RU2787714C1 - Test system based on a liquid-phase blocking indirect sandwich-type variant of elisa for determining the titre of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain a n2269/arriah/2015, genotype a/asia/g-vii, in animal blood sera after immunisation - Google Patents
Test system based on a liquid-phase blocking indirect sandwich-type variant of elisa for determining the titre of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain a n2269/arriah/2015, genotype a/asia/g-vii, in animal blood sera after immunisation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787714C1 RU2787714C1 RU2022108324A RU2022108324A RU2787714C1 RU 2787714 C1 RU2787714 C1 RU 2787714C1 RU 2022108324 A RU2022108324 A RU 2022108324A RU 2022108324 A RU2022108324 A RU 2022108324A RU 2787714 C1 RU2787714 C1 RU 2787714C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- foot
- arriah
- mouth disease
- genotype
- asia
- Prior art date
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 127
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 119
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 34
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 230000000903 blocking Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 62
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 66
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims description 66
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims description 66
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 57
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 29
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 claims description 25
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 23
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 22
- 231100000202 sensitizing Toxicity 0.000 claims description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 claims description 12
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims description 12
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 12
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 10
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 8
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 7
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N ABTS Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 abstract description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 31
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 18
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 14
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 13
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 9
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 9
- 239000000727 fraction Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 7
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 5
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100011736 H1-6 Human genes 0.000 description 4
- 101710007248 H1-6 Proteins 0.000 description 4
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 4
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 4
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 3
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic Effects 0.000 description 3
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 3
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Arginine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 2
- BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Histidine Chemical compound NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N Copalyl diphosphate Natural products [P@@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC[C@H]1C(=C)CC[C@H]2C(C)(C)CCC[C@@]12C)/C)O JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N O-Phenylenediamine Chemical group NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 2
- WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N Thr-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000521 hyperimmunizing Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- -1 possibly Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N (2S)-1-[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SBASXUCJHJRPEV-UHFFFAOYSA-N 2-(2-Methoxyethoxy)ethanol Chemical compound COCCOCCO SBASXUCJHJRPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 208000002399 Aphthous Stomatitis Diseases 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700027702 CYSD1 Proteins 0.000 description 1
- 101700028762 CYSD2 Proteins 0.000 description 1
- 241001250090 Capra ibex Species 0.000 description 1
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 1
- 102000004040 Capsid Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N Cys-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100014722 ERVS71-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000000279 Emilia sonchifolia Species 0.000 description 1
- 235000002139 Emilia sonchifolia Nutrition 0.000 description 1
- 210000002683 Foot Anatomy 0.000 description 1
- 241000710202 Foot-and-mouth disease virus - type A Species 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Aspartate Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Histidine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Arginine Chemical compound NC(=N)NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRPDZHJNLYNFFT-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 WRPDZHJNLYNFFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101800000268 Leader protease Proteins 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 210000003141 Lower Extremity Anatomy 0.000 description 1
- OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N Lys-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N Met-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O MUMXFARPYQTTSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 Mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000002445 Nipples Anatomy 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010012057 RNA Replicase Proteins 0.000 description 1
- 102100010794 SLC26A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710028993 ST3GAL4 Proteins 0.000 description 1
- 102100015668 ST3GAL4 Human genes 0.000 description 1
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010077037 tyrosyl-tyrosyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации.The invention relates to the field of veterinary virology and biotechnology, in particular, the creation of a test system for a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in sera animal blood after immunization.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией. Основными клиническими признаками заболевания являются лихорадка, хромота, афты во рту, ступнях и сосках. Молодые животные имеют более высокую смертность из-за миокардита по сравнению со взрослыми особями. Ящур был полностью ликвидирован в Северной Америке и Европе, но продолжает существовать в некоторых частях Южной Америки, Африки, Ближнего Востока и Азии [1, 2].Foot and mouth disease is a highly contagious viral disease of artiodactyl animals, which is characterized by a high incidence, which entails restrictions on the international trade in livestock and its products. The main clinical signs of the disease are fever, lameness, aphthae in the mouth, feet and nipples. Young animals have a higher mortality due to myocarditis compared to adults. FMD has been completely eradicated from North America and Europe, but continues to exist in parts of South America, Africa, the Middle East and Asia [1, 2].
Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. Геном кодирует 4 структурных белка VP1, VP2, VP3, VP4. Петля G-H белка VP1 была идентифицирована как основной антигенный сайт. РНК вируса ящура также несет в себе информацию о 8 неструктурных белках (Lpro, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3Cpro и 3D-РНК-зависимая РНК-полимераза). Вирус ящура имеет очень высокую частоту мутаций из-за отсутствия механизма репарации вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Антигенные варианты вызваны различными аминокислотными мутациями, приводящими к трудностям в борьбе с ящуром [1, 2].FMDV is a representative of the genus Aphthovirus of the family Picornaviridae and has 7 different serotypes: O, A, Asia-1, C and SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. The genome encodes 4 structural proteins VP 1 , VP 2 , VP 3 , VP 4 . The GH loop of the VP 1 protein has been identified as the main antigenic site. The foot-and-mouth disease virus RNA also carries information about 8 non-structural proteins (Lpro, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro and 3D-RNA-dependent RNA polymerase). FMDV has a very high mutation rate due to the lack of a repair mechanism for the viral RNA-dependent RNA polymerase. Antigenic variants are caused by various amino acid mutations that lead to difficulties in the fight against FMD [1, 2].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [3, 4]. Внутритипическая рекомбинация происходит часто и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [6].In RNA viruses, genome variation is favored by high mutation rates during virus replication, and emerging lineages and sublines are driven by mutation and recombination. Recombination is another important process that determines the biology and evolution of viruses. It is the exchange of genetic material between two non-segmented RNA genomes. It has been shown that genetic recombination occurs between viruses of the same serotype [3, 4]. Intratypic recombination occurs frequently and recombination events in FMD appear to occur more readily in the 3' portion of the genome than in regions encoding structural viral proteins. Mutations resulting from recombination lead to the exchange of genetic material and the formation of new antigenic variants, which can avoid immune pressure and lead to changes in cell tropism and host range [2, 5, 6]. One or more amino acid substitutions on the surface of viral particles can lead to altered receptor recognition and utilization. As a result, the same virus will acquire the ability to penetrate cells using alternative receptors [6].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев [6, 7]. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6].Antigenic variations arise from amino acid mutations that alter the recognition of viral proteins by the body's immune system. The superficially open structures of the virus are particularly susceptible to immune attack. The process of emergence of new antigenic forms is determined by the complex interaction of viral factors and host cells [6, 7]. Mutations in the genes encoding capsid proteins can lead to antigenic changes and the emergence of new genetic lines [6].
Белок VP1 является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP1 в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [8, 9, 10]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательности, хотя VP1 значительно более вариабелен [9].The VP 1 protein is the most variable, since it accounts for about 90% of mutations in all structural genes. The most variable regions are regions 40–60, 130–160, and 190–213 a.a. [7]. The site of the surface protein VP 1 in the region of 130-160 a.a. is characterized by high variability, since it is involved in the process of binding to host cell receptors [8, 9, 10]. The variability of this region allows FMDV to interact with receptors on different cell types and facilitates the transition from one host species to another. FMD virus serotypes are on average 86% identical in sequence, although VP1 is much more variable [9].
В 2015 г. широкое распространение на территории Саудовской Аравии, Ирана, Турции получил вирус ящура, который принадлежит к генотипу A/ASIA/G-VII. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17 и получен штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII) [11].In 2015, the FMD virus, which belongs to the A/ASIA/G-VII genotype, became widespread in Saudi Arabia, Iran, and Turkey. At FGBI "ARRIAH", this isolate was adapted to various sensitive cell lines, including the monolayer and suspension transplantable cell line of the kidney of a newborn Syrian hamster VNK-21/2-17, and strain A No. 2269/ARRIAH/2015 (genotype A /ASIA/G-VII) [11].
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. Для изготовления вакцин используются инактивированные вирусные штаммы ящура. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма [12].Immunization is an effective tool in the fight against disease. For the manufacture of vaccines, inactivated viral strains of foot-and-mouth disease are used. In connection with the appearance of a representative of a new genotype of the FMD virus and the need to protect animals from it, the FGBI “ARRIAH” developed a vaccine, which includes the antigen of the FMD virus of this strain [12].
Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.There was a need to create highly specific and highly sensitive diagnostic test systems that would allow the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII.
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных. Имеются сведения, что IgM, специфичные к вирусу ящура, могут быть обнаружены на 2-4 сутки после вакцинации [13, 14, 15, 16]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным, специфичным и надежным методом, однако проведение исследования имеет ряд ограничений, в частности, большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличие СО2-инкубатора, а также предполагает использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы патогенности. При этом ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде СО2 [17, 18]. Исходя из этого метод ИФА целесообразно применять для определения титра антител у вакцинированных животных.Protection against FMD after vaccination is determined by the level of specific antibodies in the blood serum of animals. There is evidence that FMDV-specific IgM can be detected 2-4 days after vaccination [13, 14, 15, 16]. The level of humoral immunity of the vaccinated livestock is determined by detecting antibodies specific to the capsid or structural proteins of the foot-and-mouth disease virus. In accordance with the recommendations of the OIE (OIE) [2], neutralization reaction and enzyme immunoassay (ELISA) are used to determine the immune status of animals. The neutralization reaction is considered a sensitive, specific and reliable method, however, the study has a number of limitations, in particular, the long reaction time (at least 3 days), the high cost of the procedure associated with the use of a sensitive cell line, the presence of a CO 2 incubator, and also involves the use of non-inactivated foot-and-mouth disease virus, which is a biological agent of pathogenicity group II. At the same time, ELISAs have many advantages, including rapidity, high specificity and sensitivity, suitability for large-scale screening of field samples, and no requirements for special laboratory conditions, such as cell culture or CO2 medium [17, 18]. Based on this, the ELISA method should be used to determine the antibody titer in vaccinated animals.
В настоящее время выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител в следствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.Currently, there are direct and indirect variants of ELISA. The advantages of the direct ELISA variant are the speed of analysis, since only one IgG variant is used and cross-reactivity of secondary antibodies is eliminated. At the same time, there are some disadvantages, namely, a decrease in the immune activity of primary antibodies due to the negative influence of enzymes or labels, the lack of flexibility in choosing a primary antibody label depending on the task of the study, as well as minimal signal enhancement.
Существует непрямой вариант ИФА, который имеет заметные преимущества по сравнению с прямым. К достоинствам этого варианта метода относится следующее: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной активности со вторичным антителом, что может привести к появлению неспецифического сигнала, а также наличие дополнительного этапа реакции [4, 17, 19].There is an indirect variant of ELISA, which has significant advantages over the direct one. The advantages of this variant of the method include the following: 1) the presence of a wide variety of labeled secondary antibodies, 2) universality (many primary antibodies can be obtained from the same species, and the same labeled secondary antibody can be used for detection), 3) maximum immune the activity of the primary antibody is preserved because it is not labeled, 4) increased sensitivity, since each primary antibody contains several epitopes that can be associated with a labeled secondary antibody, which allows to enhance the detected signal. The limitations of the method include the possibility of cross activity with a secondary antibody, which can lead to the appearance of a nonspecific signal, as well as the presence of an additional reaction step [4, 17, 19].
