RU2814310C1 - Способ определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче - Google Patents
Способ определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814310C1 RU2814310C1 RU2023119167A RU2023119167A RU2814310C1 RU 2814310 C1 RU2814310 C1 RU 2814310C1 RU 2023119167 A RU2023119167 A RU 2023119167A RU 2023119167 A RU2023119167 A RU 2023119167A RU 2814310 C1 RU2814310 C1 RU 2814310C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aromatic hydrocarbons
- polycyclic aromatic
- mcl
- liquid
- urine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 title claims abstract description 19
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims abstract description 5
- BIJNHUAPTJVVNQ-LOIXRAQWSA-N 2,3,4,5,6,7,8,9,10-nonadeuteriopyren-1-ol Chemical compound [2H]C1=C([2H])C(O)=C2C([2H])=C([2H])C3=C([2H])C([2H])=C([2H])C4=C([2H])C([2H])=C1C2=C43 BIJNHUAPTJVVNQ-LOIXRAQWSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 20
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 12
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 8
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 5
- ZDOIAPGLORMKTR-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxyfluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(O)C=C3CC2=C1 ZDOIAPGLORMKTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JWAZRIHNYRIHIV-UHFFFAOYSA-N 2-naphthol Chemical compound C1=CC=CC2=CC(O)=CC=C21 JWAZRIHNYRIHIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YPWLZGITFNGGKW-UHFFFAOYSA-N phenanthren-2-ol Natural products C1=CC=C2C3=CC=C(O)C=C3C=CC2=C1 YPWLZGITFNGGKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- BIJNHUAPTJVVNQ-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxypyrene Chemical compound C1=C2C(O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 BIJNHUAPTJVVNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N C[Si](C)C Chemical compound C[Si](C)C DCERHCFNWRGHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRKUHYFDBWGLHJ-UHFFFAOYSA-N N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide Chemical compound FC(F)(F)C(=O)N(C)[Si](C)(C)C(C)(C)C QRKUHYFDBWGLHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229950011260 betanaphthol Drugs 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VXFDOYXVHRYCGS-UHFFFAOYSA-N chrysen-6-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC3=C(C=CC=C4)C4=CC=C3C2=C1 VXFDOYXVHRYCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N chrysene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=C3C4=CC=CC=C4C=CC3=C21 WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N fluorene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3C2=C1 NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- NGPOABOEXMDQBT-UHFFFAOYSA-N 3-phenanthrol Chemical compound C1=CC=C2C3=CC(O)=CC=C3C=CC2=C1 NGPOABOEXMDQBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZKIUEHLEXLYKM-UHFFFAOYSA-N 9-phenanthrol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC3=CC=CC=C3C2=C1 DZKIUEHLEXLYKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237369 Helix pomatia Species 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 241001300028 Pomatias Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- XBBDACCLCFWBSI-ZETCQYMHSA-N melevodopa Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 XBBDACCLCFWBSI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003903 oxygen Drugs 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- -1 trimethylsilyl (TMS) Chemical class 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области аналитической токсикологии и может быть использовано при биомониторинге лиц, подвергающихся воздействию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в производственных условиях, а именно способу хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче. Способ хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче включает дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию, центрифугирование и дериватизацию гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов силилирующим реагентом, при этом дополнительно проводят ферментативный гидролиз пробы β-глюкуронидазой при 55°С в течение 1 ч, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию проводят путем внесения в пробу внутреннего стандарта 1-гидроксипирен-d9, 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана, встряхивания в течение 25 с с образованием эмульсии, центрифугирования 5000 об/мин в течение 10 мин, отбирают нижний слой во вставку на 250 мкл, дериватизацию проводят в испарителе хроматографа трехфазной системой из 1 мкл силилирующего реагента N,O-бистриметилсилилтрифторацетамида, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим анализом на капиллярной колонке НТ-8 в режиме температурного градиента в течение 15 мин. Вышеописанный способ упрощает пробоподготовку и способствует более полному извлечению аналитов за счет дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции (ДЖЖМЭ), исключающей процесс упаривания, проведения силилирования в инжекционном порту (испарителе), уменьшения продолжительности ГХ-МС анализа на капиллярной колонке. Изобретение также обеспечивает повышение селективности. 3 ил., 6 табл.
