RU2799411C1 - Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека - Google Patents
Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799411C1 RU2799411C1 RU2022130210A RU2022130210A RU2799411C1 RU 2799411 C1 RU2799411 C1 RU 2799411C1 RU 2022130210 A RU2022130210 A RU 2022130210A RU 2022130210 A RU2022130210 A RU 2022130210A RU 2799411 C1 RU2799411 C1 RU 2799411C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- sample
- pestle
- total rna
- followed
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека. Способ включает измельчение и гомогенизацию исходного образца при низких температурах в лизирующем растворе, удаление белковых примесей с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, экстракцию РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре с использованием коммерческого набора «RNEasy plant mini kit». Изобретение расширяет арсенал методов получения тотальной РНК высокого качества. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических образцов - послеоперационного материала межпозвонковых дисков человека.
Получение высокоочищенных и интактных РНК является важной проблемой в молекулярной биологии, особенно такие методики важны для исследования транскриптома различных образцов. Так как транскриптом является крайне тканеспецифичным и сильно зависит от внешних воздействий, способ получения тотальной РНК должен максимально отражать профиль экспрессии в момент забора образца и вносить минимальное искажение в конечный результат. Соблюсти все вышеперечисленные условия достаточно сложно, особенно для некоторых типов материала, к которым относятся, например, межпозвонковые диски человека: в настоящее время активное исследование их транскриптома затруднено в связи со сложностью получения РНК.
Большинство предлагаемых способов выделения РНК из образцов можно отнести к категории инвазивных, то есть требующих ферментативной обработки живых клеток.
Известен способ выделения тотальной РНК из более мягкого пульпозного ядра межпозвонкового диска, которое включает следующие сдадии: сперва образец нарезается на небольшие кусочки, потом обрабатывается коллагеназой II в течение 4 ч при температуре 37°С, затем из полученного образца выделяется фракция хондроцитов, тотальная РНК из которых выделяется с использованием реагента Тризол (TRIzol, Thermo Fisher Scientific, кат. номер 15596026) [1].
Недостатком описанного способа является длительное нагревание образца и его обработка ферментом, что однозначно приведет к существенному изменению профиля экспрессии.
Еще более «инвазивным» аналогом является способ получения первичной культуры хондроцитов для выделения РНК, заключающийся в том, что исходный образец инкубируется с коллагеназой II в течение 12 ч при температуре 37°С, затем выделяется фракция хондроцитов, которая культивируется в питательной среде с антибиотиками (стрептомицин, пенициллин) [2].
Недостатком этого способа также является длительный нагрев с ферментативной обработкой, а также продолжительное культивирование хондроцитов в культуральной среде в присутствии антибиотика и отсутствии внеклеточного матрикса, который очень важен для хрящевых тканей.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выделения РНК из суставных хрящей без предварительной обработки с использованием криопомола [3]. Данный способ предполагает измельчение образца с помощью криогенной мельницы, затем полученная из хряща пудра помещается в реагент Тризол (TRIzol, Thermo Fisher Scientific, кат. номер 15596026) и инкубируется в течение 15 мин при комнатной температуре; далее из образца удаляются центрифугированием сперва крупные фрагменты хряща, затем фильтрованием мелкие, с помощью хлороформа извлекаются белковые примеси и из полученного раствора тотальная РНК осаждается спиртовой преципитацией.
Основным недостатком прототипа является высокая стоимость целевого продукта, связанная с необходимостью использования криогенной мельницы, чтобы не допустить нагревания образца при гомогенизации. Данное оборудование является весьма дорогостоящим (около 10000 €).
Задачей изобретения является получение тотальной РНК высокого качества, пригодной для проведения транскриптомных исследований, а также упрощение и удешевление процесса.
Технический результат: получение тотальной РНК высокого качества, упрощение и удешевление известного способа.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в измельчении и гомогенизации хрящей в жидком азоте при помощи ступки и пестика с последующей адсорбцией РНК на стекловолоконном фильтре.
Способ включает следующую последовательность стадий:
1. Измельчение и гомогенизация хряща в ступке в жидком азоте с использованием шила и пестика.
2. Добавление лизирующего реагента QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306), растирание до однородности.
3. Оттаивание образца на льду, повторное добавление реагента QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306).
4. Извлечение белковых примесей экстракцией хлороформом с последующим центрифугированием и разделением фракций.
5. Экстракция тотальной РНК из водной фракции с помощью коммерческого набора «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN, кат. номер 74904), согласно инструкции.
Весь процесс выделения РНК занимает около 4 ч. Разработанный способ позволяет получить образцы РНК, пригодные для современных методов исследования, которые требуют очень высокого качества материала, например, секвенирование РНК, рибосомальный профайлинг.