Широко применяют «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Данный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность; 2) подходит для неочищенных образцов; 3) высокая чувствительность реакции.Widely used "sandwich"-ELISA, which usually requires the use of pairs of matched antibodies, where each antibody is specific for a different, non-overlapping epitope of the antigen. The first antibodies are called sensitizing and are designed to capture the antigen. The second antibodies - detector, are necessary for the detection of the antigen. This ELISA variant has the following advantages: 1) high specificity; 2) suitable for untreated samples; 3) high reaction sensitivity.
ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.ELISA is also divided into solid-phase and liquid-phase variants. Currently, the solid phase variant is widely used due to ease of use and speed of analysis. In the first reaction step for the solid phase variant, the antibodies are adsorbed onto the solid phase. In this case, the reagents not bound to the solid phase are easily removed by washing. The test sample is incubated in the sensitized wells. In this case, immune complexes are formed on the surface of the solid phase. Unbound components are removed by washing. When the conjugate is added and bound to the immobilized immune complex, the active site of the enzyme remains available for subsequent interaction with the substrate. Incubation of the substrate in wells with immobilized conjugate leads to the development of a color reaction. This reaction can be stopped at the desired stage, the severity of staining can be assessed visually or by optical density.
Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА имеет ряд преимуществ, а именно наиболее приближен к реакции нейтрализации, поскольку частицы антигена не прикреплены к субстрату, эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для применяемых специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; обладает высокой специфичностью и чувствительностью, общей диагностической точностью.The liquid-phase blocking indirect ELISA has a number of advantages, namely, it is closest to the neutralization reaction, since the antigen particles are not attached to the substrate, the antigen epitopes are most accessible in space for the specific antibodies used, and this makes it possible to obtain the most approximate results to the neutralization reaction in the cell line; has high specificity and sensitivity, overall diagnostic accuracy.
При анализе литературных данных обнаружено, что Basagoudanavar S.H., Hosamani М., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. (2013) предложили жидкофазный вариант ИФА для выявления антител против вируса ящура типа А. Данная тест-система позволяла проводить серодиагностику и серомониторинг стада сельскохозяйственных животных. Коэффициент корреляции с результатами реакции нейтрализации составлял до 0,89 [20]. В качестве блокирующего компонента используется дорогое сухое молоко, красителем является ортофенилендиамин (ОФД), который является сильным канцерогеном. Остановку реакции проводят с помощью разбавленной ортофосфорной кислоты.When analyzing the literature data, it was found that Basagoudanavar S.H., Hosamani M., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. (2013) proposed a liquid-phase ELISA for the detection of antibodies against FMDV type A. This test - the system allowed for serodiagnosis and seromonitoring of a herd of farm animals. The correlation coefficient with the results of the neutralization reaction was up to 0.89 [20]. Expensive dry milk is used as a blocking component, the dye is orthophenylenediamine (OPD), which is a strong carcinogen. The reaction is terminated with dilute phosphoric acid.
В последние 6 лет широко распространяется вирус ящура нового генотипа A/ASIA/G-VII. Референтная последовательность нуклеотидов и аминокислот для данной генотипа представлена в GenBank [21]. Полученная авторами тест-система ИФА универсальна, но она не позволяет с высокой чувствительностью выявлять антитела, которые сформировались против вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII. Иными словами, требуется создать такую тест-систему ИФА, которая позволит выявлять антитела против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с корреляцией относительно реакции нейтрализации на 99% и более.In the last 6 years, the foot-and-mouth disease virus of the new genotype A/ASIA/G-VII has been widely distributed. The reference sequence of nucleotides and amino acids for this genotype is presented in GenBank [21]. The ELISA test system obtained by the authors is universal, but it does not allow high sensitivity to detect antibodies that have been formed against FMDV genotype A/ASIA/G-VII. In other words, it is required to create such an ELISA test system that will allow the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 with a correlation relative to the neutralization reaction of 99% or more.
Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Mohapatra J.K., Pattnaik В. в 2015 г. предложили тест-систему жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 [22]. Данная методика позволяет идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа A/ASIA/G-VII невысокая, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов не представляется возможным. Коэффициент корреляции с данными реакции нейтрализации не более 85-90%. Следует заметить, что в данной тест-системе применяется в качестве блокирующего компонента неиммунная сыворотка лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Для создания данной тест-системы применяют моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности A/ASIA/G-VII. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном. Для остановки реакции применяли рабочий раствор серной кислоты, который готовили из концентрата опасного соединения.Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Mohapatra J.K., Pattnaik V. in 2015 proposed a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA test system for the detection of antibodies against FMDV types A, O, Asia -1 [22]. This technique makes it possible to identify a wide range of FMD antibodies, but the specificity for FMDV genotype A/ASIA/G-VII is low, and, therefore, accurate detection of immunoglobulins is not possible. The correlation coefficient with the data of the neutralization reaction is not more than 85-90%. It should be noted that this test system uses non-immune horse serum as a blocking component, which contains various protein compounds, including, possibly, homologous regions of amino acid sequences relative to antigenic determinants. To create this test system, monoclonal antibodies are used, the use of which increases the range of detection of various genetic lines of FMDV within one serotype, but at the same time, the specificity for the detection of antibodies against isolates/strains of a particular genotype, in particular A/ASIA/G-VII, is significantly reduced. . Tetramethylbenzidine (TMB), which is an aggressive carcinogen, was used as a dye. To stop the reaction, a working solution of sulfuric acid was used, which was prepared from a concentrate of a hazardous compound.
Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве набора для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя диагностикумов. В свою очередь на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа А - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).The above test systems are not presented on the market as a kit for the detection of FMD antibodies in animal blood sera and remain as diagnosticums inaccessible to the general consumer. In turn, the world market currently has European kits for the detection of antibodies against FMDV type A - IZSLER (Italy) and PrioCHECK (Netherlands).
Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. Комплектующие набора IZSLER (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) следующие:The test system in the IZSLER kit is intended for the detection of FMD antibodies using a solid-phase direct "sandwich" ELISA. The components of the IZSLER kit (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) are as follows:
1. Герметичные микропланшеты, сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура типа А.1. Sealed microplates sensitized with inactivated FMDV type A.
2. Конъюгат (моноклональные антитела против вируса ящура типа А, конъюгированные с пероксидазой).2. Conjugate (monoclonal antibodies against FMDV type A conjugated with peroxidase).
3. Положительный контроль сыворотки против вируса ящура типа А.3. Serum positive control against foot-and-mouth disease type A.
4. Отрицательный контроль.4. Negative control.
5. Буферный раствор для ИФА - фосфатно-солевой буфер с твином-20 (ФСБ-Tween).5. Buffer solution for ELISA - phosphate-saline buffer with tween-20 (FSB-Tween).
6. Буфер для разведения сыворотки крови и конъюгата.6. Buffer for dilution of blood serum and conjugate.
7. Субстрат (раствор хромогена ТМВ - тетраметиленбензидина).7. Substrate (solution of TMB chromogen - tetramethylenebenzidine).
8. Раствор для остановки реакции (0,6N раствор серной кислоты). Представлена процедура анализа сывороток крови с помощью данного набора:8. Solution to stop the reaction (0.6N sulfuric acid solution). The procedure for the analysis of blood sera using this kit is presented:
1) Внесение отрицательного контроля. По 50 мкл отрицательного контроля вносят в 4 лунки (E11, F11, G11, H11).1) Introduction of negative control. 50 µl of the negative control is added to 4 wells (E11, F11, G11, H11).
2) Внесение буфера ФСБ-Tween. Буфер для ИФА вносят в лунки для разведения сыворотки и положительного контроля 1/10 в количестве по 67,5 мкл и по 50 мкл во все остальные лунки.2) Introduction of the FSB-Tween buffer. ELISA buffer is added to the wells for serum dilution and
3) Внесение положительного контроля и сывороток и приготовление их разведений.3) Introduction of positive control and sera and preparation of their dilutions.
4) Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 60±10 мин.4) The plate is incubated at room temperature for 60±10 min.
5) Внесение конъюгата. Во все лунки микропланшета вносят по 25 мкл готового рабочего (1х) раствора конъюгата. Планшет накрывают и инкубируют при комнатной температуре (допустим диапазон 18-30°С) в течение 60±10 мин.5) Introduction of the conjugate. Into all wells of the microplate add 25 µl of the finished working (1x) conjugate solution. The plate is covered and incubated at room temperature (assuming a range of 18-30°C) for 60±10 minutes.
6) Промывание планшета. Из лунок удалить содержимое. Во все лунки вносят по 200 мкл раствора для отмывания. Инкубируют 3 минуты при комнатной температуре. Из лунок удаляю содержимое и повторяют процедуру еще 3 раза. После последнего раунда промывки проводят инкубацию с раствором для отмывания 5 минут (всего 4 этапа промывки).6) Washing the tablet. Remove contents from wells. Add 200 µl of wash solution to all wells.
7) Внесение субстрата. Во все лунки микропланшета вносят по 50 мкл субстрата при комнатной температуре. Планшет накрывают и помещают его в темноту на 20 минут. Время начинают отсчитывать с момента внесения субстрата в первую лунку микропланшета.7) Introduction of the substrate. Into all wells of the microplate contribute 50 μl of the substrate at room temperature. The tablet is covered and placed in the dark for 20 minutes. Time begins to count from the moment the substrate is introduced into the first well of the microplate.
8) Остановка реакции. Серную кислоту (0,6 N раствор) вносят во все лунки планшета в объеме по 50 мкл. До начала считывания результатов анализа необходимо встряхнуть содержимое планшета.8) Stop the reaction. Sulfuric acid (0.6 N solution) is added to all wells of the tablet in a volume of 50 μl. Before starting to read the results of the analysis, shake the contents of the tablet.
9) Детекция результатов исследования. Сразу после остановки реакции проводят оценку оптической плотности содержимого лунок при длине волны 450 нм.9) Detection of research results. Immediately after stopping the reaction, the optical density of the contents of the wells is evaluated at a wavelength of 450 nm.
Калькуляция результатов анализа следующая:The calculation of the results of the analysis is as follows:
% ингибиции (PI)=100-(ODсыворотки/ODК-cp)×100% inhibition (PI)=100-(OD serum /OD K-cp )×100
Критерии валидации:Validation Criteria:
- Процент ингибиции в лунках с положительным контролем сыворотки (1/10) должен быть ≥90%, для разведений (1/30) - >50%.- The percentage of inhibition in wells with a positive serum control (1/10) should be ≥90%, for dilutions (1/30) - >50%.
- Спектрофотометрические показания должны быть ≥0,800 о.е. в лунках отрицательного контроля.- Spectrophotometric readings must be ≥0.800 p.u. in the negative control wells.
