CN118166073A - 一种基于dna镊子的高特异性胞外囊泡检测技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于临近杂交触发的DNA镊子的高特异性胞外囊泡(sEVs)检测技术，本发明涉及胞外囊泡检测技术领域，实现对sEVs的高灵敏度荧光检测，捕获探针(C1和C2)分别识别sEVs膜表面的CD63蛋白和脂质双分子层，使在相应部位的膜表面C1和C2探针浓度增加，发生临近杂交。C1和C2探针临近杂交后各自的尾部序列形成一个完整的长序列，长链序列可以通过支点介导的链置换反应打开发夹结构(HP)的茎区，暴露出HP中的DNA尾巴。DNA尾巴可以通过进一步链置换反应，与DNA镊子的连接子序列(“4”序列)形成互补碱基配对，这导致“4”序列的分离和DNA镊子的激活，荧光信号重新出现，荧光信号可以通过HP辅助信号周期增强，达到增强荧光信号和提高灵敏度水平的效果。
Description
技术领域
本发明涉及胞外囊泡检测技术领域，具体为一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术。
背景技术
小细胞外囊泡(sEVs)是纳米级的生物载货颗粒，具有脂质双层结构，含有多种生物分子，如脂质、蛋白质和核酸。sEVs可以被几乎所有类型的细胞分泌到内部液体中，通过向附近和远处的细胞传递信息来促进细胞间的通信，这使得它们在包括癌症和衰老在内的病理生理过程的进展中具有重要意义。例如，先前的一项研究发现，增强sEVs的释放可以通过协调有毒生物分子的清除来减缓多细胞动物的衰老过程。因此，sEVs被视为有希望用于疾病早期诊断和治疗的生物标志物。利用sEVs作为生物标志物的主要挑战是它们在疾病初期的数量有限，以及生理液体中存在显著水平的干扰大分子。因此，为了可靠地识别sEVs，对准确的识别技术和扩增技术提出了很高的要求。
sEVs的精确和特异性鉴定在各种临床和实验室环境中具有重要意义，包括药理研究，医学诊断和治疗，以及了解细胞衰老机制。基于不同的信号换能器，如比色法、电化学、荧光和化学发光技术，已经开发出几种检测sEVs的方法。其中，荧光法以其简单、灵敏、可靠、价格低廉等优点受到广泛关注。
近距离杂交分析依赖于一对探针同时和紧密结合靶分子，从而使互补的尾部序列紧密接触。因此，这些成分在邻近区域的浓度显著增加，以促进其DNA结合的过程，而这一过程本身是无法自然发生的。结合诱导DNA退火技术的灵感来自于有效的近距离杂交过程，已被用于DNA序列的检测、凝血酶和单细胞成像。此外，某些利用酶的方法已被实施，以增强信号和提高灵敏度水平。然而，酶的使用有可能提高实验系统的复杂性和提高检测成本。
发明内容
(一)解决的技术问题
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，DNA纳米机器是一种利用沃森-克里克碱基配对连接的多个DNA序列开发的纳米器件。它能够在微观或纳米尺度内实现纳米机械运动。DNA纳米机器具有结构可预测、结构可控、生物相容性好、定制方便等显著优势。各种类型的DNA纳米机器已经被开发出来，包括DNA镊子、行走器和马达，用于生物传感、逻辑处理和药物输送等目的。DNA镊子具有在开放和关闭状态之间转换的能力，以响应许多外部刺激，包括核酸、蛋白质、酶、金属离子和pH值的变化。
(二)技术方案
基于此，本发明提供如下技术方案：一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，具体检测步骤如下：创建了两个具有不同功能段的探针：C1探针和C2探针，例如“分裂触发器”、“连接器”和“间隔器”部分，所述C1探针的末端标记有胆固醇，它具有附着在脂质双分子层上的能力；所述C2探针的末端用CD63蛋白适配体修饰，C1探针用于在sEVs存在时保护脂质双分子层；所述C2探针用于识别sEVs表面的CD63蛋白。
作为本发明进一步的方案，，所述C1探针和C2探针的接近使得C2探针的“2”部分与C1探针的“6”部分结合，形成一个完整的长序列。
作为本发明进一步的方案，，所述C1探针或C2探针不能单独使用链位移反应启动发夹探针(HP)的打开，延长的序列可以与HP的支点区结合，使发夹探针(HP)的通过链位移反应打开，释放单链部分，HP暴露的部分通过另一次链位移事件与镊子的“11”DNA序列结合。
作为本发明进一步的方案，，所述C1探针和C2探针的末端附着荧光染料FAM和Cy3，C1探针和C2探针分别与sEVs孵育30分钟。
作为本发明进一步的方案，，所述发夹探针(HP)的两端分别标记有FAM和BHQ。
作为本发明进一步的方案，，所述C1探针与C2探针杂交孵育温度为37℃，DNA镊子的浓度为250nM，sEVs的浓度为106个/μL。
作为本发明进一步的方案，，所述长序列为寡核苷酸序列，具体为：序列(5'到3')：
C1：胆固醇-TTT TTT TTT TCC TGAGTC TAC GTA GC；
C2：AGC TCG GTA GAC TCA GGA TTT TTT TTT ATA TAC ACC CCA CCT CGC TCCCGT GAC ACTAAT GCTATT；
HP：CGG TAGCCT GTGCTA CCGAGC T；
8：GTT GGA GCGACA TTAGAGAGC TAC AA-FAM；
9：DABCYL-GTAGCC TCC TGT CCTATC TAT GAT GG；
10：CTAATG TCGCTC CAACAACCATCA TAGATA GGAC；
11：TTG TAG CAC AGG CTA CCG。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，具备以下有益效果：
该一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，实现对sEVs的高灵敏度荧光检测，捕获探针(C1和C2)与CD63蛋白和脂质双分子层部分杂交，形成一个完整的长序列，长链序列可以通过支点介导的链位移反应启动发夹结构(HP)的茎区展开，暴露出HP中的DNA尾巴，随后，DNA尾巴可以通过另一种链位移反应，在脚点机制的促进下，与DNA镊子的连接子序列(“4”序列)形成互补碱基配对，这导致“4”序列的分离和DNA镊子的激活，因此，荧光信号重新出现，荧光信号可以通过HP辅助信号周期增强，达到增强信号和提高灵敏度水平的效果。
附图说明
图1为本发明sEVs检测方法的操作机制图；
图2为本发明可行性分析一示意图；
图3为本发明可行性分析二示意图；
图4为本发明可行性分析三示意图；
图5为本发明条件优化一示意图；
图6为本发明条件优化二示意图；
图7为本发明条件优化三示意图；
图8为本发明条件优化四示意图；
图9为本发明分析性能一示意图；
图10为本发明分析性能二示意图；
图11为本发明分析性能三示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-图11，一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，具体检测步骤如下：
S1：试剂的获取，试剂均为分析试剂级，该研究中使用的所有寡核苷酸序列均购自上海三工生物工程技术服务有限公司。所有试剂均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。从Gibco(Carlsbad,CA)获得DMEM高糖培养基、青霉素、链霉素和胎牛血清(FBS)；
S2：sEVs的分离与表征；
S21：将COV434细胞在37℃、5％CO2的DMEM中培养；
S22：在不含FBS的培养基中再生长48小时后，大约80％的瓶底被COV434细胞覆盖；
S23：通过300g在4℃下离心10分钟，从无FBS培养基中去除较大的微囊泡和细胞碎屑；
S24：将滤液在4℃离心30分钟，离心16500g；
S25：将含sEVs的上清液通过0.22μm孔过滤器过滤，用100KDa超滤管，4℃，5000g离心30分钟后，重新加入新鲜PBS缓冲液离心沉淀滤液，制得sEVs颗粒，需要重复三次上述操作；
S26：最后将sEVs颗粒溶解在无菌PBS中，保存在-80℃。
S3：分析程序；
S31：将不同浓度的sEVs分别在200μL结合缓冲液中，用0.5μM C2探针和1μM C1探针在冰上孵育40分钟；
S32：在含有0.5M NaCl的10mM PBS(pH 7.4)中加入发夹(150nM)和DNA镊子(200nM)。在35℃下孵育3小时后，使用荧光光谱仪分析样品；
步骤S4：序列的设计，序列为：寡核苷酸序列，具体为：
序列(5'到3')：
C1：胆固醇-TTT TTT TTT TCC TGAGTC TAC GTA GC；
C2：AGC TCG GTA GAC TCA GGA TTT TTT TTT ATA TAC ACC CCA CCT CGC TCCCGT GAC ACTAAT GCTATT；
HP：CGG TAGCCT GTGCTA CCGAGC T；
8：GTT GGA GCGACA TTAGAGAGC TAC AA-FAM；
9：DABCYL-GTAGCC TCC TGT CCTATC TAT GAT GG；
10：CTAATG TCGCTC CAACAACCATCA TAGATA GGAC；
11：TTG TAG CAC AGG CTA CCG。
实施例2
通过实施例1中的具体操作，随后进行结果与讨论；
1、临近杂交依赖DNA镊子一步检测sEVs的原理。
所建议的sEVs检测方法的操作机制如图1所示。为了识别sEVs，创建了两个具有不同功能段的探针，例如“分裂触发器”、“连接器”和“间隔器”部分。更准确地说，C1探针的末端标记有胆固醇，它具有附着在脂质双分子层上的能力。此外，C2探针的末端用CD63蛋白适配体修饰。C1探针用于识别脂质双分子层，而C2探针专门识别sEVs表面的CD63蛋白。C1探针和C2探针的接近使得C2探针的“2”部分与C1探针的“6”部分结合，形成一个完整的长序列。捕获探针和靶DNA的熔化温度被有意地设置为高于反应温度。C1探针或C2探针不能单独使用链位移反应启动发夹探针(HP)的打开。然而，延长的序列可以与HP的支点区结合，使HP通过链位移反应打开，释放单链部分。之后，HP暴露的部分可以通过另一次链位移事件与镊子的“11”DNA序列结合，导致镊子打开。同时，C1和C2探针产生的延长序列被释放，随后打开下一个HP，导致荧光信号的放大；
2、可行性分析
为了确认C1和C2探针对sEVs的识别，我们分别在C1和C2探针的末端附着荧光染料FAM和Cy3。C1和C2探针分别与sEVs孵育30分钟，之后任何未与sEVs结合的探针通过离心去除。对沉积物的荧光信号进行检测和比较。图2显示，在sEVs存在的情况下，FAM和Cy3的荧光信号显著增加，表明C1和C2探针与sEVs成功结合；
为了根据C1和C2探针的临近杂交确认HP的解离，FAM和BHQ分别标记在HP的两端。图3表明，由于BHQ对FAM信号的猝灭作用，当线性HP排列成发夹结构时，FAM荧光信号明显减弱。在C1和C2存在的情况下，HP的荧光强度减弱，说明HP在这些条件下没有被激活。只有当sEVs、C1、C2同时存在时，FAM荧光信号才会被放大，说明HP发夹结构打开。当sEVs和C1或sEVs和C2同时存在时，FAM信号保持在低水平，这表明HP的打开需要临近杂交。
在不同的设置下设计了几个样本，以评估邻近杂交依赖的DNA镊子的可行性。图4表明，由于DNA镊子处于“闭合”状态(第1行)，空白样品显示出低荧光强度。样品2缺少C1探针和C2探针，荧光水平较低，这表明在没有探针的情况下没有发生杂交，DNA镊子保持关闭状态。样品3(第4行)也表现出低荧光强度。这是由sEVs的缺失引起的，这导致无法进行临近杂交依赖的DNA镊子反应。当所有必要的成分都存在于传感器系统中时，第四种样品显示出显著增强的荧光信号；
3、条件优化
孵育温度显著影响DNA镊子的热稳定性和C1探针与C2探针杂交的效果。因此，本研究确定了最佳培养温度。细胞外囊泡(FsEVs)的荧光强度与背景荧光(FBlank)的比值最初随着孵育温度的升高而升高。随后，当温度高于37℃时，它显著降低(如图5所示)。这种现象可以解释为DNA镊子在高温下的热稳定性较弱，以及C1和C2探针之间的杂交效率较低。因此，孵育温度选择为37℃；
反应效率主要取决于反应的持续时间。随着反应时间的推移，荧光强度迅速增加，并最终在大约1.5小时时趋于平稳(如图6所示)。数据表明，由于C1探针和C2探针促进了长序列的形成，DNA镊子从封闭状态开始，然后以圆形方式逐渐打开；
DNA镊子的荧光强度主要由DNA镊子的浓度决定。我们提高了DNA镊子的浓度，将其从0nM调整到250nM。荧光强度与DNA镊子浓度成正比地明显增加。当DNA镊子浓度大于200nM时，荧光信号保持不变，表明DNA镊子在该浓度下完全饱和(如图7所示)；
接下来，需要优化DNA镊子与HP的摩尔比。在整个优化过程中，sEVs的浓度保持在固定值1×106particles/μL。荧光强度随着摩尔比的增加而显著增加，并最终趋于平稳。较高的摩尔比可以加速HP的打开，从而产生强大的荧光强度。当摩尔比约为15/5时，信号保持一致，表明在此比例下DNA镊子浓度达到饱和(如图8所示)。因此，实验中DNA镊子与HP的摩尔比为15:5；
4、该方法的分析性能
为了在理想条件下评价该方法的灵敏度和检测范围，在反应体系中加入不同量的COV434细胞sEVs。图9显示了sEVs浓度在0～1×107颗粒/μL范围内的荧光光谱。在没有sEVs的情况下，观察到微弱的荧光信号。当sEVs浓度升高时，FsEVs/FBlank持续升高。图10显示了荧光强度比与对数sEVs浓度的线性关系，其范围为1×102～1×106particles/μL。由数据导出的线性方程为FsEVs/FBlank＝5.061*lgC-7.483，其中FsEVs表示sEVs的荧光强度，FBlank表示空白的荧光强度。与该方程相关系数(R2)为0.994，相关性较强。采用3σ标准测定其检出限为157particles/μL。建议的工作证明了一种检测限，相当于甚至优于先前报道的几种检测方法，同时也提供了一个更实用的平台。实测数据表明，该方法对sEVs的定量分析是可行的；
为了检验所建立的技术的可重复性，总共重复进行了10次试验。与给定数据相对应的计算sEVs浓度如图11所示。相对标准偏差(RSD)分别为3.13％和3.65％，重复性好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：具体检测步骤如下：
创建了两个具有不同功能段的探针：C1探针和C2探针，例如“分裂触发器”、“连接器”和“间隔器”部分，所述C1探针的末端标记有胆固醇，C1探针用于在sEVs存在时保护脂质双分子层；
所述C2探针的末端用CD63蛋白适配体修饰，C2探针用于识别sEVs表面的CD63蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述C1探针和C2探针的接近使得C2探针的“2”部分与C1探针的“6”部分结合，形成一个完整的长序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述C1探针或C2探针不能单独使用链位移反应启动发夹探针(HP)的打开，延长的序列可以与HP的支点区结合，使发夹探针(HP)的通过链位移反应打开，释放单链部分，HP暴露的部分通过另一次链位移事件与镊子的“11”DNA序列结合。
4.根据权利要求1所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述C1探针和C2探针的末端附着荧光染料FAM和Cy3，C1探针和C2探针分别与sEVs孵育30分钟。
5.根据权利要求1所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述发夹探针(HP)的两端分别标记有FAM和BHQ。
6.根据权利要求1所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述C1探针与C2探针杂交孵育温度为37℃，DNA镊子的浓度为250nM，sEVs的浓度为106个/μL。
7.根据权利要求2所述的一种基于DNA镊子的高特异性胞外囊泡检测技术，其特征在于：所述长序列为寡核苷酸序列，具体为：
序列(5'到3')：
C1：Cholesterol-TTT TTT TTT TCC TGA GTC TAC GTA GC；
C2：AGC TCG GTA GAC TCA GGA TTT TTT TTT ATA TAC ACC CCA CCT CGC TCC CGTGAC ACT AAT GCT ATT；
HP：CGG TAG CCT GTG CTA CCGAGC T；
8：GTT GGA GCG ACA TTA GAG AGC TAC AA-FAM；
9：DABCYL-GTA GCC TCC TGT CCT ATC TAT GAT GG；
10：CTA ATG TCG CTC CAA CAA CCA TCA TAG ATA GGA C；
11：TTG TAG CAC AGG CTA CCG。
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|---|---|---|---|
| CN202410450082.3A CN118166073A (zh) | 2024-04-15 | 2024-04-15 | 一种基于dna镊子的高特异性胞外囊泡检测技术 |
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