RU2812210C1 - Test system based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” elisa variant for determining titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain “o-n2356/pakistan/2018” of genotype o/me-sa/panasia2 ant-10 in animal blood serum - Google Patents
Test system based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” elisa variant for determining titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain “o-n2356/pakistan/2018” of genotype o/me-sa/panasia2 ant-10 in animal blood serum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812210C1 RU2812210C1 RU2023108557A RU2023108557A RU2812210C1 RU 2812210 C1 RU2812210 C1 RU 2812210C1 RU 2023108557 A RU2023108557 A RU 2023108557A RU 2023108557 A RU2023108557 A RU 2023108557A RU 2812210 C1 RU2812210 C1 RU 2812210C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mouth disease
- foot
- disease virus
- genotype
- pakistan
- Prior art date
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 128
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 43
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 30
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 27
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 27
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 11
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 2
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 15
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 241000710194 Foot-and-mouth disease virus - type O Species 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- -1 possibly Chemical class 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- LSDGFGPIFBOTJI-UHFFFAOYSA-N 2-(aziridin-1-yl)ethanamine Chemical compound NCCN1CC1 LSDGFGPIFBOTJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091324 3C proteases Proteins 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 1
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 240000000279 Emilia sonchifolia Species 0.000 description 1
- 235000002139 Emilia sonchifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108050000278 Picornavirus capsid Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 101710140501 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173681 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100030100 Sulfate anion transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710144481 Sulfate anion transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000030499 combat disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L disodium;2-hydroxy-3-[4-[4-[(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)amino]-3-methylphenyl]-2-methylanilino]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC=2)=C1 BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в сыворотках крови животных.The invention relates to the field of veterinary virology and biotechnology, in particular, to the creation of a test system for a liquid-phase blocking indirect “sandwich” ELISA variant for determining the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in animal serum.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией. Основными клиническими признаками заболевания являются лихорадка, хромота, афты во рту, ступнях и сосках. Молодые животные имеют более высокую смертность из-за поражения миокарда по сравнению со взрослыми особями. Вспышки ящура часто возникают в странах Ближнего Востока, Азии и Африки [1, 2].Foot and mouth disease is a highly contagious viral disease of artiodactyl animals, which is characterized by high morbidity, which entails restrictions on international trade in livestock and its products. The main clinical signs of the disease are fever, lameness, canker sores in the mouth, feet and nipples. Young animals have a higher mortality rate due to myocardial damage compared to adults. Outbreaks of foot and mouth disease often occur in the Middle East, Asia and Africa [1, 2].
Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. Геном кодирует 4 структурных белка VP4, VP1, VP3, VP2. Петля G-H белка VP1 была идентифицирована как основной антигенный сайт (141-160 а.о.). РНК вируса ящура также несет в себе информацию о 8 неструктурных белках (L-протеаза, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С-протеаза и 3D-РНК-зависимая РНК-полимераза). Вирус ящура имеет очень высокую частоту мутаций из-за отсутствия механизма репарации вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Антигенные варианты вызваны различными аминокислотными мутациями, приводящими к трудностям в борьбе с ящуром [1,2].The foot-and-mouth disease virus is a member of the genus Aphthovirus of the Picornaviridae family and has 7 different serotypes: O, A, Asia-1, C and SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. The genome encodes 4 structural proteins VP 4 , VP1, VP 3 , VP 2 . The GH loop of the VP 1 protein was identified as the main antigenic site (141-160 aa). The foot-and-mouth disease virus RNA also contains information about 8 non-structural proteins (L-protease, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C protease and 3D RNA-dependent RNA polymerase). Foot-and-mouth disease virus has a very high mutation rate due to the lack of a viral RNA-dependent RNA polymerase repair mechanism. Antigenic variants are caused by various amino acid mutations, leading to difficulties in the control of foot and mouth disease [1,2].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [3, 4]. Внутритипическая рекомбинация происходит часто и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [6].In RNA viruses, variation in the genome is favored by high mutation rates during viral replication, and the lineages and sublineages that arise are driven by mutation and recombination. Recombination is another important process that determines the biology and evolution of viruses. It represents the exchange of genetic material between two non-segmented RNA genomes. Genetic recombination has been shown to occur between viruses of the same serotype [3, 4]. Intratypic recombination occurs frequently, and recombination events in FMD appear to occur more readily in the 3' portion of the genome than in regions encoding structural viral proteins. Mutations resulting from recombination lead to the exchange of genetic material and the formation of new antigenic variants, which can escape immune pressure and lead to changes in cell tropism and host range [2, 5, 6]. One or more amino acid substitutions on the surface of viral particles can lead to changes in receptor recognition and use. As a result, the same virus will acquire the ability to penetrate cells using alternative receptors [6].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев [6, 7]. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6].Antigenic variations arise from amino acid mutations that alter how the body's immune system recognizes viral proteins. Superficially exposed structures of the virus are especially susceptible to immune attack. The process of emergence of new antigenic forms is determined by the complex interaction of viral factors and host cells [6, 7]. Changes in the genes encoding capsid proteins through mutation can lead to antigenic changes and the emergence of new genetic lines [6].
Наиболее вариабельным является белок VP1 вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP1 в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [8, 9, 10]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [9].The most variable protein is VP 1 of the foot-and-mouth disease virus, since it accounts for at least 90% of the mutations of all structural genes. The most variable regions are areas 40-60, 130-160 and 190-213 aa. [7]. Section of the surface protein VP 1 in the region 130-160 a.a. is highly variable because it is involved in the process of binding to host cell receptors [8, 9, 10]. The variability of this region allows the foot-and-mouth disease virus to interact with receptors of different types of cells and facilitates the transition from one host species to another [9].
В Российской Федерации вспышки ящура типа О регистрировались начиная с 2000 по 2021 гг. на территории Приморского, Хабаровского, Забайкальского краев, Амурской, Оренбургской областей, Республики Башкортостан. Вспышки болезни были вызваны вирусом ящура типа О, генотипов O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.In the Russian Federation, outbreaks of foot-and-mouth disease type O were recorded from 2000 to 2021. on the territory of Primorsky, Khabarovsk, Transbaikal territories, Amur, Orenburg regions, and the Republic of Bashkortostan. Outbreaks of the disease were caused by foot and mouth disease virus type O, genotypes O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.
Для изготовления высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем для выявления вируса ящура генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2 применяется производственный штамм «О №2047/Саудовская Аравия/2008», однако, в последние годы в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока стали возникать вспышки ящура, вызванные новым генотипом О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. При этом известные штаммы, в том числе «О №2047/Саудовская Аравия/2008», не дают возможности создать высокоспецифичных и высокочувствительных тест-систем для проведения диагностики ящура, причиной которого являются изоляты, относящиеся к генотипу вируса О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.To produce highly specific and highly sensitive diagnostic test systems for detecting foot and mouth disease virus genotype O/ME-SA/PanAsia2, the production strain “O No. 2047/Saudi Arabia/2008” is used, however, in recent years in the countries of Southeast Asia and the Middle East outbreaks of foot and mouth disease caused by the new genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 occur. At the same time, known strains, including “O No. 2047/Saudi Arabia/2008,” do not make it possible to create highly specific and highly sensitive test systems for diagnosing foot and mouth disease, which is caused by isolates belonging to the genotype of the virus O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
В 2018 г. на территории Исламской Республики Пакистан от крупного рогатого скота с клиническими признаками ящура был отобран патологический материал, который поступил для научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изолят вируса ящура «О РК18/12», послуживший источником для получения штамма О №2356/Пакистан/2018, был выделен в культуре клеток IB-RS-2. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, выделенный изолят принадлежит к вирусу ящура типа О топотипа ME-SA генетической линии PanAsia2 новой сублинии ANT-10.In 2018, on the territory of the Islamic Republic of Pakistan, pathological material was collected from cattle with clinical signs of foot-and-mouth disease, which was sent for scientific research to the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH". The foot-and-mouth disease virus isolate “O RK18/12,” which served as the source for obtaining strain O No. 2356/Pakistan/2018, was isolated in IB-RS-2 cell culture. According to the results of a comparative analysis of nucleotide sequences, the isolated isolate belongs to the foot-and-mouth disease virus type O of the ME-SA topotype of the PanAsia2 genetic line of the new subline ANT-10.
