RU2812598C1 - Способ определения нифедипина в биологическом материале - Google Patents
Способ определения нифедипина в биологическом материале Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812598C1 RU2812598C1 RU2023116326A RU2023116326A RU2812598C1 RU 2812598 C1 RU2812598 C1 RU 2812598C1 RU 2023116326 A RU2023116326 A RU 2023116326A RU 2023116326 A RU2023116326 A RU 2023116326A RU 2812598 C1 RU2812598 C1 RU 2812598C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- temperature
- acetonitrile
- nifedipine
- volume
- residue
- Prior art date
Links
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 19
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- GPEHQHXBPDGGDP-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;propan-2-one Chemical compound CC#N.CC(C)=O GPEHQHXBPDGGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 8
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 20
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 10
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 4
- RMZQSAMHIQBMLW-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(O)=O)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O RMZQSAMHIQBMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FGDQGIKMWOAFIK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;phosphoric acid Chemical compound CC#N.OP(O)(O)=O FGDQGIKMWOAFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 2
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;hydrate Chemical compound O.CC(C)=O OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии. Раскрыт способ определения нифедипина в биологическом материале, в котором в качестве органического изолирующего агента используется смесь ацетон-ацетонитрил в соотношении 7,5:2,5 по объёму, перед хроматографированием в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму, при хроматографировании в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ используют двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, перед определением физико-химическим методом остаток растворяют в метаноле, в качестве физико-химического метода применяют метод хромато-масс-спектрометрии, при его применении хроматографируют в колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащей неподвижную фазу, представляющую собой (5%-фенил)метилполисилоксан в виде плёнки толщиной 0,25 мкм, в качестве подвижной фазы используют гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, детектором является масс-спектрометр, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70 °С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200 °С со скоростью 40 °С в минуту, затем с 200 до 290 °С со скоростью 12,5 °С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 мин, температура инжектора составляет 250 °С, температура квадруполя 150 °С, температура интерфейса детектора 290 °С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности анализа. 4 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения нифедипина в биологическом материале, и может быть использована в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.
Известен способ определения нифедипина биологическом материале (крови), который заключается в том что биологический объект обрабатывают при перемешивании дважды по 30 минут порциями хлороформа. объём каждой из которых в два раза превышает объем биологического объекта, полученные хлороформные излечение объединяют, в 4-5 раз упаривают при комнатной температуре в токе воздуха, доводят до определённого объёма хлороформом, часть хлороформного раствора хроматографируют в тонком слое на пластине «Сорбфил» UV-254 с обращенной фазой, применяя элюент ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, в присутствии вещества-свидетеля, анализируемое вещество элюируют из сорбента хлороформом, оптическую плотность хлороформного элюата измеряют при длине волны 243 нм, а содержание нифедипина рассчитывают по величине оптической плотности (Квачахия Л.Л., Шорманов В.К. Идентификация нифедипина в биологических жидкостях // Фармация. - 2013. - № 8. - С. 16-19.
Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.
Известен способ определения нифедипина биологическом материале, заключающиеся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывает порциями органического изолирующего агента, которым является этилацетат, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в два раза превышает массу биологического объекта, полученные органические излечение объединяют, растворитель из объединённого излечения испаряют в токе воздуха, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-буферный раствор с рН 3 в отношении 6:4 по объёму, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, элюируя смесью растворителей вцетонитрил-буферный раствор с рН 3 в отношении 6:4 по объёму, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 в отношении 15:5:1 по объему и проводят определение методом ВЭЖХ в аналитической колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600», с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в отношении 15:5:1 по объему, подаваемой со скоростью 100 мкл/мин, и УФ-детектора, регистрирующего оптическую плотность при 280 нм (Шорманов В.К., Квачахия Л.Л., Маркелов М.Ю., Конарева Е.Г. Определение нифедипина в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 2011. - Т. 54, № 4. - С. 31-34).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.
