SA95160061B1

SA95160061B1 - مثبطات بروتياز hiv (protease inhibitors)

Info

Publication number: SA95160061B1
Application number: SA95160061A
Authority: SA
Inventors: مارلس هيموند; فنسنت جي. كاليش; سيجفرد هاينز رايخ; جون هـ. تاتلوك; بروس ايه درسمان; جيمز أي. فريتس; وليم جي. هورنباك; ستيفن دبليو كالدور; جون أي. مونرو; تيموثي ايه شيبرد; مايكل جي. رودريجوز
Original assignee: أجورون فارماسيوتكالز انك
Priority date: 1995-06-20
Filing date: 1995-06-20
Publication date: 2006-05-06

Abstract

الملخص: يتعلق هذا الإختراع بانواع جديدة من مركبات كيميائية chemical compounds مفيدة كمثبطات بروتياز HIV protease HIV inhibitors وبإستخدام تلك المركبات كعوامل مضادة للفيروسات antiviral agents. يوفر الإختراع الحالي مركب compound من الصيغة:

Description

Y

HIV (protease inhibitors) ‏مثبطات بروتياز‎ ‏الوصف الكامل‎ ‏خلفية الا اختراع‎

HIV ‏يتعلق هذا الإختراع بأنواع جديدة من مركبات كيميائية مفيدة كمثبطات بروتياز‎ ‏وبإستخدام تلك المركبات كعوامل مضادة للفيروسات‎ HIV protease inhibitors .antiviral agents (AIDS) Acquired Immune Deficiency Syndrome ‏إن عرض نقصان المناعة المكتسبة‎ ° ‏(الإيدز) هو مرض أو حالة تم إكتشافه منذ فترة حديثة نسبيا. إن الإيدز يسبب تحلل تدريجي‎ ‏متزايد في‎ deterioration ‏جهاز مناعة الجسم بالإضافة إلى تدهور‎ gradual breakdown ‏الجهازين العصبيين المركزي والطرفي. لأن إكتشافه أوليا كان في أوائل الثمانينات؛ فقد إنتشر‎ ‏الإيدز بسرعة وقد وصل الآن إلى نسب وبائية في قطاعات محدودة نسبيا من الناس. لقد أدت‎ ‏؟‎ retrovirus ‏الأبحاث المكثفة إلى إكتشاف العامل المسبب للمرض ؛ وهو الفهيروس الإرتجاعي‎ ٠ ‏والذي يشار إليه الآن‎ «(HTLV-ID) human T-lymphotropic ‏بشرية‎ T ‏المنتحي لخلية ليمفاوية‎

HIV ‏بصورة شائعة أكثر بأنه فيروس نقصان المناعة الآدمية أو‎ ‏هو عضو من صف من الفيروسات تسمى الفيروسات الإرتجاعية. يتكون‎ HIV ‏إن‎ ‏بواسطة‎ DNA ‏والذي يتحول إلى‎ RNA ‏من‎ retroviral genome ‏الجينوم الفيروسي الإرتجاعي‎ ‏الفيروسي‎ DNA ‏هذا‎ Adve ‏يتكامل بدرجة ثابتة‎ Lrevers transcription ‏الإنتساخ العكسي‎ ٠ ‏لخلايا‎ replicative ‏وء بإستخدام العمليات النسخية‎ host ‏الإرتجاعي في كروموسوم خلية عائل‎ ‏وينقل العدوى إلى خلايا‎ 08 particles ‏العائل؛ ينتج جسيمات فيروسية إرتجاعية جديدة‎ ‏بشرية التي تلعب دورا حيويا في‎ Tara ial ‏له إنجذاب خاص للخلية‎ HIV ‏أخرى. يبدو أن‎ ‏لخلايا الدم البيضاء هذه تسبب نقصان في العدد الكلي لهذه‎ HIV ‏جهاز مناعة الجسم. إن عدوى‎ ‏الخلايا البيضاء . في النهاية؛ يصبح جهاز المناعة غير فعال وغير مؤثر ضد الأمراض‎ © ‏رئوي كيسي كاريني‎ He coal ‏من بين‎ «Jie ‏المختلفة‎ opportunistic ‏الإنتهازية‎ ‏وسرطان الجهاز‎ Karposis sarcoma ‏سرقوم كابوسي‎ «pneumocystic carini pneumonia .cancer of the lymph system ‏الليمثاري‎ ‏ليست مفهومة؛ فإن تحديد‎ HIV ‏على الرغم من أن الآلية المحددة لتكوين وعمل فيروس‎ ‏فقد إتضح أن‎ Jo ‏أدى إلى بعض التطور في السيطرة على المرض. على سبيل‎ Sod

YA v ‏مؤثرا في تثبيط الإنتساخ العكسي للجينوم الفيروسي الإرتجاعي‎ (AZT) azidothymidine ‏العقار‎ ‏وبذلك يعطي مقياسا للتحكم في المرض » برغم أنه ليس شفاءا؛ للمرضى المصابين‎ HIV ‏لفيروس‎ ‏بالإيدز. إن البحث مستمر من أجل عقاقير يمكنها أن تشفي أو على الأقل توفر مقياس محسن‎ ‏المميت.‎ HIV ‏للتحكم في المرض لفيروس‎ ‏إن السمة الروتينية للإنتساخ الفيروسي الإرتجاعي هي معالجة بعد الترجمة‎

HIV ‏تتم هذه المعالجة بواسطة إنزيم بروتياز‎ .polyproteins ‏لعديد بروتينات‎ 1 translational ‏ينتج هذا عديد ببتيدات كاملة النمو تساعد بعد ذلك في تكوين‎ ٠ ‏فيروسيا‎ encoded (as) ‏مشفر‎ ‏إذا تم إخماد 410 هذه المعالجة الجزيئية؛ فعندئذ ينتهي الإنتاج الطبيعي‎ ٠ ‏وعمل الفيروس المعدي‎

HIV ‏لذلك؛ فإن مثبطات بروتياز 1117 قد تقوم بوظيفة كعوامل فيروسية مضادة‎ HIV ‏لفيروس‎ ‏بروتين‎ pol gene ‏من جين‎ translated ‏هو واحد من المنتجات المترجمة‎ HIV ‏إن بروتياز‎ Ve ‏بصفة خاصة عديد ببتيدات‎ cleaves ‏إن هذا البروتياز الفيروسي الإرتجاعي يشطر‎ HIV ‏بنائي‎ ‏أخرى عند أماكن متفرقة لتنتج هذه البروتينات والإنزيمات البنائية حديثة التنشيط وبذاك‎ RA

HIV ‏حسب ذلك؛ فإن تثبيط بروتياز‎ LAS virion ‏يصبح تكرر الفيريون (الجسيم الفيروسي)‎ ‏بواسطة مركبات فعالة قد يمنع التكامل الأولي للخلايا الليمفاوية 7 المصابة خلال المرحلة المبكرة‎ proteolytic ‏بالإضافة إلى تثبيط المعالجة الفيروسية المحللة للبروتين‎ HIV-1 ‏من دورة حياة‎ ٠ ‏خلال المرحلة المتأخرة. إضافة إلى ذلك؛ فإن مثبطات البروتياز قد تكون لها مزايا مثل التوافر‎ ‏بسهولة أكثر ؛ فترة بقاء أطول في الفيروس؛ وسمية أقل من العقاقير المتوافرة حالياء ربما نظرا‎ ‏لخصوصيتها للبروتياز الفيروسي الإرتجاعي.‎ ‏مسستبدلة كمثبطات بروتياز‎ pipecolinic acid ‏بمشتقات‎ EP-A-0 560 268 ‏تتعلق البراءة‎ cytopathogenic ‏إن المركبات موصوفة بأنها تعوق التأثيرات المولدة للإعتلال الخلوي‎ HIV Ye ‏بشرية.‎ WA ‏في‎ HIV ‏بسبب‎ ‏لها‎ oligopeptide analogs ‏بمماثلات أوليجوببتيد‎ EP-A-0 539 2 ‏تتعلق البراءة‎ ‏؛ توصف أملاح مقبولة دوائيا منها وتركيبات دوائية‎ SA ‏إضافة‎ HIV ‏خاصية تثبيط بروتياز‎ ‏لها نشاط مثبط لبروتيازات من أصل‎ amino acid ‏بمشتقات‎ EP-A-0 346 847 ‏البراءة‎ (lai Yo ‏فيروسي. إنها تتعلق أيضا بأملاح مقبولة دوائيا منها وبتركيبات دوائية تشملها.‎ ‏فخلا‎

¢ طبقا لهذا ‎op) pay)‏ يتوافر صنف جديد من المركبات الكيميائية يمكنه تثبيط و/أو إعاقة نشاط بروتياز ‎HIV‏ ويوقف إنقسام فيبروس ‎HIV‏ تركيبات دوائية تحتوي على هذه المركبات: وإستخدام المركبات كمثبطات بروتياز ‎HIV‏ ‏الوصف العام ‎HAM‏ اع يتعلق الإختراع الحالي بمركبات تقع في نطاق الصيغة أدناه؛ وأملاح ‎salts‏ مقبولة دوائيا منهاء تتبط البروتياز المرمز بواسطة فيروس نقصان المناعة البشرية ‎(HIV)‏ من النمط ‎(HIV-1) ١‏ أو النمط 7 (1117-2). إن هذه المركبات مفيدة في معالجة عدوى ‎HIV‏ ومعالجة مرض نقصان المناعة البشرية المكتسبة (الإيدز). إن المركبات؛ الأملاح المقبولة دوائيا منهاء والتركيبات الدوائية من الإختراع الحالي يمكن إستخدامها وحدها أو في إتحاد مع مضادات فيروسية ‎antivirals‏ ‎٠‏ أخرى؛ مواد ‎Alans‏ (إضابطة) للمناعة ‎immunomodulators‏ مضادات حيوية أو لقاحات. يوفر الإختراع الحالي مركب من الصيغة: ‎OH‏ ‎Op‏ ‎APS”‏ ‏7ن ‎sen‏ 0 أو ملح مقبول دوائيا منه. في تجسيد مفضل يكون الزمير ‎Sl‏ 087 0 للمركب له الصيغة: ا 0 ‎xe‏ ‎N ~~‏ ‎A‏ ميا 5 ‎H Yo‏ أو ملح مقبول دوائيا منه. في تجسيد مفضل بصفة خاصة يكون ملح الزمير ‎DED‏ نقيا بصورة أساسية. في تجسيد مفضل بصفة خاصة أيضا يكون الزمير 2 نقيا بصورة أساسية. طبقا لتجسيد آخر يوفر الإختراع الحالي مركب من الصيغة: محلا

: ‎Cs OH “TH CH3SO3H‏ ‎OO kK‏ ‎O “spn ©‏ في تجسيد مفضل يوفر الإختراع الحالي زمير ‎ie‏ له الصيغة: ‎OH 5‏ اق ب" ‎oH‏ .4 ‎N ~~‏ لي ميا 1 ‎H‏ ‏في تجسيد مفضل بصفة خاصة يكون الزمير المُجَسَمِ نقيا بصورة أساسية. ° طبقا لتجسيد إضافي يوفر الإختراع الحالي تركيب دوائي يشمل مركب مطابق للإختراع الحالي ومادة حاملة ‎carrier‏ مقبولة دوائيا. طبقا لتجسيد آخر يوفر الإختراع الحالي إستخدام أي من المركبات أعلاه لتحضير ‎fie‏ لتتبيط بروتياز ‎HIV‏ ‎ve‏ يوفر الإختراع الحالي مركبات جديدة تقع في نطاق الصيغة؛ حسب الوصف أعلاه؛ مفيدة لعلاج عدوى ‎HIV‏ و/أو الإيدز. إن كل درجات الحرارة المذكورة هنا هي درجات مئوية (*مثوية). إن كل وحدات القياس المستخدمة هنا هي وحدات وزن ماعدا للسوائل فهي وحدات حجم. يوجد في مركبات الإختراع ‎J‏ مركزين غير متماثلين ‎asymmetric‏ على الأقل يرمز 1° إليهما بالعلامة النجمية في الصيغة. كنتيجة لهذه المراكز غير المتماثلة؛ يمكن أن توجد مركبات الإختراع الحالي في أي من الأشكال الزميرية المجسمة ‎stereoisomeric forms‏ الممكنة؛ ويمكن إستخدامها في خلطات من زمراء مجسمة؛ والتي يمكن أن تكون نشطة ضوئيا أو رزيمة ‎racemic‏ أو يمكن إستخدامها وحدها كزمراء مجسمة نقية أساسياء أي؛ نقية بنسبة 798 على الأقل. إن كل ‎JES‏ غير ‎٠‏ المتماثلة؛ الزمراء المجسمة المنفردة وإتحادات من ذلك هي في نطاق الإختراع الحالي. ‎YA‏

يمكن تحضير الزمراء المجسمة المنفردة من مصادرها الأولية الخاصة بها بالإجراءات الموصوفة أعلاه؛ بإذابة الخلطات الرزيمة؛ أو بفصل ‎ha gia‏ زمراء نجمية ‎diastereomers‏ ‏يمكن أن تثم الإذابة في جود عامل إذابة ‎resolving agent‏ بتحليل كروماتوجرافي أو بتبلور متكرر أو ببعض الإتحاد من هذه التقنيات المعروفة في المجال. يمكن وجود تفاصيل إضافية تعلق ‎٠‏ بالإذابة في: ‎Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley & Sons 1981.‏ ملم ‎Jacques et‏ يفضل؛ أن تكون مركبات الإختراع الحالي نقية جوهريا» أي؛ نقاء أكثر من ‎Toe‏ يفضل ‎os‏ أن تكون المركبات نقية بنسبة 7978 على الأقل. أيضا يفضل أكثر؛ أن تكون المركات نقية بنسبة أكبر من ‎TA‏ أيضا يفضل أكثر؛ أن تكون المركبات نقية بنسبة 795 على الأقل؛ تقية ‎٠‏ بنسبة 7997 على الأقل؛ والأكثر تفضيلا أن تكون نقية بنسبة 74949 على الأقل. كما هو مذكور ‎wie!‏ يتضمن الإختراع الأملاح المقبولة دوائيا من المركبات المحددة بالصيغة. قد يمثلك مركب من هذا الإختراع مجموعات وظيفية ‎functional groups‏ حمضية بدرجة كافية ‎sufficiently acidic‏ وقاعدية 6 بدرجة كافية؛ أو كلتيهماء وطبقا لذلك فهو يتفاعل مع أي عدد من القواعد غير العضوية أو العضوية؛ والأحماض غير العضوية والعضوية؛ ‎١‏ التكوين ملح مقبول دوائياً. يشير المصطلح "ملح مقبول دوائيا ‎"pharmaceutically acceptable salt‏ حسب الإستخدام هناء إلى أملاح من مركبات الصيغة أعلاه تكون غير سامة جوهريا للكائنات الحية. تتضمن ‎add‏ ‏مقبولة دوائياً تمثبلية تلك الأملاح المحضرة بتفاعل مركبات الإختراع الحالي مع حمض معدني أو عضوي أو قاعدة غير عضوية. تتحد المواد المتفاعلة 715 بصفة عامة في مذيب مشترك ‎mutual solvent ٠‏ مثل ‎diethylether‏ أو 6 بالنسبة لأملاح إضافة حمض؛ أو ماء أو كحولات ‎alcohols‏ لأملاح إضافة قاعدة. تتفصل الأملاح طبيعيا من المحلول بالترسيب خلال حوالي ساعة إلى حوالي ‎٠١‏ أيام ويمكن فصلها بالترشيح أو بطرق تقليدية أخرى. إن تلك الأملاح معروفة كأملاح إضافة حمض ‎addition salts‏ 2610 وإضافة قاعدة ‎“base addition salts‏ إن الأحماض المستخدمة لتكوين أمسلاح إضافة حمض هي أحماض غير عضوية ‎«sulfuric acid <hydroiodic acid hydrobromic acid chydrochloric acid J—as Yo‏ ‎(phosphoric acid‏ إلخ؛ وأحماض عضوية ‎«methanesulfonic acid «p-toluenesulfonic Jie‏ ‎VIA‏

لا ‎«succinic acid «carbonic acid «p-bromophenylsulfonic acid oxalic acid‏ ‎acetic acid «benzoic acid «citric aciod‏ إلخ. إن أمثلة الأملاح ‎i] pda‏ دوائيا همي أملاح ‎«sulfite «bisulfate «pyrosulfate «sulfate‏ ‎«dihydrogenphosphate «monohydrogenphosphate «phosphate «bisulfite‏ ‎«propionate «acetate «iodide «bromide «chloride «pyrophosphate «metaphosphate ©‏ ‎<heptanoate «caproate «dsobutyrate «formate «acrylate «caprylate «decanoate‏ ‎«maleate fumarate csebacate «suberate «succinate «malonate oxalate cpropiolate‏ ‎«methylbenzoate «chlorobenzoate (benzoate <hexyne-1,6-dloate butyne-1,4-dioate‏ ‎«sulfonate «phthalate .methoxybenzoate hydroxybenzoate «dinitrobenzoate‏ ‎Jactate «citrate «phenylbutyrate «phenylpropionate «phenylacetate «Xylensulfonate ٠‏ ‎«propanesulfonate .methane-sulfonate «tartrate «glycollate «g-hydroxybutyrate‏ ‎«mandelate «naphthalene-2-sulfonate «naphthalene-1-sulfonate‏ إلخ. إن أملاح إضافة حمض مقبولة دوائيا مفضلة هي تلك المتكونة مع أحماض معدنية ‎chydrobromic acid 5 hydrochloric acid Jie‏ وتلك المتكونة مع أحماض عضوية ‎Jie‏ ‏ذم ‎.methanesulfonic acid s maleic acid‏ تتضمن أملاح إضافة قاعدة تلك المشتقة من قواعد غير عضوية وعضوية؛ مثل ‎ammonium bicarbonates «carbonates «hydroxides‏ أو فلز قلوي ‎alkali‏ أو أرضي قلوي ‎calkaline earth metal‏ إلخ. إن تلك القواعد المفيدة في تحضير أملاح هذا الإختراع تتضمن لذلك ‎potassium ammonium hydroxide ¢potassium hydroxide «sodium hydroxide‏ ‎«potasssium bicarbonate sodium bicarbonate «sodium carbonate «carbonate | ٠‏ ‎carbonate «calcium hydroxide‏ 0م إلسخ. ‎Jad‏ بصسفة خاصة أشكال ملح ‎.sodium § potassium‏ لابد من إدراك أن الأيون المضاد المحدد ‎particular counterion‏ الذي يشكل جزءا من أي ملح من هذا الإختراع ليس ذو طبيعة حرجة ‎critical nature‏ طالما كان الملح عموما مقبول ‎٠‏ دوائيا وطالما كان الأيون المضاد غير مساهم في صفات غير مرغوبة للملح عموما. إن مركبات طبقا للإختراع الحالي هي: محل

A

2-[2'-hydroxy-3' -phenylthiomethyl-4'-aza- 5'-0x0-5'-(2"-methyl-3"- hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3 -N-t-butylcarboxamide:

OH

H

OH .