В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17 и ВНК-21/SUSP/ARRIAH, соответственно, и получен штамм «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».At the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH" this isolate was adapted to various sensitive cell lines, including monolayer and suspension continuous cell lines of the newborn Syrian hamster kidney VNK-21/2-17 and VNK-21/SUSP/ARRIAH, respectively, and obtained strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . Strain “O No. 2356/Pakistan/2018” of the foot-and-mouth disease virus has been deposited in the All-Russian State Collection of Exotic Types of Foot-and-Mouth Disease Viruses and other Animal Pathogens (GKSHM) of the Federal State Budgetary Institution “ARRIAH” under registration number: No. 415 - dep / 22-49 - GKSHM FSBI “ARRIAH” .
Филогенетическая принадлежность штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура представлена на фиг. 4.The phylogenetic affiliation of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” is presented in Fig. 4.
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма.Immunization is an effective tool to combat disease. In connection with the emergence of a representative of a new genotype of the foot-and-mouth disease virus and the need to protect animals from it, the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH" has developed a vaccine that includes the antigen of the foot-and-mouth disease virus of this strain.
Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» (генотип О/ME-SA/PanAsia2ANT-10), которые вырабатываются у животных после вакцинации вакциной содержащей данный штамм.There is a need to create highly specific and highly sensitive diagnostic test systems that would allow the detection of antibodies against the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” (genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 ), which are produced in animals after vaccination with the vaccine containing this strain.
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [11, 12, 13, 14]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным и специфичным методом, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), 2) высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием СО2-инкубатора, 3) предполагает использование живого вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности.Protection against foot and mouth disease after vaccination is determined by the level of specific antibodies in the blood serum of animals [11, 12, 13, 14]. The level of humoral immunity of vaccinated livestock is determined by detecting antibodies specific to the capsid or structural proteins of the foot and mouth disease virus. In accordance with the recommendations of the OIE (OIE) [2], a neutralization reaction and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are used to determine the immune status of animals. The neutralization reaction is considered a sensitive and specific method, however, the analysis has a number of limitations: 1) the long duration of the reaction (at least 3 days), 2) the high cost of the procedure associated with the use of a sensitive cell line, the presence of a CO 2 incubator, 3 ) involves the use of live foot-and-mouth disease virus, which is a biological agent of hazard group II.
В свою очередь ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа [15, 16]. Исходя из этого ИФА целесообразно применять для определения титра антител у вакцинированных животных.In turn, ELISA has many advantages, including rapidity, high specificity and sensitivity, suitability for large-scale screening of field samples, and no requirement for special laboratory conditions, such as cell culture or carbon dioxide environment [15, 16]. Based on this, it is advisable to use ELISA to determine the antibody titer in vaccinated animals.
Выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител в следствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.There are direct and indirect variants of ELISA. The advantages of the direct ELISA variant are the speed of analysis, since only one variant of immunoglobulin G is used and cross-reactivity of secondary antibodies is eliminated. However, there are some disadvantages, namely, a decrease in the immune activity of primary antibodies due to the negative influence of enzymes or labels, lack of flexibility in choosing the primary antibody label depending on the research task, as well as minimal signal amplification.
Существует непрямой вариант ИФА, который имеет заметные преимущества по сравнению с прямым. К достоинствам этого варианта метода относится следующее: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной активности со вторичным антителом, что может привести к появлению неспецифического сигнала, а также наличие дополнительного этапа реакции [4, 15, 17].There is an indirect version of ELISA, which has noticeable advantages over the direct one. The advantages of this variant of the method include the following: 1) the presence of a wide variety of labeled secondary antibodies, 2) versatility (many primary antibodies can be obtained from the same species, and the same labeled secondary antibody can be used for detection), 3) maximum immune the activity of the primary antibody is preserved because it is not labeled, 4) increased sensitivity, since each primary antibody contains multiple epitopes that can be bound by a labeled secondary antibody, allowing the detected signal to be amplified. Limitations of the method include the possibility of cross-activity with a secondary antibody, which can lead to the appearance of a nonspecific signal, as well as the presence of an additional reaction step [4, 15, 17].
Большое значение в лабораторной деятельности имеет «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества:Of great importance in laboratory work is the “sandwich” version of ELISA, which usually requires the use of pairs of matched antibodies, where each antibody is specific for a different, non-overlapping epitope of the antigen. The first antibodies are usually called sensitizing antibodies and are designed to capture the antigen. The second antibodies are detector antibodies, necessary to detect the antigen. This ELISA option has the following advantages:
- высокая специфичность анализа;- high specificity of the analysis;
- подходит для исследования полевых образцов разной степени очистки;- suitable for studying field samples of varying degrees of purification;
- высокая чувствительность реакции.- high sensitivity of response.
ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.ELISA is also divided into solid-phase and liquid-phase options. Currently, the solid-phase version is widely used due to its ease of use and speed of analysis. At the first stage of the reaction for the solid-phase version, antibodies are adsorbed on the solid phase. In this case, reagents that are not bound to the solid phase are easily removed by washing. The test sample is incubated in the sensitized wells. In this case, immune complexes are formed on the surface of the solid phase. Unbound components are removed by washing. When a conjugate is added and bound to the immobilized immune complex, the active site of the enzyme remains available for subsequent interaction with the substrate. Incubation of the substrate in wells with the immobilized conjugate leads to the development of a color reaction. This reaction can be stopped at the desired stage, the severity of staining can be assessed visually or by optical density.
Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА имеет ряд следующих преимуществ: 1) анализ максимально из всех модификаций данного анализа приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку частицы антигена не прикреплены к субстрату; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; 3) обладает высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности, специфичности и общей точности.The liquid-phase blocking indirect version of the ELISA has the following advantages: 1) the analysis is the closest of all modifications of this analysis to the classical neutralization reaction, since the antigen particles are not attached to the substrate; 2) antigen epitopes are most accessible in space for specific antibodies, and this allows one to obtain the closest results to the neutralization reaction in a cell line; 3) has high levels of analytical and diagnostic sensitivity, specificity and overall accuracy.
Sharma G.K. и др. (2015) предложили способ определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [18]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 не более 55%, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Следует заметить, что данный способ предполагал применение в качестве блокирующего компонента не иммунную сыворотку лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном и нестабильным компонентом для проведения цветной реакции. Для остановки реакции применяли серную кислоту, являющуюся опасным соединением.Sharma GK et al. (2015) proposed a method for determining antibodies against foot-and-mouth disease virus types A, O, Asia-1 using a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of ELISA [18]. This technique made it possible to identify a wide range of anti-foot-and-mouth disease antibodies, but the specificity for the foot-and-mouth disease virus genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 was no more than 55%, and, therefore, accurate detection of immunoglobulins G was not possible. It should be noted that this method involved the use of non-immune horse serum as a blocking component, which contains various protein compounds, including, possibly, homologous sections of amino acid sequences relative to antigenic determinants. The authors of the test system used monoclonal antibodies, the use of which increases the range of detection of various genetic lines of foot-and-mouth disease virus within one serotype, but at the same time the specificity with respect to the detection of antibodies against isolates/strains of a specific genotype, in particular O/ME-SA/PanAsia2 ANT- 10 . Tetramethylbenzidine (TMB), which is an aggressive carcinogen and an unstable component for the color reaction, was used as a dye. To stop the reaction, sulfuric acid, which is a dangerous compound, was used.
Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве набора для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются недоступными для широкого потребителя в качестве диагностикумов. В свою очередь на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа О - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).The above test systems are not presented on the market as a kit for detecting foot-and-mouth disease antibodies in animal blood sera and remain unavailable to the general consumer as diagnostic tools. In turn, the world market currently has European kits for detecting antibodies against foot-and-mouth disease virus type O - IZSLER (Italy) and PrioCHECK (Netherlands).
Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. Комплектующие набора IZSLER (Institute Zooprofllattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) следующие:The test system in the IZSLER kit is intended for the detection of anti-foot-and-mouth disease antibodies using a solid-phase direct “sandwich” version of the ELISA. The components of the IZSLER kit (Institute Zooproflattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) are as follows:
1. Герметичные микропланшеты, сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура типа О.1. Sealed microplates sensitized with inactivated foot-and-mouth disease virus type O.
2. Конъюгат (моноклональные антитела против вируса ящура типа О, конъюгированные с пероксидазой).2. Conjugate (monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus type O, conjugated with peroxidase).
3. Положительный контроль сыворотки против вируса ящура типа О.3. Positive serum control against foot and mouth disease virus type O.
4. Отрицательный контроль.4. Negative control.
5. Буферный раствор для ИФА - фосфатно-солевой буфер с твином-20 (ФСБ-Tween).5. Buffer solution for ELISA - phosphate-buffered saline with Tween-20 (PBS-Tween).
6. Буфер для разведения сыворотки крови и конъюгата.6. Buffer for diluting blood serum and conjugate.
7. Субстрат (раствор хромогена ТМВ).7. Substrate (TMB chromogen solution).
8. Раствор для остановки реакции (0,6N раствор серной кислоты).8. Solution to stop the reaction (0.6N sulfuric acid solution).
Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2018 года (период, когда выделен штамм «О №2356/Пакистан/2018») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 ниже 50%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать точных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.The advantage of this kit is the use of monoclonal antibodies, however, they were obtained before 2018 (the period when the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” was isolated) and cannot detect specific antibodies in animal blood sera with high reliability and accuracy. The specificity and sensitivity of this test system for detecting antibodies against foot-and-mouth disease virus genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 is below 50%, which is confirmed by the neutralization reaction data in the sensitive continuous monolayer pig kidney cell line IB-RS-2. Thus, the test system used does not allow obtaining accurate results specifically for isolates and strains of the foot-and-mouth disease virus of the newly emerged genotype.
Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа О.The closest prototype for the test system we developed is the PrioCHECK test system (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) for detecting antibodies to foot-and-mouth disease virus type O.
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:The components for the corresponding kit are presented below:
Компонент 1 - Планшеты иммунологические.Component 1 - Immunological tablets.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.Component 2 - Conjugate (30x). The diluted conjugate is not stable; prepare immediately before use.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).Component 3 - Dilution Buffer (5x).
Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.Component 4 - Non-immune horse blood serum.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.Component 5 - Demineralized water.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).Component 6 - Wash buffer (200x).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).Component 7 - Reference serum 1 (positive) (liquid).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).Component 8 - Reference serum 2 (less positive) (liquid).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).Component 9 - Reference serum 3 (even less positive) (liquid).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).Component 10 - Reference serum 4 (negative control) (liquid).
Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).Component 11 - Chromogen substrate (TMB).
Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.Component 12 - Stop solution (1 N sulfuric acid solution). The data is reflected in the manufacturer's instructions.
Диагностикум удобен в применении и позволяет за 5-6 ч получить результаты исследования. Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа О, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Разработана прототипная тест-система в конце 90-гг XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием вирусов, кроме активно циркулирующего с 2018 г. генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа О. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP1, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 55%. Исходя из этого требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа уровня антител против вируса ящура представленного генотипа.The diagnosticum is easy to use and allows you to obtain research results in 5-6 hours. This test system includes a conjugate, which is a labeled monoclonal antibody against foot-and-mouth disease virus serotype O, and therefore is type-specific, but without a narrower differentiation. A prototype test system was developed in the late 90s of the 20th century. and corresponding antibodies were obtained against foot-and-mouth disease virus antigens of various genotypes created using viruses, except for the genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , which has been actively circulating since 2018. Isolates and strains of this line have significant differences from other lines of serotype O. Analyzing the nucleotide and amino acid sequence of the highly variable peptide of the foot-and-mouth disease virus VP 1 , scientists came to the conclusion that there are a sufficient number of significant substitutions to classify the virus as a different genotype. Based on the above, the prototype test system is not highly sensitive and specific to the foot and mouth disease virus genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . This test system detects antibodies to this strain by no more than 55%. Based on this, it is necessary to develop a highly sensitive, specific test system for the detection and quantitative analysis of the level of antibodies against the foot-and-mouth disease virus of the presented genotype.
Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма хоть и является одним из вариантов серологических реакций, но находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.The prototype test system is based on a solid-phase competitive “sandwich” version of the ELISA, however, this form, although it is one of the variants of serological reactions, is further from the neutralization reaction in terms of the ability to capture antigenic sites compared to the liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA .
Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.The prototype version assumes the presence of native control animal blood sera in its composition, which reduces the safety of the components of the test system for a long period of time and there is a risk of contamination by microorganisms.
Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.The prototype version also has some limitations in application, namely, the working solution of the conjugate is not stable and quickly deteriorates. As part of the kit, it is presented in the form of a 30-fold concentrate. In this state, unlike the lyophilized component, the shelf life is noticeably reduced. It should also be noted that this test system does not provide for conjugate control, which does not allow obtaining more reliable data on optical densities and antibody titers against foot-and-mouth disease virus.
В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.The prototype test system uses a direct conjugate, which is convenient to use, but this increases the likelihood of background noise phenomena, which can negatively affect the final results of a quantitative study of animal blood sera.
В прототипной тест-системе для проявления цветной реакции используют краситель ТМВ, который обладает канцерогенными свойствами.In the prototype test system, the dye TMB, which has carcinogenic properties, is used to develop a color reaction.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного анализа гуморального иммунитета животных после вакцинации противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, актуальной является разработка серологической тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител в сыворотках крови животных с учетом выше приведенных недостатков.Taking into account the found limitations in the use of existing test systems, including a prototype, for an accurate analysis of the humoral immunity of animals after vaccination with foot-and-mouth disease vaccines containing inactivated foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT -10 , it is relevant to develop a serological test system of a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of ELISA for detecting antibodies in animal blood sera, taking into account the above disadvantages.
В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в сыворотках животных.Currently, the veterinary service of the Russian Federation does not have a modern domestic ELISA test system that would allow high reliability to determine the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in animal sera.
Целью изобретения является создание тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.The purpose of the invention is to create a test system based on a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA to determine the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови КРС, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против Ig G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.The goal is achieved due to the fact that the liquid-phase blocking indirect “sandwich” ELISA method is closest to the classical neutralization reaction in natural conditions, since all antigenic sites of the full virions of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA /PanAsia2 ANT-10 are free in the liquid phase, open to binding to specific sensitizing and detector antibodies of rabbit and guinea pig, respectively. The reaction is based on the interaction of the animal blood serum under study and the inactivated foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in the liquid phase in the wells of a round-bottomed plate with the formation of immune complexes. In parallel with this, the wells of the flat-bottomed plate are sensitized with rabbit immunoglobulins G against the foot-and-mouth disease virus of the same genotype. After this, the sensitized wells are blocked using fetal bovine serum, the resulting immune complexes from a round-bottom plate are added, incubated, and a reduced suspension of detector antibodies is added. The resulting complex immune complex is detected using antibodies against guinea pig Ig G conjugated with horseradish peroxidase and a chromogenic substrate.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.The technical result of the invention is the development of a modern, highly specific and sensitive test system designed to determine the titer of antibodies against the foot and mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 using the liquid-phase blocking indirect method sandwich"-version of ELISA, due to the use of inactivated foot-and-mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 and when obtaining specific reaction components in the liquid phase.
В состав разработанной тест-системы ИФА входят следующие иммуноспецифические компоненты:The developed ELISA test system includes the following immunospecific components:
1. культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 -1 флакон (0,5 см3);1. cultural inactivated lyophilized foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 -1 bottle (0.5 cm 3 );
2. сенсибилизирующие лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 - 1 флакон (0,5 см3);2. sensitizing lyophilized antibodies - rabbit immunoglobulins G against foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 - 1 bottle (0.5 cm 3 );
3. детекторные лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 - 1 флакон (0,5 см3);3. detector lyophilized antibodies - guinea pig immunoglobulins G against foot-and-mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 - 1 bottle (0.5 cm 3 );
4. контроль 1 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, с процентом ингибиции ≥75% - 1 флакон (0,2 см3);4. control 1 - positive lyophilized cattle blood serum to the foot and mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , with an inhibition percentage ≥75% - 1 bottle (0.2 cm 3 );
5. контроль 2 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, с процентом ингибиции от 50% до 75% - 1 флакон (0,2 см3);5. control 2 - positive lyophilized cattle blood serum to the foot and mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , with a percentage of inhibition from 50% to 75% - 1 bottle ( 0.2 cm 3 );
6. контроль 3 - нормальная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к вирусу ящура - 1 флакон (0,2 см3);6. control 3 - normal lyophilized cattle blood serum that does not contain antibodies to the foot-and-mouth disease virus - 1 bottle (0.2 cm 3 );
7. фетальная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета - 2 флакона (по 2,0 см3);7. fetal lyophilized bovine blood serum, normal for blocking open binding sites at the bottom of the wells of the plate - 2 bottles (2.0 cm 3 each);
8. антивидовой лиофилизированный конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.8. anti-species lyophilized conjugate - rabbit immunoglobulins against guinea pig IgG, conjugated with horseradish peroxidase.
Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:The proposed test system contains non-specific components:
9. карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (рН 9,5-9,6) для разведения антигена;9. carbonate-bicarbonate buffer solution (pH 9.5-9.6) for antigen dilution;
10. 20-кратный концентрат буферного раствора;10. 20-fold buffer solution concentrate;
11. хромогенный субстрат - краситель ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота);11. chromogenic substrate - ABTS dye (2,2-azino-di-(3-ethylbenzoaminosulfonic acid);
12. «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор додецилсульфата натрия.12. “stop” solution - 0.5% sodium dodecyl sulfate solution.
В состав тест-системы также входят 4 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 1 полимерный 96-луночный круглодонный планшет для связывания антигена и антител в жидкой фазе.The test system also includes 4 immunological 96-well flat-bottomed polystyrene plates for ELISA and 1 polymer 96-well round-bottom plate for binding antigen and antibodies in the liquid phase.
В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный инактивированный вирус ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, который представлен в виде лиофилизата. Данный факт дает возможность выявлять именно антитела против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 45% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 составляет 1:4000.Unlike the prototype, the developed test system uses a culture-inactivated foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , which is presented in the form of a lyophilisate. This fact makes it possible to detect antibodies against the foot-and-mouth disease virus of the specified strain with high rates of sensitivity (more than 99%) and specificity (100%), which is more than 45% higher than the closest prototype. In addition, the lyophilized component remains stable for at least 3 years compared to the antigen in its native state, which is an advantage in using this test system. The activity of the obtained antigen of foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 is 1:4000.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена с высокой активностью. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:9000 и 1:5000, соответственно.Unlike the prototype, sensitizing and detector antibodies of rabbit and guinea pig are used, respectively, highly specific to the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , since they were obtained using highly purified antigen with high activity. The rabbit and guinea pig immunoglobulins G against the foot and mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , indicated in the ELISA test system, are presented in the form of a lyophilic component, which allows the antibodies to remain in a stable state without less than 3 years with an activity of at least 1:9000 and 1:5000, respectively.
В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофилизата, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:3000, для контроля 2 - не менее 1:3000. Данная активность высокая и удобна для получения большого количества контролей в рабочем нативном состоянии.Unlike the prototype cattle blood serum, controls 1 and 2 were obtained against highly purified inactivated foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , which allows achieving high specificity and sensitivity during control operation of the test system. These components are presented in the form of a lyophilisate, which allows them to be stored for at least 3 years while maintaining high activity in ELISA. For control 1, the activity is at least 1:3000, for control 2 - at least 1:3000. This activity is high and convenient for obtaining a large number of controls in a working native state.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.Unlike the prototype, purified fetal calf serum is used to block open binding sites, the protein components of which ensure complete closure of empty areas at the bottom of the immunological plate. This component is also presented in lyophilic form, which allows it to be stored in this state for at least 3 years.
В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные абсолютные данные по оптическим плотностям и значению титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.Unlike the prototype version, the presented test system provides for control of the antigen and conjugate, which makes it possible to take into account background values and, thereby, obtain reliable absolute data on optical densities and the value of antibody titer against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:3500.Unlike the prototype, the proposed test system uses an indirect conjugate, which makes it possible to reduce the likelihood of background noise phenomena and obtain more reliable results for determining the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT -10 in animal blood serum. The activity of the conjugate is 1:3500.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.The essence of the invention is reflected in graphic images: Fig. 1 - Schematic diagram of a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of ELISA.
Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.Fig. 2 - Spectral profile of the antigen fractions of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Фиг. 3 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1-3: фракции с 50% сахарозы, 4-8: фракции с 40% сахарозы, 9-13: фракции с 30% сахарозы, 14-18: фракции с 20% сахарозы; целевой белок с молекулярным весом 25 кDa.Fig. 3 - Electropherogram for the foot-and-mouth disease virus antigen strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in 12% polyacrylamide gel. Note: 1-3: fractions with 50% sucrose, 4-8: fractions with 40% sucrose, 9-13: fractions with 30% sucrose, 14-18: fractions with 20% sucrose; target protein with a molecular weight of 25 kDa.
Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 вируса ящура.Fig. 4 - Phylogenetic affiliation of the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 foot and mouth disease virus.
Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10. Наличие антител к вирусу ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против Ig G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг. 1.The developed test system based on a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA is based on the specific blocking of the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 by antibodies contained in the test serum sample in the liquid phase. The “test serum/antigen” mixture is transferred into the wells of a plate previously immobilized with sensitizing rabbit antibodies against the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . The presence of antibodies to the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in the test sample will be expressed in the formation of an immune complex and a decrease in the amount of free antigen that is bound by sensitizing antibodies. The antigen fixed in the wells interacts with guinea pig detector antibodies, which are detected by reaction with an immunoperoxidase conjugate against guinea pig Ig G and subsequent staining with the chromogenic substrate ABTS. The intensity of staining is inversely proportional to the concentration of specific antibodies in the test sample. The intensity of the color reaction is taken into account using a spectrophotometer-reader. A schematic diagram of a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA is shown in Fig. 1.
Проводят подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, конъюгат, положительные и отрицательный контроли, фетальную сыворотку крови телят) восстанавливают до необходимого объема дистиллированной водой.The lyophilized components of the test system are prepared. Before starting work, lyophilized preparations (antigen of foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , conjugate, positive and negative controls, fetal blood serum of calves) are restored to the required volume with distilled water.
Проводят приготовление рабочих растворов.Working solutions are prepared.
Раствор №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор - КББ). Готовят по стандартной методике 100 мл КББ раствора (рН 9,5-9,7) для сенсибилизации планшетов.Solution No. 1 (carbonate-bicarbonate buffer solution - CBB). Prepare 100 ml of CBB solution (pH 9.5-9.7) according to standard methods to sensitize the plates.
Раствор №2 (промывочный раствор). Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,05% твин-20 (рН 7,4-7,6).Solution No. 2 (washing solution). The solution is used to prepare a working solution for interstage washing of plates and preparing samples for research, as well as as a basis for preparing a working buffer solution for diluting detector antibodies and immunoperoxidase conjugate. Prepare 2 liters of standard TBS buffer solution with the addition of 0.05% Tween-20 (pH 7.4-7.6).
Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.Для этого к 36 см3 раствора №2 следует добавить 4,0 см3 фетальной сыворотки телят, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см3 дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.Solution No. 3 (buffer for the recovery of antibodies and conjugate). The working buffer solution for diluting detector antibodies and immunoperoxidase conjugate (pH 7.4-7.6) is prepared from solution No. 2 with the addition of 10% fetal calf serum. To do this, 4.0 cm 3 of fetal serum should be added to 36 cm 3 of solution No. 2 calf serum, reconstituted from a lyophilized preparation by adding 4.0 cm 3 of distilled water to the contents of the bottle with serum. Prepared immediately before use.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 представлены ниже.The stages of conducting a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA to determine the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 are presented below.
1. Сенсибилизация планшетов. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител готовят в разведении 1:9000 в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл суспензии сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.1. Sensitization of tablets. A reconstituted suspension of sensitizing antibodies is prepared at a dilution of 1:9000 in solution No. 1 (carbonate-bicarbonate buffer solution). 100 μl of a suspension of sensitizing antibodies is added to all wells of an immunological polystyrene 96-well ELISA plate, covered with a lid and incubated for 18-20 hours at a temperature of (2-8) ° C.
2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Washer любой марки, либо вручную раствором №2. Процедуру повторяют два раза.2. Washing the wells of the plate is carried out using Washer of any brand, or manually with solution No. 2. The procedure is repeated twice.
3. Серологическая реакция в жидкой фазе. Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят иммунную реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5 log2 SN50 (1:16-1:1448) в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок HI-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см3 (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см3 (3 мкл) пробы. В лунки HI-6 вносят по 0,05 см3 (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.3. Serological reaction in the liquid phase. In parallel with sensitization of the tablet, an immune reaction of antigen binding with test and control blood serum samples is carried out. The following dilutions of animal blood serum are prepared: 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0; 9.5; 10.0; 10.5 log 2 SN 50 (1:16-1:1448) in solution No. 2. To do this, 0.047 cm 3 (47 μl) of a buffer solution and 0.003 cm 3 (3 μl) of a sample are added to all wells of the polymer plate, with the exception of wells HI-6, which are left for antigen control (CA) and conjugate control (CC). 0.05 cm 3 (50 μl) of buffer solution is added to the wells of HI-6. Test and control samples are placed on the plate according to Table 1.
В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 - процент ингибиции 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 - процент ингибиции 50-74%, контроля 3 - нормальную сыворотку свиней - процент ингибиции меньше 50%.As control 1, positive pig blood serum is used against the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 - the percentage of inhibition is 75-100%, control 2 - positive pig blood serum against the virus foot and mouth disease strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 - percentage of inhibition 50-74%, control 3 - normal pig serum - percentage of inhibition less than 50%.
Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см3 рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.Add 0.05 cm 3 of the working dilution of the antigen in solution No. 2 to all wells of the plate in accordance with the dilution. After mixing the contents of the wells of the plate using a shaker or lightly shaking by hand, the plate is closed with a lid and incubated for 18-20 hours at a temperature of (2-8) ° C.
4. Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см3 смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.4. Antigen capture. 0.05 cm 3 of a mixture of control and test samples and antigen is added to the washed wells of the sensitized plate, the plate is closed with a lid and incubated for 60±5 minutes at a temperature of (37±1)°C.
5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.5. Washing the wells of the plate. Carry out as described above (item 2). The procedure is repeated 4 times.
6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см3 раствора №3, вносят по 0,05 см3 рабочего разведения детекторных антител (1:5000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.6. Addition of detector antibodies. In all wells of the plate, with the exception of wells with QC (conjugate control), where 0.05 cm 3 of solution No. 3 is added, 0.05 cm 3 of the working dilution of detector antibodies (1:5000) in solution No. 3 is added. The plate is covered with a lid and incubated for 60±5 minutes at a temperature of (37±1)°C.
7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.7. Washing the wells of the plate. Carry out as described above (item 2). The procedure is repeated 4 times.
8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 рабочего разведения конъюгата (1:3500) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.8. Addition of the conjugate. Add 0.05 cm 3 of the working dilution of the conjugate (1:3500) in solution No. 3 to all wells of the plate. The plate is covered with a lid and incubated for 60±5 minutes at a temperature of (37±1)°C.
9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.9. Washing the wells of the plate. Carry out as described above (item 2). The procedure is repeated 4 times.
10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-23)°С.10. Manifestation of color reaction. Add 0.05 cm 3 of ABTS chromogenic substrate to all wells of the plate, cover with a lid and incubate for 15-20 minutes at a temperature of (18-23)°C.
11. Остановка реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см3 0,5% раствора додецилсульфата натрия.11. Stopping the reaction. The reaction is stopped by adding 0.05 cm 3 of 0.5% sodium dodecyl sulfate solution to each well of the plate.
12. Учет результатов ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (D) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 410 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения D контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (ПИ, %) по формуле:12. Accounting for ELISA results. The results of the analysis are taken into account in an instrumental way. Immediately after stopping the reaction, measure the optical density (D) of the reaction products in each well at a wavelength of 410 nm using a microplate reader with a vertical light beam. The D values of control and test samples are converted into the percentage of inhibition (PI, %) using the formula:
ПИ (%) = (1-(OD415 сыворотки - OD415 КК)/(OD415 КА - OD415 КК)) × 100%,PI (%) = (1-(OD 415 serum - OD 415 CC )/(OD 415 KA - OD 415 CC )) × 100%,
где, OD415 сыворотки - среднее значение оптической плотности при длине волны 415 нм для смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10;where, serum OD 415 is the average optical density at a wavelength of 415 nm for a mixture of serum with inactivated foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 ;
OD415 КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена при длине волны 415 нм;OD 415 KA - average optical density of antigen control at a wavelength of 415 nm;
OD415 КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата при длине волны 415 нм.OD 415 CC - the average optical density of the control conjugate at a wavelength of 415 nm.
Результаты реакции достоверны в том случае, если данные удовлетворяют следующим критериям:The reaction results are reliable if the data meets the following criteria:
- разница между значениями OD415 КА и OD415 КК не менее 0,38 оптических единиц (о.е.);- the difference between the values of OD 415 KA and OD 415 KK is not less than 0.38 optical units (p.u.);
- контроль 1 имеет значение PI>75%;- control 1 has a PI value>75%;
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-74%;- control 2 has a PI value in the range of 50-74%;
- контроль 3 имеет значение PI<50%.- control 3 has a value of PI<50%.
Пробы, демонстрирующие значение Р1>50%, считают положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.Samples demonstrating a P1 value>50% are considered positive, and the animals from which these blood serum samples were obtained are immune to foot and mouth disease caused by the virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . The PI value <50% in the blood serum of the examined animals is negative, which indicates the absence of specific antibodies to foot and mouth disease caused by the virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . Based on the data obtained, take the last serum dilution for which the percentage of inhibition is ≥50%. This dilution is considered the titer of antibodies against foot and mouth disease caused by the virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Активность детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:5000, антивидового конъюгата - 1:3500; сенсибилизирующих антител - 1:9000, антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 - 1:4000, контроля 1 - 1:3000, контроля 2 - 1:3000, контроля 3 - 1:3000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].As a result of the experiments, the reaction conditions were optimized. The activity of detector antibodies, determined in the indirect version of ELISA, was 1:5000, of the anti-species conjugate - 1:3500; sensitizing antibodies - 1:9000, foot and mouth disease virus antigen strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 - 1:4000, control 1 - 1:3000, control 2 - 1:3000, control 3 - 1:3000. Using the developed test system, a study of animal blood serum samples was carried out to determine the antibody titer and a comparative analysis was carried out with the results of the neutralization reaction in a sensitive continuous monolayer pig kidney cell line (IB-RS-2) [2].
Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5 log2 SN50 (1:16-1:1448). Срок годности предлагаемой тест-системы составляет не менее 24 месяцев со дня изготовления при температуре хранения (4-8)°С.The developed version of the ELISA allows you to test simultaneously in a 96-well plate format 6 serum samples in the following dilutions, expressed in binary logarithm: 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0: 9.5; 10.0; 10.5 log 2 SN 50 (1:16-1:1448). The shelf life of the proposed test system is at least 24 months from the date of manufacture at storage temperature (4-8)°C.
В качестве рабочего применяли инактивированный вирус ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.The worker used was the inactivated foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Контроль штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 вируса ящура на специфичность. Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 вируса ящура, был выделен от теленка с территории Исламской Республики Пакистан. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP1, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности (фиг. 4) указанного гена была выявлена принадлежность штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипу О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 составила 3,42 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,43 мкг/мл, 146+75S компонента - 3,27 мкг/мл.Monitoring the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 foot-and-mouth disease virus for specificity. The viral isolate that served as the source for obtaining the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 foot-and-mouth disease virus was isolated from a calf from the territory of the Islamic Republic of Pakistan. Specificity was determined using RT-PCR followed by sequencing of the 1D gene corresponding to the VP1 protein, which is responsible for the variability of the foot-and-mouth disease virus. Based on the results of a study of the nucleotide sequence (Fig. 4) of this gene, it was revealed that the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” belongs to the genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . The calculation was carried out in accordance with Bayesian probability theory. Specificity was also confirmed in the complement fixation reaction with strain-specific serum. The concentration of the total viral protein in the studied antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 was 3.42 μg/ml, the concentration of the 146S component was 2.43 μg/ml, 146 +75S component - 3.27 µg/ml.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.The possibility of using the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” of genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 of foot-and-mouth disease virus to control antigenic and immunogenic activity, as well as for the production of biological products for the diagnosis and specific prevention of foot-and-mouth disease genotype O/ME- has been experimentally confirmed. SA/PanAsia2 ANT-10 .
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Получение инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.Example 1. Preparation of inactivated foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Для получения инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 10-12 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.To obtain inactivated foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 for diagnostic purposes, suspension cultivation of the virus was carried out in the BHK-21 cell line for 10-12 hours to obtain a viral suspension with titer of infectious activity not lower than 7.00 lg TCD 50 / cm 3 . The resulting viral suspension was inactivated with aminoethylethylenimine and clarified with polyhexamethylene guanidine.
Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорида натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре (4±2)°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 300 раз (1/300 от первоначального объема).The inactivated cultural suspension containing the foot-and-mouth disease virus antigen was clarified for 30 minutes. at 6000 rpm and 4°C on a Bekman J2-21 centrifuge (Beckman Coulter, USA) or equivalent. The supernatant liquid was taken and polyethylene glycol with a molecular weight of 6000 D (PEG-6000) was added to it to a final concentration of 8% and sodium chloride (dry) to a final concentration of 0.85%, mixed intensively and kept at a temperature of (4±2)°C within 18-24 hours. The viral suspension was precipitated at 6000 rpm for 60 minutes, the sediment was dissolved in 1/15 M phosphate-buffered saline, concentrating 300 times (1/300 of the original volume).
К полученному преципитату добавляли 50% трихлорметана, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.50% trichloromethane was added to the resulting precipitate, mixed vigorously and fractionated using a centrifuge for 30 minutes. at 3000 rpm. The upper aqueous fraction containing the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 was selected. 100 μl of sample was taken for subsequent electrophoretic analysis in a 12% polyacrylamide gel.
На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).At the next stage, the 146S component of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 was obtained (this component is immunogenic and the most important in the immunization of animals, since it represents complete virions).
Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали нонилфеноксиполиэтоксилэтанолом в концентрации 1,5%.Before placing in a sucrose gradient, the foot-and-mouth disease virus antigen was treated with nonylphenoxypolyethoxylethanol at a concentration of 1.5%.
Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью ноноксинона-40 антиген вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 наливали по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 30000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.To isolate the 146S component, a linear gradient of sucrose was prepared with concentrations of 10, 20, 30, 40, 50%. The foot-and-mouth disease virus antigen of strain “O No. 2356/Pakistan/2018” of genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10, treated with nonoxynon-40, was poured into 15 ml centrifuge tubes, then sucrose solutions were successively layered, starting with 10% and ending with a 50% solution. The tubes were placed in metal centrifuge beakers and, after careful equilibration, were centrifuged at a speed of 30,000 rpm and a temperature of 4±2°C for 4 hours. Fractionation of the sucrose gradient was carried out using a peristaltic pump, collecting 1 ml fractions into separate tubes. The beginning and end of the peak of the 146S component were determined from the spectral profile, combining fractions included in this range.
При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя, все фракции 30%-го слоя и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы. Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 30000 об/мин. и температуре (4±2)°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.When using a peristaltic pump, the sucrose gradient tube was first assessed visually. The opalescent layer containing the 146S component is located in approximately 30% sucrose layer. In this case, the last upper fraction of the 50% layer, all fractions of the 30% layer and the lower fraction of the 20% sucrose layer were collected. The total volume is approximately 7.0 ml. The 146S component was then reprecipitated by ultracentrifugation for 4 hours at 30,000 rpm. and temperature (4±2)°C and resuspended the sediment in 1/15 M phosphate-buffered saline solution.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-12 фракции с максимальными значениями для 8-10 пиков. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для 18 фракций, в которых возможно нахождение 146S компонента вируса ящура данного штамма (фиг. 3). На фиг. 3 отражено, что слоты №№1-3 - это фракции с 50% сахарозы, №№4-8 - фракции с 40% сахарозы, №№9-13 - фракции с 30% сахарозы, №№14-18 - фракции с 20% сахарозы.The results of a spectrometric study of the obtained antigen fractions of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in the form of an antigenic profile are presented in Fig. 2. The analysis was carried out for all fractions; high optical density values were observed for fractions 5-12 with maximum values for 8-10 peaks. Electrophoresis of the obtained fractions was carried out in a 12% polyacrylamide gel under denaturing conditions for 18 fractions in which the 146S component of the foot-and-mouth disease virus of this strain could be found (Fig. 3). In fig. 3 shows that slots No. 1-3 are fractions with 50% sucrose, No. 4-8 are fractions with 40% sucrose, No. 9-13 are fractions with 30% sucrose, No. 14-18 are fractions with 20% sucrose.
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10.Example 2. Obtaining hyperimmune rabbit blood serum (sensitizing antibodies) against the strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.To obtain specific blood sera against the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10, clinically healthy rabbits of average fatness weighing 2.5-3.0 kg were used.
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный вирус ящура штаммаFor hyperimmunization of animals, concentrated purified inactivated foot and mouth disease virus strain
«О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см3. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (4-8)°С.“O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , obtained as described in example 1, from which an emulsion was prepared using the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG (adjuvant/antigen ratio = 60/ 40 by weight). The resulting vaccine was injected into the muscle of the hind limbs of a rabbit on days 0, 21 and 42 in a volume of 0.5 cm 3 . 7 days after the last immunization, the rabbits were completely bled and blood serum containing sensitizing antibodies was obtained, which was freeze-dried and stored at a temperature of (4-8) ° C.
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10.Example 3. Obtaining hyperimmune blood serum of guinea pigs (detector antibodies) against foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.For hyperimmunization of guinea pigs, we used an emulsion of a purified preparation of concentrated inactivated foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , obtained as described in example 1. The preparation of the vaccine and the immunization schedule are as in example 2.
Пример 4. Определение активности антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10, сенсибилизирующих и детекторных антител.Example 4. Determination of the activity of the antigen of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , sensitizing and detector antibodies.
Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 3, 4, 5.Individual serum samples were tested for activity and specificity in a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of the ELISA. A selection of optimal working dilutions of these components was carried out to obtain reliable results in ELISA. The obtained analysis data are presented in tables 3, 4, 5.
Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для детекторных антител - 1:5000, конъюгата - 1:3500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 3 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:9000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log2 SN50). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.For analysis, the following dilutions of sensitizing antibodies were studied: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. The dilutions of the remaining components were constant: for antigen - 1:4000, for detector antibodies - 1:5000, conjugate - 1:3500. Sera specific to certain strains of foot-and-mouth disease virus with an activity of 1:256 were used as control sera for analysis. Their table 3 shows that with a dilution of sensitizing antibodies of 1:9000, a reliable result was achieved (1:256 or 8 log 2 SN 50 ). At lower dilutions of antibodies, high background values were observed, which did not allow obtaining a correct result. At higher dilutions, a decrease in the detectable value of antibody titer in animal blood sera was observed. When studying nonspecific and negative sera, negative results were noted, which indicated the high specificity of the developed method.
Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:4000, 1:4500, 1:5000, 1:5500. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:3500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 4 следует, что при разведении детекторных антител 1:5000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log2 SN50). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.For analysis, the following dilutions of detector antibodies were studied: 1:4000, 1:4500, 1:5000, 1:5500. The dilutions of the remaining components were constant: for antigen - 1:4000, for sensitizing antibodies - 1:9000, conjugate - 1:3500. Sera specific to certain strains of foot-and-mouth disease virus with an activity of 1:256 were used as control sera for analysis. Their table 4 shows that when diluting detector antibodies 1:5000, a reliable result was achieved (1:256 or 8 log 2 SN 50 ). At lower dilutions of antibodies, high background values were observed, which did not allow obtaining a correct result. At higher dilutions, a decrease in the detectable value of antibody titer in animal blood sera was observed. When studying nonspecific and negative sera, negative results were noted, which indicated the high specificity of the developed method.
Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:5000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:3500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 5 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log2 SN50). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.The following antigen dilutions were studied for analysis: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. The dilutions of the remaining components were constant: for detector antibodies - 1:5000, for sensitizing antibodies - 1:9000, conjugate - 1:3500. Sera specific to certain strains of foot-and-mouth disease virus with an activity of 1:256 were used as control sera for analysis. Their table 5 shows that when the antigen was diluted 1:4000, a reliable result was achieved (1:256 or 8 log 2 SN 50 ). At lower dilutions, high background values were observed, which did not allow obtaining a correct result. At higher dilutions, a decrease in the detectable value of antibody titer in animal blood sera was observed.
При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.When studying nonspecific and negative sera, negative results were noted, which indicated the high specificity of the developed method.
Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2ANT-10, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:4000, 1:9000, 1:5000, соответственно.Thus, in the course of laboratory studies it was proven that the working dilutions of the antigen of the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , sensitizing and detector antibodies were 1:4000, 1:9000, 1:5000, respectively.
Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10.Example 5. Use of a liquid-phase blocking indirect “sandwich” ELISA test system to determine the titer of antibodies against the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10. Определены значения титра антител с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [2]. Полученные результаты отражены в таблице 6, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РМН) высокая (приближено к 100%).We studied 12 animal blood sera obtained after immunization with inactivated sorbed vaccines against foot-and-mouth disease containing the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 . Antibody titer values were determined using the developed ELISA test system, and serum data were examined in a neutralization reaction in the sensitive continuous monolayer cell line IB-RS-2, recommended by OIE [2]. The results obtained are reflected in Table 6, from which it follows that the degree of correlation between the results of the developed ELISA test system (the proposed invention) and the classical method (RMN) is high (close to 100%).
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител в сыворотках крови животных против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10 с применением жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.Example 6. Determination of diagnostic indicators of the developed test system for determining the antibody titer in animal blood sera against the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 using a liquid-phase blocking indirect “sandwich” - ELISA variant.
Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 830 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 1:32-1:1448. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 830 образцов сывороток крови 826 определены в качестве положительных, а 4 - в качестве отрицательных (титр 1:16-1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 256 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 256 отрицательных проб - 256 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,52% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,78-99,87%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,57-100,0%), k-критерий - 0,990; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) -98,46% (в 95%-ном доверительном интервале: 96,01-99,42%), общая точность (DAc) - 99,63% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,06-99,90%) (таблица 7).To study the presented test system (the proposed invention) to determine the titer of antibodies against the foot and mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 , standard diagnostic indicators were examined. To determine the sensitivity of the proposed test system, 830 animal blood sera were analyzed, which were obviously positive according to the microneutralization reaction in the sensitive continuous monolayer pig kidney cell line IB-RS-2. The antibody titer for these blood sera was in the range of 1:32-1:1448. ELISA was performed as described above. The developed test system (the proposed invention) determined that out of 830 blood serum samples, 826 were identified as positive, and 4 as negative (titer 1:16-1:24). To study the specificity of the method, 256 negative animal blood sera were tested. As a result of the study using ELISA (the proposed invention), it was determined that out of 256 negative samples, 256 were identified as negative. Using the statistical methods of analysis presented above, we determined that the diagnostic sensitivity (DSe) was 99.52% (in the 95% confidence interval: 98.78-99.87%), the diagnostic specificity (DSp) was 100% (in 95% -nom confidence interval: 98.57-100.0%), k-criterion - 0.990; positive predictive value (PPV) - 100%, negative predictive value (NPV) -98.46% (95% confidence interval: 96.01-99.42%), overall accuracy (DAc) - 99.63% (95% confidence interval: 99.06-99.90%) (Table 7).
Таким образом предлагаемая «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в сыворотках крови животных» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4-5 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением значения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2ANT-10.Thus, the proposed “Test system based on a liquid-phase blocking indirect “sandwich” ELISA variant for determining the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in animal blood sera "is specific and sensitive, allowing you to quickly analyze animal blood serum within 4-5 hours with a quantitative determination of the antibody titer against the foot-and-mouth disease virus strain "O No. 2356/Pakistan/2018" genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 .
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2ANT-10 в сыворотках крови животных»:Sources of information taken into account when compiling a description of the invention for the application for a RF patent for the invention “Test system based on a liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of ELISA for determining the titer of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain “O No. 2356/Pakistan/2018” genotype O/ME-SA/PanAsia2 ANT-10 in animal blood sera":
1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.1. Gruzdev, K.N. Program of joint actions for the prevention and control of foot and mouth disease in animals in the CIS countries / K.N. Gruzdev, V.M. Zakharov, A.M. Rakhmanov // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2005. - T. 3. - P. 3-13.
2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
3. Гуленкин, B.M. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.3. Gulenkin, B.M. Economic efficiency of preventive vaccination of animals against foot and mouth disease on the territory of the Russian Federation / V.M. Gulenkin // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2012. - T. 10. - P. 31-41.
4. Anon Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.4. Anon Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.
5. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.5. Dynamics of development of anti-foot-and-mouth disease humoral immunity in cattle immunized with trivalent sorbed vaccine types A, O, Asia-1 / D.V. Mikhalishin, T.N. Lezova // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2007. - T. 5. - P. 75-82.
6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.K., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong N.K., But K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.
7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.
8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101.8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101.
9. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.9. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.
10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP 0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.
11. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - V. 39(1). - P. 1-6.11. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - V. 39(1). - P. 1-6.
12. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-412.12. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-412.
13. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12). - P.6572-6580.13. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12). - P.6572-6580.
14. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. -V. 137(1-2).-P. 10-17.14. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid- like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. -V. 137(1-2).-P. 10-17.
15. Hamblin C, Barnett I.Т., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. -V. 93(1).-P. 115-121.15. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. -V. 93(1).-P. 115-121.
16. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.16. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.
17. Ma L.N., Zhang J, Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.17. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.
18. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India // World J Virology. -2015.-V. 4(3).-P. 295-302.18. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B. , Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India // World J Virology. -2015.-V. 4(3).-P. 295-302.
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812210C1 true RU2812210C1 (en) | 2024-01-25 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2791614C1 (en) * | 2022-07-12 | 2023-03-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Test system based on liquid phase blocking indirect "sandwich" elisa for determination of antibody titer against fmdv strain o n2047/saudi arabia/2008 genotype o/me-sa/panasia2 in animal blood sera |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2791614C1 (en) * | 2022-07-12 | 2023-03-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Test system based on liquid phase blocking indirect "sandwich" elisa for determination of antibody titer against fmdv strain o n2047/saudi arabia/2008 genotype o/me-sa/panasia2 in animal blood sera |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MA L. et al. An overview on ELISA techniques for FMD, Virology Journal, 2018, vol.8. * |
| КАМАЛОВА Н.Е. Значение комплекса методов лабораторной диагностики в борьбе с ящуром, Ветеринарная патология, 2006, No. 4. Жильцова М. В. и др. Изучение чувствительности культур клеток и восприимчивых животных к изоляту вируса ящура типа Азия-1 No1987/Амурский, Труды Федерального центра охраны здоровья животных, 2006, том 4. ФУНТИКОВ А.А. и др. Изучение иммунобиологических свойств изолятов вируса ящура типа О, выделенных на территории Южной Кореи, Ветеринария сегодня, 2018. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mackay et al. | A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus | |
| Clavijo et al. | Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease | |
| Chénard et al. | A solid-phase blocking ELISA for detection of type O foot-and-mouth disease virus antibodies suitable for mass serology | |
| CN108107217B (en) | Classical swine fever virus truncated E2 protein and application thereof | |
| TWI611188B (en) | Improved diagnostic test for csfv antibodies | |
| CN102731615B (en) | Detection reagent and detection method for PRRSV | |
| US10408841B2 (en) | Mutated HEV polypeptides and the use thereof for assaying anti-HEV antibodies | |
| Dechamma et al. | Identification of T-helper and linear B epitope in the hypervariable region of nucleocapsid protein of PPRV and its use in the development of specific antibodies to detect viral antigen | |
| Zhang et al. | Development and evaluation of a VP3-ELISA for the detection of goose and Muscovy duck parvovirus antibodies | |
| JPH07502484A (en) | Detection of mammalian immunodeficiency virus | |
| Kamstrup et al. | Mapping the antigenic structure of porcine parvovirus at the level of peptides | |
| CN108918869B (en) | Application of fiber2 protein and recombinant protein thereof in detecting serum type 4 avian adenovirus antibody | |
| RU2812210C1 (en) | Test system based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” elisa variant for determining titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain “o-n2356/pakistan/2018” of genotype o/me-sa/panasia2 ant-10 in animal blood serum | |
| CN108982847B (en) | Indirect ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) detection method for duck reovirus causing duck spleen necrosis | |
| RU2815540C1 (en) | Test system for determining titre of antibodies against structural proteins of foot and mouth disease virus of no. 2212/primorsky/2014 strain of o/sea/mya-98 genotype in animal blood sera based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of elisa. | |
| RU2817382C1 (en) | Test system for quantitative detection of antibodies against 146s component of foot-and-mouth disease virus genotype o/ea-3 in animal blood serum based on liquid-phase enzyme immunoassay | |
| RU2791614C1 (en) | Test system based on liquid phase blocking indirect "sandwich" elisa for determination of antibody titer against fmdv strain o n2047/saudi arabia/2008 genotype o/me-sa/panasia2 in animal blood sera | |
| RU2821894C1 (en) | Test system for determining titre of antibodies against complete viral particles of fmd virus "o/kenya/2017" strain using liquid-phase "sandwich" version of elisa | |
| RU2804845C1 (en) | Test system for determining the level of antibodies against the antigen of foot-and-mouth disease virus genotype a/asia/sea-97 using a liquid-phase blocking indirect “sandwich” variant of elisa | |
| RU2818811C1 (en) | Test system for determining titre of antibodies against structural proteins of foot-and-mouth disease virus of "a/tanzania/2013" strain using liquid-phase enzyme immunoassay | |
| CN115057924A (en) | Specific IgY antibody for resisting HPV virus and preparation method and application thereof | |
| RU2787714C1 (en) | Test system based on a liquid-phase blocking indirect sandwich-type variant of elisa for determining the titre of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain a n2269/arriah/2015, genotype a/asia/g-vii, in animal blood sera after immunisation | |
| RU2798510C1 (en) | Test system for quantitative determination of the level of humoral immunity of animals against the antigen of foot-and-mouth disease virus an 2205/g-iv of a/africa/g-iv genotype using liquid-phase blocking indirect elisa "sandwich" | |
| RU2796393C1 (en) | METHOD FOR RAPID QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE LEVEL OF HUMORAL IMMUNITY OF ANIMALS TO STRAIN O N2311/ZABAIKALSKY/2016 OF GENOTYPE O/ME-SA/Ind-2001 OF FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS AFTER VACCINATION USING LIQUID-PHASE "SANDWICH" ELISA | |
| RU2812211C1 (en) | Test system for determining titer of antibodies against structural proteins of asia-1 n 2356/14/2018 foot-and-mouth disease virus strain using liquid-phase blocking indirect "sandwich" version of elisa |