RU2821027C1 - Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК - Google Patents
Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821027C1 RU2821027C1 RU2023128580A RU2023128580A RU2821027C1 RU 2821027 C1 RU2821027 C1 RU 2821027C1 RU 2023128580 A RU2023128580 A RU 2023128580A RU 2023128580 A RU2023128580 A RU 2023128580A RU 2821027 C1 RU2821027 C1 RU 2821027C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- feline calicivirus
- fcv
- orf1
- infectious activity
- Prior art date
Links
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 title claims abstract description 109
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 72
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 101150068419 ORF 1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 abstract description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 51
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 14
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010014909 Enterovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001144416 Picornavirales Species 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000369696 Vesivirus Species 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 ribonucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007444 viral RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и производству культуральных вакцин. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности калицивируса кошек до 2,5 ч; исключить вероятность контаминации; повысить объективность анализа; увеличить специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных РНК-праймеров и молекулярного зонда-beacon; увеличить чувствительность анализа за счет амплификации только молекул вирусной РНК; удешевить способ анализа за счет отсутствия использования клеточных культур в качестве тест-систем; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра инфекционной активности калицивируса кошек и циклами количественной оценки реакции амплификации РНК. Аналитическая чувствительность разработанного способа составляет 0,2 lg ТЦД50/см3 с достоверностью определения аналита, равной 95,56%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 97,96-99,93%, диагностическая специфичность - 98,26-100,00%, общая точность - 98,72-99,96%. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и производству культуральных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
Калицивирусная инфекция кошек является высококонтагиозным вирусным заболеванием, характеризующимся поражением слизистой оболочки ротовой полости и верхних дыхательных путей [1, 2]. Вирус распространен повсеместно и поражает домашних кошек всех пород и возрастов, а также зоопарковых и диких представителей семейства кошачьих.
Вирионы калицивируса кошек имеют пулевидную форму длиной 100-300 нм, диаметром 45-100 нм. На наружной поверхности вирусной частицы имеются выступы в виде шипов длиной 10-12 нм, которые прикреплены к двуслойной липидной оболочке [1].
Возбудитель заболевания Feline calicivirus (FCV), относится к порядку Picornavirales, семейству Caliciviridae, роду Vesivirus. Нуклеиновая кислота вируса представлена одноцепочечной РНК (+) размером около 7690 н.о. 5’-NTR (не транслируемый регион) соответствует 1…19 н.о., ORF1 (2C, протеаза, РНК-полимераза) - 20…5311 н.о., ORF2 (структурный белок VP1) - 5314…7329 н.о., ORF3 (белок VP2 с неизвестной функцией) - 7617…7643 н.о. [3-5].
В различных источниках описана системная инфекция, вызывающая гибель до 60% заболевших животных [6-8]. Калицивирус характеризуется высокой степенью изменчивости и большим антигенным разнообразием штаммов, что значительно снижает эффективность существующих вакцин.
Система мер для борьбы с калицивирозом кошек и его профилактика предусматривает иммунизацию домашних животных [8]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности калицивируса кошек для оценки его активности в клетках. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК калицивируса кошек в активном состоянии.
Как правило, для определения титра инфекционной активности калицивируса кошек применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошки (CrFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [6]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с поражением клеток вирусом (не менее 72 ч); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.
В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для вакцины.
Существует метод, моделирующий в условиях in vitro репликацию ретровирусов, где в качестве мишени для амплификации служит одноцепочечная молекула РНК. Методика, названная «Self-Sustained Sequence Replication» или 3SR, базируется на конкурентном действии трех ферментов, участвующих в ретровирусной репликации - ревертазы, РНКазы Н и ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Реакция протекает с участием специфичных праймеров при постоянной температуре. В результате реакции амплификации за 60-90 минут образуется до 109-1012 копий РНК [9, 10].
Данный метод является объективным, высокочувствительным и высокоспецифичным, более дешевым по сравнению с прототипом, характеризуется применением стандартизированных компонентов реакции, не создает ситуаций риска контаминации, отличается высокими значениями правильности и позволяет определять титр инфекционной активности, в частности, вирусов ящура и бешенства в течение 2-3 часов. Исходя из этого, целесообразно разработать способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации вирусной РНК.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря разработке способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК. Предложенный способ позволяет: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности калицивируса кошек до 2,5 ч; 2) исключить вероятность контаминации; 3) повысить объективность анализа; 4) увеличить специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных РНК-праймеров и молекулярного зонда, меченого флуорофором FAM (карбоксифлуоресцеином) (максимальная длина волны поглощения - 520 нм) и гасителем свечения RTQ1 (максимальная длина волны поглощения - 520 нм); 5) увеличить чувствительность анализа за счет амплификации только молекул вирусной РНК; 6) удешевить способ анализа за счет отсутствия использования клеточных культур в качестве тест-систем; 7) применение фермента Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы позволяет повторно использовать молекулы комплементарной ДНК (кДНК), что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее, чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; 8) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра инфекционной активности калицивируса кошек (ТFCV) и циклами количественной оценки реакции амплификации РНК (CQ-РНК-FCV), представленной в виде логарифмической функции:
lg ТFCV=-0,2988 × CQ-РНК-FCV+9,875
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9999) и эффективностью амплификации 99,01%.
Предложенная модель позволяет количественно определить инфекционный титр калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг.1 - Зависимость цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК и титра инфекционной активности калицивируса кошек (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов ORF1-гена кДНК калицивируса кошек штамма «F9»;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, соответствующих участку ORF1-гена кДНК коронавируса кошек штамма «F9».