Наиболее близким является способ определения нифедипина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является ацетон, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетон-вода в отношении 7:3 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-вода в отношении 7:3 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил- фосфатный буферный раствор с рН 9 в отношении 5:5 по объему и проводят определение физико-химическим методом, в качестве которого используется ВЭЖХ, хроматографируя в аналитической колонке Hibar размерами 150×4,6 мм, содержащей неподвижную фазу Purospher STAR RP-18 endcapped, с применением жидкой подвижной фазы ацетонитрил-фосфатный буферный раствор с рН 9 в отношении 5:5 по объему, подаваемой со скоростью 1000 мкл/мин, и детектора, которым является УФ-спектрофотометр, регистрирующего оптическую плотность при 250 нм. (Пат. 2686741RU. G01N33/00 (2019.02); G01N33/48 (2019.02). Способ определения нифедипина в биологическом материале / Шорманов В.К., Квачахия Л.Л.; заявитель и патентообладатель: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU). - № 2018120858; заявл. 05.06.2018; опубл. 30.04.2019, Бюл. № 13. - 11 с.).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.
Технический результат достигается тем, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra inert длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)диметилполисилоксан при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий нифедипин, измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra inert длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)диметилполисилоксан при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридинди карбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани печени
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани печени прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,02, 0,04, 0,06, 0,2, 0,8 мл 0,00125% раствора и 0,2, 0,6. 1.0, 1,6, 2,0 и 2,5 мл 0,025% раствора нифедипина в метаноле и доводят объём содержимого каждой колбы до метки метанолом.
4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 4⋅10-11 - 1,0⋅10-7 г.
Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S=18252936⋅C +29749,
где S - площадь хроматографического пика; C- концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани печени представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Результаты определения нифедипина в ткани печени (n=5; p=0,95) |
||||||
| № | Внесено нифедипина, мг в 10 г ткани печени |
Найдено | Метрологические характеристики, % |
|||
| площадь пика на хроматограмме, усл. ед. |
мг в хроматографируемой пробе |
мг в пересчёте на навеску, внесённую в биомате риал |
% от внесён ной в биоматериал навески |
|||
| 1 | 10,00 | 608217577 | 3.332⋅10-8 | 8,331 | 83,31 | = 87,42 |
| 2 | 10,00 | 624645219 | 3,422⋅10-8 | 8,556 | 85,56 | S = 3,02 |
| 3 | 10,00 | 654580034 | 3,586⋅10-8 | 8,965 | 89,65 | S = 1,35 |
| 4 | 10,00 | 662611326 | 3,630⋅10-8 | 9,074 | 90,74 | Δ = 3,76 |
| 5 | 10,00 | 641437920 | 3,514⋅10-8 | 8,785 | 87,85 | = 4,30 |
Пример 2
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани желудка
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани желудка прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани желудка представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Результаты определения нифедипина в ткани желудка (n=5; p=0,95) |
||||||
| № | Внесено нифедипина, мг в 10 г ткани желудка |
Найдено | Метрологические характеристики, % |
|||
| площадь пика на хроматограмме, усл. ед. |
мг в хроматографируемой пробе |
мг в пересчёте на навеску, внесённую в биомате риал |
% от внесён ной в биоматериал навески |
|||
| 1 | 10,00 | 666626972 | 3,652⋅10-8 | 9,129 | 91,29 | = 88,86 |
| 2 | 10,00 | 674658264 | 3,696⋅10-8 | 9,242 | 92,42 | S = 2,79 |
| 3 | 10,00 | 633771687 | 3,472⋅10-8 | 8,681 | 86,81 | S = 1,25 |
| 4 | 10,00 | 638517450 | 3,498⋅10-8 | 8,745 | 87,45 | Δ = 3,47 |
| 5 | 10,00 | 630303629 | 3,453⋅10-8 | 8,633 | 86,33 | = 3,91 |
Пример 3
Определение нифедипина (1,4-дигидро-2,6-диме-тил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметилового эфира) в ткани селезёнки
К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани селезёнки прибавляют 10 мг нифедипина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 7,5:2,5 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.
Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму путём обработки остатка 2,4 мл ацетонитрила и последующего прибавления к ацетонитрильному раствору 1,6 мл воды. Полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» 30 μ и предварительно промытую смесью растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму. Хроматографируют, элюируя даухкомпонентной подвижной фазой ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 6 по 8 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят метанолом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.
В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5977А этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил)метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 12,55 мин соответствует нифедипину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 77, 127, 168, 224, 254, 284, 329, 355. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 284, интенсивность которой принимается за 100 %.
Нифедипин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание нифедипина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.
Результаты количественного определения нифедипина в ткани селезёнки представлены в таблице 3.
| Таблица 3 Результаты определения нифедипина в ткани селезёнки (n=5; p=0,95) |
||||||
| № | Внесено нифедипина, мг в 10 г ткани селезёнки |
Найдено | Метрологические характеристики, % |
|||
| площадь пика на хроматограмме, усл. ед. |
мг в хроматографируемой пробе |
мг в пересчёте на навеску, внесённую в биомате риал |
% от внесён ной в биоматериал навески |
|||
| 1 | 10,00 | 643810802 | 3,527⋅10-8 | 8,817 | 88,17 | = 84,72 |
| 2 | 10,00 | 600916402 | 3,292⋅10-8 | 8,229 | 82,29 | S = 3,07 |
| 3 | 10,00 | 633224099 | 3,469⋅10-8 | 8,672 | 86,72 | S = 1,37 |
| 4 | 10,00 | 590117421 | 3,233⋅10-8 | 8,083 | 80,83 | Δ = 3,82 |
| 5 | 10,00 | 625010278 | 3,424⋅10-8 | 8,560 | 85,60 | = 4,51 |
| Таблица 4 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени) |
||
| Показатели | Предлагаемый способ | Известный способ |
| Чувствительность (открываемый минимум) а) в 100 г биоматериала б) в детектируемой пробе |
2,5⋅10-6 г 2,5⋅10-11 г |
3,0⋅10-5 г 5,0⋅10-10 г |
| Интервал линейности градуировочного графика (г в детектируемой пробе) | 4,0⋅10-11 - 1,0⋅10-7 г | 1,0⋅10-9 - 5,0⋅10-7 г |
| Степень извлечения | 87,38±3,64% | 79,06±4,35% |
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 12 раз повышает чувствительность определения в биологическом материале и в 20 раз в хроматографируемой пробе. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.
Claims (1)
- Способ определения нифедипина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 мин обрабатывают порциями органического изолирующего агента, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого излечения испаряют в токе воздуха, остаток неоднократно обрабатывает ацетоном, ацетоновое извлечение отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22 °С до полного удаления растворителя, остаток растворяют, хроматографируют в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, используя двухкомпонентную подвижную фазу, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют и приводят определение физико-химическим методом, хроматографируя в колонке, содержащей неподвижную фазу, с применением подвижной фазы и детектора, отличающийся тем, что в качестве органического изолирующего агента используется смесь ацетон-ацетонитрил в соотношении 7,5:2,5 по объёму, перед хроматографированием в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 6:4 по объёму, при хроматографировании в макроколонке сорбентом «Силасорб С-18» 30 μ используют двухкомпонентную подвижную фазу ацетонитрил-вода в отношении 6:4 по объёму, перед определением физико-химическим методом остаток растворяют в метаноле, в качестве физико-химического метода применяют метод хромато-масс-спектрометрии, при его применении хроматографируют в колонке НР-5 ms Ultra Inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащей неподвижную фазу, представляющую собой (5%-фенил)метилполисилоксан в виде плёнки толщиной 0,25 мкм, в качестве подвижной фазы используют гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, детектором является масс-спектрометр, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70 °С, данная температура выдерживается в течение 2 мин, в дальнейшем температура повышается от 70 до 200 °С со скоростью 40 °С в минуту, затем с 200 до 290 °С со скоростью 12,5 °С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 мин, температура инжектора составляет 250 °С, температура квадруполя 150 °С, температура интерфейса детектора 290 °С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество нифедипина по площади хроматографического пика.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812598C1 true RU2812598C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108593828A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-09-28 | 李水军 | 血浆制备卡中药物和毒物含量的检测方法 |
| RU2686741C1 (ru) * | 2018-06-05 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения нифедипина в биологическом материале |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108593828A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-09-28 | 李水军 | 血浆制备卡中药物和毒物含量的检测方法 |
| RU2686741C1 (ru) * | 2018-06-05 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения нифедипина в биологическом материале |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КВАЧАХИЯ Л.Л. и др. Особенности изолирования нифедипина из биологического материала // ВЕСТНИК ВОРОНЕЖСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ: ХИМИЯ. БИОЛОГИЯ. ФАРМАЦИЯ, 2019, N.1, стр.159-165. WANG D. et al. Determination of nifedipine in human plasma by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application in a pharmacokinetic study // Journal of Chromatography B, 2011, V.879, pp.1827-1832. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lai et al. | Measurement of endogenous versus exogenous formaldehyde–induced DNA–protein crosslinks in animal tissues by stable isotope labeling and ultrasensitive mass spectrometry | |
| Villas‐Bôas et al. | Mass spectrometry in metabolome analysis | |
| CN110573478B (zh) | 检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法 | |
| US11887828B2 (en) | Determination of antidepressants by mass spectrometry | |
| Cepurnieks et al. | The development and validation of a rapid method for the determination of antimicrobial agent residues in milk and meat using ultra performance liquid chromatography coupled to quadrupole–Orbitrap mass spectrometry | |
| US8399829B2 (en) | Vitamin B2 detection by mass spectrometry | |
| US20220308021A1 (en) | Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry | |
| RU2395081C2 (ru) | Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале | |
| Bahr et al. | Determination of cyclophosphamide in urine, serum and cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients by field desorption mass spectrometry | |
| Roszkowska et al. | Optimization and comparison of two microsampling approaches for LC-MS/MS analysis of a panel of immunosuppressants in blood samples | |
| RU2812598C1 (ru) | Способ определения нифедипина в биологическом материале | |
| RU2456597C1 (ru) | Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале | |
| Bahr et al. | Isolation, identification and determination of cyclophosphamide and two of its metabolites in urine of a multiple sclerosis patient by high pressure liquid chromatography and field desorption mass spectrometry | |
| Yoshioka et al. | Quantitative analysis of the Tricholoma ustale-derived toxin, ustalic acid, in mushroom and food samples by LC–MS/MS | |
| Von Stedingk et al. | Methyl vinyl ketone—identification and quantification of adducts to N-terminal valine in human hemoglobin | |
| Krishnamurthy et al. | Mass spectral investigations on trichothecene mycotoxins: VII. Liquid chromatographic—thermospray mass spectrometric analysis of macrocyclic trichothecenes | |
| RU2546294C1 (ru) | Способ определения новокаина в биологическом материале | |
| CN113156027A (zh) | 一种羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法 | |
| RU2537125C1 (ru) | Способ определения замещенных 2-метоксигидроксибензола в биологическом материале | |
| RU2546292C1 (ru) | Способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале | |
| RU2478962C1 (ru) | Способ определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале | |
| RU2548742C1 (ru) | Способ определения о-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-n-метилкарбамата в биологическом материале | |
| RU2686741C1 (ru) | Способ определения нифедипина в биологическом материале | |
| RU2623070C1 (ru) | Способ определения О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата и О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-(дибутиламиносульфенил)-N-метилкарбамата в биологическом материале | |
| RU2477479C1 (ru) | Способ определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале |