RU97115935A - Обнаружение биомолекул - Google Patents

Claims (1)

1. Способ обнаружения присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в среде, включающий стадии: (а) обеспечение каталитической системы, содержащей (аа) рибозимы, которые a priori являются каталитически неактивными или пространственно ограничены таким образом, что они не могут проявлять их каталитическую активность в отношении их мишени; причем мишенью этих рибозимов являются другие рибозимы каталитической системы и их каталитическая активность в отношении этих других рибозимов вызывает (i) активацию неактивных рибозимов, (ii) высвобождение пространственно ограниченных рибозимов, позволяющее им достигать их мишеней, причем по меньшей мере некоторые из рибозимов каталитической системы являются мишенью каталитической активности инициирующего рибозима и каталитическая активность инициирующего рибозима в отношении этих некоторых рибозимов является такой, какая описана в (i) или (ii) выше, и (аb) детектируемую метку, имеющую детектируемые свойства, так что каталитическая активность рибозимов вызывает изменение в этих детектируемых свойствах; (b) контактирование среды с каталитической системой; (с) обеспечение условий, позволяющих каталитически активному инициирующему рибозиму и каталитически активным рибозимам каталитической системы проявлять их каталитическую активность, в результате чего присутствие каталитически активного инициирующего рибозима приводит к каскаду реакций, в которых рибозимы каталитической системы активируются или высвобождаются в среду, и (d) детектирование детектируемых свойств, причем изменение в этих свойствах является указанием на присутствие активного инициирующего рибозима в среде.

2. Способ по п. 1, включающий стадии: (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей первый и второй рибозимы, каждый из которых является априорно каталитически неактивным, причем первый рибозим становится каталитически активным под действием на него каталитической активности второго рибозима и второй рибозим становится каталитически активным под действием на него каталитической активности первого рибозима; по меньшей мере один из этих рибозимов (первый или второй) становится каталитически активным под действием каталитической активности инициирующего рибозима; по меньшей мере один из этих рибозимов (первый или второй) несет метку, так что при действии на него каталитической активности другого рибозима происходит изменение в детектируемых свойствах этой метки; (b) обеспечение условий, в которых инициирующий рибозим и первый и второй рибозимы могут проявлять их каталитическую активность; и (с) детектирование детектируемых свойств, причем изменение в этих свойствах является указанием на присутствие активного инициирующего рибозима в данной среде.

3. Способ по п. 1, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей первую композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый рибозим типа, способного отщеплять первую отщепляемую последовательность нуклеиновой кислоты, соединенный со второй отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, причем отщепление второй последовательности высвобождает первый рибозим из первой композиционной молекулы; вторую композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую второй рибозим типа, способного отщеплять вторую отщепляемую последовательность нуклеиновой кислоты, соединенный с первой отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, причем отщепление первой последовательности высвобождает второй рибозим из второй композиционной молекулы; причем по меньшей мере одна из отщепляемых последовательностей (первая или вторая) отщепляется также инициирующим рибозимом; первая и вторая композиционные молекулы нуклеиновых кислот отделены друг от друга во избежание контакта между композиционными молекулами; по меньшей мере одна из композиционных молекул (первая или вторая) несет детектируемую метку, высвобождаемую в реакционную среду после отщепления рибозимом, содержащимся в другой композиционной молекуле; (b) обеспечение условий, позволяющих отщепление рибозимов и миграцию отщепленных рибозимов между первой и второй композиционными молекулами нуклеиновых кислот, и (с) детектирование присутствия высвобожденных меток, причем присутствие метки в среде указывает на присутствие каталитически активного рибозима в данной среде.

4. Способ по п. 1, включающий стадии (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей третий рибозим, который априорно является каталитически неактивным, причем каждая молекула этого априорно каталитически неактивного третьего рибозима становится активной под действием каталитической активности других молекул каталитически активных третьих рибозимов; априорно каталитически неактивный третий рибозим становится активным также под действием каталитической активности инициирующего рибозима; третий рибозим несет метку, так что под действием каталитической активности другой молекулы третьего рибозима на него происходит изменение в детектируемых свойствах этой метки; (b) обеспечение условий, пригодных для проявления третьим рибозимом и инициирующим рибозимом их каталитической активности; и (с) детектирование детектируемых свойств, причем изменение в указанных свойствах является указанием на присутствие активного инициирующего рибозима в среде.

5. Способ по п. 1, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую меченый рибозим, соединенный с отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты в ориентации или в положении, которые препятствуют отщеплению этой последовательности нуклеиновой киcлоты рибозимом при его присутствии в композиционной молекуле, причем эта последовательность нуклеиновой кислоты может отщепляться рибозимом при его присутствии в свободной форме с высвобождением меченого рибозима из композиционной молекулы; отщепляемая последовательность нуклеиновой кислоты может отщепляться также инициирующим рибозимом; причем композиционные молекулы отделены друг от друга во избежание контакта между ними; (b) обеспечение условий, которые позволяют отщепление рибозима и миграцию отщепленных рибозимов между отделенными композиционными молекулами; и (с) детектирование присутствия высвобожденных меток, причем присутствие высвобожденной метки в среде указывает на присутствие каталитически активного рибозима в среде.

6. Способ по п. 4 для обнаружения присутствия в среде каталитически активного рибозима, имеющего каталитическую активность расщепления, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую рибозим, который имеет отщепляемую последовательность нуклеиновой кислоты, причем эта композиционная молекула находится в форме замкнутого кольца и отщепляемая последовательность нуклеиновой кислоты может отщепляться композиционной молекулой в раскрытой форме; отщепляемая последовательность нуклеиновой кислоты может отщепляться также инициирующим рибозимом; композиционная молекула несет детектируемую метку, которая изменяет ее детектируемые свойства при раскрывании замкнутой композиционной молекулы; (b) обеспечение условий, позволяющих отщепление и миграцию рибозима, и (с) детектирование детектируемых свойств, причем изменение в этих свойствах является указанием на присутствие каталитически активного рибозима в среде.

7. Способ по п. 4 для обнаружения присутствия в среде каталитически активного инициирующего рибозима, имеющего каталитическую активность сплайсинга, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей шестой рибозим, имеющий в районе, существенном для его каталитической активности, дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, делающую рибозим неактивным; сплайсинг дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты делает шестой рибозим активным; дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты способна удаляться сплайсингом из композиционной молекулы под действием шестого каталитически активного рибозима; дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты может также удаляться сплайсингом посредством каталитически активной детектируемой метки, причем шестой рибозим несет детектируемую метку, изменяющую ее детектируемые свойства при сплайсинге дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты; (b) обеспечение условий, делающих возможным сплайсинг рибозимом, и (с) детектирование детектируемых свойств, причем изменение в этих свойствах является указанием на присутствие каталитически активного рибозима в среде.

8. Способ по п. 3, в котором первая и вторая композиционные молекулы нуклеиновых кислот размещены на противоположных сторонах пористой мембраны, блокирующей их прохождение через нее, но позволяющей прохождение первого и второго рибозимов.

9. Способ по п. 3, в котором первая и вторая композиционные молекулы нуклеиновых кислот иммобилизованы на субстрате.

10. Способ по п. 5, в котором каждая композиционная молекула иммобилизована на субстрате.

11. Способ по п. 9, в котором субстрат является гранулой.

12. Способ по п. 3, в котором первая и вторая композиционные молекулы нуклеиновых кислот соединены с молекулярными частицами, имеющими одинаковые электрические заряды,
13. Способ по п. 5, в котором каждая композиционная молекула соединена с заряженной молекулярной частицей, причем все молекулярные частицы в реакционной смеси имеют одинаковый заряд.

14. Способ обнаружения присутствия анализируемых биомолекул в тест-пробе, включающий стадии: (а) контактирование пробы с системой детектирования при условиях, которые делают возможным образование каталитически активного инициирующего рибозима по существу только в присутствии анализируемых биомолекул в этой пробе, и (b) детектирование присутствия каталитически активного рибозима по способу п. 1, причем присутствие его указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в этой пробе.

15. Способ по п. 14, включающий (а) обеспечение первой комплексной молекулы, содержащей: инициирующий рибозим, при условиях, в которых рибозим каталитически неактивен, и биомолекулу узнавания, способную специфически узнавать анализируемую биомолекулу и связываться с ней; (b) контактирование первой комплексной молекулы с тест-пробой при условиях, позволяющих связывание между биомолекулой узнавания и анализируемой биомолекулой, с поддержанием условий, которые делают рибозим каталитически неактивным; (с) удаление несвязанных первых комплексных молекул; (b) обеспечение отличающихся условий, в которых инициирующий рибозим становится активным; (е) обнаружение присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

16. Способ по п. 15, включающий (а) обеспечение первой комплексной молекулы, содержащей: инициирующий рибозим, при условиях, в которых рибозим каталитически неактивен, и биомолекулу узнавания, способную специфически узнавать анализируемую биомолекулу и связываться с ней, причем рибозим соединен с отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, способной отщепляться каталитически активированным инициирующим рибозимом, причем отщепление отщепляемой последовательности высвобождает каталитически активный инициирующий рибозим в окружающую среду; (b) контактирование первой комплексной молекулы с тест-пробой при условиях, которые делают возможным связывание между биомолекулой узнавания и анализируемой биомолекулой, с поддержанием условий, которые делают рибозим каталитически неактивным; (с) удаление несвязанных первых комплексных молекул; (d) обеспечение отличающихся условий, в которых инициирующий рибозим становится каталитически активным, для отщепления отщепляемой последовательности и тем самым высвобождения инициирующего рибозима в окружающую среду, и (е) обнаружение присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

17. Способ по п. 15, включающий (а) обеспечение гибридной молекулы, содержащей: инициирующий рибозим, соединенный с отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая способна, когда она одноцепочечная, отщепляться инициирующим рибозимом, причем отщепление этой отщепляемой последовательности высвобождает каталитически активный инициирующий рибозим в окружающую среду, и содержащей, кроме того, биомолекулу узнавания, способную специфически узнавать анализируемую биомолекулу и связываться с ней, причем отщепляемая последовательность и часть биомолекулы узнавания являются априорно двухцепочечными; (b) контактирование гибридной молекулы с тест-пробой в условиях, допускающих вытеснение одной цепи двухцепочечной части биомолекулы узнавания и отщепляемой последовательности нуклеиновой кислоты по существу точно совместимой анализируемой биомолекулой; (с) обеспечение условий, допускающих расщепление каталитически активными рибозимами, для отщепления одноцепочечной отщепляемой последовательности и тем самым высвобождения каталитически активного инициирующего рибозима в окружающую среду, и (d) детектирование присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

18. Способ поп. 15, включающий (а) обеспечение второй комплексной молекулы, содержащей инициирующий рибозим и биомолекулу узнавания, способную специфически узнавать анализируемые биомолекулы и связываться с ними, причем рибозим соединен с отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, способной отщепляться каталитически активным инициирующим рибозимом, причем отщепление этой отщепляемой последовательности высвобождает каталитически активный инициирующий рибозим в окружающую среду, и содержащей также ингибиторную часть молекулы, способную ингибировать каталитическую активность инициирующего рибозима; (b) контактирование второй комплексной молекулы с тест-пробой при условиях, допускающих связывание между молекулой узнавания и анализируемой биомолекулой, с сохранением ингибиторной части молекулы в ее ингибирующей форме; (с) удаление несвязанных вторых комплексных молекул; (d) модификация ингибиторной части молекулы в связанных вторых комплексных молекулах таким образом, чтобы устранить ее ингибирующее действие, и тем самым отщепление отщепляемой последовательности и высвобождение инициирующего рибозима в окружающую среду; и (е) детектирование присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

19. Способ по п. 15, где условия в (а) характеризуются по существу отсутствием ионов магния и стадия (d) включает добавление к реакционной среде ионов магния в концентрации, достаточной для превращения инициирующего рибозима в каталитически активный рибозим.

20. Способ по п. 14, в котором анализируемой биомолекулой является последовательность нуклеиновой кислоты и способ включает стадии: (а) контактирование пробы с системой детектирования, содержащей первую олигонуклеотидную молекулу, имеющую двухцепочечный промотор, одноцепочечную олигонуклеотидную последовательность, являющуюся в основном ДНК, которая по существу идентична последовательности инициирующего рибозима; одноцепочечную последовательность, являющуюся в основном ДНК, которая по существу идентична отщепляемой последовательности, способной отщепляться каталитически активным инициирующим рибозимом, и одноцепочечную последовательность, комплементарную 5'-части анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты; вторую олигонуклеотидную молекулу, имеющую одноцепочечную последовательность, комплементарную 3'-части анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты, и далее содержащую одноцепочечную триггерную олигонуклеотидную матрицу, которая может транскрибироваться с образованием триггерной олигонуклеотидной последовательности, способной, в присутствии обратной промоторной конструкции и ДНК-полимеразы, запускать реакцию в системе транскрипции, в которой транскрибируется последовательность, с которой она соединена; (b) обеспечение условий, допускающих гибридизацию первой и второй олигонуклеотидных молекул с анализируемой последовательностью нуклеиновой кислоты; (с) добавление транскрипционной системы, при условиях, допускающих транскрипцию, в результате чего транскрибируется триггерная олигонуклеотидная последовательность, которая в присутствии обратного промотора, ДНК-полимеразы и системы транскрипции при условиях, допускающих гибридизацию, полимеризацию ДНК и транскрипцию, приводит к транскрипции конечного олигонуклеотидного транскрипта, содержащего инициирующий рибозим, соединенный с отщепляемой последовательностью, способной отщепляться каталитически активным инициирующим рибозимом; (d) обеспечение условий, допускающих отщепление отщепляемой последовательности каталитически активным рибозимом, для отщепления отщепляемой последовательности и тем самым высвобождения его в окружающую среду, и (е) детектирование присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