Сущность изобретения заключается в подходе по определению титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации вирусной РНК.
Заявляемый способ основан на: 1) элюировании РНК калицивируса кошек; 2) амплификации специфического фрагмента ORF1-гена РНК калицивируса кошек с применение специфического олигонуклеотида P1 и обратного праймера P2, а также молекулярного зонда-beacon, меченого флуорофором FAM и тушителем свечения RTQ1; 3) обнаружении РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; 4) расчете титра инфекционной активности калицивируса кошек в сырье неинактивированном сырье для культуральных вакцин с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:
lg ТFCV=-0,2988 × CQ-РНК-FCV+9,875
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9999) и эффективностью амплификации 99,01%.
В настоящее время реакцию транскрипционной амплификации применяют для выявления генома возбудителей различных инфекционных агентов, в частности, возбудителя парагриппа-1, 2, 3, 4, гриппа птиц А, энтеровирусной инфекции, цитомегаловирусной инфекции, аспергиллеза, кандидоза, хламидиоза, микобактериоза КРС, сальмонеллеза животных и др. патогенов [9, 10]. Данный метод применяется для определения титра инфекционной активности вируса ящура и бешенства в сырье для вакцин [11, 12]. При этом сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК авторами не обнаружено.
Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК по сравнению с прототипом отличается быстротой выполнения анализа, его объективностью, более высокой чувствительностью и специфичностью.
Применение разработанного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащего сырья для культуральных вакцин при определения титра инфекционной активности калицивируса кошек до 2,5 ч; повысить степень объективности получаемого результата; исключить вероятность контаминации; увеличить специфичность и чувствительность анализа; повторно использовать молекулы кДНК, что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; использовать молекулярный зонд-beacon, меченый флуорофором FAM и тушителем свечения RTQ1; повысить достоверность и правильность проводимого анализа. Исходя их этого, актуально применять разработанный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье при изготовлении культуральных вакцин посредством количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
Ключевым элементом заявляемого способа является проведение этапов денатурации, обратной транскрипции, разрушения гетеродуплекса РНК/кДНК и амплификации вирусной РНК с последующим отжигом молекулярного зонда-beacon, детектирования пороговых циклов сигмоид для исследуемых проб и опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек с применением разработанной логарифмической модели зависимости цикла количественной оценки реакции амплификации РНК-мишени для сигмоиды накопления сигнала флуоресценции и титра инфекционной активности калицивируса кошек.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в разработке и апробации способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для целевого участка ORF1-гена РНК FCV; 2) увеличить достоверность проводимого анализа благодаря подбору оптимальных температурного и временного режимов термоциклирования; 3) в 28,8 раз быстрее по сравнению с прототипом опосредованно определять титр инфекционной активности FCV в сырье для культуральных вакцин, что в рамках производственного процесса важно с экономической точки зрения.
На первом этапе работы подготавливают панель положительных стандартов калицивируса кошек, в качестве которых используют не инактивированные вируссодержащие суспензии с инфекционными титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3. Для получения данных разведений применют охарактеризованную очищенную с помощью фильтра на 0,8 мкм суспензию калицивируса кошек с титром инфекционной активности 8,0 lg ТЦД50/см3. Репродукция вируса проводится в монослойной клеточной линии CrFK. В данном анализе взят широкий диапазон возможных значений титра инфекционной активности калицивируса кошек, применяемого при исследовании. Для производства культуральных вакцин используют сырье с титрами (6,0 lg ТЦД50/см3. Отрицательным контролем служила суспензия клеток CrFK, не зараженная FCV.
Из всех стандартных положительных образцов и отрицательного контроля выделяют РНК калицивируса кошек с помощью набора «РИБО-сорб» («Интерлабсервис», РФ).
На следующем этапе исследования проводят реакцию амплификации РНК для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидов отражены в таблице 2. Расчет олигонуклеотидных праймеров и зонда-beacon осуществляли на основании нуклеотидных последовательностей ORF1-гена калицивируса кошек, опубликованных в базах данных GenBank и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
В качестве гомологичных ORF1-гену калицивируса кошек олигонуклеотидов используют:
Oligo-FCV-ORF1-P1 (5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G- CGACAATGTCGATTCCATCATG-3') (курсивом обозначена 5'-промоторная часть фермента T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы),
Downstream-FCV-ORF1-P2 (5'- TCAGGGCATAACTCGTCGG-3') и
FCV-ORF1-FAM/RHQ1-beacon (5'-FAM-CAA-AGC-GTC-TTC-AAC-CTA-GCU-UUG -RTQ1-3') в концентрации 0,25 пМ на реакцию. Для синтеза нуклеотидных цепей РНК-ампликонов применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) и рибонуклеозидтрифосфаты (NTP) с их концентрацией в реакционной смеси по 2,3 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5⋅10−2 M) и диметилсульфооксид (DMSO) (1,5%). В качестве ко-фактора добавляют 12 мМ хлорид магния. В качестве катализаторов реакции амплификации РНК применяют следующие ферменты: AMV-обратную транскриптазу (2 ед.), РНКаза Н E. сoli (2 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (2 ед.). Данные ферменты добавляют в реакционную смесь после прогревания до температуры 65°С и снижения температуры до 41°С, поскольку эти компоненты реакции термолабильны.
Элюаты РНК калицивируса кошек каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем реакционной смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидов не характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части зонда), а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4 [13-18].
Проведено определение температур плавления (Tm) для гибридизационной части олигонуклеотидов. Точное определение температуры плавления играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе РНК-праймеров и бикона для реакции амплификации РНК калицивируса кошек. В соответствии с требованиями к реакции транскрипционной амплификации с последующей детекцией РНК-ампликонов температура плавления олигонуклеотидов (гибридной их части) должна быть выше температуры реакции (41°С) не менее чем на 7-10°С [15-18].
Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда-beacon составили 60-61°С, что более чем на 7-10°С ниже, чем температура амплификации РНК (4°С) и соответствует общепринятым требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидам, используемым для данной реакции [14-17].
Последовательности разработанных оригинальных олигонуклеотидов исследованы на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [18]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Постановку реакции осуществляют в амплификаторе с наличием флуориметра любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых отражены в таблице 3. Стадию денатурации РНК проводят при температуре 65°С в течение 5 мин за 1 цикл. Реакцию амплификации РНК осуществляют в течение 35 циклов в изотермических условиях при температуре 41°С в течение 105 минут.Каждый условный цикл длится 3 минуты и складывается из 7 подэтапов: отжиг Oligo-FCV-ORF1-P1 на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг Downstream-FCV-ORF1-P2, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, синтез вирусной РНК, отжиг FCV-ORF1-FAM/RHQ1-beacon.
Принцип применяемого метода основан на проведении реакции транскрипционной амплификации нуклеиновой кислоты при фиксированной температуре 41°С (изотермические условия) с участием трех ферментов: AMV-ревертазы (ревертаза вируса миелобластоза птиц), РНКазы (RNase) Н E.coli и Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, полученной рекомбинантным способом из бактериофага Т7, специфических прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда-beacon для амплификации РНК калицивируса кошек. В результате этого процесса в ходе реакции происходит накопление миллиардов специфических фрагментов вирусной РНК-мишени. После инкубации РНК калицивируса кошек при температуре 65°С в течение 5 мин, при котором осуществляется денатурация нуклеиновой кислоты, начинается линейная стадия реакции амплификации, при которой специфический Oligo-FCV-ORF1-P1 гибридизируется с участком вирусной РНК. Данный олигонуклеотидный праймер включает в свой состав специфическую гибридизационную часть, а также промоторную последовательность T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы. При температуре 41°С AMV-ревертаза осуществляет элонгацию, создавая комплементарную ДНК с вирусной РНК-мишени. В результате формируется гетеродуплекс РНК/кДНК. Для РНКазы Н E.coli данный гибрид выступает в качестве субстрата. Фермент гидролизует РНК, тем самым разрушает гибрид РНК/кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК. С кДНК гибридизуется Downstream-FCV-ORF1-P2. AMV-ревертаза вновь удлиняет кДНК до 5´-конца с образованием двуцепочечной кДНК (дц кДНК), что приводит промотор T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы в функциональное состояние. Данный фермент воспринимает дц кДНК с активным промотором в качестве субстрата. В результате производится множество копий фрагмента вирусной РНК калицивируса кошек. Молекулярный зонд-beacon, комплементарный участку ORF1-гена РНК-мишени калицивируса кошек, гибридизутся с ним. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель флуоресценции в составе молекулярного зонда сближены за счет максимального использования водородных связей между атомами H, O и N олигонуклеотида. Благодаря механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии свечение подавлено. После линейной стадии реакция амплификации РНК вступает в циклический процесс.Downstream-FCV-ORF1-P2 гибридизуется с вновь синтезированной молекулой РНК калицивируса кошек. Фермент AMV-ревертаза проводит элонгацию кДНК. В результате образуется гетеродуплекс РНК/кДНК. За счет активности РНКазы Н E.coli после отжига beacon происходит разрушение гибрида РНК/кДНК за счет гидролиза РНК, наблюдается пространственное разделение флуорофора и гасителя свечения, что приводит к росту детектируемого сигнала при длине волны 520 нм. Oligo-FCV-ORF1-P1 гибридизируется с кДНК, а AMV-ревертаза удлиняет его с образованием дц кДНК. Фермент T7 ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК калицивируса кошек. После этого запускается следующий цикл амплификации РНК.
Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени с каждого цикла анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК CQ-РНК-FCV, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (CQ-РНК-FCV). Флуориметр определяет уровень свечения и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации РНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической РНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость в виде графика сигмоиды. Положительными считаются пробы, которым соответствуют экспонециальные кривые, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда, и при значении цикла количественной оценки реакции амплификации менее 33,20. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая, или график начинает формироваться после 33,20 цикла амплификации. Данное значение цикла количественной оценки реакции амплификации определено экспериментально. При его достижении исследуемый образец имеет значение титра инфекционной активности калицивируса кошек 0,0 lg ТЦД50/см3 или 1,0 ТЦД50/см3.
Выявляют зависимость между CQ-РНК-FCV и значением десятичного логарифма титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для вакцин.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Выражение функции зависимости титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин и цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК.
Для определения значения титра инфекционной активности калицивируса кошек подготавливали серию разведений положительных стандартных образцов калицивируса кошек, в качестве которых применяли не инактивированные суспензии калицивируса кошек с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3. Для получения данных разведений применяли охарактеризованную очищенную с помощью фильтра на 0,8 мкм суспензию калицивируса кошек с титром инфекционной активности 8,0 lg ТЦД50/см3.
Выделение нуклеиновой кислоты осуществляли, как представлено выше. Проводили постановку реакции амплификации РНК для исследования контролей, как описано выше. Получены данные реакции амплификации РНК, которые анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК. Установили зависимость между CQ-РНК-FCV и значением десятичного логарифма титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Полученные результаты отражены на фиг.1 и выражены в виде логарифмической функции:
lg ТFCV=-0,2988 (CQ-РНК-FCV+9,875)
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9999) и эффективностью амплификации 99,01%, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к реакции транскрипционной амплификации [11].
Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
В исследовании использовали 6 суспензий культурального FCV с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД50/см3, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального FCV с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CrFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 7 повторностях. Этап элюирования РНК, и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили, как описано выше.
Средние значения циклов количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК для проб №1-6 составляли 11,23±0,01, 10,39±0,01, 9,62±0,01, 8,79±0,01, 7,81±0,01, 7,01±0,02, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией, рассчитали средние значения титра инфекционной активности FCV для проб №1-6, которые составили 6,52; 6,77; 7,00; 7,25; 7,54; 7,78 lg ТЦД50/см3, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 9,62±0,00, что соответствовало титру инфекционной активности FCV, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие FCV в данных образцах. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК. Таким образом, разработанный способ позволяет рассчитывать титр инфекционной активности FCV в сырье для культуральных вакцин.
Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности FCV в сырье для вакцин с применением разработанного способа.
Для анализа использовали 300 суспензий культурального FCV с титрами инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД50/см3. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального FCV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CrFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы анализа проводили, как отражено выше. По результатам исследования, для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 9,62±0,00, что соответствовало титру инфекционной активности FCV, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие FCV в данных образцах.
Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со значениями стандартов на 99,12-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=75), на 98,33-99,11% для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3 (n=75), на 96,33-98,32% для 3,9-1,5 lg ТЦД50/см3 (n=75), на 96,05-96,32% для 1,4-1,0 lg ТЦД50/см3 (n=75) (табл.4). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности рассчитывать титр инфекционной активности FCV в сырье для вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК подготавливали серию стандартов FCV разных штаммов с титрами инфекционной активности, равными 0,00-8,00 lg ТЦД50/см3 с шагом 0,1 lg ТЦД50/см3. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы анализа проводили, как описано выше.
Выявлено, что с достоверностью 96,05-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности калицивируса кошек со значениями от 1,0 до 8,0 lg ТЦД50/см3. При исследовании вируссодержащего сырья с титрами от 0,0 до 1,0 lg ТЦД50/см3 обнаружили, что аналитическая чувствительность разработанного способа составляет 0,2 lg ТЦД50/см3 с достоверностью определения аналита, равной 95,56% (n=75, p<0,05).
Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК.
При анализе специфичности предлагаемого изобретнния, исследовали суспензии FCV, а также вирусы бешенства, ящура, инфекционного ринотрахеита кошек, чумы плотоядных, возбудителя парвовирусного энтерита, коронавирусного энтерита собак, аденовируса собак первого серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД50/см3. Исследования проводили в 5 повторностях.
Этапы анализа проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к калицивирусу кошек и может быть использован для его количественного определения.
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для кулътуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка 0RF1-гена вирусной РНК.
Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 350 кулътуральных суспензий FCV с разными значениями инфекционной активности вируса (1,0-8,0 lg ТЦДзо/см3). Данные пробы являлись заведомо положительными. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 350 исследуемых образцов в 348 пробах концентрация определена верно, в 3 - отличия были существенными (значения титра инфекционной активности составили ниже аналитической чувствительности способа).
Для исследования специфичности метода тестировали 210 отрицательных суспензий клеток линии CrFK, не содержащих FCV. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 210 проб были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,96-99,93%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,26-100,00%, k-критерий - 0,992; общая точность (DAc) - 98,72-99,96%.
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности калицивируса кошек до 2,5 ч; исключить вероятность контаминации; повысить объективность анализа; увеличить специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных РНК-праймеров и молекулярного зонда-beacon; увеличить чувствительность анализа за счет амплификации только молекул вирусной РНК; удешевить способ анализа за счет отсутствия использования клеточных культур в качестве тест-систем; применение фермента Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы позволяет повторно использовать молекулы комплементарной ДНК (кДНК), что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее, чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра инфекционной активности калицивируса кошек (ТFCV) и циклами количественной оценки реакции амплификации РНК (CQ-РНК-FCV), представленной в виде логарифмической функции:
lg ТFCV=-0,2988 (CQ-РНК-FCV+9,875
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9999) и эффективностью амплификации 99,01%.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК»:
1. Abd-Eldaim MM, Wilkes RP, Thomas KV, Kennedy MA. Development and validation of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection of feline calicivirus. Arch Virol. 2009;154(4):555-60.
2. Алипер Т. И., Непоклонов Е. А., Мухин А. Н. и др. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и кошек: руководство для практикующих ветеринарных врачей. Под ред. Т. И. Алипера. М.: ЗооВетКнига; 2017. 300 с.
3. Komina A, Krasnikov N, Kucheruk O, Zhukova E, Yuzhakov A, Gulyukin A. Distribution and genetic diversity of Feline calicivirus in Moscow metropolitan area. J Vet Sci. 2022 Nov;23(6):e92.
4. Глотова Т.И., Семенова О.В., Никонова А.А., Глотов А.Г., Вяткин Ю.В., Бондарь А.А. Выделение и филогенетический анализ калицивируса кошек в Сибири. Вопросы вирусологии. 2018; 63(6):268-274.
5. Hou J, McGahie D, Lesbros C, Almeras T, Howarth D, O'Hara V, Dawson S, Radford AD. European molecular epidemiology and strain diversity of feline calicivirus. Vet Rec. 2016 Jan 30;178(5):114-5.