Общий этап с прототипом заключается в гомогенизации образца при низких температурах, однако использование ступки и пестика существенно удешевляет процесс выделения РНК, а адсорбция РНК на стекловолоконном фильтре, который входит в набор, существенно ускоряет процесс.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:
1) для измельчения и гомогенизации хрящей используют шило, ступку и пестик, что позволяет удешевить процесс выделения РНК;
2) сразу после измельчения в гомогенат добавляют реагент QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306) из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца, что позволяет защитить РНК от деградации при оттаивании;
3) для экстракции РНК используют коммерческий набор «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN, кат. номер 74904), что позволяет повысить выход и качество выделяемой РНК.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Образец межпозвонкового диска массой 1,8 г поэтапно измельчают в ступке в жидком азоте следующим образом: 1) используя шило, как долото, а пестик, как молоток, дробят образец на небольшие фрагменты; 2) измельчают фрагменты на более мелкие фрагменты, совершая движения пестиком строго вверх-вниз; 3) образец растирают до однородного порошкообразного состояния, осуществляя круговые движения пестиком по дну ступки.
К полученному порошкообразному образцу добавляют 3 мл реагента QIAzol, растирают до однородности в жидком азоте и пересыпают образец в пробирку типа эппендорф на 25 мл, дают азоту испариться, закрывают и перемешивают, переворачивая пробирку. Затем добавляют еще 3 мл реагента QIAzol, перемешивают с использованием смесителя Вортекс 30 с, после чего инкубируют на льду 5 мин. Разливают по 1 мл полученного лизата в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, добавляют по 200 мкл хлороформа в каждую, перемешивают, используя Вортекс, инкубируют 2 мин на льду, затем центрифугируют пробирки 20 мин (10000 g, 4°С). Далее осторожно переносят 400 мкл водной фазы в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и добавляют 400 мкл реагента QIAzol. Перемешивают, переворачивая пробирки, инкубируют 30 мин на льду в темноте. Затем добавляют 180 мкл объема хлороформа в каждую, перемешивают, используя Вортекс, 1-2 с. Инкубируют 2 мин на льду, затем центрифугируют пробирки 20 мин (10000 g, 4°С). Далее 250 мкл водной фазы из каждой пробирки переносят в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Для уменьшения расхода колонок и увеличения концентрации РНК на этом этапе можно объединить водную фазу из двух пробирок в одну, таким образом, выделение РНК будет осуществляться из 500 мкл водной фазы.
Для экстракции РНК используют коммерческий набор «RNEasy plant mini kit». В каждую пробирку добавляют 250 мкл перегнанного этанола и перемешивают пипетированием, переносят на «розовые» колонки со стекловолоконным фильтром из набора (RNeasy column), центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Далее добавляют 700 мкл буфера RW1 из набора, центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Затем добавляют 500 мкл буфера RPE, центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Переносят каждую «розовую» колонку в новую пробирку, центрифугируют 1 мин (12000 g, 15°С). Снова помещают «розовые» колонки в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и осторожно наносят на фильтр 30 мкл воды, свободной от РНКаз. Инкубируют 1 мин при комнатной температуре, центрифугируют 30 с, при 10000 g, при температуре 15°С.
Содержание РБК в пробе определяли с помощью набора Qubit RNA HS Assay для количественного определения РНК (ThermoScientific, кат. номер Q32852), концентрация составила 71,2 нг/мкл (итого 2,1 мг РНК из образца межпозвонкового диска массой 1,8 г).
Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора Bioanalyzer 2100 (Agilent, кат. номер G2939BA), он составил 7,3 (высоким считается индекс от 6 и выше).
На фиг. 1 представлены этапы предварительного измельчения хряща ступкой и пестиком, где: I - фрагментация большого куска хряща с помощью шила; а - пестик, b - шило, с - хрящ; II - дробление небольших фрагментов хряща; III - раздавливание оставшихся небольших частиц. Жидкий азот не нарисован для упрощения иллюстрации.
Использование предлагаемого способа позволит повысить качество и удешевить выделение РНК из межпозвонковых дисков человека, пригодной для проведения транскриптомных исследований.
Источники информации
1. Gan, M.F.; Yang, H.L.; Qian, J.L.; Wu, C.S.; Yuan, C.X.; Li, X.F.; Zou, J. Comparison of two methods for RNA extraction from the nucleus pulposus of intervertebral discs. Genet. Mol. Res. 2016, 15, doi:10.4238/gmr.15027738.
2. Guo, W.; Mu, K.; Zhang, В.; Sun, C.; Zhao, L.; Dong, Z.Y.; Cui, Q. The circular RNA FAM169A functions as a competitive endogenous RNA and regulates intervertebral disc degeneration by targeting miR-583 and BTRC. Cell Death Dis. 2020 115 2020, 11, 1-17, doi:10.1038/s41419-020-2543-8.