Интерпретация результатов следующая:The interpretation of the results is as follows:
- если процент ингибиции в лунках с разведениями 1/10 и 1/30≥80%, то сыворотки являются сильно положительными;- if the percentage of inhibition in wells with dilutions of 1/10 and 1/30≥80%, then the sera are strongly positive;
- если процент ингибиции находится в диапазоне 50-80% для разведений сыворотки 1/10 и 1/30, то сыворотки являются среднеположительными;- if the percentage of inhibition is in the range of 50-80% for serum dilutions of 1/10 and 1/30, then the sera are medium positive;
- если процент ингибиции ≤50% для сывороток с разведениями 1/10 и 1/30, то сыворотки слабо положительные.- if the percentage of inhibition is ≤50% for sera with dilutions of 1/10 and 1/30, then the sera are weakly positive.
Титр антител рассчитывают, как крайнее разведение сыворотки крови с процентом ингибиции не менее 50%. Данные представлены в инструкции производителя.The antibody titer is calculated as the extreme dilution of blood serum with a percentage of inhibition of at least 50%. The data is presented in the manufacturer's instructions.
Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены до появления нового генотипа A/ASIA/G-VII и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII ниже 50%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.The advantage of this kit is the use of monoclonal antibodies, however, they were obtained before the appearance of the new A/ASIA/G-VII genotype and cannot detect specific antibodies in animal blood sera with high reliability and accuracy. The specificity and sensitivity of the specified test system for the detection of antibodies against FMDV genotype A/ASIA/G-VII is below 50%, which is confirmed by the neutralization reaction data in the sensitive porcine kidney cell line IB-RS-2. In other words, the test system used does not allow obtaining reliable results specifically in relation to FMDV isolates and strains of the newly appeared genotype.
Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа А.The closest prototype for the test system developed by us is the PrioCHECK test system (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) for detecting antibodies to FMDV type A.
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:The accessories for the respective kit are shown below:
Компонент 1 - Планшеты иммунологические.Component 1 - Immunological plates.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.Component 2 - Conjugate (30x). The diluted conjugate is not stable, prepare immediately before use.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).Component 3 - Dilution Buffer (5x).
Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.Component 4 - Non-immune horse serum.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.Component 5 - Demineralized water.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).Component 6 - Wash Buffer (200x).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).Component 7 - Reference serum 1 (positive) (liquid).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).Component 8 - Reference serum 2 (less positive) (liquid).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).Component 9 - Reference serum 3 (even less positive) (liquid).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).Component 10 - Reference serum 4 (negative control) (liquid).
Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).Component 11 - Chromogen Substrate (TMB).
Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.Component 12 - Stop solution (1 N sulfuric acid solution). The data is reflected in the manufacturer's instructions.
Основные этапы проведения реакции ИФА для применения данной тест-системы представлены ниже. Проводят приготовление восстановленной не иммунной сыворотки лошади, рабочего буферного раствора, ИФА-буфера на основе не иммунной сыворотки лошади и буфера для разведения, разведения исследуемой сыворотки крови животного 1:5. На следующем этапе анализа проводят инкубацию планшета с исследуемыми и контрольными сыворотками крови в течение 1 ч при температуре 37±0,5°С, промывают лунки планшета с помощью промывочного буфера. Инкубируют содержимое планшета с конъюгатом, разбавленным до рабочего разведения, в течение 60 мин. Лунки планшета промывают, инкубируют с хромогеном в течение 15 мин при комнатной температуре без доступа световых лучей, останавливают реакцию стоп-раствором и проводят расчет оптических плотностей с помощью планшетного спектрофотометра-ридера при длине волны 450 нм. Вычисляют среднее значение OD450cp blank содержимого лунок А1 и В1 с положительной сывороткой. OD450cp blank должно быть <0,350. Вычисляют скорректированный OD450 для всех образцов путем вычитания (OD450 corrected=OD450 S-OD450 blank). Вычисляют среднее значение оптической плотности для содержимого лунок G1 и H1 с отрицательной сывороткой (OD450 max). Данное значение должно быть ≥1,000. Если значение OD450 max ниже 1,000, то, вероятнее всего, хромоген был очень холодным. В таком случае инкубируют еще 30 минут.The main stages of the ELISA reaction for the use of this test system are presented below. Reconstituted non-immune horse serum, working buffer solution, ELISA buffer based on non-immune horse serum and buffer for dilution, dilution of the studied animal blood serum 1:5 are carried out. At the next stage of the analysis, the plate is incubated with the test and control blood sera for 1 hour at a temperature of 37±0.5°C, the wells of the plate are washed with washing buffer. Incubate the contents of the plate with the conjugate diluted to working dilution for 60 min. The wells of the plate are washed, incubated with a chromogen for 15 min at room temperature without access to light rays, the reaction is stopped with a stop solution, and optical densities are calculated using a plate spectrophotometer reader at a wavelength of 450 nm. Calculate the average value of OD 450cp blank contents of wells A1 and B1 with positive serum. OD 450cp blank must be <0.350. Calculate the corrected OD 450 for all samples by subtraction (OD 450 corrected =OD 450 S-OD 450 blank). Calculate the average value of the optical density for the contents of the wells G1 and H1 with negative serum (OD 450 max ). This value must be ≥1,000. If the OD 450 max is below 1,000, then the chromogen was most likely very cold. In this case, incubate for another 30 minutes.
Процент ингибиции (PI) эталонных и тестовых сывороток рассчитывают в соответствии с приведенной ниже формулой:The percent inhibition (PI) of reference and test sera is calculated according to the formula below:
PI=100-(OD450 corrected/OD450 max)×100PI=100-(OD 450 corrected /OD 450 max )×100
Рассчитывают среднее значение OD450 для лунок с референтными сыворотками 2 и 3. Процент ингибиции для S2 должен быть >60%, для S3 <40%.Calculate the average value of OD 450 for wells with
Данная тест-система удобна в применении и позволяет за 4-5 ч получить результаты исследования. Диагностикум включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа А, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Разработана прототипная тест-система в конце 90-гг XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием антигенов вируса ящура различных генотипов, кроме активно циркулирующего с 2015 г. генотипа A/ASIA/G-VII. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа А. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP1, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа A/ASIA/G-VII. Исходя из этого требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа антител против вируса ящура представленного генотипа.This test system is easy to use and allows you to get the results of the study in 4-5 hours. Diagnosticum includes a conjugate, which is a labeled monoclonal antibody against foot-and-mouth disease virus serotype A, so it is type-specific, but without narrower differentiation. A prototype test system was developed at the end of the 90s of the XX century. and obtained corresponding antibodies against FMDV antigens of various genotypes, created using FMDV antigens of various genotypes, except for the A/ASIA/G-VII genotype, which has been actively circulating since 2015. The isolates and strains of this line have significant differences from other lines of serotype A. Analyzing the nucleotide and amino acid sequence of the highly variable VP1 foot-and-mouth disease virus peptide, scientists came to the conclusion that there are a sufficient number of significant substitutions to attribute the virus to a different genotype. Based on the above, the prototype test system is not highly sensitive and specific for FMDV genotype A/ASIA/G-VII. Based on this, it is required to develop a highly sensitive, specific test system for the detection and quantitative analysis of antibodies against FMDV of the presented genotype.
Кроме того, прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма хоть и является одним из вариантов серологических реакций, но при этом находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.In addition, the prototype test system is based on a solid-phase competitive “sandwich” ELISA variant, however, although this form is one of the options for serological reactions, it is further from the neutralization reaction in terms of the ability to capture antigenic sites compared to the liquid-phase blocking indirect " sandwich" ELISA variant.
Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.The prototype version assumes the presence in its composition of native control animal blood sera, which reduces the safety of the components of the test system for a long period of time and there is a risk of contamination by microorganisms.
Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.The prototype version also has some limitations in use, namely, the working solution of the conjugate is not stable and quickly collapses. As part of the set, it is presented in the form of a 30-fold concentrate. In this state, in contrast to the lyophilized component, the shelf life is markedly reduced. It should also be noted that this test system does not provide for conjugate control, which does not allow obtaining more reliable data on optical density and antibody titer against FMDV.
В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.In the prototype test system, a direct conjugate is used, which is convenient to use, however, this increases the likelihood of noise background phenomena, which can adversely affect the final results of a quantitative study of animal blood sera.
В прототипной тест-системе для проявления цветной реакции используют ТМВ, который является сильным канцерогеном, а также для остановки реакции применяют серную кислоту, рабочий раствор которой готовят с применением концентрата, негативно влияющего на слизистые органов дыхания и зрения.In the prototype test system, TMB, which is a strong carcinogen, is used to display a color reaction, and sulfuric acid is used to stop the reaction, the working solution of which is prepared using a concentrate that negatively affects the mucous membranes of the respiratory and vision organs.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения достоверного исследования гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, актуальной является разработка серологической тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител в сыворотках крови животных после иммунизации вакцинами с учетом выше приведенных недостатков.Taking into account the limitations found in the use of existing test systems, including the prototype, for conducting a reliable study of the humoral immunity of animals after inoculation with FMD vaccines containing inactivated antigen of FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, relevant is the development of a serological test system for a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant for the detection of antibodies in the blood sera of animals after immunization with vaccines, taking into account the above disadvantages.
В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках иммунизированных животных.Currently, the veterinary service of the Russian Federation does not have a modern domestic ELISA test system that would allow to determine with high reliability the titer of antibodies against FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in the sera of immunized animals.
Целью изобретения является создание тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.The aim of the invention is to create a test system based on a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты: культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированный); сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные); детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные); контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции ≥75%); контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции от 50% до 75%); контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антитела к вирусу ящура; лиофилизированную фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена. Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена (в виде капсул), концентрат (20х) буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.This goal is achieved by the fact that the proposed test system contains the following immunospecific components: cultural inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (lyophilized); sensitizing antibodies - rabbit immunoglobulins G against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (lyophilized); detector antibodies - guinea pig immunoglobulins G against foot and mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (lyophilized); control 1 - lyophilized positive blood serum of cattle to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (with a percentage of inhibition ≥75%); control 2 - lyophilized positive blood serum of cattle to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (with the percentage of inhibition from 50% to 75%); control 3 - lyophilized blood serum of cattle, not containing antibodies to foot-and-mouth disease virus; lyophilized normal fetal bovine serum to block open binding sites at the bottom of the plate wells; anti-species conjugate - rabbit immunoglobulins against guinea pig IgG, conjugated with horseradish peroxidase. The proposed test system contains non-specific components: carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5-9.6) for antigen dilution (in the form of capsules), buffer solution concentrate (20x), chromogenic substrate ABTS (2,2-azino-di- (3-ethylbenzoaminosulfonic acid), "stop" solution - 1% solution of sodium dodecyl sulfate.
Цель достигается также благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови КРС, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, добавляют детекторные антитела. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.The goal is also achieved due to the fact that the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA method is closest to the neutralization reaction in vivo, since all antigenic sites of complete virions of FMDV strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII are in a free state in the liquid phase, open to binding with specific sensitizing and detection antibodies of rabbit and guinea pig, respectively. The reaction is based on the interaction of the studied blood serum of the animal and the inactivated antigen of the foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in the liquid phase in the wells of a round bottom plate with the formation of immune complexes. In parallel with this, the wells of a flat-bottomed plate are sensitized with rabbit immunoglobulins G against foot-and-mouth disease virus of the same genotype. After that, the sensitized wells are blocked with fetal bovine serum, the resulting immune complexes are added from a round bottom plate, incubated, and detection antibodies are added. The resulting complex immune complex is detected using antibodies against guinea pig IgG conjugated with horseradish peroxidase and a chromogenic substrate.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.The technical result of the invention consists in the development of a modern, highly specific and sensitive test system designed to determine the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII by the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant , due to the use of inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII and upon receipt of specific reaction components in the liquid phase.