6. Рахманина М.М. Калицивирусная инфекция кошек: биологические свойства возбудителя, эпизоотология, специфические средства и методы профилактики: Автореф. диcс. д-ра ветеринар. наук. М.; 2005.
7. Hofmann-Lehmann R, Hosie MJ, Hartmann K, et al. Infection in Cats. Viruses. 2022 Apr 29;14(5):937.
8. Вакцина против калицивироза, вирусного ринотрахеита и панлейкопении кошек Нобивак Tricat Trio. - URL: https://www.vetlek.ru/directions/?id=112 (Дата обращения 11.08.2023).
9. Morre S., Sillekens P., Jacobs M.V., et al. RNA amplification by nucleic acid sequence-based amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples // J. Clin. Microbiol. - 1996. - Vol.34. - P. 3108-3114.
10. Шипицина Е.В. Применение метода NUCLEIC ACID SEQUENCE -BASED AMPLIFICATION в реальном времени (NASBA-REAL-TIME) для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции // Журнал Акушерства и женских болезней. - Т. LIV выпуск 4/2005. - С.17-21.
11. Патент РФ №2 756 557, 10.01.2021 Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов» // Заявка 2020136076, Бюл. 28 от 02.11.2020 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Борисов А.В., Гусева М.Н.
12. Патент РФ №2 756 472, 10.09.2020 Способ опосредованного определения инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для антирабических вакцин при транскрипционной амплификации и детекции продуктов реакции с применением beacon-технологии // Заявка 2020129954, Бюл. №28 от 30.09.2021 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Мудрак Н.С.
13. Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol.20. - P. 163-179.
14. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.
15. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol.47, no. 11. - P. 1956-1961.
16. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol.95, no. 4. - P. 1460-1465.
17. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol.33. - P. 11-14.
18. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 14.08.2023).
Таблица 1
Состав реакционной смеси для опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК (разработанный способ)
| Наименование реагента | Концентрация компонента |
| Oligo-FCV-ORF1-P1 | 0,25 пМ |
| Downstream-FCV-ORF1-P2 | 0,25 пМ |
| FCV-ORF1-FAM/RHQ1-beacon | 0,25 пМ |
| Дезоксирибонуклеотиды | 2,3 мМ |
| Рибонуклеотиды | 2,3 мМ |
| Хлорид магния | 12 мМ |
| Буферный раствор (10-кратный) | 10% от объема реакционной смеси |
| AMV-обратная транскриптаза | 2 ед. |
| РНКаза Н E. сoli | 2 ед. |
| Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза | 2 ед. |
Примечание: объем вносимого элюата РНК - 5 мкл,
объем реакционной смеси - 25 мкл.
Таблица 2
Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для разработанного способа
| Наименование олигонуклеотидов | Дизайн олигонуклеотидов (5'…3') |
| Oligo-FCV-ORF1-P1 | AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G- CGACAATGTCGATTCCATCATG)* |
| Downstream-FCV-ORF1-P2 | TCAGGGCATAACTCGTCGG |
| FCV-ORF1-FAM/RHQ1-beacon | FAM-CAA-AGC- GTC-TTC-AAC-CTA-GCU-UUG -RTQ1** |
Примечание: * - курсивом обозначена 5'-промоторная часть T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы
** - выделены флуорофор и гаситель свечения, подчеркнута гибридизационная часть в центре.
Таблица 3
Временные и температурные режимы для опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК (разработанный способ)
| Этап реакции | Подэтап реакции | Температура, °С | Время реакции, мин | Количество циклов |
| Стадия плавления РНК (денатурация) | - | 65 | 5 | 1 |
| Амплификация РНК | отжиг прямого праймера | 41 | 3 | 35 |
| элонгация кДНК | ||||
| разрушение гибрида РНК/кДНК | ||||
| отжиг обратного праймера | ||||
| элонгация кДНК | ||||
| активация промотора Т7 ДНК-зависимой-РНК-полимеразы и синтез вирусной РНК | ||||
| отжиг зонда-beacon |
Таблица 4
Достоверность способа опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК (разработанный способ)
(nкаждого измерения=3, p<0,001)
| Значения титра инфекционной активности калицивируса кошек (стандарты), lg ТЦД50/см3 | Достоверность (%) определения титра инфекционной активности FCV в сырье для вакцин с помощью разработанного способа |
| 8,0-6,0 (n=75) | 99,12-100,00 |
| 5,9-4,0 (n=75) | 98,33-99,11 |
| 3,9-1,5 (n=75) | 96,33-98,32 |
| 1,4-1,0 (n=75) | 96,05-96,32 |
--->