H * aC N ‏ل لمحب‎ H 0 ‏هر‎ ‎SPh 07 'N

H

2-[2'-hydroxy-3 '.phenylthiomethyl-4'-aza-5 '.0x0-5'-(2"-methyl-3"- hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3 N-t-butylcarboxamide ° methanesulfonic acid salt:

OH H

OH Te H ‏اودر‎ ‎N « * 0 ‏ص و مو‎

H

‏كل من الصيغ أعلاه لها خمسة مر اكز غير متمالة وبالتالي يحدد مركب مختار من المجموعة‎ ‏وأي مزيج من إثنين أو أكثر من زمراء‎ individual stereoisomers ‏"؟ زمير مجسم فردي‎ stereoisomers ‏مجسمة‎ ٠ ‏مفضلة من تلك المركبات هي:‎ stereoisomers ‏إن زمراء مجسمة‎ [3S-(3R*,4aR*,8aR*2'S * 3'S*)]-2-[2'-hydroxy-3 '-phenylthiomethyl-4'-aza-3 '-0XO0- 5'-(2"-methyl-3" -hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3-N-t- butylcarboxamide:

OH

H.., ‏ب ال ان‎

NAAN o Jc “sph 07 ‏ير<‎ ‎H vo [3S-(3R* 4aR*,8aR*,2'S*,3 'S*)]-2-[2'-hydroxy-3' -phenylthiomethyl-4'-aza-3 '-0X0- 5'-(2"-methyl-3' '"-hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3-N-t- butylcarboxamide methanesulfonic acid salt:

YA

OH

H.,

XC H oH or H ‏و50‎ ‎No ‎o Kk “sph 0 ‏يرح‎ ‎H ‏مقبول دوائيا من أي من المركبات الأكثر تفضيلا السابقة.‎ salt ‏أو ملح‎ ‏يمكن تحضير المركبات طبقا للإختراع الحالي طبقا لمخطط التفاعل العام التالي:‎ ١ ‏تفاعل‎ ‎Oy . NO: ‏و‎ NOG, QQ

Oy - COOH oe

HN ONY . + A ‏إقتران‎ ‎8 ‎OH o (14) * (IB)

Oy NGC, a a

Cs A, NG

A OH B

Qe T Cs a (I) ‏الصيغة‎ o nitrogen ‏هو‎ D oxygen ‏هو‎ G t-butyl ‏هو‎ Q, hydrogen ‏د( هو‎ Ve decahydroisoquinoline ‏هو‎ B methylthiophenyl ‏هى‎ Qs; hydrogen ‏هر‎ Qo carbon ‏هر‎ E methyl ‏هو‎ Qq Vo hydroxyl ‏هو‎ Qs

VA

١ .phenyl ‏هو‎ A ‏يستخدم بصورة شائعة‎ standard coupling reaction ‏هو تفاعل إقتران قياسي‎ ١ ‏إن التفاعل‎ ‏مستبدل بدرجة ملائمة‎ [A ‏من الصيغة‎ amine ‏أو 95 ويجري بتفاعل‎ amides ‏في تخليق‎ ‏مستبدل بدرجة ملائمة من الصسيغة 18؛ في مذيب غير‎ carboxylic acid ‏مع مادة متفاعلة‎ ‏أو مزيج من مذيبات. يجري التفاعل نموذجيا في وجود أو غياب عامل‎ aprotic solvent ‏بروتوني‎ © ‏يفضل في وجود عامل حث (مثير)؛ وفي وجود عامل كاشضف‎ cpromoting agent ‏حث (مثير)‎ ‏إن المذيبات غير البروتونية النموذجية لهذا التفاعل هي‎ coupling reagent ‏إقتران‎ ‏يجري التفاعل نموذجيا‎ ٠ ‏أو مزيج من تلك المذيبات‎ «dimethylformamide s tetrahydrofuran ‏عند درجة حرارة من حوالي (- ٠*”مئوية) إلى حوالي (7©5*مثوية). تستخدم المادة المتفاعلة‎ ‏في وجود‎ «carboxylic acid ‏بصفة عامة بنسب مساوية جزيئيا جراميا للمادة المتفاعلة‎ amine)» .coupling reagent ‏الإقتران‎ Gals ‏كمية مساوية جزيئيا جراميا إلى زيادة طفيفة من عامل‎ dicyclohexylcarbodiimide ‏مقل‎ carbodiimides ‏تتضمن عوامل كاشفة إققران نموذجية‎ ‏بالإضافة إلى‎ «carbonyldiimidazole ‏مثل‎ imidazoles ¢N,N'-diethylcarbodiimde 5 (DCC) 4 (BOP-CI) bis(2-ox0-3-oxazolidinyl)phosphinic chloride J— ‏عوامل كاشفة‎ ‏إن عامل كاشضف إقتران‎ (EEDQ) N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline Vo ‏يفضل تضمن عامل حث في هذا التفاعل؛ إن عامل حث مفضل هو‎ DCC ‏مفضل لهذا التفاعل هو‎ .(HOBTH;0) hydroxybenzotriazole hydrate ‏بمجرد إكتمال التفاعل؛ فقد ينفصل المركب؛ عند الطلب؛ بإجراءات معروفة في المجال» على‎ ‏أو قد يزال مذيب التفاعل بالإستخلاص؛‎ cad ll ‏سبيل المثال؛ فقد يتبلور المركب ويجمع عندئذ‎

Oe ‏عند الطلب؛ بتقنيات شائعة‎ (Lilia) ‏تنقية المركب‎ (Sey .06020800 ‏التبخير أو قد يصفق‎ ‏مستتتئلة.‎ silica gel ‏صلبة مثل‎ supports ‏تبلور أو تحليل كروماتوجرافي على دعامات‎ ‏لإجراءات مبينة في‎ Wh IA ‏من الصيغة‎ starting compound ‏قد يحضر المركب الباديء‎ ‏مخطط التفاعل العام (أ).‎ ‏خلأ‎

١١ ( i ) ‏برنا مج التفاعل‎ 0 3 9 3 . 1 A en - \ . . Nn Ns ‏ل‎ . alpha-diazo carbonyl ‏تكرين‎ -Y N N;

OH 0

Qs

H-ZZ -¥ A ‏؟- إختزال‎ + ‏و9‎ ‏قاعدة قوية‎ -© vA a ~ N

H 6

NOOO» 6 ‏:00م‎ ‎H ~ Oy a

B A

A Vu Ao 8 ‏م‎ OH ‏(حرارة)‎ Oo 0, NQ, Oy —— 220 “Ny (IA)

H,N ِ B

OH

Ce ‘amino Ales de gana ‏هو‎ VA ‏وو0 محددين بالمثل حسب تحديدهم أعلاه في الصبغة (1)؛ و77 هو‎ Q3 «Qa «Qi 0 08 halo eo

YA

VY

‏بطريقة متسلسلة. بمجرد إكتمال‎ 7-١ ‏بإجراء التفاعلات‎ wed of) ‏يتم تنفيذ برنامج التفاعل‎ ‏فقد ينفصل المركب الوسيط؛ عند الطلب؛ بإجراءات معروفة في المجال؛ على سبيل‎ Jel) ‏مذيب التفاعل بالإستخلاص؛‎ Jom ‏المثال؛ فقد يتبلور المركب ويجمع عندئذ بالترشيح؛ أو قد‎ ‏التبخير أو قد يصفق. قد ينقى المركب الوسيط إضافيا؛ عند الطلب؛ بتقنيات شائعة مثل تبلور أو‎ ‏قبل إجراء الخطوة التالبة‎ calumina ‏أو‎ silica gel Jie ‏تحليل كروماتوجرافي على حوامل صلبة‎ ‏من برنامج التفاعل.‎ ‏له البناء:‎ amino— sass carboxylic acid ‏متفاعلة‎ sale ‏يجري التفاعل (أ-١) بتحويل‎ 3 ve

H

‏فقد تتفاعل‎ Jha ‏المختلط المقابل تحت شروط معروفة في المجال. على سبيل‎ anhydride ‏إلى‎ ‎Je «C-C alkylchloroformate ‏مع‎ amino- s—as= carboxylic acid ‏المادة المتفاعلة‎ > ‏إن الأحمساض‎ .8010 scavenger ‏يفضل في وجود حمض كاسح‎ isobutylchloroformate ‏يجري التفاعل نموذجيا في مذيب‎ triethylamine ‏يفضل‎ ctrialkylamines ‏الكاسحة المفضلة هي‎ . الماخ ‏غير بروتوني مثل 6 .الإطاء. إن إختيار المذيب ليس حرجا طالما أن المذيب المستخدم‎ ‏بالنسبة للتفاعل؛ والمواد المتفاعلة ذائبة بدرجة كافية لإتمام التفاعل المطلوب. يفضل إستخدام‎ 4 ‏المختلط الناتج في التفاعل (أ-7) بدون فصل أو تنقية إضافية.‎ anhydride ‏المادة المتفاعلة‎ eo sodium hydroxide ‏محلول‎ Jelly Yl ‏يجري التفاعل (ا-؟) على خطوتين.‎ ‏يتفاعل مع زيادة كبيرة من‎ «diethyl ether ‏يفضسل‎ cether ‏مع طبقة من مذيب‎ aia ‏يفضل إستخدام‎ .diazomethane ‏لتكوين مادة متفاعلة‎ N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine ‏جزيء جرامي (مول))/ تر‎ ١ ‏كمحلول مائي به حوالي 4 إلى‎ sodium hydroxide ‏بمجرد إكتمال هذا التفاعل جوهرياء؛ تجفف الطبقة العضوية على مادة‎ sodium ‏علل«معانيط‎ ٠ ‏المختلط من‎ anhydride ‏يتفاعل هذا المحلول عندئذ مع‎ potassium hydroxide ‏تجفيف مثل‎ ‏المقابل. يفضل إستخدام المادة‎ alpha-diazo carbonyl ‏التفاعل (أ-١)؛ أعلاه؛ لتكوين مركب‎ ‏في هذا التفاعل بدون فصل أو تنقية. يجري التفاعل نموذجيا عند درجة‎ diazomethane ‏المتفاعلة‎ ‎(Asie =) ‏إلى حوالي (-٠٠*مثوية)؛ يفضل حوالي‎ (sia) ‏حرارة من حوالي‎ ‏محلا‎

ل في التفاعل (أ-7)؛ يتفاعل المركب ‎ual) alpha-diazo carbonyl‏ في التفاعل (أ-7) مع حمض من الصيغة ‎HZZ‏ حيث يكون 22 هو 810 نموذجيا في مذيب غير بروتوني مشل ‎diethyl ether‏ لتكوين مركب ‎-alpha-halo carbonyl‏ إن مادة متفاعلة حمض مفضلة هي حمض مكلور الماء ‎(hydrochloric acid)‏ والذي يوفر مركب ‎alpha-chloro carbonyl‏ المقابل - يجري ‎٠‏ التفاعل نموذجيا عند درجة حرارة من حوالي ‎(RATT)‏ إلى حوالي صفر*مثوية. إن إختيار المذيب ليس حرجا طالما أن المذيب المستخدم خاملا في التفاعل والمواد المتفاعلة ذائبة بدرجة كافية لإتمام التفاعل المطلوب. تضاف نموذجيا المادة المتفاعلة الحمض في شسكل غاز لامائي ‎anhydrous gas‏ بمقادير زيادة صغيرة حتى يبدو التفاعل مكتملا جوهريا. يمكن مراقبة التفاعل بتحليل كروماتوجرافي رقيق الطبقة. ‎ya‏ في التفاعل )£1 ‎o‏ يختزل جزء الإصواغف على المركب المحضر في التفاعل (أ-) بإستخد ام شروط قياسية معروفة في المجال لتكوين المركب ‎alpha-chloro hydroxy‏ المقابل على سبيل المثال؛ يتحد المركب ‎mad‏ في التفاعل (أ-©) مع عامل إختزال في مزيج من مذيبات. تتضسمن عوامل إختزال نموذجية ‎«sodium borohydride‏ ‎«diisobutylaluminum hydride «zinc borohydride «lithium borohydride‏ ‎.sodium bis(2-methoxy-ethoxy)aluminum hydrides eo‏ إن عامل إختزال مفضل هو ‎sodium borohydride‏ . تتضمن خلطات مذيب نموذجية خليط بروتوني وغير بروتوني مثل ‎[tetrahydrofuran‏ ماء. إن إختيار المذيب ليس حرجا طالما أن المذيب خامل في التفاعل والمواد المتفاعلة ذائبة بدرجة كافية لإتمام التفاعل المطلوب. يجري التفاعل نموذجيا عند درجة حرارة حوالي (-١٠٠”مئوية)؛‏ يفضل حوالي صفر"مئوية. ‎Ye‏ في التفاعل (أ-9)؛ يعالج المركب ‎alpha-chloro hydroxy‏ المحضر في التفاعل )£1( مع قاعدة قوية لتكوين ‎epoxide‏ المقابل تحت شروط قياسية معروفة في المجال. على سبيل المثال: فقد يتفاعل مركب ‎alpha-chloro hydroxy‏ مع مزيج من ‎ethanol/potassium hydroixde‏ في مذيب كحولي مثل امصقطه. يجري التفاعل نموذجيا عند درجة حرارة من حوالي صفر”مئوية إلى حوالي درجة حرارة إعادة تكثيف بخار المذيب. يفضل إجراء التفاعل عند درجة حرارة الغرفة. ‎Yo‏ في التفاعل (أ-7)؛ يتفاعل ‎epoxide‏ المحضر في التفاعل )01( مع مادة متفاعلة حلقية مختلطة (غير متجانسة) ‎‘heterocyclic reactant‏ محلا

AR

NC\C2

G

Bo

B

Qo ‏إلى‎ (Ai om) ‏نموذجيا في مذيب كحولي عند درجة حرارة تتراوح نموذجيا من حوالي‎ ‏مثوية). إن إختيار المذيب ليس حرجا طالما أن المذيب المستخدم خامل في التفاعل؛ والمواد‎ ٠ ) ‏المتفاعلة ذائبة بدرجة كافية لإتمام التفاعل المطلوب. تتضمن مذيبات نموذجية لهذا التفاعل‎ ‏يفضل إجراء التفاعل عند درجة حرارة‎ ethanol ‏أو‎ isopropanol ‏يفضل‎ «alcohols ‏الكحولات‎ ٠ ‏حوالي (80”مئوية).‎ ‏قياسي يستخدم إجراءات وطرق معروفة في‎ amino Ales ‏إن التفاعل (أ-7) هو تفاعل إزالة‎

GUD ‏بدون‎ amine ‏المقابل المستخدم في التفاعل ١؛ أعلاه. قد يتفاعل هذا‎ amine ‏المجال لتوفير‎ ‏لكن يفضل تنقيته أولا.‎ ‏قد تحضر المواد المتفاعلة الحلقية غير المتجانسة الحلقة من الصيغة:‎ 6

NQ,Q,

H ~

B

‏و0‎ ‏المستخدمة في التفاعل )1-1( بإستخدام إجراءات وطرق معروفة في المجال. على سبيل المثال.‎ ‏المحمية-800100 المقابلة‎ amino acids ‏المتفاعلة الحلقية المختلطة الحلقة من‎ of gall Lad gad ‏تحضر‎ ‏يجري هذا التفاعل نموذجيا في وجود حمض‎ .alkylamine ‏مع‎ dallas ‏بواسطة تنشيط حمض تليه‎ ‏بإستخدام تقنيات إزالة‎ amino Ales de gene al 3 ‏إن‎ N-methylmorpholine Jie ‏كاسج؛‎ eo ‏حماية كيميائية قياسية توفر عندئذ المواد المتفاعلة الحلقية المختلطة المطلوبة.‎ :)13( ‏من الصيغة‎ carboxylic acid ‏يمكن تحضير المادة المتفاعلة‎ 4 ‏ل‎ ‎A ‎Qs =~ Qg

Q,

YA yo ‏المستخدمة في مخطط التفاعل )¢ عندما لا تكون متوافرة تجارياء؛ يمكن تحضيرها بإستخدام‎ ‏فقد تحضر هذه المادة المتفاعلة بإستبدال إضافي و/أو أكسدة‎ ¢ ASH ‏إجراءات معروفة. بتحديد‎ ‏متوافر تجاريا. على‎ heterocyclic ‏مختلط‎ Sila ‏أو‎ carbocyclic ‏إضافية لمركب كربوني حلقي‎ ‏من‎ heterocyclic ‏أو حلقية مختلطة‎ carbocyclic ‏سبيل المثال؛ فقد تتأكسد مركبات كربونية حلقية‎ ‏الصيغة:‎ 0 4

Ty 3

A

Qs Qs 0 ‏بإستخدام إجراءات معروفة في المجال. بصفة خاصة؛ فإن مركب الصيغة:‎ 4

Tr

A

Qs ‏سس‎ Qg

Q, ‏عند درجات‎ potassium permanganate ‏أو‎ selenium dioxide ‏قد يتفاعل مع عامل أكسدة مثل‎ ‏حرارة من حوالي صفر”مئوية إلى ( ٠٠*مثوية) في مذيب خامل بصورة مشتركة؛ مثل ماء أو‎ ٠ .diphenylether ‏حماية مجموعة كربونية حلقيبة‎ (IB) ‏تشتمل طريقة ثانية لتحضير مركبات من الصيغة‎ ‏مستبدلة بدرجة ملائمة‎ carboxylated ‏كربوكسيلية‎ heterocyclic ‏أو حلقية مختلطة‎ carbocyclic ‏مع مجموعة حماية-(<8100؛ وعندئذ إجراء إستبدال إضافي للمجموعة الكربونية الحلقية‎ ‏بإستخدام إجراءات معروفة في المجال. يمكن‎ heterocyclic ‏أو الحلقية المختلطة‎ carbocyclic ve ‏عندئذ إزالة مجموعة حماية-7ا*08:00 بإستخدام إجراءات معروفة في المجال لتوفير المادة‎ .)13( ‏المطلوبة من الصيغة‎ carboxylic acid ‏المتفاعلة‎ ‏حسب الإستخدام‎ "carboxy-protecting group ‏يشير المصطلح "مجموعة حماية كربوكسي‎ ‏في المواصفة إلى بدائل مجموعة 77 المستخدمة شيوعا لإيقاف نشاط أو لحماية وظيفية‎ ‏أثناء تفاعل مجموعات وظيفية أخرى على المركب. إن أمثلة لتلك المجموعات‎ carboxy ٠ «p-methoxybenzyl «p-methylbenzyl «p-nitrobenzyl methyl ‏تتضمن‎ carboxy-ajleal 2,4,6-trimethoxybenzyl 2 4-dimethoxybenzyl 3,4-dimethoxybenzyl

YA

١ «3, 4-methylenedioxybenzyl «pentamethylbenzyl «2,4,6-trimethylbenzyl 2.244 -tetramethoxybenzhydryl «4 4'-dimethoxybenzhydryl <benzylhydryl «4,4'-dimethoxy-trityl «4-methoxytrityl ctrityl «t-amyl «t-butyl «t-butyldimethylsilyl «trimethylsilyl «2-phenylprop-2-yl «4.4' 4"-trimethoxytrityl «b-(di(n-butyl)methylsilyl) ethyl :2,2,2-trichloroethyl «phenacyl ٠ «cinnamyl «allyl «4-nitrobenzylsulfonylethyl «p-toluenesulfonylethyl ‏وأجزاء مثيلة. تشتمل طريقة مفضلة لحماية‎ 1-(trimethylsilylmethyl)prop-1-en-3-yl ‏مرة‎ amide ‏وعندئذ تتحلل مائيا لل‎ amide ‏إلى جزء‎ carboxy ‏تحويل جزء‎ carboxy ‏مجموعة‎ ‏المطلوب. توجد أمثلة إضافية لهذه المجموعات في:‎ carboxy ‏أخر ى لتوفير بديل‎

E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J.G.W. McOmie, Ed., Ye

Plenum Press, New York, N.Y, 1973, Chapter 5, T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1981, Chapter 5. ‏يليه تكوين‎ carboxy ‏تنشيط الحمض لجزء‎ carboxy ‏يشتمل إجراء مفضل لحماية جزء‎ «acyl anhydride «acyl halide ‏إلى‎ carboxy ‏على سبيل المثال؛ فقد يتحول جزء‎ amide ‏نشط. يستخدم‎ carboxy ‏الرعة؛ إلخ؛ يفضل في وجود حمض كاسح لتكوين جزء‎ imidazole ٠ ‏متوافر تجارياء وذلك يزيل الحاجة إلى تنشيط حمض إضافي. إن المواد‎ 40 chloride ‏نموذجيا‎ ‏يجري التفاعل نموذجيا في‎ triethylamine ‏يفضل‎ ctrialkylamines ‏كاسحة حمض المفضلة هي‎ ‏مفضل هو‎ cada ‏إلخ. إن‎ «methylene chloride «diethyl ether ‏مذيب غير بروتوني مثل‎ ‏إن إختيار المذيب ليس حرجا طالما أن المذيب المستخدم خامل في‎ methylene chloride carboxy ‏جزء‎ Mae ‏التفاعل؛ والمواد المتفاعلة ذائبة بدرجة كافية لإتمام التفاعل المطلوب. يتفاعل‎ ٠ ‏في مذيب غير بروتوني لتوفير مادة‎ caniline ‏على سبيل المثال‎ (R''-NH, «amine ‏النشط مع‎ amide ‏متفاعلة‎ ‎9 ‎TX (O)NH-RM

A

Qs ‏سس‎ Qg 0 ‏والتي قد تستبدل إضافيا عندئذ طبقا لإجراءات معروفة.‎ :amide ‏إن المادة المتفاعلة‎ Yo ‏اف‎