Description
Изобретение относится к области аналитической токсикологии, и может быть использовано при биомониторинге лиц, подвергающихся воздействию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) метаболизируются в полярные гидроксильные производные (ОН-ПАУ) с помощью оксидазной системы со смешанными функциями в присутствии молекулярного кислорода и никотинамидадениндинуклеотида или никотинамидадениндинуклеотидфосфата. Так, например, нафталин, метаболизируется в 2-гидроксинафталин; флуорен в 2-гидроксифлуорен; фенантрен в 9-гидроксифенатрен, 3-гидроксифенатрен, 2-гироксифенатрен; пирен в 1-гидроксипирен, хризен в 6-гидроксихризен.
Известен способ определения гидроксилированных ПАУ методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС), предполагающий извлечение аналитов жидкостной экстракцией (Campo L, F. Rossella, S. Fustinoni. Development of a gas chromatography/mass spectrometry method to a quantify several urinary monohydroxy metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in occupationally exposed subjects // J. Chromatog. B. 2008. V. 875. P. 531-540.) Данный способ включает следующие этапы: ферментативный гидролиз образца мочи β-глюкуронидазой при 37°С 16 ч, экстракция гексаном дважды, упаривание объединенного экстракта в токе азота при комнатной температуре, дериватизация сухого остатка реагентом N,O-бистриметилсилилтрифторацетамид (БСТФА) 100 мкл при температуре 90°С в течение 45 мин, ГХ-МС анализ на капиллярной колонке HP-5MS в течение 40 мин. К недостаткам данного способа можно отнести трудоемкость и длительность анализа, возможность потерь легких гидроксилированных ПАУ в процессе упаривания экстракта до сухого остатка.
Имеется также способ определения гидроксилированных ПАУ твердофазной микроэкстракцией (ТФМЭ). (Luan, Т., Fang, S., Zhong, Y., Lin, L., Chan, S.M.N., Lan, C. et al. Determination of hydroxyl metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons by fully automated solid-phase microextraction derivatization and gas chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography A, 2007. Vol. 1173, P. 37-43.)
Однако этим способом требуется длительное время выдержки волокна ТФМЭ от 45 минут до 12 ч, что делает его неприменимым для рутинного анализа.
Наиболее близким аналогом-прототипом к заявляемому способу является способ ГХ-МС определения ОН-ПАУ в донных отложениях (Wang, X., Lin, L., Yang, L., Tam. N.F.Y. Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments samples by combining subcritical water extraction and dispersive liquid-liquid microextraction with derivatization. Analytica Chimica Acta. 2012. V. 753. P. 57-63.) Способ включает в себя ускоренную экстракцию из твердой матрицы (10 г) очищенной водой с ацетонитрилом (20%) при температуре 150°С и давлении 1500 psi в течении 10 мин, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию хлорбензолом (100 мкл) из водно-ацетонитрильной смеси (11 мл), упаривание экстракта до сухого остатка, силилирование сухого остатка реагентом N-метилтретбутилдиметилсилилтрифторацетамидом (МТБСТФА) при 60°С в течение 1 ч в трет-бутилдиметилсильные производные, ГХ-МС анализ на капиллярной колонке DB-5 (30 м, 0,25 мм. 0,25 мкм) в течение 48 мин. Однако данный способ обладает следующими недостатками: возможность потерь легких ОН-ПАУ в процессе упаривания экстракта до сухого остатка, длительность силилирования (1 ч) гидрокси-ПАУ в сухом остатке, длительность ГХ-МС анализа (48 мин).
Технической задачей предлагаемого нами способа является упрощение пробоподготовки и более полное извлечение аналитов за счет дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстроакции (ДЖЖМЭ), исключающей процесс упаривания, проведения силилирования в инжекционном порту (испарителе), уменьшения продолжительности ГХ-МС анализа на капиллярной колонке.
Для достижения технического результата при ГХ-МС определении ОН-ПАУ в моче в режиме мониторинга заданных ионов с использованием ДЖЖМЭ и силилирования в инжекционном порту во флакон вместимостью 5 мл и с острым коническим дном вносят пробу мочи 2 мл, 20 мкл β-глукуронидазы (Helix Pomatia, 85000 ед/мл), выдерживают 60 мин при 55°С, далее добавляют 20 мкл внутреннего стандарта (1-гидроксипирен-d9, 1 мкг/мл), 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола - диспергирующий растворитель, 100 мкл трихлорметана - экстрагирующий растворитель; проводят встряхивание в течение 25 с для образования эмульсии; центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин; переносят нижний трихлорметановый слой во флакон на 250 мкл и осуществляют автоматический ввод микрошприцом в инжекционный порт хроматографа 3-х фазную систему: 1 мкл силилирующего реагента БСТФА, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим ГХ-МС анализом на капиллярной колонке НТ-8 (30 м, 0.25 мм, 0,25 мкм) в условиях перечисленных в таблице 1.