В состав разработанной тест-системы ИФА входят следующие иммуноспецифические компоненты:The developed ELISA test system includes the following immunospecific components:
1. культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированный) - 1 флакон (0,5 см3);1. cultural inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII (lyophilized) - 1 vial (0.5 cm 3 );
2. сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные) - 1 флакон (0,5 см3);2. sensitizing antibodies - rabbit immunoglobulins G against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII (lyophilized) - 1 bottle (0.5 cm 3 );
3. детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные) - 1 флакон (0,5 см3);3. detector antibodies - guinea pig immunoglobulins G against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII (lyophilized) - 1 bottle (0.5 cm 3 );
4. контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции ≥75%) - 1 флакон (0,2 см3);4. control 1 - lyophilized positive blood serum of cattle to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII (with a percentage of inhibition ≥75%) - 1 vial (0.2 cm 3 );
5. контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции от 50% до 75%) - 1 флакон (0,2 см3);5. control 2 - lyophilized positive blood serum of cattle to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII (with a percentage of inhibition from 50% to 75%) - 1 bottle (0.2 cm 3 );
6. контроль 3 - лиофилизированная нормальная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к вирусу ящура - 1 флакон (0,2 см3);6. control 3 - lyophilized normal blood serum of cattle, not containing antibodies to foot-and-mouth disease virus - 1 vial (0.2 cm 3 );
7. лиофилизированная фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета - 2 флакона (4,0 см3);7. freeze-dried fetal bovine serum normal to block open binding sites at the bottom of the wells of the tablet - 2 bottles (4.0 cm 3 );
8. антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.8. anti-species conjugate - lyophilized rabbit immunoglobulins against guinea pig IgG, conjugated with horseradish peroxidase.
Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:The proposed test system contains non-specific components:
9. карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена (в виде капсул);9. carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5-9.6) for antigen dilution (in the form of capsules);
10. концентрат (20х) буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота);10. buffer concentrate (20x), ABTS chromogenic substrate (2,2-azino-di-(3-ethylbenzoaminosulfonic acid);
11. «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.11. "stop" solution - 1% solution of sodium dodecyl sulfate.
В состав тест-системы также входят 4 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 1 полимерный 96-луночный круглодонный планшет для связывания антигена и антител в жидкой фазе.The test system also includes 4 immunological 96-well flat-bottom polystyrene plates for ELISA and 1 polymer 96-well round-bottom plate for antigen and antibody binding in the liquid phase.
В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, который представлен в лиофилизированном состоянии. Это позволяет детектировать именно антитела против вируса ящура указанного генотипа с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 10% выше по сравнению с прототипом. Кроме того, лиофильно высушенный компонент остается стабильным не менее 3 лет, чем антиген в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII составляет 1:3000.In contrast to the prototype, the developed test system uses a cultured inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, which is presented in a lyophilized state. This makes it possible to detect precisely antibodies against the FMDV of the specified genotype with high sensitivity (more than 99%) and specificity (100%), which is more than 10% higher compared to the prototype. In addition, the freeze-dried component remains stable for at least 3 years than the antigen in its native state, which is an advantage in using this test system. The activity of the obtained antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII is 1:3000.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены в виде лиофилизата, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:12000 и 1:3000, соответственно.In contrast to the prototype, sensitizing and detection antibodies of rabbit and guinea pig are used, respectively, highly specific for the antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, since they were obtained using a highly purified antigen. The rabbit and guinea pig immunoglobulins G indicated in the ELISA test system against foot-and-mouth disease virus strain A No. less than 1:12000 and 1:3000, respectively.
В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в лиофилизированном состоянии, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 - не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:3000.In contrast to the prototype bovine blood serum, controls 1 and 2, were obtained against a highly purified inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, which makes it possible to achieve high specificity and sensitivity when monitoring the operation of the test system . These components are presented in a lyophilized state, which allows them to be stored for at least 3 years while maintaining high activity in ELISA. For control 1 - not less than 1:4000, for control 2 - not less than 1:3000.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется фетальная сыворотка КРС, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в виде лиофилизата, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.Unlike the prototype, fetal cattle serum is used to block open binding sites, the protein components of which ensure complete closure of empty areas at the bottom of the immunological tablet. This component is also presented in the form of a lyophilisate, which allows it to be stored in this state for at least 3 years.
В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.Unlike the prototype version, the presented test system provides for the control of antigen and conjugate, which makes it possible to take into account background values and, thereby, obtain more reliable data on optical density and antibody titer against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ ASIA/G-VII.
В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2000.Unlike the prototype, the proposed test system uses an indirect conjugate, which makes it possible to reduce the likelihood of noise background phenomena and obtain more reliable results for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in blood sera animals. The activity of the conjugate is 1:2000.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:The essence of the invention is reflected in the graphics:
Фиг. 1 - Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.Fig. 1 - Schematic diagram of a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant.
Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.Fig. 2 - Spectral profile of FMDV antigen fractions, strain A No. 2269/ARRIAH/2015, genotype A/ASIA/G-VII.
Фиг. 3 - Электрофореграмма для инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в 12% полиакриамидном геле.Fig. 3 - Electrophoregram for inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in 12% polyacryamide gel.
Примечание: 1-9 - фракции №№2-10 градиента плотности сахарозы (40-30%); 10 - 146S компонент вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для ИФА (С≈1 мг/мл); 11 - 146S компонент вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для иммунизации животных (C≈0,2 мг/мл)Note: 1-9 - fractions No. 2-10 of the sucrose density gradient (40-30%); 10 - 146S component of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 for ELISA (C≈1 mg/ml); 11 - 146S component of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 for animal immunization (C≈0.2 mg/ml)
Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.Fig. 4 - Phylogenetic affiliation of strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of FMDV genotype A/ASIA/G-VII.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:The essence of the invention is explained in the sequence listing, in which:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII;SEQ ID NO: 1 represents the nucleotide sequence of the VP1 protein gene of strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of foot-and-mouth disease virus genotype A/ASIA/G-VII;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.SEQ ID NO:2 represents the amino acid sequence of the VP1 protein gene of strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of foot and mouth disease virus genotype A/ASIA/G-VII.
Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами. Наличие антител к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в исследуемой пробе будет выражаться в образовании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается иммобилизованными на планшете сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг. 1.The developed test system based on the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant is based on the specific blocking of the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII with antibodies contained in the test serum sample in the liquid phase. The test serum/antigen mixture is transferred to the wells of a plate previously immobilized with sensitizing antibodies. The presence of antibodies to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 genotype A / ASIA / G-VII in the test sample will be expressed in the formation of an immune complex and a decrease in the amount of free antigen that binds sensitizing antibodies immobilized on the plate. The antigen fixed in the wells interacts with detection antibodies, which are detected by reaction with an immunoperoxidase conjugate against guinea pig IgG and subsequent staining with the ABTS chromogenic substrate. The intensity of staining is inversely proportional to the concentration of specific antibodies in the test sample. The intensity of the color reaction is taken into account using a spectrophotometer-reader. A schematic diagram of a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant is shown in Fig. 1.
Перед началом работы набор с компонентами выдерживают 30 минут при температуре (18-25)°С.Before starting work, the set with components is kept for 30 minutes at a temperature of (18-25)°C.
Проводят подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, конъюгат, контроли, фетальную сыворотку крови КРС) восстанавливают до объема, указанного на этикетке, для чего к содержимому флаконов добавляют необходимое количество дистиллированной воды.The lyophilized components of the test system are prepared. Before starting work, lyophilized preparations (antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, conjugate, controls, fetal bovine serum) are restored to the volume indicated on the label, for which the necessary amount is added to the contents of the vials. amount of distilled water.
Проводят приготовление рабочих растворов.Conduct the preparation of working solutions.
Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный (КББ) раствор, рН 9,5-9,6, для сенсибилизации планшетов. Содержимое капсулы КББ растворяют в 100 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают.Solution No. 1. Carbonate-bicarbonate buffer (CBC) solution, pH 9.5-9.6, for sensitization of tablets. The contents of the CBB capsule are dissolved in 100 cm 3 of distilled water and mixed thoroughly.
Раствор №2. Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Для этого содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора переливают в мерную посуду, добавляют дистиллированную воду до 2000 см3 и тщательно перемешивают. Значение рН раствора №2 должно быть в пределах 7,4-7,6.
Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Для этого к 36 см3 раствора №2 следует добавить 4,0 см3 фетальной сыворотки КРС, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см3 дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.Solution No. 3. Working buffer solution for dilution of detection antibodies and immunoperoxidase conjugate (pH 7.4-7.6) is prepared from solution No. 2 with the addition of 10% fetal bovine serum. To do this, 4.0 cm 3 of fetal cattle serum, restored from a lyophilized preparation by adding 4.0 cm 3 of distilled water to the contents of the vial with serum, should be added to 36 cm 3 of solution No. 2. Prepared immediately before use.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены ниже.The stages of the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant to determine the antibody titer against FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII are presented below.
Сенсибилизация планшетовTablet Sensitization
Раствор сенсибилизирующих антител готовят в разведении, указанном на флаконе с данным компонентом, в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Например, при указанном разведении сенсибилизирующих антител 1:100 в объеме 110 мкл восстановленный концентрат добавляют в 11,0 см3 раствора №1. Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл раствора сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.A solution of sensitizing antibodies is prepared in the dilution indicated on the vial with this component in solution No. 1 (carbonate-bicarbonate buffer solution). For example, at the indicated dilution of sensitizing antibodies 1:100 in a volume of 110 μl, the reconstituted concentrate is added to 11.0 cm 3 of solution No. 1. Into all wells of the immunological polystyrene 96-well plate for ELISA add 100 μl of a solution of sensitizing antibodies, cover with a lid and incubate for 18 hours at a temperature of (2-8)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Промывание производят с использованием автоматических устройств, либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляют, затем заполняют лунки раствором №2 и сбрасывают интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяют два раза.Washing is carried out using automatic devices, or manually. At the same time, the contents of the wells of the tablet are removed, then the wells are filled with solution No. 2 and discarded by vigorous shaking. The procedure is repeated twice.
Реакция в жидкой фазеReaction in the liquid phase
Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят реакцию антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см3 (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см3 (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см3 (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.In parallel with the sensitization of the tablet, an antigen reaction is carried out with the test and control samples of blood serum. The following dilutions of animal blood sera are prepared: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 in solution No. 2. To do this, 0.047 cm 3 (47 μl) of buffer solution and 0.003 cm 3 (3 μl) of the sample are added to all wells of the polymer plate, with the exception of wells H1-6, which are left for antigen control (CA) and conjugate control (CC). In the wells H1-6 make 0.05 cm 3 (50 µl) buffer solution. The test and control samples are placed on the tablet according to table 1.
В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови КРС против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции ≥75%), контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции от 50% до 75%), контроля 3 - нормальную сыворотку КРС.As
Затем во все лунки планшета добавляют по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением, указанным на этикетке. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.Then, 0.05 cm 3 (50 µl) of the working dilution of the antigen in solution No. 2 is added to all wells of the tablet in accordance with the dilution indicated on the label. After mixing the contents of the wells of the tablet using a shaker or light shaking by hand, the tablet is covered with a lid and incubated for 18 hours at a temperature of (2-8)°C.
Улавливание антигенаAntigen capture
В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см3 (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.0.05 cm 3 (50 μl) of a mixture of control and test samples and antigen are added to the washed wells of the sensitized plate, the plate is closed with a lid and incubated for 1 hour at a temperature of (37±2)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза. Внесение детекторных антителCarried out as above. The procedure is repeated 4 times. Introduction of detection antibodies
Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК, куда добавляют по 0,05 см3 (50 мкл) раствора №3, вносят по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.In all wells of the plate, except for wells with QC, where 0.05 cm 3 (50 μl) of solution No. 3 are added, 0.05 cm 3 (50 μl) of the working dilution of detection antibodies in solution No. 3 are added in accordance with the dilution indicated on the label of the vial, the tablet is covered with a lid and incubated for 1 hour at a temperature of (37±2)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза.Carried out as above. The procedure is repeated 4 times.
Внесение конъюгатаIntroduction of the conjugate
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона с лиофилизированным конъюгатом, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.0.05 cm 3 (50 µl) of the working dilution of the conjugate in solution No. 3 is added to all wells of the tablet in accordance with the dilution indicated on the label of the vial with the lyophilized conjugate, the tablet is closed with a lid and incubated for 1 hour at a temperature of (37 ± 2 )°С.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза.Carried out as above. The procedure is repeated 4 times.
Проявление цветной реакцииThe manifestation of a color reaction
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 (50 мкл) хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-25)°С.0.05 cm 3 (50 µl) of the ABTS chromogenic substrate are added to all wells of the tablet, closed with a lid and incubated for 15-20 minutes at a temperature of (18-25)°C.
Остановка реакцииReaction stop
Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см3 (50 мкл) «стоп»-раствора.The reaction is stopped by adding to each well of the tablet 0.05 cm 3 (50 μl) "stop"-solution.
Учет результатов ИФАAccounting for ELISA results
Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI) по формуле:The results of the analysis are taken into account in an instrumental way. Immediately after stopping the reaction, measure the optical density (OD) of the reaction products in each well at a wavelength of 405 nm using a spectrophotometer-reader for microplates with a vertical beam of light. The OD values of the control and test samples are converted to the value of the percentage of inhibition (PI) according to the formula:
где, ОП пробы - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с инактивированным антигеном вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII;where, OD of the sample is the average value of the optical density of the mixture of the test or control sample with the inactivated antigen of the foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII;
ОП КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;OP KA - the average value of the optical density of the antigen control;
ОП КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.OD QC - the average value of the optical density of the conjugate control.
Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:A response is considered valid if it meets the following criteria:
- разница между значениями ОП КА и ОП КК не менее 0,4 о.е.;- the difference between the values of OP KA and OP CC is not less than 0.4 r.u.;
- контроль 1 имеет значение PI >75%;-
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-75%;-
- контроль 3 имеет значение PI <50%.-
Пробы, демонстрирующие значение PI ≥50%, считают положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Значение PI <50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотке крови обследуемых животных. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.Samples showing a PI value of ≥50% are considered positive, and the animals from which these blood serum samples are obtained are immune to foot and mouth disease caused by virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII. The PI value <50% is negative, which indicates the absence of specific antibodies to FMD caused by the A/ASIA/G-VII genotype virus in the blood serum of the examined animals. Based on the data obtained, take the last serum dilution for which the percentage of inhibition is ≥50%. This dilution is considered the titer of antibodies against foot and mouth disease caused by virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015.
В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Концентрация детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:3000, а антивидового конъюгата 1:2000; рабочее разведение сенсибилизирующих антител, определенное путем постановки жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, составило 1:12000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].As a result of the experiments, the conditions for setting up the reaction were optimized. The concentration of detection antibodies, determined in the indirect ELISA, was 1:3000, and the anti-species conjugate was 1:2000; the working dilution of sensitizing antibodies, determined by staging a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant, was 1:12000. Using the developed test system, we studied animal blood serum samples to determine the antibody titer and compared the results of the neutralization reaction in a sensitive monolayer porcine kidney cell line (IB-RS-2) [2].
Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета до 12 проб сывороток в разведениях с 1:16 до 1:1024. Срок годности предлагаемой тест-системы составляет не менее 24 месяцев со дня изготовления при температуре хранения 4-8°С.The developed version of the ELISA allows testing simultaneously in the format of a 96-well plate up to 12 serum samples in dilutions from 1:16 to 1:1024. The shelf life of the proposed test system is at least 24 months from the date of manufacture at a storage temperature of 4-8°C.
В качестве рабочего штамма применяли штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.As a working strain, strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of FMDV genotype A/ASIA/G-VII was used.
Контроль штамма А/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура на специфичность.Control of strain A/ARRIAH/2015 FMDV for specificity.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, был выделен от КРС в селе Аразап Армавирской области Республики Армения. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP1, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности (представлена в приложении) указанного гена была выявлена принадлежность штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 к генотипу A/ASIA/G-VII. Данная последовательность наиболее близка к нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank под номером AF390646.1 [21]. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом инактивированном антигене вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 составила 3,45 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,84 мкг/мл, 75S компонента - 0,51 мкг/мл, 12S - 0,10 мкг/мл.The virus isolate, which served as a source for obtaining strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 of foot-and-mouth disease virus, was isolated from cattle in the village of Arazap, Armavir region, Republic of Armenia. Specificity was determined by RT-PCR followed by sequencing of the 1D gene corresponding to the VP1 protein responsible for the variability of FMDV. According to the results of the study of the nucleotide sequence (presented in the appendix) of the indicated gene, strain A No. 2269/ARRIAH/2015 was identified as belonging to the A/ASIA/G-VII genotype. This sequence is closest to the nucleotide sequence presented in GenBank under the number AF390646.1 [21]. The calculation was carried out in accordance with the Bayesian probability theory. Specificity was also confirmed in the reaction of complement fixation with strain-specific serum. The concentration of total viral protein in the studied inactivated antigen of foot and mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 was 3.45 μg / ml, the concentration of the 146S component was 2.84 μg / ml, the 75S component was 0.51 μg / ml, 12S - 0 .10 µg/ml.
По сравнению с известными штаммами данный штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.Compared with known strains, this strain A No. 2269/ARRIAH/2015 has a higher infectious, antigenic and immunogenic activity in its native form and after inactivation.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.The possibility of using strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of the FMD virus for the control of antigenic and immunogenic activity, as well as for the manufacture of biological products for the diagnosis and specific prevention of FMD type A has been experimentally confirmed.
Морфологические признакиMorphological features
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/ASIA/G-VII и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 belongs to the family Picornaviridae, genus Aphthovirus, serotype A, genotype A/ASIA/G-VII and has morphological features characteristic of the FMD pathogen: the virion is icosahedral in shape, 23–25 nm in size. A virion consists of an RNA molecule enclosed in a protein shell. The protein shell consists of 32 capsomeres arranged in cubic symmetry.
Антигенные свойстваAntigenic properties
По своим антигенным свойствам штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к серотипу А, генотипу A/ASIA/G-VII. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации.According to its antigenic properties, strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of foot-and-mouth disease virus belongs to serotype A, genotype A/ASIA/G-VII. The virus is stably neutralized by homologous antiserum. The virus does not show hemagglutinating activity. In ill animals, antibodies are formed in the blood serum, which are detected in the enzyme immunoassay (ELISA) and neutralization tests.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:3000.During hyperimmunization of guinea pigs, the concentrated antigen from the inactivated foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 induces the formation of virus-specific antibodies detected in CSC at a dilution of 1:3000.
Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А/ВНИИЗЖ/2015 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22№550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.The degree of nucleotide differences in the sequences of strain A/ARRIAH/2015 with strains of foot-and-mouth disease virus of serological type A was: A 22 No. 550 - 21.49%, A 22 / Iraq / 64 - 21.73%, A / Iran / 96 - 22.03 %, A/Armenia/98 - 22.39%, A/Turkey/06 - 22.11%, A/Iran/05 - 22.32%.
Антигенное родство штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 антигенно отличается от производственных штаммов А22№550, А22/Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06, А №2187/Кути/13, А №2171/Кабардино-Балкарский/13.The antigenic relationship of strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of foot and mouth disease virus with the available industrial strains of foot and mouth disease virus serotype A was studied by serological method in the cross-reaction of microneutralization (RMN). Strain A No. 2269/ARRIAH/2015 antigenically differs from industrial strains A 22 No. 550, A 22 /Iraq/64, A/Iran/97, A/Turkey/06, A No. 2187/Kuti/13, A No. 2171/Kabardino -Balkarian/13.
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r1) составило для А22№550 - 0,01; А22/Ирак/64 -0,01; А/Иран/97 - 0,05; А/Турция/06 - 0,02; А №2187/Кути/13 - 0,01; А №2171/Кабардино-Балкарский/13 - 0,06. При значении r1 ≥ 0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r1 < 0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.The results of studies in the RMN are presented in table 2. Antigenic correspondence (r 1 ) amounted to A 22 No. 550 - 0.01; A 22 /Iraq/64 -0.01; A/Iran/97 - 0.05; A/Turkey/06 - 0.02; A No. 2187/Kuti/13 - 0.01; A No. 2171 / Kabardino-Balkarian / 13 - 0.06. When r 1 ≥ 0.3, the field isolate and the production strain are closely related, and the vaccine from the production strain will protect against the epizootic field virus, when r 1 < 0.3, the field isolate differs from the production strain, and the vaccine from this strain does not protect from an epizootic field virus.
Биотехнологические характеристики.Biotechnological characteristics.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 17-24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,50 до 7,75 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 17-24 часов, сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).Strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 is reproduced in transplantable monolayer cell lines of the kidney of the Siberian mountain ibex (PSGK-30), the kidney of the pig IB-RS-2, the kidney of the newborn Syrian hamster VNK-21, and within 17-24 hours of incubation of the virus in these cell cultures accumulate from 6.50 to 7.75 lg TCD 50 /cm 3 . With a high multiplicity of infection (1-10 TCD/cell) causes CPP after 17-24 hours, retains its original characteristics when passaged in cell cultures for 5 passages (observation period).
Генотаксономическая характеристика.Genotaxonomic characteristics.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Да.Strain A No. 2269/ARRIAH/2015 of FMDV type A is an RNA-containing virus with a molecular weight of 7×10 6 Da.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×106 Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP1, VP2, VP3 и VP4.Nucleic acid is represented by a single-stranded linear molecule with a molecular weight of 2.8×10 6 Da. The virion has a protein coat consisting of four structural proteins VP 1 , VP 2 , VP 3 and VP 4 .
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.The main antigenic protein is VP 1 . The virion contains approximately 31.5% RNA and 68.5% protein. Virion RNA is infectious and is involved in the formation of precursor proteins in infected cells. The precursors, in turn, are cleaved to form more stable structural and non-structural virus polypeptides. Of the 8 non-structural polypeptides that accumulate in infected cells, one (VP 66a ) is an RNA-dependent RNA polymerase involved in RNA replication of new virions.