و 4 1 ري ‎A‏ ‎Qs ~ Qs‏ ‎Q 7‏ قد تستبدل إضافيا بإزالة بروتونية ‎ortho deprotonation‏ للمجموعة: 4 ‎A‏ ‎Qs =~ Qs‏ ‎Q,‏ ‏لتوفير الأنيون المقابل ويلي ذلك تفاعل مع تشكيلة من ‎Jul gall‏ الكاشفة مثل ‎«alkyl halides‏ أو © عوامل هلجنة ‎bromine Jw halogenating‏ تزال البروتونية بصفة عامة من المادة المتفاعلة ‎amide‏ مرتين بإستخدام مكافثئين من قاعدة قوية مثل ‎n-butyl lithium‏ أو ‎sec-butyl lithium‏ بالنسبة للمادة المتفاعلة ‎amide‏ إختياريا في وجود عامل تناسق فلزي ‎.(TMEDA) tetramethylethylenediamine Ji metal coordinating agent‏ يجري التفاعل نموذجيا في مذيب غير بروتوني؛ يفضل ‎«tetrahydrofuran «diethylether Jie ether‏ 4« عند ‎٠‏ درجة حرارة منن حوالي ‎(AVA)‏ إلى حوالي (©؟"مئوية). 0 ض قد يتحلل مائيا المركب الناتج عندئذ بإستخدام إجراءات معروفة في المجال لتوفير المادة المتفاعلة ‎carboxylic acid‏ المستبدل المطلوبة من الصيغة ‎(IB)‏ على سبيل المثال؛ يشتمل تحلل مائي مناسب على ‎glad)‏ المادة المتفاعلة ‎amide‏ لحمض معدني قوي؛ حمض عضويء أو خليط من حمض معدني/ عضوي عند درجة حرارة من حوالي ١٠٠*مئوية‏ إلى حوالي ‎Asatte‏ ‎٠‏ تتضمن أحماض نموذجية يمكن إستخدامها في التفاعل ‎«acetic acid chydrobromic acid‏ ‎hydrochloric acid‏ إلخ. قد تستخدم إختياريا أنبوبة محكمة الإغلاق لإسراع معدل التفاعل. تشتمل طريقة ثالثة لتحضير المادة المتفاعلة ‎carboxylic acid‏ المستبدل من الصيغة ‎(IB)‏ ‏أزوتية ثنائية ‎diazotization‏ لل ‎caniline‏ يليها إخماد ‎diazonium salt‏ الناتج. بمسفة ‎ali‏ ‏يتحول جزء ‎amino‏ في المادة المتفاعلة ‎aniline‏ إلى ‎diazonium salt‏ بالتفاعل مع ‎٠٠‏ ولمع 8. قد ينتج ‎nitrous acid‏ في مكانه بمعالجة ‎pe sodium nitrite‏ محلول مائي من حمض قوري ‎hydrochloric acid Jie‏ أر ‎sulfuric acid‏ يجري هذا التفاعل نموذجيا عند أو أقل من (**مئوية) . يخمد عندئذ ‎diazonium salt‏ مع عامل كاشف مناسب لتوفير النظام الأروماتي طخل

YA

«cyanide ‏تتضمن عوامل كاشفة إخمادية تمقيلية ما‎ ٠. ‏المستبدل المطلوب‎ aromatic system ‏إلخ. نموذجياء سوف يسخن التفاعل لتسهيل التفاعل المطلوب.‎ Fle sulfuric acid <halide ‏هناك تشكيلة من التفاعلات معروفة في المجال يمكن إستخدامها لإنتاج الإستبدالات المطلوبة‎ ‏على الحلقات الكربونية الحلقية أو الحلقية المختلطة. على سبيل المثال؛ هناك تشكيلة من تفاعلات‎ ‏محددة في الفصلين‎ nucleophilic ‏ومحب للنواة‎ electrophilic ‏إستبدال أروماتي محب للكيهرباء‎ ‏المرجع:‎ oe VY WY

March, J., "Advanced Organic Chemistry, "3rd edition, Wiley, 1985. ‏بكربوكسيلية لمركب كربوني حلقي أو حلقي‎ (IB) ‏فقد تحضر مركبات الصيغة‎ (LH ‏مختلط مستبدل بدرجة ملائمة. قد تجرى الكربوكسيلية بإستخدام عدد من عوامل كاشضفة مختلفة.‎ «phosgene ‏على سبيل المثال؛ فقد يتفاعل العامل الكاشف الكربوني الحلقي أو الحلقي المختلط مع‎ ٠ ‏إيثيل كلوريد‎ SUB NN ‏أو‎ «urea hydrochloride ‏هيدروكلوريد يرريا‎ coxalyl chloride ‏يشتمل شكل‎ (Friedel-Crafts ‏في وجود محفزات‎ N,N-diethylcarbamoyl chloride ‏كربامويل‎ ‏متباين لهذه الطريقة على تفاعل العامل الكاشضف الكربوني الحلقي أو الحلقي المختلط مع‎ ‏لتوفير‎ )11214000( carbamoyl chloride ‏أو‎ «((RSCOCI) alkyl thiochloroformate ‏عندئذ لتوفير مجموعة‎ thiol ester s amide ‏على الترتيب. قد يتحلل مائيا‎ «thiol ester s amide ٠٠ 3 . 4951 ‏صفحة‎ 4 March ‏المطلوبة.‎ carboxy

Aluminum bromide ‏مثل‎ (Lewis ‏تتضمن أحماض‎ Friedel-Crafts ‏إن أمثلة لمحفزات‎ boron trichloride «(FeCls) iron (III) chloride ¢(AlCl3) aluminum chloride «(AlBr3) ‏إلخ. أنظر أيضا:‎ «(BF3) boron trifluoride «(BCl3)

March. J., "Advanced Organic Chemistry, "3rd edition, Wiley, 1985; Olah, ‏ص‎ ‎"Friedel-Crafts and Related Reactions," Interscience, New York, 1963-1965; and

Olah, "Friedel-Crafts Chemistry," Wiley, New York, 1973. ‏من الإختراع. إن هذه الأمثلة لأغراض التوضيح‎ Li ga ‏توضح المستحضرات والأمثلة التالية‎ ‏ولا يقصد بها تحديد نطاق الإختراع.‎ ‏أطياف رنين مغناطيسي نووي‎ (mp) ‏إن الإختصارات من أجل المصطلحات نقطة الإنصهار‎ Yo ‏أطياف كتلة‎ MS(FD) ‏مجال‎ AES ‏أطياف‎ ((EIMS) ‏بتصادم إلكترون‎ ALS ‏أطياف‎ (NMR) ‏تحليل‎ (UV) ‏أطياف فوق بنفسجية‎ (JR) ‏أطياف تحت الحمراء‎ (MS(FAB) ‏تصادم ذرة سريعة‎

YA

عنصريء تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء ‎(HPLC)‏ وتحليل كروماتوجرافي رقيق الطبقة ‎(TLC)‏ إضافة إلى ذلك؛ إن القيم القصوى للإمتصاص من أجل أطياف 1 هي تلك التي لها ‎(Ayan‏ وليست هي كل القيم القصوى الملحوظة. في إتحاد مع أطياف ‎(NMR‏ تستخدم الإختصارات التالية: فردية (9)؛ ثنائية ‎od)‏ ثائية ‎٠‏ الثنائيات ‎(Ad)‏ ثلاثية ‎«(f)‏ رباعية ‎«(q)‏ متعددة ()» ثنائية المتعددات (:48)؛ فردية عريضة ‎(brs)‏ ثنائية عريضة ‎«(br.s)‏ ثلاثية عريضة ‎(br.t)‏ ومتعددة عريضة ‎(brim)‏ يشير آ إلى ثابت الإقتران بالهيرتز ‎(HZ)‏ إذا لم يذكر خلاف ذلك؛ تشير بيانات ‎NMR‏ إلى القاعدة الحرة لمركب الموضوع. يتم الحصول على أطياف ‎NMR‏ على أذاة ‎Bruker Crop. 270 MHz‏ أو على أداة ‎General Electric QE-300 300 MHz ٠‏ يتم التعبير عن الإنتقالات الكيميائية بالقيم دلتا (جزء على المليون هابطة من ‎(tetramethylsilane‏ تؤخذ أطياف ‎MS(FD)‏ على أداة قياس طيف ‎Varian-MAT 1‏ بإستخدام أدوات إنبعاث متشبعة ‎carbon‏ نحصل على أطياف ‎EIMS‏ على أداة 21-110 ‎CEC‏ من مؤسسة ‎.Consolidated Electrodynamics‏ نحصل على أطياف ‎MS(FAB)‏ على أداة قياس طيف ‎Jans VG ZAB-3‏ على أطياف 18 على أداة ‎Perkin-Elmer 281 ne‏ نحصل على أطياف ‎UV‏ على أداة 118 ‎-Cary‏ يجري ‎TLC‏ على ألواح هلام سليكا ‎Merck Silica gel‏ .25. نقاط الإنصهار ليست مصححة. مستحضر_مرجعي ‎Reference Preparation‏ ‎A. 2R-N(Benzyloxycarbonyl Jamino-3-naphth-2-ylthio propanoic acid‏ إلى محلول من ‎٠,78‏ جم ‎A)‏ مللي جزيء جرامي (ميلي مول)) من ‎naphthalene-2-thio‏ في ‎Ye ov‏ ملليلتر 6000 يضاف ببطء ‎AY) pa), VY‏ جرام) ‎sodium hydride‏ ١ل‏ تحت ‎.nitrogen‏ بعد التقليب لمدة ‎Vo‏ دقيقة تقريباء يضاف ببطء مطلول من ‎N(benzyloxycarbonyl)serine-f-lactone‏ في ‎٠‏ ملليلتر ‎tetrahydrofuran‏ يترك المزيج ليتفاعل عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريباء وعندئذ يركز تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تذاب هذه المادة المتبقية في ‎ethyl acetate‏ وتغسل على التوالي مع م ‎sodium bisulfate‏ 8 عياري ‎(N)‏ ومحلول ملحي مشبع. تفصل الطبقات الناتجة وتجفف الطبقة العضوية على ‎sodium sulfate‏ ترشح وتركز عندئذ تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. محلا

٠ ‏تتقى هذه المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي لتوفير 7,08 جم من مادة صلبة بللون‎ ‏أصفر باهت.‎ 778 ‏الإنتاجية:‎ ‎'H NMR (CDCl): ‏ة‎ 3.42-3.61(br.m,2H), 5.53-5.76(br.s, 1H), 4.85-5.08(br.m,2H), 5.54-5.76(br.s,1H), 7.06-7.97(m, 12H). ° [op -55.72° (¢ 1.0, MeOH).

IR (KBr): 3348, 3048, 1746, 1715, 1674, 1560, 1550, 1269, 1200, 1060 cm’.

MS(FD): m/e 381 (M"), 381 (100). (C ‏197ر؟؛ الموجود‎ (N 0,0 Y ‏المحسوب 0؛ ؟ ,37 كل‎ :CyoH9NO4S ‏التحليل لأجل‎ ‏ل لد ال تل‎ 7 Vv.

B. 3R-1-Diazo-2-0x0-3-N-( benzyloxycarbonyllamino-4-( naphth-2-ylthio) butane ‏من 16,38 جم )£07 ملي مول) من مركب عنوان‎ (AT +7) ‏إلى محلول بارد‎ ‏يضاف ببطء 0,17 ملليلتر (007 مللي مول)‎ ethyl acetate ‏ملليلتر‎ YY ‏المستحضر 2/8 في‎ lille 7,84 ‏تحت بواسطة محقن. يضاف إلى المحلول الناتج عندئذ‎ triethylamine ‏بواسطة محقن. في دورق منفصسل؛ يضاف‎ cisobutyl chloroformate ‏مللي مول) من‎ 11,0) ٠ ‏إلى مزيج من طبقتين‎ N(methyl)-N(nitro)-N(nitroso)-guanidine ‏جرامات من‎ ٠١ ‏بحرص‎ ‏عياري؛ لينتج‎ © sodium hydroxide ‏ملليلتر من محلول‎ ١7٠١و‎ diethylether ‏ملليلتر‎ ١7١ ‏من‎ ‏جوهريا؛ تصفق الطبقة العضوية من الطبقة المائبة‎ Joli) ‏تصاعد كثيف لغاز. عندما يكتمل هذا‎ ‏وتجفف. يتكرر تكوين وإضافة هذا‎ 20 hydroxide ‏فوق هيدروكسيد بوتاسيوم‎ ‏جم من‎ ١و‎ sodium hydroxide 5 diethylether ‏بإستخدام كميات متمائلة من‎ diazomethane Y- diazomethane ‏المادة المتفاعلة‎ Mae ‏عستل تمصع -(0:050م)11-(هتانص) ا -(ابطاء )11 تضاف‎ ‏باردا‎ Jeti ‏ويترك مزيج التفاعل‎ Sel ‏المختلط المحضر‎ anhydride ‏الناتجة إلى محلول‎ 716 ‏دقيقة تقريبا. عندما يكتمل التفاعل جوهرياء حسب التحديد بواسطة‎ ٠١ ‏لمدة‎ (30°77) ‏مصقولة بالنار لإزالة أي زيادة من‎ Pasteur ‏خلال المحلول بإستخدام ماصة‎ nitrogen ‏يضخ‎ ‏وعندئذ يركز المحلول تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه المادة‎ diazomethane ‏في‎ 7٠١ ethyl acetate ‏المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي (المادة الفاصسلة:‎ ‏لتوفير 1,17 جم من زيت بلون أصفر.‎ (methylene chloride

YA

أ الإنتاجية: ‎JAY‏ ‎3.32-3.46(m,2H), 4.40-4.67(m, 1H), 5.00-5.09(m,2H),‏ ة :(ينعم) ‎NMR‏ برا ‎5.44(s,1H), 5.76(d,J=7.8Hz,1H), 7.25-7.86(m,12H).‏ ‎C. 3R-1-Chloro-2-0x0-3-N-( benzyloxycarbonyl)amino-4-( naphth-2-ylthio) butane‏ ° يمرر بإندفاع فقوي لمدة قصيرة (حوالي ثانيتين) ‎WY hydrochloric acid‏ (غاز) خلال محلول بارد (-> ؟“مئوية) من ؟ 1 جم ‎T1018)‏ مللي مول) من مركب عنوان المستحضر ‎IB‏ ‏في ‎«diethylether Salle YY.‏ لينتج تصاعد للغاز. يكرر هذا الإجراء مع الأخذ في الإعتبار عدم إضافة زيادة من ‎Lovie hydrochloric acid‏ يكتمل التفاعل جوهرياء حسب التحديد بواسطة ‎(TLC‏ يركز المحلول تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه ‎٠‏ المادة المتبقية بتحليل كروماتوجر افي وميضي (مادة فاصلة: ‎7٠١ ethyl acetate‏ في ‎methylene‏ ‎(chloride‏ لتوفير 98 جم من مادة صلبة بلون أسمر مصفر باهت. الإنتاجية: ‎JAY‏ ‎'H NMR (CDCls): 8 3.41 (dd, J=12,6Hz,1H), 3 53(dd,J=12,6Hz,1H), 4.18(AB‏ ‎q,J=41 9Hz,J= 15.9Hz,2H), 4.77(dd,J=9,3Hz,1H), 5 .04(AB‏ ‎q.J=12Hz,J=10.4Hz,2H), 5 59(d,J=7Hz,1H), 7.24-7.85(m,12H). vo‏ ‎[op -80.00° ) 1.0, MeOH).‏ ‎IR (CHCl): 3426, 3031, 3012, 1717, 1502, 1340, 1230, 1228, 1045 cm’.‏ ‎MS(FD): m/e 413 (M"), 413 (100).‏ التحليل لأجل [11105دين: المحسوب نا 8ر7 آل ‎¢£,AY‏ ل ‎FFA‏ الموجود ‎(C‏ ‎Y Y.‏ لقت كل متت لل م ‎D. [3R-(3R*,45*)]-1 -Chloro-2-hydroxy-3-N-( benzyloxycarbonyl)amino-4-(naphth-‏ ‎2-ylthio) butane‏ إلى محلول بارد (صفر"مئوية) من 070 مجم ‎YA)‏ مللي مول) من مركب عنوان المستحضر 20؛ في ‎٠‏ ملليلتر ‎tetrahydrofuran‏ و١‏ ملليلتر ماء ‎٠‏ يضاف ‎VY‏ مجم )1,87 ‎Yo‏ مللي مول) من ‎Lexie sodium borohydride‏ يكتمل التفاعل جوهريا حسب التحديد بواسطة ‎TLC‏ يضبط المحلول إلى أس هيدروجيني ‎(PH)‏ © بإستخدام ‎bile ٠١‏ من ‎plan‏ ‎ammonium chloride‏ مائي مشضبع و60٠٠ ‎lg Kaa‏ من محلول حمض هيدروكلوريك ‎YA‏

YY methylene chloride ‏عياري. يستخلص المحلول الناتج مرتين مع‎ © hydrochloric acid ‏ترشح وتركز عندئذ‎ sodium sulfate ‏تجفف على‎ cele ‏وتغسل الطبقات العضوية المتحدة مع‎ ‏تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تنقى المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي شعاعي (مادة‎ ‏مجم من مادة صلبة بلون أسمر مصفر.‎ ١ ‏لتوفير ؟‎ (methylene chloride ‏فاصلة:‎ ‎Jt ‏الإنتاجية:‎ oo 'H NMR (CDCl): 6 3.40(s,2H), 3.61-3 71(m,2H), 3.97-3.99(m,2H), 4.99(s,2H), 5.16(br.s,1H), 7.21-7.83(complex, 12H).

MS(FD): m/e 415 (MM), 415 (100). [ap -47.67° (c 0.86, MeOH).

IR (CHCl): 3630, 3412, 3011, 1720, 1502, 1236, 1044 cm’. Ve (C ‏الموجود‎ TTY ‏التحليل لأجل 11::110:015وو0: المحسوب نا 17,07 1ل ره آل‎ ‏ل بم ال كدو‎ ¢1Y, vy

E. [I'R-(1'R*,18*)]-1-[(1'-N- Benzyloxvcarbonyl) amino-2'-( naphth-2-ylthio)ethyl] oxirane ‏في‎ potassium hydroxide (Js— ‏مجم )0 8» مللي‎ TY ‏يضاف محلول من‎ vo ‏مجم ( ؛؟,؛ مللي مول) من مركب‎ ١5١ ‏إلى محلول من‎ ethanol ‏ملليلتر‎ ١ ‏عند‎ .)7:١( ethyl acetate/ethanol ‏من محلول‎ Silla ١ ‏عنوان المستحضر 20؛ في‎ ‏يصب مزيج التفاعل في مزيج من‎ (TLC ‏إكتمال التفاعل جوهريا؛ حسب التحديد بواسطة‎ ‏تجفف على‎ cela ‏تفصل الطبقات الناتجة؛ وتغسل الطبقة العضوية مع‎ .methylene chloride/sls ‏ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه المادة‎ aad ‏ترشح وتركز عندئذ‎ sodium sulfate ٠٠ ‏في‎ 2٠١ ethyl acetate ‏المتبقية بإستخدام تحليل كروماتوجرافي شعاعي (مادة فاصلة:‎ ‏مصفر فاتح.‎ and ‏مجم من مادة صلبة بلون‎ ١١7 ‏لتوفير‎ (methylene chloride

Jaa ‏الإنتاجية:‎ ‎IH NMR (CDCl): ‏ة‎ 2.76(br.s,2H), 3.01 (br.s,1H), 3.31(d,J=5Hz,2H), 3.77(br.s, 1H), 5.05(s,2H), 5.22(d,J=6Hz,1H), 7.25-7.85(complex, 12H). Yo [a]p -125.42° (¢ 0.59, MeOH).

MS(FD): m/e 379 (M"), 379 (100).