Идентификацию проводят по времени удерживания и по соотношению интенсивностей регистрируемых ионов (табл. 2)
Количественное определение по предлагаемому способу проводят методом внутреннего стандарта по растворам известной концентрации ОН-ПАУ в моче от 0,1 до 100 нг/см3, предварительно обработанным аналогично анализируемым пробам. При градуировке процедуру ферментативного гидролиза допускается не проводить.
Описание графических материалов:
Фиг. 1 - Зависимость площади пика ТМС производного ОН-ПАУ от температуры инжектора
Фиг. 2. Зависимость степени извлечения ОН-ПАУ из мочи от природы диспергирующего растворителя
Фиг.3 - Масс-хроматограмма образца мочи с концентрацией ОН-ПАУ 10 нг/мл
Общими признаками с прототипом являются:
- применение ДЖЖМЭ для извлечения ОН-ПАУ;
- центрифугирование для эффективного разделения трехкомпонентной системы на этапе ДЖЖМЭ;
- дериватизация ОН-ПАУ силилирующим реагентом.
Отличительными признаками заявляемого способа от прототипа являются:
- использование трихлорметана в качестве экстрагента на этапе ДЖЖМЭ;
- использование этанола в качестве диспергирующего растворителя на этапе ДЖЖМЭ;
- использование 0,1М соляной кислоты для создания кислой среды рН 1,6-2;
- дериватизация в инжекционном порту силилирующим реагентом БСТФА;
- использование высокотемпературной колонки НТ-8 для уменьшения времени ГХ-МС анализа.
Имеющийся прототип не содержит совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического результата.
Поскольку силилирование происходит внутри порта инжектора системы ГХ-МС, температуру инжекционного порта можно рассматривать как температуру реакции силилирования. Поэтому влияние температуры порта инжектора на эффективность силилирования в виде максимальной площади пика ТМС производного ОН-ПАУ было исследовано в диапазоне 150-370°С.
Из рисунка фиг. 1 ясно видно, что при повышении температуры порта инжектора от 150 до 300°С, площади пиков всех производных ОН-ПАУ также увеличиваются, однако при превышении 300°С не наблюдается значительного увеличения площадей пиков производных ОН-ПАУ. Также следует учесть то, что при температуре выше 350°С может разрушаться капиллярная колонка. Поэтому 300°С было выбрано в качестве оптимальной температуры порта инжектора при силилировании ОН-ПАУ реагентом БСТФА.
В ДЖЖМЭ диспергирующий растворитель должен смешиваться как с экстрагентом, так и с водно-солевой фазой. Роль диспергирующего растворителя заключается в диспергировании экстрагента по водно-солевой фазе в виде мелких капель и в образовании эмульсии (моча/диспергирующий растворитель/экстрагент). При образовании мутного раствора контакт между экстрагентом и водной фазой бесконечно больше, что помогает очень быстро достичь равновесия, что приводит к сокращению времени экстракции, повышению коэффициентов распределения и степени извлечения. Исходя из этих условий, для выбора лучшего растворителя-диспергатора были использованы четыре наиболее часто используемых диспергирующих растворителей, а именно ацетон, ацетонитрил, этанол и метанол. К 2 мл образца мочи с добавкой 5 нг/мл каждого ОН-ПАУ вводили 3 мл бидистилированной воды, подвергали ДЖЖМЭ с 100 мкл трихлорметана в качестве экстрагента и 300 мкл диспергирующего растворителя (ацетон, ацетонитрил, этанол и метанол).
Из рисунка фиг. 2 видно, что этанол показал самую высокую эффективность экстракции ДЖЖМЭ для всех метаболитов ОН-ПАУ.
Следующими факторами, влияющих на эффективность экстракции ДЖЖМЭ остаются рН пробы, объем диспергирующего растворителя этанола, время экстракции. Для этого был проведен ряд опытов с изменением объема этанола в диапазоне 100-300 мкл, рН в диапазоне 1,6-4.8, времени экстракции (встряхивания) 5-25 с (табл. 3).
