RU2808461C1 - Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы - Google Patents
Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808461C1 RU2808461C1 RU2023110700A RU2023110700A RU2808461C1 RU 2808461 C1 RU2808461 C1 RU 2808461C1 RU 2023110700 A RU2023110700 A RU 2023110700A RU 2023110700 A RU2023110700 A RU 2023110700A RU 2808461 C1 RU2808461 C1 RU 2808461C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- mycelium
- late blight
- ribonucleic acid
- sample
- Prior art date
Links
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, характеризующийся тем, что измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в течение 10-15 с стальными шариками с частотой 50-60 Гц, при температуре ротора от -70 до -80 °C в лизирующем реагенте Trizol или Qiazol, удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа, далее центрифугируют и разделяют на фракции; при этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр RNEasy для экстракции, далее определяют количественное наличие РНК при помощи набора Qubit RNA HS Assay. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения тотальной РНК из биологических образцов - мицелия фитофторы. 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических образцов - мицелия фитофторы Phytophthora infestans.
Получение высокоочищенных и интактных РНК из грибов и грибоподобных организмов является важной проблемой в молекулярной биологии, особенно такие методики важны для исследования транскриптома. Сложности с выделением РНК возникают в первую очередь из-за толстой клеточной стенки и активных эндогенных РНКаз.
P. infestans - это паразитический Оомицет, поражающий такие значимые хозяйственные культуры, как картофель и томаты. Не являясь родственником настоящих грибов, она демонстрирует определенное конвергентное сходство с ними, формируя несептированный мицелий с клеточной стенкой из целлюлозы и бета-глюканов, поэтому проблемы, встающие при выделении РНК из настоящих грибов, справедливы и в случае P. Infestans.
Из уровня техники известен способ выделения РНК (патент RU2232810). Способ включает инкубацию биологического образца с мелкодисперсным сетчатым стеклом, предварительно обработанным 3,5-7% раствором плавиковой кислоты, в течение 2-6 ч в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, отделение сорбента и связанной с сорбентом РНК центрифугированием, промывку сорбента и элюирование РНК из сорбента буферным раствором, содержащим 5-50 мМ гидрокарбоната ионов (HCO3) и 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0. Способ позволяет сократить время процесса, повысить выход РНК и обеспечить выделение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фракций РНК.
Недостатком прототипа является отсутствие значимых подробностей при выделении, которые могут существенно влиять на общий выход и качество РНК: время измельчения, добавление ингибиторов РНКаз, использование лизирующего буфера.
Задачей изобретения является получение тотальной РНК высокого качества из мицелия фитофторы P. infestans.
Технический результат заключается в получении тотальной РНК из мицелия фитофторы (P. Infestans). Кроме того, технический результат заключается в оптимизации проведения транскриптомных исследований. Дополнительный технический результат заключается в сокращении операций для получения тотальной РНК из мицелия фитофторы.
Технический результат достигается предлагаемым способом, который заключается в сборе материала, его измельчении в приборе, например, Tissue Lyzer LT (QIAGEN) с последующей адсорбцией РНК на стекловолоконном фильтре, например, из набора «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN).
Способ включает следующую последовательность стадий:
1. Сбор биомассы P. infestans и ее заморозка в жидком азоте.
2. Измельчение мицелия в шаровой мельнице - гомогенизаторе, с добавлением лизирующего реагента, например тризол или Qiazol.
3. Инкубация образца на льду.
4. Удаление белковых примесей хлороформной экстракцией.
5. Выделение тотальной РНК на стекловолоконном фильтре.
Разработанный способ позволяет получить образцы РНК, пригодные для современных методов исследования, которые требуют очень высокого качества материала, например, изучение экспрессии и переключения генов.
При выделении тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы при температуре ниже 0°С в лизирующем растворе, далее удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций. При этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр для дальнейшей экстракции.
В частном варианте осуществления способа, при выделении тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в лизирующем растворе. Из раствора удаляют белковые примеси с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, далее проводят экстракцию РНК из водной фракции. К измельченному образцу добавляют реагент QIAzol, из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца и растирают до однородности в жидком азоте. Образец размещают на льду для дальнейшего его оттаивания. Далее повторно добавляют реагент QIAzol, удаляют белковые фракции, отделяют водную фракцию центрифугированием с последующей экстракцией РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре.
Пример №1.
С помощью препаровальной иглы из чашек Петри собирается выращенный на среде с агаром образец мицелия фитофторы P. infestans массой, помещается в микроцентрифужную пробирку и замораживается в жидком азоте.
Далее замороженный мицелий измельчается с помощью стальных шариков на приборе Tissue Lyser LT, режим измельчения: частота колебаний 50 Гц, время обработки 15 с (увеличение времени приводит к падению качества тотальной РНК и контаминации образца примесью ДНК). Ротор прибора предварительно охлаждается до -70°С. Сразу после измельчения к образцам добавляется лизирующий реагент тризол. Образцы тщательно перемешиваются и инкубируются на льду.
Затем для удаления белковых примесей производится их экстракция хлороформом, для этого хлороформ добавляется к образцу, тщательно перемешивается и инкубируется на льду. Далее образец центрифугируется в 400 - 500 мкл водной фазы отбирается в новую микроцентрифужную пробирку.
Для экстракции к водной фракции, содержащей РНК образец добавляется 200 мкл 96% этанола в пропорции 2:1, образец перемешивается пипетированием, переносится на колонку со стекловолоконным фильтром, центрифугируется, после этого смыв удаляется.
Содержание РНК в пробе определяется с помощью набора Qubit RNA HS Assay (Измерение концентрации двуцепочечной РНК в пробе) для количественного определения РНК, концентрация составила 55 нг/мкл (итого 2,75 мг РНК из образца мицелия массой 100 мг).
Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора, он составил 7,2.
Пример №2.
С помощью препаровальной иглы из чашек Петри собирается выращенный на среде с агаром образец мицелия фитофторы P. infestans массой, помещается в микроцентрифужную пробирку и замораживается в жидком азоте.
Далее замороженный мицелий измельчается с помощью стальных шариков на приборе Tissue Lyser LT, режим измельчения: частота колебаний 60 Гц, время обработки 10 с (увеличение времени приводит к падению качества тотальной РНК и контаминации образца примесью ДНК). Ротор прибора предварительно охлаждается до -80°С. Сразу после измельчения к образцам добавляется лизирующий реагент QIAzol. Образцы тщательно перемешиваются и инкубируются на льду.
Затем для удаления белковых примесей производится их экстракция хлороформом, для этого хлороформ добавляется к образцу, тщательно перемешивается и инкубируется на льду. Далее образец центрифугируется в 400 - 600 мкл водной фазы отбирается в новую микроцентрифужную пробирку.
Для экстракции к водной фракции, содержащей РНК образец добавляется 300 мкл 96% этанола в пропорции 2:1, образец перемешивается пипетированием, переносится на колонку со стекловолоконным фильтром, центрифугируется, после этого смыв удаляется.
Содержание РНК в пробе определяется с помощью набора Qubit RNA HS Assay (Измерение концентрации двуцепочечной РНК в пробе) для количественного определения РНК, концентрация составила 45 нг/мкл (итого 1,35 мг РНК из образца мицелия массой 100 мг).
Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора, он составил 7,2.
Claims (1)
- Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, характеризующийся тем, что измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в течение 10-15 с стальными шариками с частотой 50-60 Гц, при температуре ротора от -70 до -80 °С в лизирующем реагенте Trizol или Qiazol, удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа, далее центрифугируют и разделяют на фракции; при этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр RNEasy для экстракции, далее определяют количественное наличие РНК при помощи набора Qubit RNA HS Assay.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808461C1 true RU2808461C1 (ru) | 2023-11-28 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2119954C1 (ru) * | 1996-12-27 | 1998-10-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| RU2232810C1 (ru) * | 2002-12-19 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения рибонуклеиновых кислот |
| RU2595374C2 (ru) * | 2014-04-09 | 2016-08-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ автоматизированного выделения с одновременной очисткой нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2119954C1 (ru) * | 1996-12-27 | 1998-10-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных | Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот |
| RU2232810C1 (ru) * | 2002-12-19 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения рибонуклеиновых кислот |
| RU2595374C2 (ru) * | 2014-04-09 | 2016-08-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ автоматизированного выделения с одновременной очисткой нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ИВАНОВ А.А., УКЛАДОВ Е.О. "Выделение тотальной РНК из Phytophtora infestans и амплификация фрагментов генов INF1 и INF4 для разработки фунгицидного препарата"; Материалы 59 международной научной студенческой конференции, 2021, Новосибирск, с.68. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1997740B (zh) | 用于分离纯化的rna的试剂和方法 | |
| US20140212868A1 (en) | Method and Kit For The Isolation Of Genomic DNA, RNA Proteins and Metabolites From A Single Biological Sample | |
| US20020192667A1 (en) | Method for isolating and purifying nucleic acids | |
| US7687254B2 (en) | Phenol-free method of isolating DNA | |
| RU2808461C1 (ru) | Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы | |
| HUT70980A (en) | Dna isolation method | |
| CN114395638B (zh) | 适用于高淀粉果实的ATAC-seq方法 | |
| CN116376896A (zh) | 一种提取血浆游离dna的试剂盒、制备方法及提取方法 | |
| CN112225791B (zh) | 一种丝胶蛋白肽及其应用 | |
| CN108866042B (zh) | 一种微量rna的提取方法 | |
| CN112501156A (zh) | 一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法 | |
| JPH06289016A (ja) | 生物試料からのｄｎａ抽出試薬、該試薬を用いるｄｎａ抽出方法、並びにｄｎａ抽出キット | |
| Merante et al. | The simultaneous isolation of RNA and DNA from tissues and cultured cells | |
| RU2799411C1 (ru) | Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека | |
| CN118006596A (zh) | 从环境样本中同时提纯核酸和蛋白质的方法 | |
| Aristya et al. | Optimization of the CTAB3-LiCl and commercial kit methods in the process of RNA isolation and amplification in strawberries fruit (Fragaria spp.) | |
| RU2807254C1 (ru) | Универсальный способ выделения ДНК и лизирующая смесь для его осуществления | |
| CN114908081B (zh) | 一种核酸提取试剂及其试剂盒以及快速萃取分离纯化核酸的方法 | |
| Chai et al. | Isolation of Double-Stranded RNAs by Lithium Chloride Fractionation | |
| CN112501250A (zh) | 一种rna提取方法及试剂盒 | |
| CN106434640A (zh) | 一种利用常规试剂提取rna的方法 | |
| CN114410744A (zh) | 一种处理样本的方法及其核酸提取方法与文库 | |
| KR20030028498A (ko) | 객담에서 ｒｎａ를 추출하는 방법 | |
| Tomà et al. | Evaluation of different methods for total RNA extraction from Thaumastocoris peregrinus | |
| Junaid et al. | Fungal Basidiomycete Ceratobasidium theobromae DNA obtained directly from cocoa petioles |