VIA

YY

IR (CHCI;): 3640, 3022, 2976, 1720, 1 502, 1235, 1045 cm’. ‏آل 14,؛ الموجود 0؛‎ t0,0A ‏المحسوب نا 13,17 آل‎ :: 05 Jal Jalal ‏آل تعد ال عل‎ 4 ١

F. [2S-(2R* 2R*.3'S*)]-1-| 2'-Hydroxy-3'-(N -benzyloxycarbonylamino-4'-( naphth- 2-ylthio)butyl]piperidine-2-N-( t-butyl) carboxamide ° ‏مول) من‎ olla 1,7) ‏لمدة £4 ساعة تقريبا محلول من )10+ جم‎ E200 ‏يسخن إلى‎

Cat ‏و7 جم (1, مللي مول) من مركب العنوان المستحضر‎ 2E ‏مركب عنوان المستحضر‎ aise ‏تحت ضغط‎ Baie ‏يبرد مزيج التفاعل الناتج ويركز‎ .isopropanol ‏ملليلتر من‎ Yo ‏في‎ ‏هذه المادة بتحليل كروماتوجرافي شعاعي (لوح ؛ ملليمتر؛ مادة فاصسلة‎ (AS ‏لتوفير مادة خام.‎ ‏مجم من رغوة بلون أبيض. الإنتاجية:‎ ٠١4 ‏لتوفير‎ (methylene chloride ‏في‎ 1/٠١ acetone ٠ ١ك‎

IH NMR ‏:(ينعص)‎ 5 1.29(s,9H), 1.44-1 .82(m,6H), 2.19(m, 1H), 2.40(m, 1H), 2.68(m,2H), 3.09(m,1H), 3.46(m,2H), 4.00(m,2H), 5.01(s,2H), 5.73(d,1H), 6.01(br.s,1H), 7.23-7.34(m,5H), 7.45(m,3H), 7.72-7.83(m,4H).

MS(FD): m/e 563(M", 100). Vo

G. [2S-(2R*,2'S*.3'S*)]-1-] 2'-Hydroxy-3'-amino-4'-( naphth-2-ylthio)butyl] piperidine-2-N-(t-butyl )carboxamide 27 ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر‎ + VA) ‏جم‎ ٠8 ‏يتفاعل محلول يحتوي على‎ ‏لمدة ساعة واحدة تقريبا. يركز مزيج‎ acetic acid ‏في‎ 77٠0 hydrobromic acid ‏ملليلتر‎ ٠ ‏في‎ ‎toluene ‏التفاعل الناتج؛ يغلي عند درجة حرارة غليان ثابثة ؟ مرات مع‎ ٠ diethylamine ‏من كل من‎ sll ¢,0 ‏يحتوي على‎ methanol ‏تعاد إذابته في‎ ‏ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه المادة‎ cand ‏ويركز عندئذ‎ ammonium hydroxide ‏في‎ 77 methanol ‏ملليمتر؛ المادة الفاصلة:‎ ١ ‏المتبقية بتحليل كروماتوجرافي شعاعي (اللوح‎ ‏مجم من رغوة بلون أبيض.‎ VE ‏لتوفير‎ (7) acetic acid ‏يحتوي على‎ methylene chloride

JA ‏الإنتاجية:‎ ve

YA

A

'H NMR (CDCls): 8 1.29(s,9H), 1.52-1 .73(m,6H), 1.84(m, 1H), 2.3 1-2.43(m,2H), 2.75-3.04(m,5H), 3.17(m, 1H), 3.41(m, 1H), 3.71(m,1H), 6.22(br.s,1H), 7.47(m,3H), 7.73-7.82(m,4H).

MS(FD): m/e 430 (M", 100). 3 ‏مستحضر‎ ©

A. 2S-N-(Benzyloxycarbonyl )-2-pyrrolidinecarboxylate pentafluorophenyl ester ‏مول)امن‎ + VY) ‏جرام‎ 7١ ‏إلى محلول بارد (صفرمئوية) من‎ ‏مول)من‎ + VE) ‏جم‎ YOM 2S-N(benzyloxycarbonyl)-2-pyrrolidinecarboxylic acid ‏مول)من‎ +) E) ‏جم‎ YVV ‏يضاف‎ dtetrahydrofuran ‏في .£0 ملليلتر‎ pentafluorophenol ٠١٠١ ‏على مرة واحدة؛ يليه‎ (EDC) 1 -(3-dimethylamino-propyl)-3-ethylcarbodiimide Ye .methylene chloride ‏ملليلتر‎ ‎1 ‏مستحضر‎ ‎A. 2R-2-N(Benzyloxycarbonyl)amino-3 -phenylthio propanoic acid ‏تحضر المادة الوسطية بالعنوان أعلاه المطلوبة جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء‎ ‏مللي‎ VY) ‏جم‎ 1 «thiophenol ‏مللي مول) من‎ ١ V) ‏ملليلتر‎ ١,١ ‏بإستخدام‎ (A ‏المرجعي‎ ve ‏جم )11% ملي مول) من‎ 15,3730 sodium hydride ‏مول) من محلول‎ ‏لتوفير مادة‎ tetrahydrofuran ‏في .£0 ملليلتر‎ L-N(benzyloxycarbonyl)-serine p-lactone ‏متبقية. تنقى هذه المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي (فصل متدرج من (صفر-؟1)‎ ‏لتوفير 717,5 جم من‎ (ethyl acetate/methylene chloride ‏في مزيج )1:2( من‎ acetic acid ‏مادة صلبة بلون أبيض.‎ - .7977 ‏الإنتاجية:‎ ‏يرا‎ NMR (CDCl3): 6 7.55-7.18(m,10H), 5.55(d,J=7Hz,1H), 5.08(s,2H), 4.73- 4.60(m, 1H), 3.55-3.30(m,2H).

IR (KBr): 3304, 3035, 1687, 1532, 736 cm’.

MS(FD): m/e 332, 288, 271, 181. Yo

C ‏4,77؛ الموجود‎ N,V HY, C ‏المحسوب‎ :»1 105 Jal ‏التحليل‎ ‎LELEY ‏ل ترم ال‎ 43 ‏خلا‎

Yo

B. 3S-1-Diazo-2-0x0-3-N-(benzyloxycarbonyl Jamino-4-phenylthio butane ‏يحضر المركب بالعنوان أعلاه المطلوب جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء المرجعي‎

TV) ‏ملليلتر‎ 0,04 (IA ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر‎ TY) ‏جم‎ ١7,١ ‏بإستخدام‎ 8 ٠6 «isobutyl chloroformate ‏مللي مول)‎ © o) ‏ملليلتر‎ ٠ triethylamine ‏مللي مول) من‎ diazomethane ‏لتوفير مادة متبقيبة. يحضر محلول‎ diazomethane ‏مللي مول من محلول‎ © ‏عياري‎ © sodium hydroxide ‏ملليلتر من محلول‎ ٠ «diethylether ‏ملليلتر‎ ٠٠١ ‏بإستخدام‎ ‏حسب الوصسف‎ N(methyl)-N(nitro)-N(nitroso)-guanidine ‏مللي مول) من‎ VET) ‏جم‎ ؟١و‎ ‏تنقى هذه المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي (فصل متدرج من‎ 2B ‏في المستحضر‎ ‏لتوفير زيت بلون أصفر.‎ (methylene chloride ethyl acetate lo ‏صفر إلى‎

JY ‏الإنتاجية:‎ ٠ 'H NMR (CDCl): 6 7.50-7.19(m, 10H), 5.62(d,J=7Hz,1H), 5.47(br.s,1H), 5.11(s,2H), 4.50-4.32(m, 1H), 3 .33(d,J=6Hz,1H).

IR (KBr): 3012, 2115, 1720, 1501, 1367, 1228 cm’.

MS (FD): m/e 356, 328, 242.

C. 3R-1-Chloro-2-0x0-3-N-(benzyloxycarbonyl )amino-4-phenylthio butane vo ‏يحضر المركب بالعنوان أعلاه المطلوب جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء المرجعي‎ ‏بإستخدام 17,3 جم (17 مللي مول) من مركب عنوان المستحضر 1 وكميات قليلة من‎ .© ‏جم من مادة صلبة بلون‎ 7١ ‏لتوفير‎ diethylether ‏(غاز) في 500 ملليلتر‎ hydrochloric acid ‏أبيض . تستخدم هذه المادة الصلبة بدون تنقية إضافية.‎ 'H NMR (CDCl3): 8 7.50-7.15(m, 10H), 5.56(dd,J=2,6.7Hz,1H), 5.11(s,2H), 4.78- Y. 4.67(m, 1H), 4.20(d,=15.9Hz, 1H), 4.12(d,J=15.9Hz,1H), 3.48-3.23(m,2H).

IR (KBr): 3349, 1732, 1684, 1515, 1266 cm.

MS (FD): m/e 363 (M"). (C ‏الموجود‎ (FAS ‏لال‎ ¢£,99 (H 09,47 0 ‏المحسوب‎ :C13HgNO3SClL ‏التحليل لأجل‎ ‏الالمخففم نكل تم ال أل‎ Yo

D. [2S-(2R*.38*)]-1-Chloro-2-hydroxy-3 -N-(benzyloxycarbonyl)amino-4- phenylthio butane

VIA

Yi ‏يحضر المركب المطلوب بالعنوان أعلاه جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء المرجعي‎ ‏مللي‎ TF) ‏جم‎ Y, 85 (IC ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر‎ OA) ‏جم‎ 7١ ‏بإستخدام‎ D ‏لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه‎ tetrahydrofuran ‏ملليلتر‎ 3٠١0 ‏في‎ sodium borohydride ‏مول)‎ ‏في‎ methanol 77- ‏متدرج: صفر‎ Jad) ‏المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي‎

IX Jia ‏ذلك تحليل كروماتوجرافي (فصل متدرج:‎ Ly "(methylene chloride © ‏عند‎ methylene chloride ‏من‎ 3 aie ‏ويعاد تبلورها‎ (chloroform ‏في‎ ethyl acetate ‏لتوفير 4,9 جم من المركب بالعنوان أعلاه.‎ (5A)

JA ‏الإنتاجية:‎ ‏يا‎ NMR (CDCl): 6 7.47-7.19(m, 10H), 5.22-5.03(m,1H), 5.09(s,2H), 4.01- 3.89(m,2H), 3.75-3.58(m,2H), 3 32(d,J=4Hz,2H). Ve

IR (KBr): 3321,2951, 1688, 1542, 1246, 738 cm’.

MS (FD): m/e 366 (M"), 119. (C ‏الموجود‎ (VAT ‏لل‎ t0,01 ‏التحليل لأجل 0,:11:010:501: المحسوب 454 آل‎ ‏تعد لحن‎ (H ‏بف‎ oY

E. [I'R-(1'R*,18*)]-1-[(1'-N-( benzyloxycarbonyl Jamino-2'-phenylthio)ethyl oxirane ‏د‎ ‏يحضر المركب المطلوب بالعنوان أعلاه جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء المرجعي‎ ‏مللي‎ Yo) ‏جم‎ ١,4 (ID ‏المستحضر‎ sie ‏مللي مول) من مركب‎ YF) ‏جم‎ AT ‏بإستخدام‎ E ‏لتوفير مادة متبقية. تتقى هذه المادة‎ ethanol ‏في 506 ملليلتر‎ potassium hydroxide (J ‏في‎ ethyl acetate 77- ‏متدرج صفر‎ Jaa) ‏المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي‎ ‏لتوفير 1,4 جم من مادة صلبة بلون أبيض.‎ (methylene chloride ٠٠

Joho ‏الإناجية:‎ ‎'H NMR (CDCl): 8 7.45-7.15(m, 10H), 5.12(s, 1H), 5.08(s,2H), 3.77-3.62(m, 1H), 3.21(d,J=6Hz,2H), 2.99(m, 1H), 2.77(m,2H).

IR (KBr): 3303, 3067, 1694, 1538, 1257, 741 cm’.

MS (FD): m/e 329. Yo (C ‏الموجود‎ ££,Y0 ‏آل‎ 0,A) ‏كل‎ 10,17 C ‏المحسوب‎ :C3HasN304S ‏التحليل لأجل‎ ‏تخرم ال تا‎ (H ¢1o, EA ‏طخلا‎

لا ‎F. [3S-(3R*.4aR*.8aR* 2'S* 3'S*)]-2-[3'-N=( benzyloxycarbonyl Jamino-2'-hydroxy-‏ ‎4'-(phenyl)thio]butyl decahydroisoquinoline-3-N -t-butyl carboxamide‏ يحضر المركب المطلوب بالعنوان أعلاه جوهريا طبقا للإجراء المفسسسل في الإجراء المرجمي تل بإسستخدام ‎TF‏ جسم )18 مالي مسول) 8 من مركب عنوان المستحضر 7 جم ( ‎7١‏ مللي مول)من ‎[3S-(3R*,4aR* 8aR*)]-decahydroisoquinoline-3-N-t-butylcarboxamide‏ في ‎Yoo‏ ‏ملليلتر ‎ethanol‏ لتوفير مادة متبقية. تنقى هذه المادة المتبقية بتحليل كروماتوجر أفي وميضي (فصل متدرج صفر = ‎ethyl acetate IX ٠‏ في ‎(methylene chloride‏ لتوفير 7.؛ جم من مادة صلبة بلون أبيض. ‎٠‏ الإنتاجية: ‎Jee‏ ‎(m,10H), 5.90(d,J=5Hz, 1H), 5.64(s,1H),‏ 8741-1 :ري020) ‎NMR‏ ترا ‎5.05(d,J=4Hz,2H), 4.08-3 .90(m,2H), 3.40(d,J=6,2H), 3 .05(s,1H), 2.95-2.85(m, 1H),‏ ‎2.62-2.45(m,2H), 2.28-2.15(m,2H), 2.05-1.88(m,2H), 1.78-1.10(m,7H), 1 29(s,9H).‏ ‎IR(KBr): 3330, 2925, 2862, 1706, 1661, 1520, 1454, 1246, 738, 694 cm’.‏ ‎MS (FD): m/e 568 (M"), 467. Vo‏ التحليل لأجل ‎:C3HasN304S‏ المحسوب 19ر11 كل ‎¢V,48‏ ل 60 ‎1V,‏ الموجود ‎(C‏ ‏3 لخت تل ‎NAY‏ فرلا ‎G. [3S-(3R*.4aR* 8aR*2'S*.3'S*) ]-2-[3 '_amino-2'-hydroxy-4'-(phenyl)thio [butyl‏ ‎decahydroisoquinoline-3 -N-t-butyl carboxamide‏ ‎Ye‏ يحضر المركب المطلوب بالعنوان أعلاه جوهريا طبقا للإجراء المفصل في الإجراء المرجعي 6 بإستخدام ‎١‏ جم ‎VN)‏ مللي مول) من مركب عنوان المستحضر ‎IF‏ و50 ملليلتر من محلول ‎JAR‏ من ‎hydrobromic acid‏ في 2010 ‎cacetic‏ بإستثاء أن المادة الخام تذاب في ‎٠‏ ملليلتر ‎.methanol‏ إلى المحلول الناتج؛ يضاف ؟ ملليلتقر ‎diethylamine‏ و ؟ ‎lll‏ ‎ammonium hydroxide‏ مركز وعندئذ يركز المزيج تحثت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. ‎Yo‏ تعاد إذابة هذه المادة المتبقية في ماء ‎ethyl acetates‏ تفصل الطبقات الناتجة وتغسل الطبقة العضوية على التوالي مع محلول ‎(Sle sodium bicarbonate‏ ومحلول ‎(ale‏ تجفف على ‎sodium sulfate‏ ترشح وتختزل عندئذ حتى الجفاف تحت ضغط مخفض لتوفير مادة متبقية. مكلا

YA

‏في‎ methanol 7) + sina ‏تتقى هذه المادة المتبقية بتحليل كروماتوجرافي وميضي (فصل متدرج‎ ‏ملايلقر‎ ٠٠٠١ ‏لكل‎ ammonium hydroxide ‏(يحتوي على ؟ قطرات‎ chloroform ‏جم من رغوة بلون أبيض.‎ ٠55 4 ‏لتوفير‎ (chloroform ‏الإنتاجية: 7971. منفصلة.‎ 'H NMR (CDCly): 58 7.41-7.16(m,5H), 6.07(s,1H), 3.78-3.70(m, 1H), 3.45- ° 3.38(m, 1H), 3.03-2.84(m,3H), 2.38-2.20(m, 3H), 2.00-1.05(m, 12H), 1 33(s,9H).

IR (KBr): 2924, 2862, 1660, 1517, 1454, 1439, 737, 691 em.

MS (FD): m/e 434 (M"), 293. 2 ‏مستحضر‎ ‎A. 3-Methoxy-N-phenylbenzamide Ve alll 70,7 ‏في‎ aniline ‏مللي مول)‎ ٠١ V) ‏ملليلتر‎ ١3,4 ‏يضاف ببطء محلول من‎ ‏مللي مول)من‎ 4 V) ‏جم‎ YO, ‏إلى محلسول يحتوي على‎ triethylamine 3١ ‏يتفاعل مزيج التفاعل الناتج لمدة‎ .methylene chloride ‏في‎ 3-methoxybenzoy! chloride ‏عياري. تفصل الطبقات الناتجة وتغسل‎ ١ sodium bicarbonate ‏دقيقة تقريبا ثم يخفف عندئذ مع‎ ‏مولار ثم محلول ملحي؛ تجفشف‎ ١ sodium hydroxide ٠ ‏الطبقة العضوية على التوالي مع ماء‎ ٠ ‏ترشح وتختزل حتى الجفاف تحت ضغط مخفض لتوفير 1,1 جم من‎ esodium sulfate ‏على‎ ‏مادة صلبة بلون أبيض مائل للصفرة.‎

Jao ‏الإنتاجية:‎ ‎B. 3-Methoxy-2-methyl-N-phenylbenzamide ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر‎ ٠١( ‏7*مئوية) من 4,94 جم‎ ١-( ‏إلى محلول بارد‎ Ye ‏لامائي؛ يضاف‎ tetrahydrofuran ‏ملليلتر‎ 7٠١ ‏في‎ TMEDA ‏و )2,0 جم )££ مللي مول) من‎ 8 ‏مزيج التفاعل‎ ly hexane ‏في‎ n-butyl lithium ‏مولار من‎ ٠,576 ‏؟ ملليلتر من محلول‎ ‏الناتج إلى (-٠٠١”مثوية) ويقلب لمدة £0 دقيقة تقريبا لتوفير ملاط بلون أصفر. يعاد تبريد الملاط‎ ‏الإطاع؛ وذلك يؤدي إلى‎ iodide ‏مللي مول)‎ ٠١( ‏7*مئوية) ويضاف 1,85 جم‎ ١-( ‏عندئذ إلى‎ ‏تكوين راسب بلون أبيض. يقلب خليط التفاعل طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة؛ يخمد مع‎ Ye ‏تفصل الطبقات الناتجة وتغسل الحالة‎ (diethylether ‏مشبع ويخفف مع‎ ammonium chloride sodium bicarbonate ‏مشيع ما‎ ammonium chloride ‏العضوية على التوالي مع محاليل‎ ‏مكل‎

مشبع ومحلول ملحي. تجفف عندئذ المواد المستخلصة العضوية على ‎sulfate‏ صتسله وتركز لتوفير مادة صلبة بلون أبيض والتي تنقى بإعادة التبلور من محلول ‎hexane/ethyl acetate ٠:١‏ لتوفير ؛ جم من إبر ‎needles‏ ‏الإنتاجية: 799. ‎2.36(s,3H), 3.88(s,3H), 3.89(s, 1H), 6.90-7.70(m,8H). °‏ 6 :(ياعط) ‎'H NMR‏ ‎IR (CHCly): 3424, 3013, 2963, 2943, 2840, 1678, 1597, 1585, 1519, 1463, 1438,‏ ‎em’.‏ 1069 ,1083 ,1178 ,1240 ,1264 ,1321 ,1383 ‎MS(FD): m/e 241 (M”, 100).‏ التحليل لأجل 11,107ئى: المحسوب ب ‎VERY‏ كل ‎¢L,YV‏ لل ‎0,A0‏ الموجود و ‎VE,10‏ ‎Hye‏ حاترت لل ‎OA‏ ‎C. 3-Hydroxy-2-methylbenzoic acid‏ يسخن مع إعادة تكثيف البخار لمدة ‎YE‏ ساعة مزيج من ‎٠,7١‏ جم (5 مللي مول) من مركب عنوان المستحضر ‎hydrochloric acid lik Yeo 2B‏ © عياري و١٠‏ ملليلكقر من محلول ‎ZY + hydrobromic acid‏ في ‎acetic acid‏ بعد التبريد ؛» يخفف مزيج التفاعل مع ‎٠٠١‏ ملليلقر ‎acetate ٠٠‏ الاطاء و١٠٠‏ ملليلتر ماء . تفصل الطبقات الناتجة وتغسل الطبقة العضوية مرة واحدة مع ماء ثم تصبح قاعدية إلى أس هيدروجيني ‎١١ (pH)‏ بإستخدام ‎١,5 sodium hydroxide‏ عياري. تفصل الطبقات الناتجة ويعاد تحميض الطبقة الماثية إلى أس هيدروجيني ‎١ (pH)‏ بإستخدام ‎hydrochloric acid‏ © عياري. يستخلص المركب المطلوب عندئذ من هذه الطبقة المائية بإستخدام ‎.ethyl acetate‏ تغسل عندئذ المواد المستخلصة بواسطة ‎ethyl acetate‏ مع محلول ملحي» تجفف ‎٠‏ على ‎sodium sulfate‏ ترشح؛ وتركز عندئذ لتوفير مادة متبقية والتي بعد التركيز مرتين من ‎hexane‏ تنتج (790) مجم من مادة صلبة بلون أبيض. الإنتاجية: ‎JAN‏ ‎1H), 7.02(t,J=7.69Hz,1H),‏ م7 8.03-,6.98)41 ‎IH NMR (DMSO-d): 5 2.26(s,3H),‏ ‎7.15(d,J=7.37Hz,1H), 9.55(br.s, 1H).‏ ‎IR (CHCl3): 3600-2100 (br.), 3602, 2983, 1696, 1588, 1462, 1406, 1338, 1279, Yo‏ ‎cm’.‏ 816 ,854 ,892 ,920 ,1038 ,1075 ,1154 ,1174 ‎MS(FD): m/e 152 (M", 100).‏ ‎VA‏ v. 0) (H 17,18 (C ‏الموجود‎ 0,7 + 1 £1F,10 © ‏المحسوب‎ :CsHsO3 ‏التحليل لأجل‎ ‏مول)‎ + FF) ‏بطريقة بديلة؛ يحضر المركب المطلوب بالعنوان أعلاه بإضافة 77,6 جم‎ ‏على أقسام صغيرة إلى محلول بارد (- ٠*مثوية) من £0 جم )07+ مول) من‎ sodium nitrite ‏جزيء جرامي) من‎ ٠,١8 ‏ملليلتر؛‎ © A) ‏جم‎ ٠١و‎ 3-amino-2-methylbenzoic acid ‏مع إستقاء درجة الحرارة أقل‎ cela ‏مركز في £0 ملليلر‎ sulfuric 2000 ٠ ‏دقيقة تقريبا عند (-١٠”مئوية)؛ يصب في محلول‎ To ‏من 7*مئوية. يقلب مزيج التفاعل الناتج لمدة‎ ‏ويسخن عندئذ ببطء إلى 80"مئوية‎ cele ‏لتر‎ ٠,7 ‏مركز في‎ sulfuric acid ‏ملليلتر من‎ ٠ ‏عندما يتوقف تصاعد الغان‎ .)ةيوئم#٠‎ ١-6 ‏تصاعد كثيف للغاز بين درجات حرارة‎ aaa) ‏يبرد مزيج التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة ويستخلص المركب بالعنوان أعلاه خمس مرات مع‎ ‏ملاليلقر من محلول‎ ٠00 ‏ملليلتر). تتحد الأطوار العضوية المتحدة مع‎ ٠٠١( ethyl acetate ٠ ‏مائي مشبع. تفصل الطبقات الناتجة وتحمض الطبقة المائية إلى‎ sodium carbonate ‏مركز. يستخلص مركب العنوان عندئذ بإستخدام‎ 1370100010116 acid ‏أس هيدروجيني ؟ مع‎ ‏تجفف على‎ ale ‏ملليلتر) وتغسل الأطوار العضوية المتحدة مع محلول‎ 0+ +) ethyl acetate ‏ترشح وتركز عندئذ تحت ضغط مخفض لتوفير مادة خام. تنقى هذه المادة‎ «sodium sulfate ‏لتوفير 77,7 جم من مسحوق بلون‎ chloroforom/ethyl acetate ‏بإعادة التبلور مرتين من مزيج‎ ve ‏برتقالي فاتح.‎ .707 ‏الإنتاجة:‎ ‏مثال مرجعي‎ [3S-(3R*,4aR* ,8aR*2'S* 3'R*)]-2-] 2'-hydroxy-3'-phenylmethyl-4'-aza-5'-0x0-5'"- (2"-fluoro-3"-hydroxyphenyl)pentyl]decahydroi soquinoline-3-N-t- ‏ىل‎ ‎butylcarboxamide ‏مللي مول) من مركب عنوان‎ +, Y) ‏إلى محلول بارد (-١٠٠”مئوية) يحتوي على 80 مجم‎ ‏مللي مول) من‎ ١7( ‏المستحضر 13 )¥ مجم )+ مللي مول) من المستحضر 118 و17 مجم‎ ‏لامائي؛‎ tetrahydrofuran ‏في ¥ ملليلتقر‎ (HOBTH,0) 1 -hydroxybenzotriazole hydrate ‏يقلب مزيج‎ (DCC) 1,3-dicyclohexylcarboimide ‏يضاف ١؛ مجم (7. مللي مول) من‎ vo ‏التفاعل لمدة 7 ساعة عند درجة حرارة الغرفة ثم يركز تحت ضغط مخفض. تعاد إذابة الباقي‎ sodium bicarbonate ‏يغسل على التوالي مع‎ celite ‏يرشح خلال‎ ethyl acetate ‏الناتج في‎

VA

مشبع ومحلول ‎(gale‏ يجفف على ‎«sodium sulfate‏ يرشح ويركز ‎٠‏ ينقى المنتج الخام بإستخدام تحليل كروماتوجرافي ‎eld‏ (لوح ‎١‏ ملليمتّر؛ فمسل متدرج 25-7 ‎methanol‏ في ‎(methylene chloride‏ لتوفير ‎VE‏ مجم من رغوة بلون أبيض. الإنتاجية: ‎VY‏ ‎(c = 0.333, MeOH). °‏ 90.80°- و[ه] ‎'H NMR (CDCls): 8 1.24(s,.9H), 1.1 6-2.05(m, 14H), 2.20-2.40(m,2H), 2.55-‏ ‎2.70(m,2H), 2.90-3.04(m,2H), 3. 10-3.25(m, 1H), 4.03(br.s,1H), 4.51 (br.s,1 H),‏ ‎6.01(s, 1H), 6.90-7.35(m,9H).‏ ‎IR (CHCl3): 3580, 3550-3100 (br.), 2929, 2865, 1662, 1596, 1521, 1472, 1455,‏ ‎cm’. ١‏ 839 ,879 ,1047 ,1157 ,1293 ,1368 ,1394 ‎MS(FD): m/e 540 2, 100).‏ ‎m/e :HR MS(FAB)‏ لأجل ‎:C3HasN3OsF‏ المحسوب ‎FYTA‏ 08 الموجود 40777778 مثال ؟ ‎[3S-(3R*.4aR*.8aR*2'S*.3 'R*)]-2-[2'-hydroxy-3 '.phenylmethyl-4'-aza-5 '-0Xx0-3'-‏ ‎(2"-chloro-pyrid-3"-yl)pentyl |decahydroisoquinoline-3-N -t-butylcarboxamide Yo‏ يحضر مركب العنوان جوهريا طبقا للإجراء المفصل في المثال ١؛‏ بإستخدام 86 مجم ‎CX)‏ ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر ‎YY (IB‏ مجم )¥,+ مللي مول)من ‎١ «2-chloronicotinic acid‏ مجم ‎١57(‏ مللي مول) ‎DCC‏ و/ا؟ مجم ‎lle ١7(‏ مول) من ‎HOBT HO‏ في ¥ ملليلتر ‎tetrahydrofuran‏ لامائي. ينقى المنتج الخام بتحليل كروماتوجرافي ‎٠‏ شعاعي (لوح ‎١‏ ملليمتر ¢ فصل متدرج ‎ja‏ -ه / ‎methanol‏ في ‎(methylene chloride‏ لتوفير ‎OA‏ مجم من رغوة بلون أبيض مائل للصفرة. الإنتاجية: ‎Jot‏ ‎(DCC‏ و؟؟ مجم )31+ مللي مول) من ‎HOBTH;0‏ في ؛ ملليلتر ‎tetrahydrofuran‏ تتقى المادة الخام الناتجة بتحليل كروماتوجرافي شعاعي (لوح ‎١‏ ملليمتر؛ مادة فاصلة ¥/ ‎methanol‏ ‏»في ‎(methylene chloride‏ لتوفير ‎VO‏ مجم من رغوة بلون أبيض. الإنتاجية: ‎JA‏ ‎MeOH).‏ ,0.160 = ¢( 43.75°- وزه] خلا

'H NMR (CDCl): & 0.87(t.3H), 1.18(s,9H), 1 -2.04(m,15H), 2.24-2.33(m,2H), 2.49-2.58(m,3H), 2.66(m, 1H), 2.98(m,2H), 3.37(m, 1H), 3.99(m, 1H), 4.52(m,1H), 5.07(m, 1H), 5.70(s, 1H), 6.43(d,J=8.32Hz,1H), 6.56(d,J=7.32Hz,1H), 6.76(d,J=7.12Hz,1H), 6.95(t.J=7.78Hz,1H), 7.20-7.33(m,5H).

IR (KBr): 3287 (br.), 3086, 2932, 2868, 1681, 1558, 1456, 1368, 1334, 1291, 1261, 0 1218, 1169, 1101, 1042, 776, 734, 552 cm’.

MS(FD): m/e 564 (M", 100).

OTE, FVAL ‏الموجود‎ €0TE, FAY ‏المحسوب‎ :CaHsoN304 ‏لأجل‎ m/e :HR MS(FAB) ١ ‏مثال‎ ‎[3S-(3R*.4aR* ,8aR*2'S* 3'S*)]-2- 2'-hydroxy-3'-phenylthiomethyl-4'-aza-3 '-0X0- ١ 5'-(2"-fluoro-3"-hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3-N-t- butylcarboxamide ‏مجم‎ 7٠١ ‏يحضر مركب العنوان جوهريا طبقا للإجراء المفصل في المثال المرجعي؛ بإستخدام‎ ‏مجم )11+ مللي مول) من مركب‎ TET 16 ‏مللي مول) من مركب عنوان المستحضر‎ ١ 1) ‏و77 مجم )17+ مللي مول) من‎ DCC ‏مجم )17+ مللي مول) من‎ TF 20 ‏عنوان المستحضر‎ 00 ‏تنقى المادة الخام الناتجة بتحليل كروماتوجرافي‎ tetrahydrofuran ‏في ¢ ملليلتر‎ 00 ‏لتوفير 4 © مجم‎ (methylene chloride ‏في‎ methanol 7 ‏ملليمتر؛ مادة فاصلة:‎ ١ ‏شعاعي (لوح‎ ‏من رغوة بلون أبيض.‎

Je ‏الإنتاجية:‎ ‏وز[ه]‎ -119.23° (c = 0.26, MeOH). Y. 'H NMR (CDCl): 8 1.09(s,9H), 1.12-1.79(m, 12H), 1 .93-2.02(m,2H), 2.17- 2.30(m,2H), 2.31(s,3H), 2.43-2.61(m,2H), 2.91(m, 1H), 3.42(m, 1H), 3.78(m, 1H), 4.07(m, 1H), 4.47(m,1H), 5.37(m,1H), 5.51(br.s,1H), 6.84(m,1H), 7.06(m,2H), 7.17- 7.32(m,4H), 7.45(m,2H).

IR (KBr): 3297, 2925, 2862, 1627, 1586, 1530, 1482, 1466, 1439, 1366, 1287, Yo 1221, 1156, 1119, 1026, 801, 735, 689 cm’.

MS(FD): m/e 568 (M", 100).

YA

‎HR MS(FAB)‏ لأجل 05م ::: المحسوب 04 ‎$0TATY‏ الموجود ‎OTA TIAY‏ مثال ‎Y‏ ‎[3S-(3R*.4aR*,8aR*2'S*.3'S*)]-2-| 2'-hydroxy-3'-phenylthiomethyl-4'-aza->'-oxo-‏ ‎5'-(2"-methyl-3"-hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoguinoline-3-N-t-butyl‏ ‎carboxamide methanesulfonic acid salt °‏ يحضر هذا المركب كما في المثال ١؛‏ بإستثناء أن خطوات التحضير ‎1A‏ و10 تتغير كما هو مذكور في خطوة ‎)١(‏ أدناه؛ وتضاف خطوة تكوين الملح (7) أدناه. ‎)١(‏ إلى دورق سعة ؟ لتر يضاف ‎(on ٠٠١5,7( PsP‏ في ‎٠٠٠‏ ملليلتر ‎CHyCly‏ ويبرد المزيج إلى ‎(Vem)‏ يضاف إلى المزيج محلول من ‎diethylazidodicarboxylate‏ ‎٠‏ )17 ملليلتر) في ‎٠١‏ ملليلتر ‎THF‏ بالتنقيط خلال ‎Yo‏ دقيقة. بعد ‎YO‏ دقيقة؛ يضاف بالتتقيط محلول ‎٠٠١( N-carbobenzyloxy-L-serine‏ جم) في 5060 ملليلتر ‎THF‏ خلال ©؛ دقيقة ويترك ‎la‏ ‏إلى درجة حرارة الغرفة في حمام ماء على مدار ساعتين. يضاف ‎١٠٠١‏ ملليلتر ‎THE‏ إلى المزيج. في دورق آخر؛ يبرد محلول ‎thiophenol‏ )£1 جم) في لتر واحد ‎THF‏ في حمام ‎ab‏ ‏إلى صفر"مئوية ويعالج على أجزاء مع تشتيت ‎٠١( NaH‏ جم) ليعطي محلول غليظ القوام. بعد ‎Ne‏ ساعة واحدة؛ يضاف محلول ‎lactone‏ الخام إلى محلول 6 بالتنقيط بواسطة قمع إضافة خلال ‎ABET‏ بعد ‎١١‏ ساعة؛ يفصل بالترشيح راسب بلون أبيض؛ وتغسل عجينة المرشح مع ‎THF‏ توضع المادة الصلبة في 11011504 ‎١,4‏ عياري 5 ‎«Jail (EtOAc‏ وتغسل الطبقة العضوية مع محلول ملحي؛ تجفف؛ وتبخر لتوفير ‎AO‏ جم من ‎2R-2-N-(benzyloxycarbonyl)amino-3-phenylthio propanoic acid‏ كزيت لزج. 7 يعتقد أن المادة الصلبة الأصلية هي ‎sodium salt‏ من المنتج المطلوب. لذلك» فإن الإنتاجية وسهولة العزل يمكن تحسينها بعزل ‎sodium salt‏ مباشرة. إن ‎chloroketone 3R-1-Chloro-2-oxo-3-N-(benzyloxycarbonyl)am ino-4-phenylthio butane‏ الخام ‎can YAY)‏ 476,4 مللي مول) يضاف إلى لتر واحد من ‎ethanol‏ مطلق و١0٠٠ ‎lle‏ ‎(THE‏ ويبرد المحلول في ‎plas‏ 002-2061008 (حرارة داخلية -78*مئوية)؛ ويضاف بالتنقيط ‎NaBH; re‏ (17, جم 19,5 ملي مسول) في ‎You‏ ماللقر ‎ethanol‏ مطلسق خلال ساعة واحدة (درجة الحرارة الداخلية > (-75*مثوية)). يبين تحليل ‎TLC‏ بعد الإضافة أن التفاعل قد إكتمل. يخفف التفاعل مع 00" ملليلتر ‎ether‏ ويخمد بالإضافة البطيثة لمركب مكلا

Ye ‏عياري مع التقليب؛ وذلك يسبب تصاعد الغاز. يركز هذا المزيج تحت ضغط‎ ١. NaHSO; ‏وتغسل الطبقات‎ cether ‏ويضاف ماء إضافي. يستخلص المزيج مع‎ ethanol ‏مخفض لإزالة معظم‎ ‏وتركز‎ «(sodium sulfate) ‏تجفف‎ (ala ‏العضوية المتحدة مع 11211003 مائي مشبع ومحلول‎ ‏تحت‎ hexane ‏جم من مادة صلبة بلون أبيض مائل للصفرة. تسحق هذه المادة مع‎ ١6,7 ‏لتوفير‎ ‏مرات‎ ٠١ ‏بحرص وهو ساخن. يكرر هذا الإجراء‎ hexane ‏ملليلتر)؛ ويصفق‎ Yoo) ‏الغليان‎ ٠ ‏جم من مادة صلبة بلون أبيض مائل للصفرة‎ ٠٠75 ‏في كل مرة) لتوفير‎ SLY) ‏لتعطي 6 جم من مادة‎ hexane ‏تركز المادة المرشحة‎ (TLC ‏واحد نقي بواسطة‎ 7 =)

CHCl, ‏ملليلقر‎ ٠ ‏صلبة بلون أبيض توضع جانبا. تسخن المادة الصلبة المسحوقة مع‎

Agee ‏وترشح ساخنة. يترك المحلول الصافي ليبرد إلى‎ hexane ‏ملليلتر‎ ١ ‏وحوالي‎ ‏لتعطي 7,167 جم‎ hexanes ‏ويوضع عندئذ في المجمد . ترشح المادة الصلبة الناتجة وتغسل مع‎ ٠ ‏خام من‎ Jeli ‏من أعلاه ومع منتج‎ hexane ‏من مادة صلبة بلون أبيض. تتحد المادة المرشحة مع‎ ‏الباديء في كل منهما)؛ وتنقى المادة‎ ketone ‏مجم من‎ O00 ( ‏تجربتين لهما نطاق إنتاج قليل‎ ‏محمل مع‎ cether-hexanes y:)<—ether-hexanes ٠:7( SiO; ‏المتحدة كروماتوجرافيا على‎ ‏جم من زمير نقي للمركب‎ ٠٠١ ‏لتوفير 1,27 جم من منتج إضافي. ينتج إجمالي‎ (CHCl [2S-(2R*,35*)]-1-Chloro-2-hydroxy-3-N-(benzyloxycarbonyl)amino-4-phenylthio butane | ٠ ‏من حمض).‎ 725٠6 ‏(إنتاجية‎ ‎alphap = -63.6° ‏راحه)‎ MeOH). (Y) ‏تكوين ملح‎ ‏يذاب‎ Y. [3S-(3R*,4aR*,8aR*,2'S*.3 'S¥)]-2-[2'-hydroxy-3 '-phenylthiomethyl-4'- aza-5'-0x0-5'-(2"-methyl-3"-hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline- 3-N-t-butylcarboxamide ‏ويضاف بالتنقيط محلول من‎ «CHCl ‏ملليلتر‎ Yo 5 methanol ‏ملليلتر‎ "٠١ ‏جم) في‎ TYE) ‏دقائق؛ يركز مزيج‎ ٠١ ‏بعد‎ CHCl ‏ملليلتر‎ ٠١ ‏مجم) في‎ ©471) methanesulfonic acid ve

Wo ‏ويضاف ببطء إلى مزيج من‎ THF ‏التفاعل إلى رغوة. يوضع الملح الخام في © ملليلتر‎ ‏مللبلتر 95 مع التقليب حتى ينتج معلق دقيق. يبرد هذا في مُجَسَّد‎ Yo ethyl ether ‏ملليلتر‎ ‎YA vo ¥ Vo ‏ويلي ذلك تجفيف بالشفط لتوفير‎ cethyl ether ‏يرشح باردا ويغسل عدة مرات مع‎ cfreezer ‏جم )1 9 %( من:‎ [3S-(3R*,4aR*,8aR* ,2'S* 3'S*)]-2-[2' -hydroxy-3' -phenylthiomethyl-4'-aza- 5'-0x0-5'-(2"-methyl-3 "_hydroxyphenyl)pentyl] decahydroisoquinoline-3-N-t- butyl carboxamide methanesulfonic acid salt ° ‏كمسحوق بلون أبيض.‎ ‏وهو إنزيم‎ HIV ‏كما هو مذكور أعلاه؛ فإن مركبات الإختراع الحالي مفيدة لتثبيط بروتياز‎

HIV ‏يصاحبه إنتاج وتجميع مكون فيروسي. إن تطبيقا للإختراع الحالي هو طريقة لعلاج عدوى‎ ‏تشمل إعطاء عائل أو مريض»؛ مثل حيوان من الحيوانات الرئيسية؛ كمية مؤثرة من مركب من‎ ‏الصيغة أو ملح مقبول دوائيا منه. إن تطبيقا آخرا للإختراع الحالي هو طريقة لعلاج الإيدز تشمل‎ ٠ ‏إعطاء عائل أو مريض كمية مؤثرة من مركب من الصيغة أو ملح مقبول دوائيا منه. إن تطبيقا‎ ‏تشمل إعطاء خلية أو عائل أو مريض‎ HIV ‏إضافيا للإختراع الحالي هو طريقة لتثبيط بروتياز‎ ‏كمية مؤثرة من‎ (HIV ‏مثل حيوان من الحيوانات الرئيسية؛ مصاب بعدوى‎ HIV ‏مصابين مع‎ ‏مركب من الصيغة أو ملح مقبول دوائيا منه.‎ ‏كمية من مركب من الصيغة أو ملحه‎ effective amount ‏يعني المصطلح "كمية مؤثرة‎ vo ‏إن الجرعة‎ (HIV ‏المقبول دوائيا تكون مؤثرة لتثبيط إنتاج وتجميع مكون فيروسي بواسطة بروتياز‎ ‏الخاصة من مركب المعطاة طبقا لهذا الإختراع للحصول على تأثيرات علاجية أو تثبيطية سوف‎ ‏متضمنة؛ على سبيل المثال؛ المركب‎ GAIL ‏تعتمد؛ بالطبع؛ على الظروف الخاصة المحيطة‎ ‏المعطى؛ طريقة الإعطاء؛ الحالة المراد علاجها والعائل أو المريض المنفرد المراد علاجه. تحتوي‎ ‏مجم/‎ ١509 ‏جرعة يومية تمثيلية (معطاة في جرعات وحيدة أو مقسمة) مستوى جرعة من حوالي‎ oT ‏مجم/ كجم من وزن الجسم من مركب من هذا الإختراع. تكون الجرعات‎ ٠0 ‏كجم إلى حوالي‎ ‏يفضل‎ og ‏مجم/ كجم‎ 5١ ‏اليومية المفضلة بصفة عامة من حوالي 5 مجم/ كجم إلى حوالي‎ ‏مجم/ كجم.‎ ٠١ ‏مجم/ كجم إلى حوالي‎ ١١ ‏من حوالي‎ eS ‏قد تعطى مركبات الإختراع بعدة طرق؛ متضمنة الإعطاء بالفم؛ شرجياء عبر الجلد؛ تحت‎ ‏الجلد؛ في الوريد؛ في العضل وفي الأنف. يفضل أن تصاغ مركبات الإختراع الحالي قبل‎ ve ‏الإعطاء. لذلك؛ فإن تطبيقا آخرا للإختراع الحالي هو تركيب أو مستحضر دوائي يشمل كمية‎

YA

A

Jie ‏مقبولة دوائياء‎ carrier ‏مؤثرة من مركب من الصيغة (1) أو ملح مقبول دوائيا منه ومادة حاملة‎ ‏لذلك.‎ excipient ‏أو مادة مسوغة‎ diluent ‏مادة تخفيف‎ ‏يفضل أن يشمل المقوم النشط من 7009 إلى 744,5 من وزن المستحضر. إن 'مقبولة دوائيا‎ (A gal) ‏مادة التخفيف أو المادة‎ Jie Alaa) ‏تعني أن المادة‎ "pharmaceutically acceptable ‏ى للمستحضر وليست ضارة للعائل أو المريض.‎ AY ‏متوائمة مع المقومات‎ 0 ‏قد تحضر مستحضرات دوائية من مركبات الإخثر 2 بإجراءات معروفة بإستخد أم مقومات‎ ‏معروفة ومثو افرة تماما. في تصنيع تركيبات الإختر اع الحالي ¢ فسوف يمزج المقوم النشط عادة مع‎ ‏مادة حاملة؛ أو يخفف بمادة حاملة؛ أو يغلف بمادة حاملة؛ والتي قد تكون في شكل كبسولة؛ كيس؛‎ ‏ورقة أو حاوية أخرى مناسبة . عندما تخدم المادة الحاملة كمادة تخفيف؛ فقد تكون عبارة عن مادة‎ ‏صلبة شبه صلبة أو سائلة تقوم بدور وسط حامل ؛ مادة مسوغة أو وسط للمقوم النشط. لذلك؛ فقد‎ Ye. ‘ ‏تكون التركيبات في شكل أقر اص حبوب» مساحيق؛ أقر اص معينة- الشكلء أكياس ‘ براشيم‎ ‏ات هو ائية (كمادة صلبة أو في وسط سائل)‎ Nay ¢ ‏الكسير ات؛ معلقات؛ مستحلبات ‘ محاليل ¢ أشربة‎ ‘ ‏ا من الوزن من المركب النشط)‎ Yo ‏مر اهم (تحتوي ‘ على سبيل المثال ‘ على ما يصل إلى‎ ‏للحقن» مساحيق معبأة معقمة؛ إلخ.‎ ALE ‏كبسولات جيلاتين رخوة وصلبة؛ تحاميل؛ محاليل معقمة‎ ‏إن أمثلة الصياغة التالية توضيحية فقط ولا يقصد بها تحديد نطاق الإختراع. يمثل المصطلح‎ vo ‏أو ملح مقبول دوائيا منه.‎ (I) ‏مركب من الصيغة‎ "active ingredient ‏'مقوم نشط‎ ١ ‏الصياغة‎ ‏تحضر كبسولات جيلاتين صلبة بإستخدام المقومات التالية:‎ ‏ا | الكمية (مجم/ كبسولة)‎

Yo. ‏مقوم نشط‎ 7 ٠*١ ‏نشا ‘ جافة‎ ٠ Magnesium stearate

ETT ‏الإجمالي‎ ‏الصياغة ؟‎ ‏يحضر قرص بإستخدام المقومات أدناه:‎ 7 fed

YOu ‏مقوم نشط‎ ‏متبلور دقيق ف‎ «Cellulose ٠١ ‏مدخن‎ «Silicon dioxide ° Stearic acid ave ‏الإجمالي‎ ‎YA

0 تتولف المكونات وتكبس لتكوين أقر اص يزن كل منها 176 مجم. الصيغة ¥ ‎pan‏ محلول رذاذ هو ‎a)‏ : يحتوي على المكونات التالية : مقوم نشط ‎٠ Yo‏ ‎Methanol‏ مار مادة دافعة ‎Ve propellant YY‏ ‎(Chlorodifluoromethane)‏ ‎vo pa‏ يمزج المركب النشط مع ‎ethanol‏ ويضاف المزيج إلى قسم من المادة الدافعة ‎(YY‏ يبرد إلى ‎٠‏ )- ١٠*مئوية)‏ وينقل إلى أداة تعبئة. تلقم الكمية المطلوبة عندئذ إلى حاوية من صلب لا ‎faa‏ ‎stainless steel‏ وتخفف مع الباقي من المادة الدافعة. تثبت عندئذ وحدات الصمام مع الحاوية. الصياغة ¢ ‎ual A Leal‏ ¢ يحتوي كل منها على ‎Te‏ مجم مقو نشط»؛ كما : (النن ل ‎CELL‏ ‏مقوم نشط ‎Te‏ ‏نشا ‎to‏ ‎Cellulose‏ متبلور دقيق ‎Yo‏ ‎Polyvinylpyrrolidone‏ (كمحلول ‎٠‏ في ‎(slo‏ ¢ ‎Sodium carboxymethyl starch‏ 8 ‎Magnesium stearate‏ ا ‎١ Talc‏ الإجمالي ‎ve]‏ ‏يمرر المقوم النشط؛ النشا 5 ‎cellulose‏ خلال منخل أمريكي شبكة رقم £0 ‎Jay .mesh‏ ‎٠‏ ويمزج جيدا. يمزج المحلول المائي الذي يحتوي على ‎polyvinylpyrrolidone‏ مع المسحوق الناتج؛ ويمرر المزيج عندئذ خلال منخل أمريكي شبكة رقم ‎mesh VE‏ تجفف الحبيبات الناتجة بهذه الطريقة عند ‎ago‏ وتمرر خلال منخل أمريكي شبكة رقم ‎mesh VA‏ يضاف ‎vie‏ 3 ‎ctale magnesium stearate «sodium carboxymethyl starch‏ المارين مسبقا خلال منخل أمريكي شبكة رقم 60 ‎mesh‏ إلى الحبيبات والتي؛ بعد المزج؛ تكبس على ‎A‏ صنع الأقراص ‎he‏ لتنتج أقراصاً يزن كل منها ‎٠5١‏ مجم. الصياغة 0 ‎pea 0‏ كبسو لات تحتوي كل منها على ‎Ae‏ مجم مقوم نشط؛ كما يلي : ‎VIA‏

YA

Gans |]

Ae ‏مقوم نشط‎ oq ‏نشا‎ ‎09 ‏متبلور دقيق‎ Cellulose

Y Magnesium stearate =] ‏الإجمالي‎ ‏يمرر خلال منخل أمريكي‎ «magnesium stearate Lal cellulose ‏يتولف المقوم النشط»‎ ‏مجم.‎ ٠٠١0 ‏ويعبأ في كبسولات جيلاتين صلبة بكميات‎ cmesh £0 ‏شبكة رقم‎ 1 ‏الصياغة‎ ‏كما يلى:‎ Jods ‏مجم مقوم‎ 7١ ‏تصنع تحاميلء تحتوي كل منها على‎ ‏مجم‎ YYO ‏مقوم نشط‎ ‏مجم‎ 1١ ‏جلسريد ات حمض د هني مشبعة‎

Saturated fatty acid glycerides ee] ‏الإجمالي‎ ‏ويعلق في جلسريدات الحمض الدهني‎ ٠ ‏يمرر المقوم النشط خلال منخل أمريكي شبكة رقم‎ ‏المنصهرة مسبقا بإستخدام أدنى حرارة ضرورية.‎ saturated fatty acid glycerides ‏المشبعة‎ ‏يصب المزيج عندئذ في قالب تحميلة محدد السعة يسع ؟ جر 0 ويترك ليبرد.‎ ١ ‏الصياغة‎ ‎: ‏مجم مقوم نشط/ © ملليلتر من الجرعة؛ كما بل‎ 5٠ ‏تصنع تحاميل؛ تحتوي كل منها على‎ ‏مجم‎ CS ‏مقوم نشط‎ ‏مجم‎ Or Sodium carboxymethyl cellulose ‏ملليلتر‎ Yo ‏شراب‎ ‏ملليلتر‎ «0 Benzoic acid ‏محلول‎ ‏كمية كافية‎ Flavor ‏نكية‎ ‏لون كمية كافية‎ ‏ماء نقي حتى إجما © ملليلتر‎ ‏ويمزج مع‎ mesh ¢° ‏يمسرر المقوم النط خلال منخل أمريكي شبكة رقم‎ Ye ‏والشر اب لتكوين عجينة ناعمة. يخفف محلول‎ sodium carboxymethylcellulose ‏النكهة واللون مع قسم من الماء ويضاف؛ من التقليب. تضاف عندئذ كمية كافية‎ benzoic 40 ‏من الماء لينتج الحجم المطلوب.‎

A ‏الصياغة‎ ‏يحضر مستحضر فى الوريد كما يلي:‎ yo ‏مجم‎ ١ +e ‏مقوم نشط‎ ‏ملليلتر‎ ٠ isotonic ‏محلول ملح متواتر‎

YA

يعطى محلول المقومات أعلاه بصفة عامة في الوريد لمريض عند معدل ‎١‏ ملليلتر في الدقيقة. فحص النشاط يستخدم عدد من الإختبارات لإختبار النشاط الحيوي للمركبات المثبطة لبروتياز ‎HIV‏ على سبيل المثال؛ تستخدم الإختبارات لتحليل معدلات التثبيط المحلل للبروتين والتأثيرات المضادة للفيروسات على خطوط خلية ‎cell Lines‏ مصابة مع ‎(HIV‏ إن الإجراءات لهذه التجارب موصوفة أدناه. إن النتائج من هذه الإختبارات ملخصة في الجدول ‎١‏ أدناه أو ملخصة في الأمثلة أعلاه. ‎-١‏ فحص عقار ‎Jf‏ لمركبات مضادة ‎HIV‏ في معهد ‎(SRD) Southern Research‏ (يرمز — النتائج المسجلة في جدول ‎١‏ كما يل ‎SRI SEM’‏ (نانوجرام/ ‎"(Alle‏ أو "2 ‎SRT‏ (نانوجرام/ لقد وضع ‎SRI‏ برنامجا للتحليل المضاد للفيروسات الأولية للمركبات في إختبارات عيار دقيق ‎Ould‏ قدرة مركب منتقى على تثبيط ‎HIV‏ القاتل للخلايا. يشتمل هذا الإختبار على تحويل صبغة ‎MTT tetrazolium‏ إلى منتج فورمازان ‎formazan‏ ملون بواسطة إنزيمات الميتوكوندريا ‎mitochondrial enzymes‏ في ‎UWA‏ نشطة أيضيا. يستخدم نظام الإختبار هذا عند ‎SRI‏ لفقحص أكثر من ‎7٠٠٠١8‏ مركب/ اليوم. بإيجازء يشتمل الإختبار على إصابة خلايا ‎CEM‏ أو 1112 في أطباق مستديرة القاعدة بها 47 عين. يضاف المركب موضع الأهمية قبل الإصابة. عقب ‎١‏ أيام من الحضانة عند ١7*مثوية‏ تصبغ الأطباق مع ‎MTT‏ تقدر نتائج الإختبار كميا بقياس ضوئي طيفي على قاريء طبق ‎Molecular Devices Vmax‏ تحلل البيانات بالتراجع الخطي ‎regression‏ 7 بإستخدام برنامج سوفت وير ‎in-house‏ لحساب النشاط المضاد للفيروسات ‎(ICss <ICso ICas) ٠‏ والسمية ‎(TCos 10 (TCas)‏ بالإضافة إلى قيم أخرى. تجرى روتينيا الإختبارات المضادات للفيروسات الأولية في خلايا ‎CEM‏ أو ‎MT-2‏ لقد وجد ‎SRI‏ أن كل المركبات النشطة تم تحديدها في خلايا ‎«CEM‏ بينما أن التجارب التي أجريت في خط الخلية ‎MT-2‏ تفتقد نسبة صغيرة من المركبات النشطة. ب إختبارات فحص قياسية في خلايا ‎MT-25 CEM‏ ‎(V) Ye‏ تخفيف المركب وتوصيله إلى الأطباق تذاب العقاقير في الوسط الحامل الملائم مثل ماء مقطر أو 0 عند الضرورة. تستخدم قفازات لثية ‎datex‏ أغطية معمل وأقنعة أثناء كل مراحل عملية المعالجة لمنع التعرض للعوامل محلا

ف الضارة بصورة محتملة. يحضر العقار عند التركيز الملائم ويخزن عند (-١7"مئوية)‏ حتى الإستخدام بواسطة معمل الفحص. يجري التخفيف الأول لكل مركب في أنبوبة تخفيف مع وسط لينتج تركيز مرتين مثل ‎lel‏ تركيز إختبار. تستخدم عندئذ أنابيب معايرة معقمة لعمل تخفيفات متسلسلة نصف لوغاريتم لكل مركب. عقب تخفيف ‎lied)‏ يضاف المركب المخفف إلى العين 0 الملائمة من طبق العيار الدقيق الذي به 97 عين. يمكن تقليديا إختبار ما يصل إلى ‎١١‏ تخفيف في ثلاثة مقادير متساوية على طبق وحيد مع كل الأمثلة المقارنة الملائمة متضمنة مثال مقارن خلية؛ مثال مقارن فيبروس؛ مثال مقارن للسمية؛ مثال مقارن للون عقار؛ مثال مقارن للوسط ومثال مقارن لدن (بلاستيك) (الخلفية الأساسية). عندما يتضمن الإختبار >7 تخفيفات فقط» يمكن إختبار عقارين على طبق عيار دقيق واحد. تضاف العقاقير إلى الطبق في حجم نهائي ‎٠٠١‏ ميكرواتر.

‎(Y) ٠‏ الخلايا والفيبروس في أثناء فترة تحضير تخفيفات العقار ؛ تغسل الخلايا وتعد. تراقب الحيوية بإستثناء صبغة أزرق تريبان ‎trypan‏ ولا تجرى الإختبارات إذا كانت الحيوية أقل من ‎TA‏ تستبقى الخلايا في طور ‎sail‏ الأسي ‎exponential growth phase‏ وتفصل بنسبة 7:1 في اليوم السابق لتأكيد معدل

‎. ‏الأسي‎ growth rate sell ‏إذا لم يحدد خلاف‎ MT-2 5 CEM ‏بالنسبة للفحص الأولي؛ فإن خطوط الخلية المستخدمة هي‎ vo (FBS) 7٠١ ‏مع مصل جنين بقري خامد بالحرارة‎ RPMI 1640 ‏ذلك؛ فإن الوسط المستخدم هو‎ .antibiotics ‏ومضادات حيوية‎ 3 glutamine ‏جلوتامين‎ ‏تنمو الخلايا عند 7١7*مئوية في جو 60(2 10 في هواء. إن الفيروس المستخدم لهذه التجربة‎ ‏والتي تحضر بعملية إصابة حادة.‎ (RF ‏من 1117-1 و/أو‎ IIIB isolates ‏هو عزلات‎ ‏بإيجازء تتكور الخلايا المصابة بالفيروس يوميا بالبدء عند ¥ أيام بعد الإصابة حتى يقوم‎ Ye ‏الفبروس بقتل كل لخلايافي المزرعة. يستخدم نشاط ترانسكربتاز عكسي‎ ‏بها أكبر قدر من الفيروس.‎ A pools ‏لتحديد التجمعات‎ p24 ‏و2115‎ Reverse transcriptase ‏قبل الإستخدام‎ (Asie =) ‏ترشح وتجمد عند‎ els YE ‏تجمع هذه الكميات المجمعة كل‎ ‏في الإختبار؛ يعاير تجمع الفيروس المعدي على كل خطوط الخلية المتوافرة لتحديد كمية الفيروس‎ ‏المطلوبة في الإختبار المضاد للفيروسات.‎ Yo ‏بصفة عامة؛ فإن التجمعات الناتجة بطريقة الإصابة الحادة تتطلب إضافة ميكرولتر واحد من‎ ‏بهذه الطريقة؛ تحضر كمية‎ ..,١٠ ‏فبروس معدي لكل عين لينتج فحص للعقاقير عند تعددية عدوى‎ ‏محل‎

)£ ‎AAS‏ من الفيروس وتجمد لتكتمل على ‎٠٠٠١‏ طبق عيار دقيق ‎cmicrotiter plates‏ وذلك يسمح بإختبار ما يصل إلى ألفين مركب من مخزون واحد للفيروس المعدي. إن إستخدام مخزون واحد للفيروس لمدة طويلة من الإختبار له تأثيرات محبذة جدا على إمكانية تكرار أنظمة الإختبار. تجرى الإصابة الفيروسية لخلايا ‎CEM‏ و111-2 من أجل الإختبار المضاد للفيروسات في ‎٠‏ عملية إصابة ضخمة. يخلط العدد الملائم من الخلايا المطلوبة لإكمال الإختبار مع فيروس معدي في أنبوبة طرد مركزي مخروطية الشكل في حجم كلي قليل ‎7-١‏ ملليلتر. عقب حضانة لمدة ؛ ساعات تصل الخلايا ‎Abad‏ إلى التركيز النهائي الملائم 75 ١٠؟‏ خلية/ ‎Fe‏ مع وسط مزرعة نسيج حديث التحضير ويضاف ‎٠٠١‏ ميكرولتر إلى العيون التجريبية الملائمة والعيون المقارنة للفيروس. تزرع الخلايا غير المصابة عند نفس التركيز من أجل الأمثلة ‎٠‏ - المقارنة للسمية والأمثلة المقارنة للخلية. يمكن أيضا إجراء الإختبارات بإستخدام طريقة إصابة في العين ‎ -in-well infection method‏ هذه الحالة؛ يضاف العقار؛ الخلايا والفيروس إلى العين بصورة منفردة. في كل ‎Alla‏ يضبط ‎MOI‏ ليعطي ‎JB‏ كامل للخلية في عيون المثال المقارن الفيروس بحلول اليوم السادس. 9 تقييم تبيط 17م[ ‎Vo‏ بعد إضافة الخلايا والعقاقير إلى طبق العيار الدقيق ‎٠‏ يحضن الطبق لمدة ‎١‏ أيام عند ‎Gy TY‏ تحدد الخبرة أن الحضانة لفترات أطول من الوقت (7-+ أيام) أو إستخدام أعداد خلية مستخدمة أكبر )20 )1( تؤدي إلى نقصان ملحوظ في حيوية المثال المقارن الخلية وتضييق نطاق التباين في الكثافة البصرية بين الأمثلة المقارنة الخلية والفيروس عند الصباغة مع ‎MTT‏ ‏تشتمل طريقة تقييم الإختبار المضاد للفيروسات على إضافة ‎ly Sa ٠١‏ من ‎tetrazolium salt MTT | ٠‏ عند © مجم/ ملليلتر لكل عين من الطبق لمدة ‎A—f‏ ساعات. بعد مدة الحضانة هذه؛ تمزق الخلايا بإضافة ‎٠‏ © ميكرولتر من ‎SDS‏ 270 في ‎HCL‏ )++ عياري. إن النشاط الأيضي للخلايا الحية في المزرعة يؤدي إلى منتج تفاعل ملون يقاس بقياس طيفي ضوئي في قارئ ‎Molecular Devices Vmax (ub‏ عند ‎OV‏ نانومتر. إن قيمة الكثافة البصرية ‎(0D)‏ هو وظيفة لكمية منتج الفورمازان 2 التي تتناسب مع عدد الخلايا الحية. ‎Yo‏ يكون قارئ الطبق متصل مع الحاسوب الدقيق المعملي الفاحص الذي يقوم بتقييم بيانات الطبق ويحسب بيانات الطبق. يوفر تقرير الطبق ملخصاً لكل المعلومات الخاصة بالموضوع متضمنة قيم 0 المجردة؛ متوسط 0.0.8 المحسوب والتقليل 7 في ‎CPE‏ للفيروس بالإضافة إلى حسابات محلا