Картина складывается следующая: с увеличением рН степень извлечения уменьшается. Только для 1-гидроксинафталина величина рН оказывает влияния на степень извлечения. Увеличению степени извлечения способствуют также увеличение объема диспергирующего растворителя этанола и времени экстракции. При большем объеме этанола степень извлечения увеличивается. Следует также отметить, что при увеличении времени встряхивания вклад факторов рН и объема этанола уменьшается. Степень извлечения ДЖЖМЭ для ОН-ПАУ была максимальной, когда рН водной фазы поддерживался на уровне 1.6, объем этанола составляет 300 мкл и время экстракции 25 с.
Установлены валидационные характеристики: предел обнаружения, предел количественного определения, линейный диапазон, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность, селективность.
Предел обнаружения и предел количественного определения приведены в таблице 4.
Линейный диапазон установили по 6 модельным образцам мочи с разными концентрациями ОН-ПАУ (0.5, 2, 5, 10, 40, 100 нг/см3), коэффициент корреляции r>0.999. Приемлемый критерий для r не ниже 0,990. Таким образом, линейный диапазон составил от 0.5 до 100 нг/см3. Прецизионность и точность оценивали для 3 образцов мочи с веденными концентрациями 0.5, 10 и 40 нг/см3, каждый образец анализировали 4 раза 5 дней. По результатам анализа рассчитали относительное стандартное отклонение (RSD, %) повторяемости и внутрилабораторной прецизионности, оценили значимость систематической погрешности по t-критерию (табл. 5).
Расчетные значения t-критерия, соответствовали приемлемому критерию tpacч<tтаб (tтаб(0.05;15)=2.13), что говорит о незначимости систематической погрешности. Исключения составляют только 2-ОН-нафталин для концентрации 0.5 нг/см3 и 9-ОН-фенантрен для концентраций 0.5 и 40 нг/см3.
На рисунке фиг. 3 приведена масс-хроматограмма образца мочи с концентрацией каждого ОН-ПАУ 10 нг/см3.
Пики триметилсилильных (ТМС) производных ОН-ПАУ узкие (полуширина пика 1.5 с), симметричные, контаминирующие пики не оказывают мешающего влияния. Таким образом, достигается отличная селективность определения.
Пример конкретного анализа.
Во флакон вместимостью 5 мл с острым коническим дном вносят 2 мл пробы мочи, 20 мкл β-глукуронидазы (Helix Pomatia, 85000 ед/мл), выдерживают 60 мин при 55°С.Затем после охлаждения до комнатной температуре вносят 20 мкл внутреннего стандарта (1-гидроксипирен-d9, 1 мкг/мл), 2 мл 0,1М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана; проводят встряхивание в течение 25 с для образования эмульсии; центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин; переносят нижний (трихлорметановый) слой во флакон на 250 мкл и осуществляют автоматический ввод микрошприцом в инжекционный порт хроматографа 3-х фазную систему (1 мкл силилирующего реагента БСТФА, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта) с последующим ГХ-МС анализом на капиллярной колонке НТ-8 (30 м, 0.25 мм, 0,25 мкм) в условиях по табл. 1.
Далее проводят обработку полученных данных с применением программного обеспечения (табл. 6).
Благодаря повышенной селективности и чувствительности предлагаемого способа удалось количественно определить содержание ОН-ПАУ в моче не только у работников производства алюминия, но и у лиц, не контактирующих с ПАУ в производственных условиях.
Результаты экспериментальных исследований и приведенный пример подтверждают достижение технического результата:
использование ДЖЖМЭ вместо классической жидкостной экстракции с упариванием экстракта упростило пробоподготовку и обеспечило количественное извлечение аналитов на 70-100% (табл. 3);
благодаря силилированию в инжекционном порту удалось исключить стадию упаривания трихлорметанового экстракта и достигнуть экспрессность дериватизации;
быстрый ГХ-МС анализ за 15 мин стал возможным благодаря высокотемпературной колонке НТ-8.
Заявленные отличительные признаки позволяют исследовать образцы мочи на содержание семи ОН-ПАУ: 2-гидроксинафталин, 2-гидроксифлуорен, 9-гидроксифенантрен, 3-гидроксифенантрен, 2-гидроксифенантрен, 1-гидроксипирен, 6-гидроксихризен. Предлагаемый способ является новым, обладает изобретательским уровнем и может широко использоваться для биомониторинга ОН-ПАУ в моче, в том числе у лиц, не контактирующих с ПАУ в производственных условиях.
Claims (1)
- Способ хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче, включающий дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию, центрифугирование и дериватизацию гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов силилирующим реагентом, отличающийся тем, что дополнительно проводят ферментативный гидролиз пробы β-глюкуронидазой при 55°С в течение 1 ч, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию проводят путем внесения в пробу внутреннего стандарта 1-гидроксипирен-d9, 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана, встряхивания в течение 25 с с образованием эмульсии, центрифугирования 5000 об/мин в течение 10 мин, отбирают нижний слой во вставку на 250 мкл, дериватизацию проводят в испарителе хроматографа трехфазной системой из 1 мкл силилирующего реагента N,O-бистриметилсилилтрифторацетамида, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим анализом на капиллярной колонке НТ-8 в режиме температурного градиента в течение 15 мин.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814310C1 true RU2814310C1 (ru) | 2024-02-28 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687887C1 (ru) * | 2018-09-18 | 2019-05-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований" | Способ определения 1-гидроксипирена в моче методом хромато-масс-спектрометрического анализа |
| CN111983053A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-24 | 广东工业大学 | 一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687887C1 (ru) * | 2018-09-18 | 2019-05-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований" | Способ определения 1-гидроксипирена в моче методом хромато-масс-спектрометрического анализа |
| CN111983053A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-24 | 广东工业大学 | 一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HO-SANG SHINA et al. Simultaneous determination of 2-naphthol and 1-hydroxy pyrene in urine by gas chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography B, 879 (2011) 489-494. * |
| XIAOWEI WANGA et al. Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment samples by combining subcritical water extraction and dispersive liquid-liquid microextraction with derivatization // Analytica Chimica Acta 753 (2012) 57- 63. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LeBeau et al. | Analysis of biofluids for gamma-hydroxybutyrate (GHB) and gamma-butyrolactone (GBL) by headspace GC-FID and GC-MS | |
| Zhao et al. | Rapid determination of amide herbicides in environmental water samples with dispersive liquid–liquid microextraction prior to gas chromatography–mass spectrometry | |
| Yang et al. | Full automation of solid-phase microextraction/on-fiber derivatization for simultaneous determination of endocrine-disrupting chemicals and steroid hormones by gas chromatography–mass spectrometry | |
| CN111239267B (zh) | 一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法 | |
| Yergey et al. | High-performance liquid chromatography/thermospray mass spectrometry of eicosanoids and novel oxygenated metabolites of docosahexaenoic acid | |
| Santurio et al. | Determination of glibenclamide in human plasma by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography | |
| RU2814310C1 (ru) | Способ определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче | |
| CN108508130B (zh) | 一种超高效合相色谱-串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法 | |
| CN108152425B (zh) | 一种高效液相色谱检测芝麻油木脂素的方法 | |
| Kudo et al. | Selective determination of amitriptyline and nortriptyline in human plasma by HPLC with ultraviolet and particle beam mass spectrometry | |
| CN113030361A (zh) | 基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法 | |
| CN114813988B (zh) | 一种同时提取和检测头发中甲状腺激素和类固醇激素的方法 | |
| CN114813989B (zh) | 毛发中褪黑素、n-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法 | |
| Stetson et al. | Determination of plasma propofol levels using gas chromatography—mass spectrometry with selected-ion monitoring | |
| del Mar Ramírez Fernández et al. | Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the analysis of amphetamines in plasma | |
| KR20100009940A (ko) | 동물생체시료에 함유된 피레쓰로이드계농약 검출방법 및잔류농도 분석방법 | |
| de Oliveira et al. | Applicability of new configuration of open tubular solid phase microextraction for determination of free (unconjugated) testosterone esters by gas chromatography with barrier ionization discharge detector | |
| Chen et al. | Stability of plasma gamma-hydroxybutyrate determined by gas chromatography-positive ion chemical ionization-mass spectrometry | |
| CN113655147A (zh) | 一种检测水中微囊藻毒素的方法 | |
| RU2419788C2 (ru) | Способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психоактивные вещества | |
| CN113109471A (zh) | 一种快速同时检测蔬菜水果中百菌清及其代谢物的lcmsms方法 | |
| CN109633015B (zh) | 一种英托利匹特中添加剂的检测方法 | |
| Hsieh et al. | Determination of Dechlorane compounds in aqueous samples using ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction and gas chromatography-electron-capture negative ion-mass spectrometry | |
| Mullins | Evaluation of a novel non‐porous membrane extraction probe to determine sulphonylureas in plasma with analysis by LC‐MS/MS | |
| CN111579703A (zh) | 基于lc-ms/ms对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法 |