Физические свойства.physical properties.
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Плавучая плотность вирионов в растворе сахарозы 1,45 г/см3.The mass of the virion is 8.4×10 -18 g. The floating density of the virions in the sucrose solution is 1.45 g/cm 3 .
Устойчивость к внешним факторам.Resilience to external factors.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.Strain A No. 2269/ARRIAH/2015 is resistant to ether, chloroform, freon, acetone and other organic solvents and detergents. Most stable at pH 7.4-7.8. Shifts in pH, both in the acidic and alkaline directions, lead to virus inactivation. Sensitive to formaldehyde, UV radiation, γ-irradiation, high temperatures.
Дополнительные признаки и свойства. Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.Additional signs and properties. Immunogenic activity - immunogenic as part of an inactivated vaccine.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.Antigenic activity - the introduction of an inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII to guinea pigs induces the formation of virus-specific antibodies.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.Reactogenicity - does not possess reactogenic properties.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.Pathogenicity - pathogenic for artiodactyl animals, newborn mice, guinea pigs.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.Virulence - virulent for naturally susceptible animals with contact, aerosol and parenteral infection.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).Stability - retains the original biological properties when passaged in sensitive biological systems for 5 passages (observation period).
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Получение инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.Example 1. Obtaining an inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015.
Для получения инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли благодаря полигексаметиленгуанидина.To obtain an inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 for diagnostic purposes, suspension cultivation of the virus was carried out in the VNK-21 cell line for 12-14 hours to obtain a viral suspension with an infectious activity titer of at least 6.5 lg TCD 50 / cm 3 . The resulting viral suspension was inactivated with aminoethylethyleneimine and clarified with polyhexamethyleneguanidine.
Инактивированную культуральную жидкость, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С на центрифуге типа Bekman J2-21 или Avanti J-26 ХР (Beckman Coulter, USA). Надосадочную жидкость отбирали.The inactivated culture liquid containing the FMD virus antigen was clarified for 30 min. at 6000 rpm and 4°C in a Bekman J2-21 or Avanti J-26 XP centrifuge (Beckman Coulter, USA). The supernatant was collected.
В надосадочную жидкость добавляли ПЭГ-6000 до конечной концентрации 8% и NaCl до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М растворе ФСБ, концентрируя приблизительно в 100 раз (1/100 от первоначального объема).PEG-6000 was added to the supernatant to a final concentration of 8% and NaCl to a final concentration of 0.85%, vigorously mixed and kept at a temperature of 4±2°C for 18-24 hours. The virus suspension was precipitated at 6000 rpm for 60 minutes, the precipitate was dissolved in 1/15 M PBS solution, concentrating approximately 100 times (1/100 of the original volume).
К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционируя в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015. Небольшое количество (50-100 мкл) переносили в криопробирку и замораживали при температуре - 10-20°С для последующего электрофоретического анализа в полиакриламидном геле.Chloroform (50%) was added to the resulting precipitate, vigorously stirred, and fractionated for 30 min. at 3000 rpm. The upper water fraction containing the antigen of FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 was taken. A small amount (50-100 µl) was transferred into a cryovial and frozen at -10-20°C for subsequent electrophoretic analysis in a polyacrylamide gel.
На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).At the next stage, the 146S component of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 was obtained (this component is immunogenic and the most important in animal immunization, since it is a complete virion).
Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали детергентом NP-40 в концентрации 1%.Before being placed in the sucrose gradient, the FMDV antigen was treated with NP-40 detergent at a concentration of 1%.
Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью NP-40 антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 наливали по 13-15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания откручивали при температуре 4°С в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин.To isolate the 146S component, a linear gradient of sucrose was prepared with concentrations of 10, 20, 30, 40, and 50%. The antigen of foot and mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 treated with NP-40 was poured into centrifuge tubes in 13-15 ml increments, then sucrose solutions were sequentially layered, starting with 10% and ending with 50% solution. The tubes were placed in metal centrifuge cups and, after careful balancing, were unscrewed at a temperature of 4°C for 4 hours at a speed of 25,000 rpm.
Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектрофореграмме, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.Fractionation of the sucrose gradient was performed using a peristaltic pump, taking fractions of 1 ml into separate tubes. The beginning and end of the peak of the 146S component were determined from the spectrophoregram by combining the fractions within this range.
При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Белковая полоса, содержащая 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы, и выделяется опалесценцией. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя (1,0 мл), все фракции 30%-го слоя (5,0 мл) и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы (1,0 мл). Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М растворе ФБР.When using a peristaltic pump, the sucrose gradient tube was first visually evaluated. The protein band containing the 146S component is located in approximately 30% sucrose layer and stands out as opalescence. In this case, the last upper fraction of the 50% layer (1.0 ml), all fractions of the 30% layer (5.0 ml) and the lower fraction of the 20% layer of sucrose (1.0 ml) were taken. The total volume is approximately 7.0 ml. The 146S component was then reprecipitated by ultracentrifugation for 4 hours at 25,000 rpm. and a temperature of 4°C and the pellet was resuspended in 1/15 M PBS.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 3).The results of a spectrometric study of the obtained fractions of the FMDV antigen of strain A No. 2269/ARRIAH/2015 in the form of an antigenic profile are shown in Fig. 2. Electrophoresis of the obtained fractions was carried out in 12% polyacrylamide gel under denaturing conditions (Fig. 3).
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела).Example 2. Obtaining hyperimmune rabbit blood serum (sensitizing antibodies).
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.To obtain specific blood sera against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015, clinically healthy rabbits of average fatness weighing 2.5-3.0 kg were used.
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см3. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.For hyperimmunization of animals, a concentrated purified inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015, obtained as described in example 1, was used, from which an emulsion was prepared using Montanide ISA-61 VG oil adjuvant (adjuvant/antigen ratio = 60/40 by mass). The resulting vaccine was injected into the muscle of the hind limbs of the rabbit on
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела).Example 3. Obtaining hyperimmune blood serum of guinea pigs (detector antibodies).
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.For hyperimmunization of guinea pigs, an emulsion of a purified preparation of a concentrated inactivated antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269 / ARRIAH / 2015 was used, obtained as described in example 1. The preparation of the vaccine and the immunization scheme is the same as in example 2.
Пример 4. Определение активности антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител.Example 4. Determination of the activity of the antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015, sensitizing and detection antibodies.
Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблице 3. Выявлено, что рабочее разведение антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител составило 1:3000, 1:12000, 1:3000, соответственно.Individual sera samples were tested for activity and specificity in a liquid-phase blocking indirect "sandwich" variant of the ELISA. The optimal working dilutions of these components were selected to obtain reliable results in ELISA. The obtained analysis data are presented in Table 3. It was found that the working dilution of the FMDV antigen of strain A No. 2269/ARRIAH/2015, sensitizing and detection antibodies was 1:3000, 1:12000, 1:3000, respectively.
Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.Example 5. Application of the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA test system.
Перед началом работы набор с компонентами выдерживают 30 минут при температуре (18-25)°С. Проводили подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, конъюгат, контроли, фетальную сыворотку крови КРС) восстанавливали до объема, указанного на этикетке, для чего к содержимому флаконов добавляли необходимое количество дистиллированной воды.Before starting work, the set with components is kept for 30 minutes at a temperature of (18-25)°C. The lyophilized components of the test system were prepared. Before starting work, lyophilized preparations (antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII, conjugate, controls, fetal bovine serum) were restored to the volume indicated on the label, for which the necessary amount of distilled water.
Проводили приготовление рабочих растворов.Conducted the preparation of working solutions.
Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный (КББ) раствор, рН 9,5-9,6, для сенсибилизации планшетов. Содержимое капсулы КББ растворяли в 100 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивали.Solution No. 1. Carbonate-bicarbonate buffer (CBC) solution, pH 9.5-9.6, for sensitization of tablets. The content of the CBB capsule was dissolved in 100 cm 3 of distilled water and thoroughly mixed.
Раствор №2. Раствор использовали для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же в качестве основы для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Для этого содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора переливали в мерную посуду, добавляли дистиллированную воду до 2000 см3 и тщательно перемешивали. Значение рН раствора №2 должно быть в пределах 7,4-7,6.
Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовили из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Для этого к 36 см3 раствора №2 добавили 4,0 см3 фетальной сыворотки КРС, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см3 дистиллированной воды. Готовили непосредственно перед использованием.Solution No. 3. Working buffer solution for dilution of detection antibodies and immunoperoxidase conjugate (pH 7.4-7.6) was prepared from solution No. 2 with the addition of 10% fetal bovine serum. To do this, 4.0 cm 3 of fetal cattle serum, recovered from a lyophilized preparation by adding 4.0 cm 3 of distilled water to the contents of the vial with serum, was added to 36 cm 3 of solution No. 2. Prepared immediately before use.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены ниже.The stages of the liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant to determine the antibody titer against FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII are presented below.
Сенсибилизация планшетовTablet Sensitization
Раствор сенсибилизирующих антител готовили в разведении, указанном на флаконе с данным компонентом, в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор).A solution of sensitizing antibodies was prepared in the dilution indicated on the bottle with this component in solution No. 1 (carbonate-bicarbonate buffer solution).
Например, при указанном разведении сенсибилизирующих антител 1:100 в объеме 110 мкл восстановленный концентрат добавляют в 11,0 см3 раствора №1.For example, at the indicated dilution of sensitizing antibodies 1:100 in a volume of 110 μl, the reconstituted concentrate is added to 11.0 cm 3 of solution No. 1.
Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора сенсибилизирующих антител, накрывали крышкой и инкубировали в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.Into all wells of the immunological polystyrene 96-well plate for ELISA, 100 μl of a solution of sensitizing antibodies were added, covered with a lid and incubated for 18 hours at a temperature of (2-8)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Промывание производили с использованием автоматических устройств, либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляли, затем заполняли лунки раствором №2 и сбрасывали интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяли два раза.Washing was carried out using automatic devices or manually. At the same time, the contents of the wells of the tablet were removed, then the wells were filled with solution No. 2 and discarded by vigorous shaking. The procedure was repeated twice.
Реакция в жидкой фазеReaction in the liquid phase
Параллельно с сенсибилизацией планшета проводили реакцию антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовили разведения следующих сывороток крови: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляли для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносили по 0,047 см3 (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см3 (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносили по 0,05 см3 (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагали на планшете согласно таблице 1.In parallel with the sensitization of the tablet, an antigen reaction was carried out with the test and control samples of blood serum. Dilutions of the following blood sera were prepared: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 in solution No. 2. To do this, 0.047 cm 3 (47 μl) of buffer solution and 0.003 cm 3 (3 μl) of the sample were added to all wells of the polymer plate, with the exception of wells H1-6, which were left for antigen control (CA) and conjugate control (CC). In wells H1-6 was added to 0.05 cm 3 (50 μl) of buffer solution. The test and control samples were placed on the plate according to table 1.