تتضمن ‎١10‏ 0و1 والمؤشرات المضاة للفيروسات ومؤشرات الخصوصية ‎.specificity indices‏ أخير ا تتضمن النتائج ‎Cosy‏ بيانياً يصف بصورة مرئية تأثير المركب على الخلايا غير المصابة (السمية) والتأثير الواقي أو غير الواقي للمركب على الخلايا المصابة. "- فحص خلية ‎ALS‏ لمركبات مضادة ‎HIV‏ عند ‎Lilly‏ 1 (يرمز إلى النتائج المسجلة في جدول ب ل لخلية كاملة نانوجزيئي جرامي" أو ‎ICs‏ خلية كاملة نانوجزيئي جرامي") أ- الغرض والخامات الغرض: تحديد 0و1 و0و00 للمركبات: العوامل الكاشفة ‎reagents‏ والمواد ‎materials‏ ‏الأوساط ‎media A A‏ ‎٠‏ الأوساط ‎٠٠١( (4) DMSO) A‏ ميكرولتر ‎DMSO‏ + 4,3 ملليلتر أوساط ‎(A‏ ‏يستخدم 123 ‎SN‏ لإصابة الخلايا )0 ‎١‏ ملليلتر لكل “> أطباق) ( ‎٠‏ ملليلتر لكل ؛ أطباق) خلايا ‎CEM‏ عند ‎]'٠١7٠[‏ خلية/ ملليلتر )£ أطباق = 50 ملليلتر) )1 أطباق = ‎6١‏ ملليلتر) ‎DMSO‏ (يحتاج © ملليلتر) 8 عند ‎(Usa lle ٠١(‏ (يحتاج ‎7١‏ ميكرولتر لكل منها) ض ‎AD ve‏ عند ‎٠١(‏ مللي مول) في ‎11٠٠١ DMSO‏ ؛ أو ‎١‏ أطباق قاعدتها على ‎JSS‏ لآ بها 976 ‎oe‏ ‏؛ أطباق مسطحة القاعدة بها 976 عين للتخفيفات ‎٠١-١‏ صناديق سنون كوستار معقمة ‎٠‏ صواني عامل كاشف تقريبا ‎Costar 12-pette ٠‏ المعلومات الخاصة بالموضوع: ‎٠‏ خلية/ عين = ‎١.١‏ خلية/ ملليلتر = ‎٠٠٠١‏ خلية/ ‎٠٠١‏ ميكرولتر ‎٠‏ ميكرولتر = حجم كلي في العين تركيز ‎DMSO‏ النهائي = 2,75 ‎ve‏ تخفيف 50123 نهائي = ‎NE)‏ ‏مركبات مخففة بدرجة متسلسلة 353 ‎AD‏ 3:1 ب- الإجراء ‎YA‏

07 تحضير الخلية وزراعة الخلاياء الأوساط ‎A‏ والأوساط ‎DMSO) A‏ )/(: (أ) يرقم طبق زراعة أنسجة ‎tissue culture‏ به ‎AT‏ عين لكل مركب مختبر؛ واحد لطبو مقارنء وواحد للمركب المقارن ‎٠‏ ‎١‏ أمثلة مقارنة سالبة وموجبة ‎Y‏ 355 ‎A Y‏ ‎B ¢‏ ° 0 ‎D 3‏ (ب) تعد الخلايا على جهاز ‎elas)‏ خلايا ‎hemacytometer al‏ ويعاد تعليقها في ‎5٠0‏ ملليلتر أو ‎Av‏ ملليلتر أوساط ‎A‏ عند تركيز ‎(FY ex)‏ خلية/ ملليلتر. عد الخلايا على جهاز إحصاء خلايا الدم: ترسم أنبوبتان ‎١‏ و؟ ‎nune‏ سعة ‎١,8‏ ملليلتر. يوضع ‎١.5‏ ملليلتر من خلايا ‎CEM‏ مختلطة جيدا (في طور النمو) في الأنبوب ‎.١‏ ‏يوضع ‎or‏ ميكرولتر ‎PBS‏ £15 ميكرولتر أزرق تريبان ‎trypan‏ في الأنبوب ؟. ‎ve‏ تمزج الخلايا في الأنبوب ‎١‏ ثم يزال ‎٠‏ ميكرولتر من الخلايا وتوضع في الأنبوب ؟. يتم المزج جيدا في الأنبوب ‎oY‏ يزال ‎٠‏ ميكرولتر من الخلايا المصبوغة وتوضع على ‎Ole‏ إحصاء خلايا الدم . يعد عدد الخلايا في المربع المركزي لجهاز إحصاء خلايا الدم مع ضبط المجهر عند ‎10X‏ ‏يكون تركيز مخزون 0151/49 بخلية/ ‎sila‏ كما يلي: ‎vo‏ الخلايا المعدودة ‎Vu 7 ١ X‏ < تركيز ‎CEM's‏ [خلية/ ملليلتر]. (ج) يضاف ‎٠٠00‏ ميكرولتر من الأوساط ‎A‏ إلى: اه في الأطباق ‎.-١‏ ‏هذه هي عيون خالية. ‎١‏ ‏4-4 في ‎.١ Gall‏ ص هذه عيون خالية. د يضاف © ميكرولتر من أوساط م إلى كل عيون الصفوف ‎AD‏ في الأطباق 1-7 ما عدا ‎Al‏ (النصف العلوي لكل طبق). مكلا tt ‏(النصف العلوي‎ ١ ‏في الطبق‎ AL-D3 ‏ميكرولتر من الأوساط لم إلى العيون‎ ٠٠ ‏(ه) يضاف‎ ‏للطبق).‎ ‏من الطبق‎ 3-١ ‏لكل عيون الأعمدة‎ ]7١ DMSO] A ‏ميكرولتر من الأوساط‎ ٠٠ ‏(و) يضاف‎

A

١ ‏ميكرولتر من ))0 0( خلية/ ملليلتر لكل عيون الأعمدة ١-؟ في الطبق‎ ٠٠١ ‏(ز) يضاف‎ - ‏خلية/ عين.‎ ٠٠٠١ ‏وهي الخالية) الأطباق الأخرى. إن هذا يضع‎ Al ‏ولكل عيون (ماعدا‎ ‏(ح) توضع الأطباق في حضانة أثناء إجراء تخفيفات عقار.‎ ‏تحضير عقاقير مقارنة وإختبار‎ (1)

J++ DMSO ‏في طبق مع‎ 3:١ ‏بتخفيفات متسلسلة‎ (A-D ‏(أ) تحضير (358؛‎

AE ‏الصفوف‎ YY ‏ميكرولتر من 101450 في كل عيون الأعمدة‎ ٠ ‏يوضع‎ )١( y.

Al ‏في العين‎ 7٠٠١ DMSO ‏عند‎ [Use ‏مللي‎ ٠١[ 35B ‏ميكرولتر من‎ Ve ‏يوضع‎ )7(

BI ‏في العين‎ 7٠٠١ DMSO ‏مللي مول] عند‎ ٠١[ ‏ميكرولتر من ل‎ 7٠١ ‏يوضع‎ )7( .01 ‏في العين‎ 7٠٠١ DMSO ‏مللي مول] عند‎ ٠١[ 8 ‏ميكرولتر من‎ Ve ‏(؟) يوضع‎

El ‏في العين‎ ٠ DMSO ‏مللي مول] عند‎ ٠١[ 1 ‏ميكرولتر من‎ Ve ‏يوضع‎ )1( vo ‏بنقل 0© ميكرولتقر من‎ ١١ ‏لأسفل خلال العمود‎ ©:١ (AD 35B) ‏يخفف بالتسلسل‎ (V) ‏تغير‎ AY ‏إلخ؛ لأسفل حتى العمود‎ oF ‏وعندئذ من العمود ؟ إلى العمود‎ oF ‏إلى عمود‎ ١ ‏عمود‎ ‏قبل كل تخفيف.‎ tips ‏السنون‎ ‏م:‎ blag ‏في‎ ٠١:١ ‏تحضير طبق بتخفيف‎ (=) ‏يطابق كل صف‎ ٠٠١:١ ‏في طبق آخر يحضر صف لأول تخفيف‎ ACE ‏في الصفوف‎ )١( Y. ‏لكل مركب.‎ 1٠١ DMSO

Ne) ‏لأول تخفيف‎ A ‏في الصف‎ 8

Aen) ‏ه في الصف 33 لأول تخفيف‎

Aen) ‏لأول تخفيف‎ E ‏الصف‎ AD

YA

= 1 (7) يوضع ‎٠8١‏ ميكرولتر من الأوساط هه في ‎JS‏ عيون الصفوف ‎A-E‏ المقابلة لصفوف ‎.2٠0٠ DMSO‏ هناك حاجة لمقدار ©,؟ ملليلتر لكل صف. (؟) يزال ‎٠١‏ ميكرولتر من كل عيون كل صف من صفوف ‎7٠٠0 DMSO‏ وتنقل إلى الصف ‎٠١:١‏ المقابل. © (ج) تحضير طبق تخفيف ‎٠٠١:١‏ (و احد: مئة) في الأوساط م: ‎)١(‏ يحضر طبق لكل 7 مركبات يراد إختبارها. ‎(Y )‏ يوضع ‎YYeo‏ ميكرولتر من الأوساط ‎A‏ في كل العيون في الصفوف ‎«GE D B (A‏ ‎Hy‏ مع ترك الصفوف © و7 فارغة. يستخدم ‎7١0‏ ملليلتر من الأوساط ‎A‏ لكل طبق. () ينقل ‎Yo‏ ميكرولتر من كل مركب من الصف بتخفيف ‎٠١:١‏ إلى الصفين المقابلين في ‎٠‏ طبق التخفيف ‎٠٠١:١‏ مع تغيير السنون قبل كل إنتقال. تركيز العقار إنانومول] | تركيز العقار [ميكرولتر] ‎ewe | ves Te]‏ ‎wes we pv‏ ‎(V)‏ يضاف 123 ‎SN‏ فيروسي إلى الأطباق. 0 يتفكك من التجمد 123 58 في حمام ماء درجة حرارته ‎AAT‏ لمدة ‎٠١‏ دقائق تقريبا. (ب) يخفف 123 ‎Sn‏ بنسبة ‎١:1‏ بإضافة ‎١‏ ملليلتر من 123 580 إلى ‎vo‏ ملليلتر من أوساط ‎A‏ ‏(ج) يضاف ‎٠٠‏ ميكرولتر من 123 58 ‎[V1]‏ إلى العيون 11-1112 في الأطباق ‎T-Y‏ ‏وإلى العيون 51-113 في الطبق ‎.١‏ ‏(؛) إضافة العقاقير إلى الأطباق خلا

£1 )0( يضاف ‎٠٠‏ ميكرولتر من العقاقير المقارنة وعقاقير الإختبار من الصفوف في أطباق التخفيف ‎٠٠١:١‏ إلى الصفوف الملائمة في الأطباق النهائية (تتغير السنون قبل كل إنتقال). إن الصف في الطبق ‎٠٠١:١‏ يعمل صفوف في الطبق النهائي. تترك ‎AL‏ خالية. (ب) تحضن كل الأطباق لمدة ‎V‏ أيام عند 7١7"مئنوية ‎Jo CO,‏ )=( يجري بروتوكول (طريقة) ‎Xt‏ في اليوم السابع كما يلي: )3( تحضير محلول 8: )£ أطباق = ‎(Alle Ye‏ (6 أطباق = 70 ‎(le‏ ‎)١(‏ طريقة لتحضير ‎PMS‏ ؟ مللي مول: ‎yor‏ مجم ‎١.5 + PMS‏ ملليلتر ‎PMS = PBS‏ عند ‎٠٠١[‏ مللي مول] ‎٠‏ ميكرولتر ‎lle ٠٠١[‏ مول] ‎PMS‏ + 4,£ ملليلتر ‎PMS = PBS‏ عند ‎Y]‏ مللي مول] ‎ve‏ 7( يسخن ‎0٠9‏ ملليلتر ماء في فرن موجة دقيقة 6 لمدة © دقائق عند أعلى درجة حرارة. (7) يوضع ‎٠١‏ أو ‎Yo‏ ملليلتر أحمر فينول ‎RPMI phenol‏ في أنبوبة طرد مركزي سعة 0ه )¢( يوضع ‎RPMI‏ في إناء الماء الساخن. )0( يضاف ‎Tol ٠١‏ مجم من ‎XTT‏ إلى ‎RPMI‏ الدافئ. التركيز النهائي من ‎١[ = XTT‏ مجم/ ‎TALL‏ ‏)1( ننتظر حتى ذوبان ‎XTT‏ وعندئذ يضاف ‎٠٠00‏ ميكرولتر من ‎YIPMS‏ مللي مول] لكل ‎٠‏ ملليلتر من محلول ‎XTT‏ ‏(ه) إضافة ‎PMS/Xtt‏ إلى الطبق: 2 )0( يضاف ‎٠٠‏ ميكرولتر من محلول ‎PMS/XTT‏ لكل العيون في كل الأطباق. (7) تغطى الأطباق وتحضن لمدة ؛ ساعات عند ١#"مئوية‏ وعند ‎CO;‏ 6 (7) تزال الأطباق من الحضانة وتستبدل الأغطية مع أغلفة طبق لدنة مائعة للتسرب. (؛) تخلط محتويات الأطباق. )©( تجرى قراءة للأطباق عند طول موجة إختبار £00 نانومول وطول موجة مقارن 50 ‎Yo‏ نانومول. *- إختبار مثبط بروتياز ‎HIV-1‏ فلورسيني ‎fluorescence‏ لفحص تثبيط بروتاز 7 (النتائج المسجلة في الجدول ‎١‏ يرمز إليها "28008 (نانوجرام/ ملليلتر)") محلا ty ‏حسب الإستخدام هناء؛ فإن الإختصارات محددة كما يلي:‎ bovine serum albumin ‏الومبن مصل بقري‎ — BSA t-butoxycarbonyl - BOC 2-bromobenzyloxycarbonyl - BrZ 2-chlorobenzyloxycarbonyl — 2-CIZ ° dicyclohexylcarbodiimide - DCC diisopropylethylamine - DIEA dithiothreitol - DTT ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA fluorescein isothiocarbamyl - FITC Ye 4-(2-hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid - HEPES 4- morpholineethanesulfonic acid - MES phenylacetimidomethyl - PAM 3-[tris (hydroxymethyl)methyl]amino-1 -sulfonic acid = TAPS tris(hydroxymethyl)aminomethane - TRIS vo p-toluenesulfonyl (tosyl) — TOS

Gag ‏(أ) تحضير بروتياز وأجزاء‎

E. Coli K12 L507/pHP10D ‏مزرعة‎ (V) ‏من‎ E. coli K12 L507/pHP10D ‏نحصل على المواد المجففة بالتبريد من‎ ‏تحت رقم الوصول‎ ithe Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61 604 x. ‏تصفق المواد المجففة بالتبريد في أنابيب‎ (VAY ‏نوفمبر‎ VE ‏(المودع في‎ NRRL 8-0 ‏جرام من مستخلص‎ © Bacto-tryptone ‏جرام‎ ٠ ( LB ‏ملليلتر من وسط‎ ٠١ ‏تحتوي على‎ ‏مائي لكل لتر؛ يضبط الأس‎ sodium chloride ‏جرام‎ ٠١و‎ (Bacto yeast extract ‏خميرة‎ ‏طوال الليل).‎ Ay PTY ‏الهيدروجيني إلى © ويحضن عند‎ ٠٠١ ‏مع‎ LB ‏يوضع قسم صغير من الزرعة المستديمة طوال الليل على أطباق أجار-18 (وسط‎ Yo ‏بطريقة بحيث‎ tetracycline ‏ميكروجرام/ ملليلتر‎ ١7,8 ‏جرام/ لتر أجار-58616) تحتوي على‎ .E. coli K12 L507/pHP10D ‏مسن‎ single colony isolate ‏نحصل على عزلة مستعمرة وحيدة‎ ‏فخلا‎

£A

AL ‏ملليلتر من وسط 113 يحتوي على 11,8 ميكروجرام]‎ ٠١ ‏تلح المستعمرة الوحيدة في‎ ‏ملليلتر من المزرعة المستديمة‎ ٠١ ‏تلقح‎ ٠ ‏وتحضن عند 77"مئوية مع الرج الشديد‎ tetracycline ‏وتحضن‎ tetracycline ‏ميكروجرام/ ملليلتر‎ V0 ‏طوال الليل في وسط 1.3 يحتوي على‎ ‏عند 7؟*مئوية مع الرج الشديد حتى تصل المزرعة إلى طور النمو اللوغاريتمي الوسطي‎ .mid-log phase ©

E. coli K12 L507/pHGAG ‏مزرعة‎ 7 ‏من 1481 تحت‎ E. coli K12 L507/pHGAG ‏يمكن الحصول على بكتريا مجففة بالتبريد‎ ‏تفصل مستعمرة نقية من‎ L(V IAT ‏نوفمبر‎ VE ‏(المودع بتاريخ‎ NRRL B-18561 ‏رقم الوصول‎ ‏.ع وتستخدم كلقاح للمزرعة التي تنمو حتى الطور اللوغاريتمي‎ coli K12 L507/pHGAG ‏من أجل‎ ode ‏الوسسطي بصورة مطابقفة جوهريا لتعاليم خطوة (()؛‎ ٠ .E. coli K12 L507/pHP10D

Protease ‏()ت تحضير _جزء بروتياز‎ ‏إلى طور النمو اللوغاريتمي الوسطي عند‎ 58. coli 2 L507/pHP10D ‏تنمى مزرعة‎ ‏ترتفع بسرعة‎ tetracycline ‏ميكروجرام/ ملليلتر‎ VY,0 ‏تحتوي على‎ LB ‏77"مئوية في أوساط‎ ‏وتنمو الخلايا لمدة‎ cgene expression ‏درجة حرارة المزرعة إلى ٠؛“مئوية لحث التعبير الجيني‎ Ne ‏ساعتين ونصف عند درجة الحرارة هذه قبل تبريد المزرعة بسرعة على ثلج. تعالج الخلايا بالطرد‎

MES ‏ملليلتر من مثبت أس هيدروجيني‎ Yo cell pellet ‏المركزي ويعاد تعليق حبيبة الخلية‎ ¢ ‏مول‎ olla ١ DTT ¢ ‏مللي مول‎ ١ EDTA ‏مللي مول (أس هيدروجيني 6) يحتوي على‎ ٠ ‏تحلل الخلايا بالمعالجة‎ ("A" buffer ‏(محلول منظم‎ 1٠١ glycerol s ‏مللي مول‎ ١ PMSF sll ‏ومجس دفيق‎ Fischer Model 300 Dismembrator lai wb sonication ‏الصوتية‎ | ٠ ‏تخفف المادة الطافية إلى حجم‎ ogo gi ‏بعد الطرد المركزي عند 7970060 ” ثقل‎ .microtip probe ١( ‏سم‎ V4 x ١ QAE-Sepharose ‏وتحمل فوق عمود‎ A ‏ملليلتر مع محلول منظم‎ ٠ ‏كلي‎ ‏ملليلتر/ دقيقة؛ ؛"متوية)؛ متزن في محلول منظم م. يغسل العمود بدرجة متمائلة‎ ‏مع فصل متدرج من صفر-١ مولار من‎ ANE ‏دقيقة وينتفصسل‎ ١8١8 ‏التدرج لمدة‎ ‏دقيقة. يقاس النشاط الإنزيمي بواسطة‎ ٠ ‏لمدة‎ A ‏مائي في محلول منظم‎ 0 chloride Ye ‏حسب الوصف في‎ Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-lle-Val ‏بإستخدام الببتيد التخليقي‎ HPLC ‏محلا‎

£4 ‎¢Margolin et al, Biochem.