21. Способ по п. 14, где анализируемой биомолекулой является последовательность нуклеиновой кислоты и способ включает стадии: (а) инкубирование тест-пробы с системой детектирования, содержащей третью композиционную молекулу, содержащую третью одноцепочечную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-части анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты, причем третья олигонуклеотидная последовательность соединена с частью инициирующего рибозима; четвертую композиционную молекулу, содержащую четвертую одноцепочечную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную остальной 3'-части анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты, причем четвертая олигонуклеотидная последовательность соединена с частью инициирующего рибозима, необходимой для дополнения рибозима, соединенного с третьей олигонуклеотидной последовательностью, для образования полного инициирующего рибозима; (b) обеспечение условий, допускающих гибридизацию третьей и четвертой олигонуклеотидных последовательностей с анализируемой последовательностью нуклеиновой кислоты и делающих возможной сборку полного инициирующего рибозима из его частей; и (с) детектирование присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

22. Способ по п. 14, где анализируемой биомолекулой является последовательность нуклеиновой кислоты и способ включает стадии: (а) инкубирование тест-пробы с системой детектирования, содержащей рибозим типа головки молотка, в котором часть двухцепочечного участка стебля-II укорочена и остальной двухцепочечный стебель II присоединен к двум одноцепочечным последовательностям, одна из которых комплементарна 3'-концу анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты, а другая комплементарна 5'-концу этой последовательности нуклеиновой кислоты; причем этот рибозим априорно является неактивным, и гибридизация двух одноцепочечных последовательностей с комплементарными последовательностями делает рибозим каталитически активным; (b) обеспечение условий, допускающих гибридизацию рибозима с анализируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, и (с) детектирование присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в соответствии со способом п. 1, причем его присутствие указывает на присутствие анализируемой биомолекулы в пробе.

23. Способ по п. 1 для обнаружения присутствия в среде каталитически активного инициирующего рибозима, имеющего активность расщепления, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей четвертый рибозим типа, способного лигировать части пятого рибозима, соединенный с последовательностью нуклеиновой кислоты, отщепляемой инициирующим рибозимом, причем отщепление этой последовательности нуклеиновой кислоты высвобождает каталитически активный четвертый рибозим в окружающую среду; две части пятого рибозима, которые могут быть лигированы четвертым рибозимом с образованием каталитически активного пятого рибозима, причем пятый рибозим является рибозимом типа, способного лигировать части четвертого рибозима; две части четвертого рибозима, которые могут быть лигированы пятым рибозимом с образованием каталитически активного четвертого рибозима; причем четвертая молекула является априорно отделенной от двух частей пятого рибозима во избежание контакта между ними; и по меньшей мере один из этих рибозимов (четвертый или пятый) несет метку, которая изменяет ее детектируемые свойства при лигировании; (b) обеспечение условий, допускающих отщепление рибозима и миграцию отщепленной полной четвертой молекулы к двум частям пятого рибозима; (с) обеспечение или поддержание условий, допускающих лигирование рибозимов и (d) обнаружение детектируемых свойств, причем изменение этих свойств является указанием на присутствие инициирующего рибозима в среде.

24. Способ по п. 1 для обнаружения присутствия в среде каталитически активного инициирующего рибозима, имеющего активность лигирования, включающий (а) контактирование среды с каталитической системой, содержащей две части пятого рибозима, которые могут быть лигированы четвертым рибозимом с образованием каталитически активного пятого рибозима, причем пятый рибозим является рибозимом типа, способного лигировать части четвертого рибозима; две части четвертого рибозима, которые могут быть лигированы пятым рибозимом с образованием каталитически активного четвертого рибозима, причем четвертый рибозим является рибозимом типа, способного лигировать части пятого рибозима; причем две части пятого рибозима или две части четвертого рибозима могут быть лигированы каталитически активным инициирующим рибозимом; и по меньшей мере один из этих рибозимов (четвертый или пятый) несет метку, которая изменяет ее детектируемые свойства при лигировании; (b) обеспечение условий, допускающих лигирование рибозимов; (с) обнаружение детектируемых свойств, причем изменение этих свойств является указанием на присутствие инициирующего рибозима в среде.

25. Набор для детектирования присутствия каталитически активного инициирующего рибозима в среде, содержащий каталитическую систему, включающую в себя (а) тест-рибозимы, которые априорно являются каталитически неактивными или пространственно ограниченными таким образом, что они не могут проявлять их каталитическую активность на их мишени; причем мишенью этих рибозимов являются другие рибозимы этой каталитической системы и их каталитическая активность в отношении таких других рибозимов вызывает (i) активацию неактивных тест-рибозимов; (ii) высвобождение пространственно ограниченных тест-рибозимов, позволяющее им достигать их мишеней; причем по меньшей мере часть тест-рибозимов каталитической системы является мишенью каталитической активности инициирующего рибозима, которая вызывает в отношении этих тест-рибозимов (i) или (ii); (b) детектируемую метку, имеющую детектируемые свойства, причем каталитическая активность тест-рибозимов вызывает изменение детектируемых свойств.

26. Набор по п. 25, где каталитическая система содержит первый и второй тест-рибозимы, оба являющиеся априорно каталитически неактивными; причем первый тест-рибозим становится каталитически активным под действием каталитической активности второго тест-рибозима, a второй тест-рибозим становится каталитически активным под действием каталитической активности первого тест-рибозима; по меньшей мере один из тест-рибозимов (первый или второй) становится каталитически активным также под действием каталитической активности инициирующего рибозима; по меньшей мере один из тест-рибозимов (первый или второй) несет метку, так что под действием каталитической активности другого из этих тест-рибозимов происходит изменение детектируемых свойств этой метки.

27. Набор по п. 25, в котором каталитическая система содержит первую композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый тест-рибозим типа, способного отщеплять первую отщепляемую последовательность нуклеиновой кислоты, соединенный со второй отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты, причем отщепление второй последовательности высвобождает первый тест-рибозим из первой композиционной молекулы; вторую композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую второй тест-рибозим типа, способного отщеплять вторую отщепляемую последовательность нуклеиновой кислоты, соединенный с первой последовательностью, причем отщепление первой последовательности высвобождает второй тест-рибозим из второй композиционной молекулы; причем по меньшей мере одна из отщепляемых последовательностей (первая или вторая) может также отщепляться инициирующим рибозимом; первая композиционная и вторая композиционная молекулы нуклеиновых кислот отделены друг от друга во избежание контакта между двумя композиционными молекулами; по меньшей мере одна из композиционных молекул (первая или вторая) несет детектируемую метку, которая высвобождается в реакционную среду после отщепления рибозимом, содержащимся в другой композиционной молекуле.

28. Набор по п. 25, в котором каталитическая система содержит третий тест-рибозим, являющийся априорно каталитически неактивным; причем каждая молекула априорно каталитически неактивного третьего тест-рибозима становится активной под действием каталитической активности других молекул каталитически активных третьих тест-рибозимов; априорно каталитически неактивный третий тест-рибозим становится каталитически активным также под действием каталитической активности инициирующего рибозима; третий тест-рибозим несет метку, так что под действием на нее каталитической активности другой молекулы третьего рибозима происходит изменение детектируемых свойств этой метки.

29. Набор по п. 25, в котором каталитическая система содержит композиционную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую меченый тест-рибозим, соединенный с отщепляемой последовательностью нуклеиновой кислоты в ориентации или в положении, которые препятствуют отщеплению этой последовательности нуклеиновой кислоты тест-рибозимом при его присутствии в композиционной молекуле, причем эта последовательность нуклеиновой кислоты может отщепляться тест-рибозимом, когда он присутствует в свободной форме, и тем самым высвобождать меченый тест-рибозим из композиционной молекулы при этом отщепляемая последовательность нуклеиновой кислоты может также отщепляться инициирующим рибозимом; композиционные молекулы отделены друг от друга во избежание контакта между ними.