescenta nanomärkningar.

20. Förfarande enligt något av de föregående kraven för att identifiera genotoxiska ämnen för att utveckla ett förfarande för behandling av ett tillstånd, en sjukdom eller en störning i människor eller djur genom att utveckla en DNA-bindande förening innefattande: (a) sållning av föreningar enligt någon av analyserna be- skrivna i de föregående kraven; (b) välja de föreningar som uppvisar störst effektgrad på DNA-smältning; 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18 10 15 20 25 23 (c) formulering av en farmaceutisk komposition innefattande en eller flera av vilka som helst av dessa föreningar; och (d) administrering av den farmaceutiska kompositionen till en individ i behov av sådan behandling.

21. 2l. Anordning för att sålla ett flertal genotoxiska ämnen enligt förfarandet enligt något av kraven l-20, varvid anord- ningen innefattar: (a) ett flertal testbrunnar till vilka en volym av dsDNA kan tillsättas, och (b) utrustning för övervakning av DNA-smältning, inklude- rande, men inte begränsat till, utrustning använd för att detektera DNA med användning av naturlig absorption, eller fluorescenta eller spektrofotometriska DNA-färgämnen, (c) utrustning för analysering av smältkurvor, företrädesvis en termocykler.

22. Anordning enligt krav 21, varvid testbrunnarna innefattar en behållare med förmågan att hålla vilken volym som helst utförd av konventionellt eller okonventionellt material in- kluderande, men inte begränsat till polystyren, polyvinylklo- rid, polykarbonat, metall och glas, och varvid testbrunnarna valfritt är behandlade, derivatiserade eller belagda. 1250380-1 (120025SE sv översättn râtteuidocx, 2013-04-18