В качестве контроля 1 использовали положительную сыворотку крови КРС к ящура вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции ≥75%), контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС к ящуру вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции от 50% до 75%), контроля 3 - нормальную сыворотку КРС.As
Затем во все лунки планшета добавляли по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением, указанным на этикетке. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.Then, 0.05 cm 3 (50 μl) of the working dilution of the antigen in solution No. 2 was added to all wells of the tablet in accordance with the dilution indicated on the label. After mixing the contents of the wells of the tablet using a shaker or light shaking by hand, the tablet was covered with a lid and incubated for 18 hours at a temperature of (2-8)°C.
Улавливание антигенаAntigen capture
В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносили по 0,05 см3 (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.0.05 cm 3 (50 μl) of a mixture of control and test samples and antigen were added to the washed wells of the sensitized plate, the plate was closed with a lid and incubated for 1 hour at a temperature of (37±2)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводили, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.Carried out as above. The procedure was repeated 4 times.
Внесение детекторных антителIntroduction of detection antibodies
Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК, куда добавляли по 0,05 см3 (50 мкл) раствора №3, вносили по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.In all wells of the plate, with the exception of wells with QC, where 0.05 cm 3 (50 μl) of solution No. 3 were added, 0.05 cm 3 (50 μl) of the working dilution of detection antibodies in solution No. 3 were added in accordance with the dilution indicated on the vial label, the plate was capped and incubated for 1 hour at (37±2)°C.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.Carried out as above. The procedure was repeated 4 times.
Внесение конъюгатаIntroduction of the conjugate
Во все лунки планшета вносили по 0,05 см3 (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона с лиофилизированным конъюгатом, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.0.05 cm 3 (50 µl) of the working dilution of the conjugate in solution No. 3 was added to all wells of the tablet in accordance with the dilution indicated on the label of the vial with the lyophilized conjugate, the tablet was closed with a lid and incubated for 1 hour at a temperature of (37 ± 2 )°С.
Промывание лунок планшетаWashing the wells of the plate
Проводили, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.Carried out as above. The procedure was repeated 4 times.
Проявление цветной реакцииThe manifestation of a color reaction
Во все лунки планшета вносили по 0,05 см3 (50 мкл) хромогенного субстрата ABTS, закрывали крышкой и выдерживали 15-20 минут при температуре (18-25)°С.0.05 cm 3 (50 μl) of the ABTS chromogenic substrate were added to all wells of the plate, covered with a lid and incubated for 15-20 minutes at a temperature of (18-25)°C.
Остановка реакцииReaction stop
Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см3 (50 мкл) «стоп»-раствора.The reaction was stopped by adding 0.05 cm 3 (50 μl) stop solution to each well of the plate.
Учет результатов ИФАAccounting for ELISA results
Результаты анализа учитывали инструментальным способом, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Сразу после остановки реакции измеряли оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ингибиции (PI) по формуле:The results of the analysis were taken into account instrumentally using a spectrophotometer-reader for microplates with a vertical beam of light. Immediately after stopping the reaction, the optical density (OD) of the reaction products was measured in each well at a wavelength of 405 nm. The OD values of the control and test samples were converted into the percentage of inhibition (PI) using the formula:
где, ОП пробы - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с инактивированным антигеном вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII;where, OD of the sample is the average value of the optical density of the mixture of the test or control sample with the inactivated antigen of the foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII;
ОП КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;OP KA - the average value of the optical density of the antigen control;
ОП КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.OD QC - the average value of the optical density of the conjugate control.
Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:A response is considered valid if it meets the following criteria:
- разница между значениями ОП КА и ОП КК не менее 0,4 о.е.;- the difference between the values of OP KA and OP CC is not less than 0.4 r.u.;
- контроль 1 имеет значение PI >75%;-
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-75%;-
- контроль 3 имеет значение PI <50%.-
Пробы, демонстрирующие значение PI ≥50%, считали положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Значение PI <50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотке крови обследуемых животных.Samples showing a PI value of ≥50% were considered positive, and the animals from which these blood serum samples were obtained were immune to foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII. The PI value <50% is negative, which indicates the absence of specific antibodies to FMD genotype A/ASIA/G-VII in the blood serum of the examined animals.
Исследовали 12 сывороток крови КРС, полученных после иммунизации животных инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Определены значения титра антител с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [2]. Полученные результаты отражены в таблице 4, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РН) составляет 100%.We studied 12 bovine blood sera obtained after immunization of animals with inactivated adsorbed FMD vaccines containing FMDV antigen strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII. Antibody titer values were determined using the developed ELISA test system, and serum data were studied in a neutralization reaction in a sensitive monolayer cell line IB-RS-2 recommended by OIE [2]. The results obtained are shown in table 4, from which it follows that the degree of correlation between the results of the developed ELISA test system (the proposed invention) and the classical method (RN) is 100%.
Пример 6. Определение степени корреляции результатов реакции нейтрализации и ИФА с помощью разработанной тест-системы (предлагаемое изобретение) при исследовании большого количества сывороток крови животных.Example 6. Determining the degree of correlation between the results of the neutralization reaction and ELISA using the developed test system (the proposed invention) in the study of a large number of animal blood sera.
Для анализа использовали 630 сывороток крови животных содержащих антитела против 146S антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с титрами специфических антител 1:16-1:1024. Данные сыворотки исследовали в реакции нейтрализации в соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ (OIE) и в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА (предлагаемое изобретение) для определения специфических антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII).For the analysis, 630 blood sera of animals containing antibodies against the 146S antigen of foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 with specific antibody titers of 1:16-1:1024 were used. These sera were studied in a neutralization reaction in accordance with the recommendations of the OIE Guidelines (OIE) and in a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA (invention) to determine specific antibodies against FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 (genotype A/ASIA /G-VII).
Выявили, что данные (n=630), полученные с помощью разработанной тест-системы, коррелировали с данными реакции нейтрализации на 99,17% для сывороток крови животных с титром антител 1:16 (n=90), на 99,21% для сывороток крови животных с титром антител 1:32 (n=90), на 99,38% для сывороток крови животных с титром антител 1:64 (n=90), на 99,54% для сывороток крови животных с титром антител 1:128 (n=90), на 99,57% для сывороток крови животных с титром антител 1:256 (n=90), на 99,81% для сывороток крови животных с титром антител 1:512 (n=90), на 99,97% для сывороток крови животных с титром антител 1:1024 (n=90). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанной тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после вакцинации по сравнению с реакцией нейтрализации.It was found that the data (n=630) obtained using the developed test system correlated with the data of the neutralization reaction by 99.17% for the blood sera of animals with an antibody titer of 1:16 (n=90), by 99.21% for blood sera of animals with an antibody titer of 1:32 (n=90), by 99.38% for blood sera of animals with an antibody titer of 1:64 (n=90), by 99.54% for blood sera of animals with an antibody titer of 1: 128 (n=90), 99.57% for animal blood sera with antibody titer 1:256 (n=90), 99.81% for animal blood sera with antibody titer 1:512 (n=90), 99.97% for blood sera of animals with an antibody titer of 1:1024 (n=90). The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed test system based on liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA for determining the titer of antibodies against FMDV strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in the blood sera of animals after vaccination compared with the neutralization reaction.
Пример 7. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител в сыворотках крови животных против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с применением жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.Example 7. Determination of the diagnostic parameters of the developed test system for determining the antibody titer in the blood sera of animals against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 using a liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA variant.
Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 450 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 1:32-1:1024. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 450 образцов сывороток крови 449 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательной (титр 1:16). Для исследования специфичности метода тестировали 190 отрицательных сывороток крови. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 190 отрицательных проб - 190 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,78% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,77-99,99%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,08-100,0%), k-критерий - 0,996; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,48% (в 95%-ном доверительном интервале: 96,41-99,93%), общая точность (DAc) - 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,13-100,00%) (таблица 5).To study the presented test system (the proposed invention) for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015, standard diagnostic indicators were studied. To determine the sensitivity of the proposed test system, 450 animal sera were analyzed, which were known to be positive according to the neutralization test in the sensitive porcine kidney cell line IB-RS-2. The antibody titer for these blood sera was in the range of 1:32-1:1024. The ELISA was performed as described above. The developed test system (the proposed invention) determined that out of 450 blood serum samples, 449 were identified as positive, and 1 as negative (titer 1:16). To study the specificity of the method, 190 negative blood sera were tested. As a result of the study using ELISA (the present invention), it was determined that out of 190 negative samples, 190 were identified as negative. Using the above statistical methods of analysis, it was determined that the diagnostic sensitivity (DSe) was 99.78% (in the 95% confidence interval: 98.77-99.99%), the diagnostic specificity (DSp) was 100% (in 95% -nom confidence interval: 98.08-100.0%), k-test - 0.996; positive predictive value (PPV) - 100%, negative predictive value (NPV) - 99.48% (95% confidence interval: 96.41-99.93%), overall accuracy (DAc) - 99.84% (in 95% confidence interval: 99.13-100.00%) (Table 5).
Таким образом предлагаемая «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4-5 часов провести анализ сывороток крови животных с определением уровня антител после вакцинации против ящура, вызванного вирусом ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.Thus, the proposed "Test system based on liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII in the blood sera of animals after immunization" is specific and sensitive, allowing for a quick analysis of animal blood sera within 4-5 hours to determine the level of antibodies after vaccination against foot-and-mouth disease caused by foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A/ASIA/G-VII.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации»:Sources of information taken into account when compiling the description of the invention to the application for a patent of the Russian Federation for the invention "Test system based on liquid-phase blocking indirect "sandwich" ELISA for determining the titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain A No. 2269/ARRIAH/2015 genotype A /ASIA/G-VII in blood sera of animals after immunization”:
1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.1. Gruzdev, K.N. The program of joint actions for the prevention and control of foot and mouth disease in the CIS countries / K.N. Gruzdev, V.M. Zakharov, A.M. Rakhmanov // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2005. - T. 3. - S. 3-13.
2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.3. Gulenkin, V.M. Economic efficiency of preventive vaccination of animals against foot-and-mouth disease on the territory of the Russian Federation / V.M. Gulenkin // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2012. - T. 10. - S. 31-41.
4. Anon (2012) Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. In, Bangkok, Thailand, pp. 27-29.4. Anon (2012) Global Strategy for the control of foot-and-mouth disease. In, Bangkok, Thailand, pp. 27-29.
5. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова, Н.Н. Ходакова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.5. Dynamics of development of anti-foot-and-mouth humoral immunity in cattle immunized with trivalent adsorbed vaccine types A, O, Asia-1 / D.V. Mikhalishin, T.N. Lezova, N.N. Khodakov [et al.] // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2007. - T. 5. - S. 75-82.
6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.K., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477.6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477.
7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. (1992) Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus. J. Mol Biol 228(4): 1263-1268.7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. (1992) Crystallization and preliminary X -ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus. J. Mol Biol 228(4): 1263-1268.
8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. (2005) The structure of foot-and-mouth disease virus. Curr Top Microbiol Immunol 288:71-101.8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. (2005) The structure of foot-and-mouth disease virus. Curr Top Microbiol Immunol 288:71-101.
9. Palmenberg A.C. (1990) Proteolytic processing of picornaviral polyprotein. Annu Rev Microbiol 44:603-623.9. Palmenberg A.C. (1990) Proteolytic processing of picornaviral polyprotein. Annu Rev Microbiol 44:603-623.
10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. (1997) Dissecting the roles of VP0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 71(12):9743-9752.10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. (1997) Dissecting the roles of VP 0 cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 71(12):9743-9752.
11. Российский патент RU2640261, 27.12.2017 по МПК C12N 7/00 A61K 39/135. Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.11. Russian patent RU2640261, December 27, 2017 according to
12. Российский патент RU2665850, 25.12.2017 61K 39/135 (2006.01); C12N 7/00 (2006.01) Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А.12. Russian patent RU2665850, 25.12.2017 61K 39/135 (2006.01);
13. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. (2007) Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target. Int J Biochem Cell Biol 39(1): 1-6.13. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. (2007) Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target. Int J Biochem Cell Biol 39(1): 1-6.
14. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. (2007) Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine 25(20):4112-412.14. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. (2007) Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine 25(20):4112-412.
15. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. (1991) Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs. J. Virol. 65(12):6572-6580.15. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. (1991) Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs. J. Virol. 65(12):6572-6580.
16. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. (2009) Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs. Vet. Microbiol. 137(1-2):10-17.16. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. (2009) Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs. Vet. microbiol. 137(1-2):10-17.
17. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. (1986) A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods 93(1):115-121.17. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. (1986) A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods 93(1):115-121.
18. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. (2008) Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 53(1):8-17.18. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. (2008) Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 53(1):8-17.
19. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD. Virol J. 2011 Sep 4;8:419.19. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview of ELISA techniques for FMD. Virol J. 2011
20. Basagoudanavar S.H., Hosamani M., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. Development of a liquid-phase blocking ELISA based on foot-and-mouth disease virus empty capsid antigen for seromonitoring vaccinated animals. Arch Virol. 2013 May;158(5):993-1001.20. Basagoudanavar S.H., Hosamani M., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. Development of a liquid-phase blocking ELISA based on foot-and-mouth disease virus empty capsid antigen for seromonitoring vaccinated animals. Arch Virol. 2013 May;158(5):993-1001.
21. GenBank. Foot-and-mouth disease virus A A/IND/40/2000 1D protein (po1) gene, partial cds / URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/21591351 (Дата обращения: 28.05.2021).21 GenBank. Foot-and-mouth disease virus A A/IND/40/2000 1D protein (po1) gene, partial cds / URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/21591351 (Date of access: 05/28/2021 ).
22. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India. World J Virology 2015; 4(3): 295-302.22. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B. , Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India. World J Virology 2015; 4(3): 295-302.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны<110> Federal State Budgetary Institution "Federal Security Center
здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary InstitutionAnimal Health (FSBI ARRIAH) Federal Governmental Budgetary Institution
«Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)Federal Center for Animal Health (FGBI ARRIAH)
<120> Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-<120> Test system based on liquid-phase blocking indirect "sandwich" -
варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма АELISA variant to determine the antibody titer against FMDV strain A
№2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных послеNo. 2269/ARRIAH/2015 of genotype A/ASIA/G-VII in blood sera of animals after
иммунизацииimmunization
<160> 2<160> 2
<210> 1<210> 1
<211> 636<211> 636
<212> РНК<212> RNA
<213> вирус ящура<213> foot-and-mouth disease virus
<400> 1<400> 1
accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc 60acccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc 60
gagacacaag tacagcggcg ttaccacacc gacgtcggct tcttaatgga caggttcgtg 120gagacacaag tacagcggcg ttaccacacc gacgtcggct tcttaatgga caggttcgtg 120
cagatcaagc ctgtgggccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180cagatcaagc ctgtgggccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180
ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240
aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actgcaaaac 300aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actgcaaaac 300
acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agtgggacga gcaagtactc cgcacctcaa 420gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agtgggacga gcaagtactc cgcacctcaa 420
aaccggcgag gtgacttggg tcctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480aaccggcgag gtgacttggg tcctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480
ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atctgcgaac tccttgtgcg catgaagcgc 540ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atctgcgaac tccttgtgcg catgaagcgc 540
gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600
aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636
<210> 2<210> 2
<211> 213<211> 213
<212> ПРТ<212> PRT
<213> вирус ящура<213> foot-and-mouth disease virus
<400> 2<400> 2
1 Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 151 Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 15
16 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr 3016 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr 30
31 Asp Val Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Val Asn Val 4531 Asp Val Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Val Asn Val 45
46 Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly 6046 Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly 60
61 Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp 7561 Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp 75
76 Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro 9076 Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro 90
91 Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Ser Asn Thr Gly Asn Pro Thr 10591 Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Ser Asn Thr Gly Asn Pro Thr 105
106 Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr 120106 Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr 120
121 Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Asn Lys 135121 Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Asn Lys 135
136 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Ala Arg Gly Asp Leu Gly Gln Leu 150136 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Ala Arg Gly Asp Leu Gly Gln Leu 150
151 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly 165151 Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly 165
166 Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys 180166 Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys 180
181 Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Met Leu Ala Val Glu Val 195181 Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Met Leu Ala Val Glu Val 195
196 Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys 210196 Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys 210
211 Gln Leu Leu 213211 Gln Leu Leu 213
<---<---
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787714C1 true RU2787714C1 (en) | 2023-01-11 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2812211C1 (en) * | 2023-07-03 | 2024-01-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Test system for determining titer of antibodies against structural proteins of asia-1 n 2356/14/2018 foot-and-mouth disease virus strain using liquid-phase blocking indirect "sandwich" version of elisa |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101082626A (en) * | 2007-06-14 | 2007-12-05 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | ELISA reagent kit for testing Asial type foot-and-mouth disease virus |
| RU2640192C1 (en) * | 2016-07-19 | 2017-12-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Elisa test system for segological diagnostics of cattle nodulous dermatitis - dermatitis nodularis bovum |
| CN109613238A (en) * | 2018-12-20 | 2019-04-12 | 中牧实业股份有限公司 | Detect enzyme linked immunological kit and its application of foot-and-mouth disease a type Wuhan strain antigen |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101082626A (en) * | 2007-06-14 | 2007-12-05 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | ELISA reagent kit for testing Asial type foot-and-mouth disease virus |
| RU2640192C1 (en) * | 2016-07-19 | 2017-12-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Elisa test system for segological diagnostics of cattle nodulous dermatitis - dermatitis nodularis bovum |
| CN109613238A (en) * | 2018-12-20 | 2019-04-12 | 中牧实业股份有限公司 | Detect enzyme linked immunological kit and its application of foot-and-mouth disease a type Wuhan strain antigen |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Жильцова Милена Владимировна. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: диссертация. кандидата ветеринарных наук: 16.00.03 / Жильцова Милена Владимировна [Место защиты: Федер. центр охраны здоровья животных]. - Владимир, 2008. - 146 с. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2812211C1 (en) * | 2023-07-03 | 2024-01-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Test system for determining titer of antibodies against structural proteins of asia-1 n 2356/14/2018 foot-and-mouth disease virus strain using liquid-phase blocking indirect "sandwich" version of elisa |
| RU2821894C1 (en) * | 2023-08-28 | 2024-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Test system for determining titre of antibodies against complete viral particles of fmd virus "o/kenya/2017" strain using liquid-phase "sandwich" version of elisa |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101334047B1 (en) | Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency | |
| US7776521B1 (en) | Coronavirus isolated from humans | |
| Sanford et al. | Assessment of the cross-protective capability of recombinant capsid proteins derived from pig, rat, and avian hepatitis E viruses (HEV) against challenge with a genotype 3 HEV in pigs | |
| CN111848786B (en) | Monoclonal antibody, preparation method and application thereof | |
| TW201102430A (en) | Hybridoma cell line producing monoclonal antibodies against the foot-and-mouth disease virus, the monoclonal antibodies therefrom, and reagent and ELISA kit comprising the same | |
| CN109485703A (en) | A kind of foot-and-mouth disease a type Structural protein VP1 antigen epitope polypeptide and its application | |
| WO2012163263A1 (en) | Reagents and methods for prrsv detection | |
| Salem et al. | Construction, expression and evaluation of recombinant VP2 protein for serotype-independent detection of FMDV seropositive animals in Egypt | |
| Kamstrup et al. | Mapping the antigenic structure of porcine parvovirus at the level of peptides | |
| CN105296434B (en) | The monoclonal antibody and application of hybridoma cell strain and its O-shaped virus of the resistant to foot and mouth disease of secretion | |
| CN117043177A (en) | African swine fever DIVA immunoassay | |
| CN104961809A (en) | Foot and mouth disease O-type structure protein VP1 antibody enzyme-linked immune detection reagent kit | |
| JPH09117287A (en) | Gb type hepatitis virus recombination protein and its use | |
| Zhao et al. | Characterization of antigenic domains and epitopes in the ORF3 protein of a Chinese isolate of avian hepatitis E virus | |
| US5843450A (en) | Hepatitis GB Virus synthetic peptides and uses thereof | |
| RU2787714C1 (en) | Test system based on a liquid-phase blocking indirect sandwich-type variant of elisa for determining the titre of antibodies against the foot-and-mouth disease virus strain a n2269/arriah/2015, genotype a/asia/g-vii, in animal blood sera after immunisation | |
| CN105296435B (en) | The monoclonal antibody specific and application of hybridoma cell strain and its O-shaped (O/GX/09-7) virus of the resistant to foot and mouth disease of secretion | |
| Ko et al. | Noninfectious virus-like particle antigen for detection of swine vesicular disease virus antibodies in pigs by enzyme-linked immunosorbent assay | |
| RU2791614C1 (en) | Test system based on liquid phase blocking indirect "sandwich" elisa for determination of antibody titer against fmdv strain o n2047/saudi arabia/2008 genotype o/me-sa/panasia2 in animal blood sera | |
| Kim et al. | Characterization of the humoral immune response of experimentally infected and vaccinated pigs to swine influenza viral proteins | |
| RU2796393C1 (en) | METHOD FOR RAPID QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE LEVEL OF HUMORAL IMMUNITY OF ANIMALS TO STRAIN O N2311/ZABAIKALSKY/2016 OF GENOTYPE O/ME-SA/Ind-2001 OF FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS AFTER VACCINATION USING LIQUID-PHASE "SANDWICH" ELISA | |
| RU2815540C1 (en) | Test system for determining titre of antibodies against structural proteins of foot and mouth disease virus of no. 2212/primorsky/2014 strain of o/sea/mya-98 genotype in animal blood sera based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” version of elisa. | |
| RU2812210C1 (en) | Test system based on liquid-phase blocking indirect “sandwich” elisa variant for determining titer of antibodies against foot-and-mouth disease virus strain “o-n2356/pakistan/2018” of genotype o/me-sa/panasia2 ant-10 in animal blood serum | |
| RU2798510C1 (en) | Test system for quantitative determination of the level of humoral immunity of animals against the antigen of foot-and-mouth disease virus an 2205/g-iv of a/africa/g-iv genotype using liquid-phase blocking indirect elisa "sandwich" | |
| Bar-Joseph et al. | Booster immunization with a partially purified citrus tristeza virus (CTV) preparation after priming with recombinant CTV coat protein enhances the binding capacity of capture antibodies by ELISA |