3. Le Bleu, H.K.; Kamal, F.A.; Kelly, M.; Ketz, J.P.; Zuscik, M.J.; Elbarbary, R.A. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Anal. Biochem. 2017, 518, 134-138, doi:10.1016/J.AB.2016.11.018.
4. Sophia Fox, A.J.; Bedi, A.; Rodeo, S.A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health 2009, 7, 461, doi:10.1177/1941738109350438.
Claims (2)
1. Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека, включающий измельчение и гомогенизацию исходного образца при низких температурах в лизирующем растворе, удаление белковых примесей с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, экстракцию РНК из водной фракции, отличающийся тем, что к измельченному образцу добавляют реагент QIAzol из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца и растирают до однородности в жидком азоте, оттаивают образец на льду, повторно добавляют реагент QIAzol, удаляют белковые фракции, отделяют водную фракцию центрифугированием с последующей экстракцией РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре с использованием коммерческого набора «RNEasy plant mini kit».
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измельчение исходного образца осуществляют в ступке, используя шило как долото, а пестик как молоток, дробя образец на небольшие фрагменты с последующим растиранием до однородного порошкообразного состояния, двигая пестиком строго вверх-вниз и выполняя круговые движения пестиком по дну ступки.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2799411C1 true RU2799411C1 (ru) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060031026A1 (en) * | 2004-08-09 | 2006-02-09 | Inha-Industry Partnership | Method and system for extracting and visualizing secondary RNA structure elements from protein-RNA complexes |
WO2020156048A1 (zh) * | 2019-02-01 | 2020-08-06 | 成都导胜生物技术有限公司 | 利用基于超声原理的动植物组织消融仪快速提取rna的方法 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060031026A1 (en) * | 2004-08-09 | 2006-02-09 | Inha-Industry Partnership | Method and system for extracting and visualizing secondary RNA structure elements from protein-RNA complexes |
WO2020156048A1 (zh) * | 2019-02-01 | 2020-08-06 | 成都导胜生物技术有限公司 | 利用基于超声原理的动植物组织消融仪快速提取rna的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Piprode V. et al. An optimized step‐by‐step protocol for isolation of nucleus pulposus, annulus fibrosus, and end plate cells from the mouse intervertebral discs and subsequent preparation of high‐quality intact total RNA. JOR spine, 2020., 3(3), p. e1108. Caprez S. et al. Isolation of high‐quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR spine, 2018, 1(2), p. e1017. Гареев И. Ф. и др. Экстракция некодирующих РНК из студенистого ядра межпозвоночного диска с последующим профилированием их экспрессии. Креативная хирургия и онкология, 2020, 2, с. 108-114. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1997740B (zh) | 用于分离纯化的rna的试剂和方法 | |
Tien et al. | Methods for DNA extraction from various soils: a comparison | |
Ding et al. | Using silica particles to isolate total RNA from plant tissues recalcitrant to extraction in guanidine thiocyanate | |
US9605256B2 (en) | Procedure for the specific isolation of total DNA content of bacterial germs and a kit for this purpose | |
UA108736C2 (uk) | Химерна конструкція для забезпечення стійкості до виходу у стрілку у цукрового буряка | |
US8574890B2 (en) | Nucleic acid extraction from complex matrices | |
Rodrigues et al. | Isolation and purification of RNA from tissues rich in polyphenols, polysaccharides, and pigments of annatto (Bixa orellana L.) | |
WO2023246266A1 (zh) | 基于同一组织样本同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的方法及应用 | |
Jahan et al. | Genomic DNA extraction methods: a comparative case study with gram–negative organisms | |
RU2799411C1 (ru) | Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека | |
US7074565B2 (en) | Preparation of DNA-containing extract for PCR amplification | |
Yee et al. | A simple and inexpensive physical lysis method for DNA and RNA extraction from freshwater microalgae | |
EP0939118A1 (en) | Method for isolating DNA and RNA from faeces | |
Wang et al. | Direct isolation of high-quality low molecular weight RNA of pear peel from the extraction mixture containing nucleic acid | |
CN102181439B (zh) | 细胞周期s期报告基因 | |
DE4422044A1 (de) | Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren | |
Henfrey et al. | Isolation of plant nuclei | |
Tashiro et al. | Multiple forms of nuclear ribonuclease H from Tetrahymena pyriformis | |
Schrauwen et al. | Ribonuclease in styles | |
Alecki et al. | Identification of R-Loop-Forming Sequences in Drosophila Melanogaster Embryos and Tissue Culture Cells Using DRIP-Seq | |
Yamaguchi et al. | Isolation and characterization of nuclei from rice embryos | |
RU2808461C1 (ru) | Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы | |
Öztürk et al. | Isolation of High‐Quality RNA from Pichia pastoris | |
CN115058415B (zh) | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 | |
Van Damme et al. | Cell-free synthesis of lectins |