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="1.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2024-03-14">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-03-12</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>544</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-03-12</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State-Financed Institution Federal Centre
for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим
Игоревич</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения
титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном
сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета
реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК </InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5289</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5289</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctcaaactctgagcttcgtgcttaaaactcacagtgtccgaaaggact
ttgtgcactctgtcaagttaacacttgcacggaggcgcgatcttcagtatatttataacaagctctcacg
cactatacgtgctgaggcttgcccttcttgtgctagttacgacgtatgtcctaactgcacctctggtgac
gtcccggatgacgggtcttcgacaatgtcgattccatcatgggaggatgtcacaaagtcttcaacctact
ctctcctgctctctgaggacacctccgacgagttatgccctgaggacttggttaatgtggctgctcatat
ccgtaaggcgctatccactcagtcccacccggctaatgctgaaatgtgcaaagaacagctcactttctta
ttagtcatggctgaggcgatgctgccccaacgatcccgagcgtcaatcccactgcaccaacaacacacgg
ctgcacggttggaatggagggagaaattcttctctaaacctcttgactttctccttgaaagagttggtgt
gtcaaaagatattctccaaactactgcgatttggaaaattatcttggaaaaagcatgctattgtaaatcc
tatggagagcagtggttcactgctgccaaacaaaagttaagggaaatgaaaaactttgagagtgatacgc
taaaacctcttattggtggatttatagatggtctacggttcttgaccgtggacaacccaaacccgatggg
tttcctcccaaaactcatagggcttgtaaaacccctgaatttggcgatgattattgataatcatgaaaac
acaatatctggctggatcatcacattaaccgcaataatggagctatacaacatcaccgaatgcaccatag
atattataacatcagtcattacggctttctatgataaaattggcaaggcaaccaaattttacagttgtgt
taaggcgctgttcactggatttagatctgaggacgtagcgaattccttttggtacatggcagcagcgatt
ctatgttacctgatcactgggttaatcccaaacaacggcagattttcaaagataaaagcttgcctggccg
gagcgacaactcttgtatcaggtatagttgccacacaaaagctagctgcaatgttcgcaacatggaactc
tgagtccattgttaatgagttgtcagcaagaactgttgccctatcagagctaaacaatccaacaacaacg
tctgacacggattcggtagaacgactgctagaattggctaagatcttgcatgaggagatcaagattcata
ctctaaaccccatcatgcaatcatacaatccaatcttgagaaatttaatgtcaaccttggacggtgttat
aacatcatgcaacaagaggaaagctattgctcggaagagacaggtgccagtttgttacatattaactggc
ccacctggatgtgggaaaacaaccgcagctcaagcattagctaagaaattgtctgatcaagagccgtcgg
taattaaccttgatgttgatcatcatgacacatatactggaaatgaggtatgtatcattgatgagtttga
ttcgtctgacaaggtagactatgcaaattttgtgattgggatggtaaactctgctcctatggtgttaaat
tgtgacatgcttgagaacaagggaaagctcttcacctcaaagtatataattatgacttccaactctgaaa
ctccagtgaaaccctcttccaagcgcgcaggtgcattctaccgaagggttactatcatcgatgtaactaa
cccttttgtggagtcgcacaagcgtgcaaggcctgggacgtctgttcctcgtagctgctataagaaaaac
ttctcccatctctcacttgctaaacgaggggccgagtgctggtgcaaggaatacgttcttgaccctaagg
ggcttcaacaccaaagcatgaaggctccccctcctacctttcttaacattgactctttagctcagacgat
gaagcaagacttcttgctcaagaacatggcttttgaggctgaagatgggtgcgcagaacatcgatatggg
tttgtgtgtcaacaggaagaggttgaaactgttcgcaggctcctcaacgcggttagggcaaggatgaatg
ctaccttcactgtgtgtgttggacccgagacctcgcactcgattggttgcactgcgcacgtgttaactcc
caatgagacctttaatggaaagaagtttgttgtgtcacgatgtaacgaagcatcactttctgcccttgaa
ggtaactgtgtaaagtcagctttgggcgtgtgtatgtcagataaggatctcactcatttatgccacttca
ttaaagggaaaattgtcaatgacagtgttaggttggatgaactacccgccaatcagcatgtggtaaccgt
taattcggtgtttgatttggcctgggctgttcgtcgtcatctcacactggcagggcagtttcaagctatc
agagccgcatatgatgtgcttactgtccccgacaagatccctgcaatgttgcgtcactggatggatgaga
cctccttttctgatgaccacgttgtaacacaatttgtaacacctggtggcatagtcatcctggagtcttg
cggtggtgcacgcatctgggctttaggtcgcaacgtgatccgagcaggaggtgtcaccgcaaccccaacc
ggaggatgtgttaggttaatgggattatctgcgccaaccatgccatggtccgagatctttcgtgagctct
tctctctcttaggtagaatttggtcatctgtcaaagtatcagccctagtactaactgctcttggaatgta
cgcatctagatttagaccaaaatcggaagcaaaaggaaaaaccaaattgaagattgggacatacaggggt
cgcggtgtagcgctgactgatgacgagtacgatgagtggcgcgaacacaacgcctccagaaaattggatt
tgtcagtggaggatttcttaatgttgcgccatcgtgccgctctaggagccgacgacaatgatgcagtaaa
attccggtcgtggtggaactccagaaccaaaatggccaatgattatgaggatgtcaccgtaattggcaaa
ggtggcgtcaaacatgaaaagatcagaaccaataccctaaaagctgtggatcgtggttatgacgtcagct
ttgctgaggaatcaggaccaggcaccaagttccacaagaatgcaattggatctgtcacagatgtttgtgg
ggagcacaaaggctattgcatccacatgggccacggtgtttacgcatccgtagctcacgtggtgaaaggg
gattcatttttcttgggtgaaaggatttttgatcttaagactaatggtgaattttgctgctttcgcagca
cgaaaattctacctagtgctgcacctttcttttctgggaagcccactcgtgatccgtggggatcccccgt
ggcaactgagtggaagcctaaaatgtacacaacaacctctggaaagattctggggtgctttgcaacaact
tcaactgaaactcacccgggagactgtggcctcccatatattgatgacaacgggagggtgaccggcctcc