Biophys.

Res.

Commun., 167, 554-560 (1990)‏ يقاس إنتاج الببتيد ‎.(Ser-Gln-Asn-Tyr) pl‏ تتحد الأجزاء النشطة؛ تضبط إلى أس هيدروجيني ‎٠,7‏ في ‎«ammonium sulfate‏ وتوضع على عمود ‎YA XY hexyl agarose‏ سم متزن في محلول منظم ‎A‏ يحتوي على ‎٠ Y ammonium sulfate ©‏ جزيئي جرامي. تحمل العينة عند معدل تدفق ‎١‏ ملليلتر/ الدقيقة عند ‎٠ (eet)‏ تغسل مع محلول منظم الإتزان لمدة 750 دقيقة )1 ملليلتر/ الدقيقة) وعندذ تتفل بتدرج خطي عكسي من ‎ammonium sulfate‏ ؟ ‎iam),‏ مولار في محلول منظم ‎A‏ لمدة ‎١١١‏ ‏دقيقة عند نفس معدل التدفق. يغسل العمود عندئذ بتدرج متمائل في محلول منظم ‎A‏ لمدة ‎٠١١‏ ‏دقيقة. ‎Ve‏ تتحد الأجزاء ‎dali)‏ تركز إلى ‎٠١‏ ملليلتر بإستخدام خلية مقلبة ‎Amicon‏ مع غشاء ‎YM-10‏ ‏وتوضع عندئذ على عمود إستبدال كاتيون ‎٠١ XY) MonoS‏ سم) متزن في محلول منظم ‎A‏ ‏تحمل العينة عند معدل تدفق ‎١‏ ملليلتر/ دقيقة عند © 7*مئوية. بعد الغسيل بتدرج متمائل لمدة ١؟‏ دقيقة؛ ينفصل البروتياز بإستخد ام تدرج خطي من صفر-459,.. مول ‎sodium chloride‏ مائي في محلول منظم م خلال £0 دقيقة. يغسل العمود بتدرج متمائل في محلول منظم ‎A‏ يحتوي على ‎١,49 Se sodium chloride ٠٠‏ مول لمدة ‎Ye‏ دقيقة. تتحد الأجزاء النشطة وتركز إلى ‎Yoo‏ ميكرولتر بإستخدام خلية ‎Amicon Adie‏ وغشاء ‎YM-10‏ وعندئذ يوضع البروتياز على عمود إقصاء ‎Superose‏ مقاس 1 متزن في محلول منظم ‎A‏ يحتوي على ‎sodium chloride‏ مائي )»+ مول ‎٠‏ يغسل العمود بتدرج متماثل في محلول منظم هذا عند معدل تدفق © ملليلتر/ ‎Aida‏ وعقب ذلك ينفصل بروتياز ‎HIV‏ كذروة وحيدة. ‎١‏ يشترى ‎hexyl agarose 5s QAE-Sepharose‏ من شركة ‎.Sigma Chemical‏ يشترى ‎Superose 6‏ و ‎MonoS‏ من ‎.Pharmacia‏ يمكن الحصول على المحاليل المنظمة والعوامل الكاشفة من ‎Sigma‏ ‏بطريقة مماثلة؛ تنمو مزرعة ‎JE.

Coli 2 L507/pHGAG‏ طور النمو اللوغاريتمي ‎Ye‏ الوسطي عند ‎BA ALYY‏ تنقل إلى ‎diate‏ لحوالي ؛ إلى © ساعات. تبرد المزرعة على ثلج وتعالج بالطرد المركزي؛ عندئذ يعاد تعليق حبيبة الخلية في ‎A‏ ملليلتر من محلول منظم التحلل يحتوي على © مجم/ ملليلتر من إنزيم ‎dads lysozyme‏ محلول منظم ‎Tris-HCl Jail‏ 0ه محلا

مللي مول (أس هيدروجيني 7,8)؛ ‎sl © EDTA‏ مولء ‎١ DTT‏ مللي مول ‎٠٠١ NaCl‏ مللي مول؛ ‎١ E64‏ ميكروجرام/ ملليلتر ‎aprotinin g‏ ؟ ميكروجرام] ‎«salle‏ تحضن المزرعة عند ‎pt‏ لحوالي ‎7٠‏ إلى ‎1١‏ دقيقة؛ وتعالج عندذ بالموجات الصوتية في ‎Branson® Cell Disrupter‏ عند طاقة 760 بثلاثة إندفاعات قوية ‎٠١‏ ثانية مع التبريد بين كل ‎oo‏ إندفاع قوي. تعالج المزرعة عندئذ بالطرد المركزي عند 19080868 ‎Jax‏ نوعي. تنقى جزيعيا المادة الطافية؛ التي تحتوي على البروتين ‎gag‏ غير المعالج؛ بواسطة تحليل كروماتوجرافي يستثشى المقاس على عمود 6-50 ‎Sephadex‏ وتخزن عند =« ؟*مئوية في ‎glycerol‏ 1750 ومحلول منظم التحلل. (ب) تحضير مادة خاضعة: ‎N_Biotin-Gly-Ser-Gln-Asn-Tyr -Pro-Ile-Val-Gly-Lys( N°-FITC)-OH ٠١‏ ‎<Apha = a)‏ ع = ‎(Epsilon‏ ‏7 تحضير_الببتيد البيو تنيلي الطر ‎amino-terminal biotinylated) amino-, x‏ ( يخلق الببتيد- راتينج ‎tena)‏ ‎N®Boc-Gly- Ser-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Ile-Val-Gly-Lys(2-C1Z)-OCH,-PAM-‏ ‎eo‏ راتيتج على أداة تخليق ببتيد ‎Advanced Chemtech‏ طر از ‎٠٠١‏ عند درجة 1,0 مالي مول بإستخدام بروتوكول الإقتران المزدوج القياسي ‎standard double-couple protocol‏ تزال مجموعة ‎t-Boc‏ في الطرف الأميني مع ‎trifluoroacetic acid‏ 780 في ‎methylene chloride‏ ويتعادل الراتينج الناتج مع ‎(DIEA) diisopropylethylamine‏ 756 في ‎methylene chloride‏ عندئذ ؛» يضاف ‎١,١‏ جرام )0,£ ‎le‏ مول) ‎biotin‏ في ‎٠‏ ملليلتر ‎dimethylsulfoxide‏ إلى ‎Ye‏ الببتيد راتينج؛ يليه ‎(DCC) dicyclohexylcarbodiimide‏ 0,£ مللي مول في 4 ‎alle‏ ‎.methylene chloride‏ يخفف مزيج التفاعل الناتج إلى حجم ‎4٠0 JS‏ ملليلتر بإستخدام ‎١١‏ ملليلتر من ‎«methylene chloride‏ وعندئذ يترك ليتفاعل ‎sad‏ © ساعات تقريبا. يركز محلول التفاعلء ويغسل الراتينج عندئذ على ‎J sil‏ مع ‎dimethylformamide »)02150( dimethylsulfoxide‏ ‎(MC) methylene chloride s (DMF)‏ وبتعادل ‎ic‏ مع ‎DIEA‏ ه17 في ‎.methylene chloride Yo‏ يكرر هذا ‎Jeli‏ مرتين؛ مع إمتداد زمن التفاعل إلى ‎VY‏ ساعة لكل تفاعل. يشير تحليل ‎Ninhydrin‏ للراتينج إلى إكتمال تفاعل 0 مع مجموعة ‎glycine amine‏ محلا

١ت‏ يغسل الببتيد راتينج النهائي بشدة مع ‎methylene chloride dimethylformamide‏ ويجفف لتوفير ‎cal a EF‏ إنتاجية ‎(AA)‏ ‎(Y)‏ إزالة الحماية تزال حماية الببتيد وينفصل من الراتينج بإستخدام © ملليلتر من محلول ‎[hydrofluoric acid‏ ‎«m-cresol ٠‏ صفر”مثوية؛ ساعة واحدة. بعد إزالة ‎hydrofluoric acid‏ بالتقطير بواسطة ‎Jai al‏ يستخلص ‎m-cresol‏ من مزيج التفاعل بإستخدام ‎٠٠١‏ ملليلتر ‎(diethylether‏ يذاب ‎Avie anal‏ 3 في ‎acetic acid‏ مائي 750 ¢ يجمد ويجفف بالتبريد لتوفير ‎7,٠6‏ جرام. (©) التنقية يذاب الببتيد الخام؛ البيوتنيلي عند الطرف ‎camino‏ يذاب في ‎il ٠٠٠١‏ من مطلول ‎Jo acetonitrile ٠‏ في ماء يحتوي على ‎trifluoroacetic acid‏ 7.71 ويرشح عندئذ خلال مرشح "7 ميكرون. يوضع المحلول الناتج على عمود معكوس الحالة ‎YO X,Y‏ سممن ‎(Vydac C-18) octadecyl-silica‏ متزن مع نفس المحلول المنظم. ينفصل الببتيد بإستخدام تدرج خطي مدته 855 دقيقة من 7,6 7 ‎cacetonitrile‏ عند * ملليلتر/ الدقيقة؛ مع جمع الأجزاء. تحلل هذه الأجزاء بإستخدام ‎HPLC‏ تحليبللي يجري على ‎Vydac C-18 25sec‏ ‎YO X 410 ve‏ سم بإستخدام شروط محلول منظم مشابهة. تتحد الأجزاء المحتوية على المادة المطلوبة؛ تجمد وتجفف بالتبريد لتوفير ‎٠,705‏ جرام (إنتاجية 0( يعطي تحليل ‎amino acid‏ للببتيد البيوتنيلي المنفصل النسب التالية المتطابقة مع القيم النظرية: ‎«Val 0.80 ¢Gly 2.1 ‘Pro 1.1 ¢Gln 1.1 ¢Ser 0.96 ¢tAsn 1.1‏ 0.78 علا؛ 1.1 ‎Lys 1.1 «Tyr‏ يعطي قياس طيف ‎ALS‏ تصادم ذرة سريعة ‎fast atom bombardment mass spectrometry‏ ‎٠‏ ذروة كتلة أيون جزيئي ‎YAMA‏ متطابقة مع القيمة النظرية. )2( عملية الوم يوسم عندئذ الببتيد البيوتنيلي النقي مع علامة فلورسينية عند نهاية ‎Cabal‏ للإستخدام في إختبار ‎.Pandex‏ أولاء يذاب الببتيد البيوتنيلي )1 ‎٠‏ جمء ‎le ATT‏ مول) في ‎Salle ٠٠١‏ ‎«Jse ١١ sodium borate‏ أس هيدروجيني 5,9. ‎(aie‏ يضاف محلول من ¥ جرام ‎VV)‏ مللي ‎Yo‏ مول) من ‎fluorescein isothiocyanate‏ في ‎Yo‏ ملليلتر من ‎dimethylsulfoxide‏ إلى مزيج التفاعل في ‎٠١‏ أقسام متساوية خلال ساعتين. يترك المزيج الناتج ليتفاعل لمدة ساعة واحدة بعد ‎VIA‏ oy © hydrochloric acid ‏الإضافة الأخيرة. يضبط المحلول عند أس هيدروجيني ؟ بإستخدام‎ ‏عياري؛ ويؤدي ذلك إلى تكوين راسب يزال بالطرد المركزي.‎ ‏عياري‎ © sodium hydroxide ‏بإستخدام‎ V/A (diag pa ‏يضبط عندئذ محلول الببتيد إلى أس‎

No ‏أس هيدروجيني‎ «Je ١١ ammonium acetate ‏ملليلتر بإضافة‎ Yoo ‏إلى‎ Nae ‏ويخفف‎ ‎x 7,١ Vydac C-18 ‏ميكرون ويحمل فوق عمود‎ ١77 ‏يرشح المحلول الناتج عندئذ خلال مرشح‎ ١ .)7,5 ‏مول (أس هيدروجيني‎ ١ ammonium acetate ‏في‎ 76 acetonitrile ‏سم متزن مع‎ 8 ‏عند‎ «acetonitrile £Y0—0 ‏مدته 855 دقيقة من‎ ad ‏ينفصل الببتيد من العمود بإستخدام تدرج‎ ‏تحليلي لتحليل الأجزاء. تتحد عندئذ الأجزاء‎ HPLC ‏ملليلتر/ الدقيقة مع جمع الأجزاء. يستخدم‎ .)797( ‏مجم‎ ٠" ‏المحتوية على المنتج المطلوب؛ تجمد وتجفف بالتبريد لتوفير‎ «Ser 1.0 Asn 1.1 ‏للببتيد النقي القيم التالية المتطابقة مع النظرية:‎ amino acid ‏يعطي تحليل‎ Ve ‏يعطي قياس طيف كتلة‎ (Lys 1.0 ¢Tyr 1.1 dle 0.8 ¢Val 0.8 ‏نياه؛‎ 2.1 «Pro 1.1 «Gln 1.1 . ‏أيون جزيثي غملاتلت متطابقة مع التظرية‎ as ‏سريعة ذروة‎ Bd ‏تصادم‎ ‏إستشعاعى‎ HIV-1 ‏إختبار مثبط بروتياز‎ (9) (Fluorescence HIV-1 Protease Inhibitor Assay) ‏الإستشعاعي:‎ HIV-1 ‏تستخدم المحاليل المنظمة والمحاليل التالية في إختبار مثبط بروتياز‎ vo ‏مول‎ *,+ © 4-morpholine ethane sulfonic acid MES-ALB ‏محلول منظم‎ 0,0 ‏أس هيدر وجيني‎ ‏مو لار‎ (١ ١ NaCl ‏مولار‎ 7 EDTA ‏مولار‎ 6١١ DIT alle 5 ‏مجم/‎ ١ BSA ‏مولار‎ ١7 TRIS TBSA ‏محلول منظم‎ ‏؛ مولار‎ ,6 NaCl ‏ملليلتر‎ [ane ١ BSA

Fluoricon Avidin ‏من جسيمات إختبار‎ Le) ‏محلول‎ | Avidin ‏محلول كريات مغطاة بواسطة‎ ‏صلبة؛ قطرها‎ polystyrene ‏متحد مع كريات‎ Avidin) (TBSA ‏ميكرون في محلول منظم‎ A 2, ‏محلول إنزيم:‎ ‏نقي في‎ HIV-1 ‏وحدة عالمية/ ملليلتر من بروتياز‎ YY ‏وحدة عالمية = كمية‎ ١( MES-ALB ‏محلول منظم‎ ‏الإنزيم المطلوبة لإجراء تحلل مائي لواحد ميكرومول من‎ )ةيوئم“١7 ‏الدقيقة عند‎ [substrate ‏المادة المتفاعلة‎ ‏طخل‎ oy ‏ميكرولتر من محلول الإنزيم‎ Yo ‏يضاف إلى كل عين في طبق مستدير القاعدة به 47 عين‎ ‏ينتج‎ IY ‏مائي‎ dimethylsulfoxide ‏ميكرولتر من المركب المراد تقييمه في محلول‎ ٠١ ‏يليه‎ ‏بروتياز 11117-1 نقي حسب الوصف أعلاه. يحضن المحلول الناتج لمدة ساعة واحدة عند درجة‎ ‏ميكرولتر من محلول يحتوي على المادة المتفاعلة؛ محضر‎ ٠١ ‏حرارة الغرفة وعندئذ يضاف‎ 3 vie ‏ميكرولتر/ ملليلتر) لكل عين. تحضن المحاليل‎ ١ ,°) MES-ALB ‏في محلول منظم‎ lef 0 ‏ميكرولتر من محلول‎ ١560 ‏ساعة عند درجة حرارة الغرفة ثم تخفف كل عين عندئذ مع‎ ١١ ‏لمدة‎ ‎MES-ALB ahi ‏ميكروالقر من‎ YO ‏به 57 عين مستدير القاعدة يضاف‎ HU Pandex ‏إلى كل عين من طبق‎ ‏ميكرولتر من محاليل‎ YO (pe ‏يضاف إلى كل‎ ٠» ‏محلول الكريات المغطاة بواسطة صتلوزجم. عندكذ‎

Pandex® ‏الحضانة المخففة؛ المحضرة أعلاه. تخلط المحاليل بعناية وتحمل الأطباق في ماكينة‎ ٠ ‏تغسل؛ تفرغ وتتم القراءة. يجري تحديد العينة بالإثارة عند 186 نانومتر؛ وتتم قراءة الإستشعاع‎ ‏نانومتر.‎ OVO ‏الفائق الناتج عند‎ ‏إن نتائج و10 الناتجة في إختبار الإستشعاع لمركبات الإختراع الحالي مذكورة أدناه في‎ ‏و؟. إن كل القيم تمت معادلتها مع مثال مقارن موجب وهو:‎ Y ١ ‏الجداول‎ ‎1S-(1R* 4R*,58%)]-N-(1 -(2-amino-2-oxoethyl)-2-0x0-3 -aza-4-phenylmethyl-5- Vo hydroxy-6-(2-(1 -t-butylamino-1 -oxomethyl)phenyl)hexyl)-2-quinolinyl carboxamide. ‏؟‎ ١ ‏إن بيانات النشاط للمركبات التمثيلية المتداخلة في الإختراع الحالي متوافرة في الجداول‎ ‏لطلب براءة الإختراع الأوروبية‎ ١ ‏و؟ أدناه وفي الأمثلة السابقة. إن النتائج في الأقواس هي للمثال‎ ‏في نفس الإختبار.‎ 358 = 0526 009 Al ‏المنشورة‎ - ٠ ١ ‏جدول‎ ‏من طلب براءة الإختراع الأوروبية المنشورة‎ ١ ‏إن النتائج في الأقواس هي للمثال‎ ‏في نفس الإختبا‎ 35B = 9 Al

Pandex SRIMT2 | SRICEM ‏نانومولار‎ IC ‏نانومولار‎ ICs | لاثملا‎

TE eT

NY 1,vyY AY 14 Y, v4 \ ‏ا ااام‎ es ‏سم ال‎ ‏نانوجرام/ ملليلتر.‎ 0,17 8 ( ¢ All [ya si 4,7 35B

Yo

FL ‏إختبار فلورسيني 8و6 في ميكروجرم]‎ | EAS . \ ‏مقارن‎ ‎Yo ١

AY ‏مرح‎ ‏فخلا‎

Claims

o0 ‏عناصر_الحماية‎ ‏من الصيغة:‎ compound بكرم-١‎ ١ OH H CH H re Pe © seh oN H Y ‏مقبول دوائيا منه.‎ salt ‏أ أو ملح‎ ‏من المركب طبقا لعنصر الحماية ١ء له الصيغة:‎ 1 fama ‏زمير‎ -7 0١ OH

H., H OH “H N ~~ © sph © A< H Y ‏أو ملح 1 مقبول دوائيا منه.‎ 7 ‏لعنصر الحماية ؟.‎ Wh essentially pure salt ‏؟- ملح نقي بصورة أساسية‎ ١ ‏طبقا لعنصر الحماية ؟.‎ essentially pure stereoisomer ‏زمير مجمتم نقي بصورة أساسية‎ -©0 ١ ‏من الصيغة:‎ compound ‏مركب‎ -© ١ OH H OH IH CH3SO4H 0 sph © A H Y ‏من المركب طبقا لعنصر الحماية 0( له الصيغة:‎ 51660180106: gua ريمز-١“‎ ١ OH

H.. Hoo CH3SO3H N ‏مص‎ ‎a i ‏حل‎ ‎sph oF ON H Y .١ ‏طبقا لعنصر الحماية‎ essentially pure stereoisomer ‏نقي بصورة أساسية‎ guna ريمز-١7‎ ١ ‏طخلا‎ on ‏تحتوي على المركب طبقا لواحد أو أكثر من‎ pharmaceutical composition ‏+-تركيبة دوائية‎ 0٠١ ‏مقبولة دوائيا.‎ carrier ‏ومادة حاملة‎ ١ ‏إلى‎ ١ ‏عناصر الحماية‎ Y medicament ‏لتحضير دواء‎ V ‏إلى‎ ١ ‏إستخدام المركب من واحد أو أكثر من عناصر الحماية‎ -4 ١ .HIV-protease HIV- ‏لتتبيط 00 بروتياز‎ Y VIA