acactggctctgggggacccaaaaccccaagtgccaagttggtggtgccatatgtgcatattgacatgaa
gactaaatccgtcactgctcaaaagtatgacgtaacaaagcctgatataagttacaaaggcttaatttgt
aagcaattggatgagattaggattataccaaaaggcacacgtctccatgtctccccagcccacactgagg
attatcaagaatgctcacaccaacccgcatcacttggaagcggggatccccgctgtccaaaatctctcac
tgctatagttgttgattctctaaaaccatactgtgagaacgttgagggtcctccacatgatgttttgcac
agagttcaaaagatgcttatcgaccacctttcaggctttgtccctatgaacatttcctcggaaacctcta
tgctctcagctttccacaaactcaatcatgatacttcctgtggaccatacttgggtggcagaaagaaaga
tcacatggctaacggtgagccggacaagcagttattggatctcctgtctgcaaaatggaaattggcaacc
caaggcatagcactaccacatgagtacacaattgggctaaaggacgagttaaggcccgtggagaaggtta
gtgaagggaagagaaggatgatttggggttgtgatgttggcgtcgctactgtctgtgcagctgcgttcaa
gggtgttagcgatgccatcacagcaaaccaccagtacgggcctatacaggttggtatcaacatggatagc
cccagcgtcgaagcgctgttccaaaggatcaaaagcgcggccaaggtatttgcggtcgattattccaaat
gggattcgacccaatcgcctcgtgtcagtgcagcttcaattgacatccttcgttacttttccgatcgctc
tccaattgttgactcagcctctaacacactgaagagccctcctgttgcaatctttaatggtgttgctgta
aaagtgtcctctggcttaccatctggaatgcctcttacctcagtaatcaattcccttaatcattgtctgt
atgttgggtgtgccattcttcaatccctagaagctaaggccattcccgtcacttggaaccttttctcaac
ttttgatatcatgacttacggggatgatggtgtctacatgtttcctattatgtatgcaagtattagtgac
caaatttttggaaatctttcttcctatggcctgaaaccaactcgggttgacaagtccgttggagcaattg
agcctattgatcctgactctgttgttttcttgaagagaacaatcacaaggacacctcaggggataagggg
tttacttgatcgcagctctataataagacaattctattatattaaaggtgagaactccgatgactggaag
agccccccaaaacatattgacccaacatctcgagggcaacagctttggaatgcctgtctgtacgctagcc
aacatggcttggagtttttcaacaaggtttacaggctggccgagagggctgttgaatatgaagagctgca
ctttgaacccccaacatatgcttcggctttggatcattacaacagccagttcaatggcgtggaggcgcgg
tctgaccagatcgactcgagtggcatgaccgccctacactgtgatgtgttcgaagtt</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1763</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1763</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSQTLSFVLKTHSVRKDFVHSVKLTLARRRDLQYIYNKLSRTIRAEACPSCA
SYDVCPNCTSGDVPDDGSSTMSIPSWEDVTKSSTYSLLLSEDTSDELCPEDLVNVAAHIRKALSTQSHPA
NAEMCKEQLTFLLVMAEAMLPQRSRASIPLHQQHTAARLEWREKFFSKPLDFLLERVGVSKDILQTTAIW
KIILEKACYCKSYGEQWFTAAKQKLREMKNFESDTLKPLIGGFIDGLRFLTVDNPNPMGFLPKLIGLVKP
LNLAMIIDNHENTISGWIITLTAIMELYNITECTIDIITSVITAFYDKIGKATKFYSCVKALFTGFRSED
VANSFWYMAAAILCYLITGLIPNNGRFSKIKACLAGATTLVSGIVATQKLAAMFATWNSESIVNELSART
VALSELNNPTTTSDTDSVERLLELAKILHEEIKIHTLNPIMQSYNPILRNLMSTLDGVITSCNKRKAIAR
KRQVPVCYILTGPPGCGKTTAAQALAKKLSDQEPSVINLDVDHHDTYTGNEVCIIDEFDSSDKVDYANFV
IGMVNSAPMVLNCDMLENKGKLFTSKYIIMTSNSETPVKPSSKRAGAFYRRVTIIDVTNPFVESHKRARP
GTSVPRSCYKKNFSHLSLAKRGAECWCKEYVLDPKGLQHQSMKAPPPTFLNIDSLAQTMKQDFLLKNMAF
EAEDGCAEHRYGFVCQQEEVETVRRLLNAVRARMNATFTVCVGPETSHSIGCTAHVLTPNETFNGKKFVV
SRCNEASLSALEGNCVKSALGVCMSDKDLTHLCHFIKGKIVNDSVRLDELPANQHVVTVNSVFDLAWAVR
RHLTLAGQFQAIRAAYDVLTVPDKIPAMLRHWMDETSFSDDHVVTQFVTPGGIVILESCGGARIWALGRN
VIRAGGVTATPTGGCVRLMGLSAPTMPWSEIFRELFSLLGRIWSSVKVSALVLTALGMYASRFRPKSEAK
GKTKLKIGTYRGRGVALTDDEYDEWREHNASRKLDLSVEDFLMLRHRAALGADDNDAVKFRSWWNSRTKM
ANDYEDVTVIGKGGVKHEKIRTNTLKAVDRGYDVSFAEESGPGTKFHKNAIGSVTDVCGEHKGYCIHMGH
GVYASVAHVVKGDSFFLGERIFDLKTNGEFCCFRSTKILPSAAPFFSGKPTRDPWGSPVATEWKPKMYTT
TSGKILGCFATTSTETHPGDCGLPYIDDNGRVTGLHTGSGGPKTPSAKLVVPYVHIDMKTKSVTAQKYDV
TKPDISYKGLICKQLDEIRIIPKGTRLHVSPAHTEDYQECSHQPASLGSGDPRCPKSLTAIVVDSLKPYC
ENVEGPPHDVLHRVQKMLIDHLSGFVPMNISSETSMLSAFHKLNHDTSCGPYLGGRKKDHMANGEPDKQL
LDLLSAKWKLATQGIALPHEYTIGLKDELRPVEKVSEGKRRMIWGCDVGVATVCAAAFKGVSDAITANHQ
YGPIQVGINMDSPSVEALFQRIKSAAKVFAVDYSKWDSTQSPRVSAASIDILRYFSDRSPIVDSASNTLK
SPPVAIFNGVAVKVSSGLPSGMPLTSVINSLNHCLYVGCAILQSLEAKAIPVTWNLFSTFDIMTYGDDGV
YMFPIMYASISDQIFGNLSSYGLKPTRVDKSVGAIEPIDPDSVVFLKRTITRTPQGIRGLLDRSSIIRQF
YYIKGENSDDWKSPPKHIDPTSRGQQLWNACLYASQHGLEFFNKVYRLAERAVEYEELHFEPPTYASALD
HYNSQFNGVEARSDQIDSSGMTALHCDVFEV</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aattctaatacgactcactatagggcgacaatgtcgattccatcatg</INS
DSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcagggcataactcgtcgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>viral cRNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaagcgtcttcaacctagcnnng</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (9)
1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК, включающий применение олигонуклеотидов:
- Oligo-FCV-ORF1-P1 с дизайном 5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-CGACAATGTCGATTCCATCATG-3',
- Downstream-FCV-ORF1-P2 с дизайном 5'- TCAGGGCATAACTCGTCGG-3',
- FCV-ORF1-FAM/RHQ1-beacon с дизайном 5'-FAM-CAA-AGC-GTC-TTC-AAC-CTA-GCU-UUG-RTQ1-3',
которые рассчитаны для целевого участка ORF1-гена калицивируса кошек,
и использование логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:
lg ТFCV=-0,2988×CQ-РНК-FCV+9,875,
с достоверностью аппроксимации 0,9999 и эффективностью амплификации 99,01%.
2. Способ по п. 1, где его аналитическая чувствительность составляет 0,2 lg ТЦД50/см3 с достоверностью определения титра инфекционной активности FCV, равной 95,56% при n=75 и p<0,05, в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составляет 97,96-99,93%, диагностическая специфичность – 98,26-100,00%, k-критерий – 0,992; общая точность – 98,72-99,96%.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821027C1 true RU2821027C1 (ru) | 2024-06-17 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1156333B1 (en) * | 2000-04-27 | 2007-08-01 | Pfizer Products Inc. | A method of measuring the duration of adequate immune memory in companion animals |
| RU2755925C1 (ru) * | 2020-08-03 | 2021-09-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени |
| RU2793900C1 (ru) * | 2022-07-19 | 2023-04-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1156333B1 (en) * | 2000-04-27 | 2007-08-01 | Pfizer Products Inc. | A method of measuring the duration of adequate immune memory in companion animals |
| RU2755925C1 (ru) * | 2020-08-03 | 2021-09-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в сырье для инактивированной антирабической вакцины методом ПЦР в режиме реального времени |
| RU2793900C1 (ru) * | 2022-07-19 | 2023-04-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111020064B (zh) | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 | |
| US10815539B1 (en) | Assays for the detection of SARS-CoV-2 | |
| CN111004870B (zh) | 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒 | |
| US9080204B2 (en) | Compositions and methods for rapid, real-time detection of influenza a virus (H1N1) Swine 2009 | |
| Belák § et al. | Molecular diagnosis of animal diseases: some experiences over the past decade | |
| Monpoeho et al. | Application of a real-time polymerase chain reaction with internal positive control for detection and quantification of enterovirus in cerebrospinal fluid | |
| US10626473B2 (en) | Methods and compositions for detecting Zika virus | |
| IL197139A (en) | A product and methods for identifying a biological organism | |
| Borm et al. | A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification | |
| CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| US9650685B2 (en) | Selective detection of human rhinovirus | |
| US20230203603A1 (en) | Rt-pcr detection reagent for detecting novel coronavirus, kit and detection method thereof | |
| JP2023536962A (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂの検出のための組成物及び方法 | |
| RU2821027C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью количественного учета реакции амплификации участка ORF1-гена вирусной РНК | |
| Liu et al. | Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Batai virus in cattle and mosquitoes | |
| RU2821895C1 (ru) | Способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма "РИЧ" возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса | |
| CA2645883C (en) | Selective detection of human rhinovirus | |
| US20230250493A1 (en) | Kit and methods for characterizing a virus in a sample | |
| Bohórquez et al. | Development of a new loop-mediated isothermal amplification test for the sensitive, rapid, and economic detection of different genotypes of Classical swine fever virus | |
| RU2808585C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2823930C1 (ru) | Способ опосредованного определения концентрации А-антигена производственного штамма «ВГНКИ» возбудителя инфекционного гепатита собак в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации целевого участка orf25-гена | |
| RU2815533C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин методом обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени | |
| RU2811995C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства в сырье для изготовления аттенуированной антирабической вакцины с применением технологии алгебраического анализа дифференциала второго порядка максимальной точки d CP MAX логистической кривой ПЦР | |
| RU2812858C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вобудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2809221C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности калицивируса кошек в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени |