RU2806684C1 - Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани - Google Patents
Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2806684C1 RU2806684C1 RU2023107406A RU2023107406A RU2806684C1 RU 2806684 C1 RU2806684 C1 RU 2806684C1 RU 2023107406 A RU2023107406 A RU 2023107406A RU 2023107406 A RU2023107406 A RU 2023107406A RU 2806684 C1 RU2806684 C1 RU 2806684C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stromal
- lipoaspirate
- vascular fraction
- needle
- container
- Prior art date
Links
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем забора липоаспирата, его эмульгирования и двойного центрифугирования. Изобретение позволяет получать очищенную стромально-васкулярную фракцию жировой ткани с сохранением количества клеток в конечном продукте. 1 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии и регенеративной медицине, и может быть использовано для получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани для инъекции с целью повышения регенерации и трофики кожи и мягких тканей, лечения суставов и заболеваний опорно-двигательной системы за счет потенцирования регенеративных процессов.
Известен способ получения стромально-васкулярной фракции, при котором жировую ткань получают методом липоаспирации. Так, 10 граммов липоаспирата подвергают ферментативной обработке либо эмульгируют механическим способом, затем центрифугируют, удаляют супернатант, а оставшуюся часть ресуспендируют, и именно в ней определяется стромально-васкулярная фракция (Chaput В, Bertheuil N, Escubes М, Grolleau JL, Garrido I, Laloze J, Espagnolle N, Casteilla L, Sensebé L, Varin A. Mechanically Isolated Stromal Vascular Fraction Provides a Valid and Useful Collagenase-Free Alternative Technique: A Comparative Study. Plast Reconstr Surg. 2016 Oct;138(4):807-819. doi: 10.1097/PRS.0000000000002494. PMID: 27307342). Однако при данном способе невозможно полноценно удалить супернатант, содержащий адипоциты и масляную фракцию, так как его липкие частицы оседают на стенках емкости с липоаспиратом и смешиваются со стромально-васкулярной фракцией при ее извлечении.
Технический результат: получение очищенной стромально-васкулярной фракции жировой ткани с сохранением количества клеток в конечном продукте путем исключения смешивания компонентов; простота применения.
Указанный результат достигается путем установки в емкость инъекционной иглы перед центрифугированием липоаспирата таким образом, чтобы кончик иглы доходил до дна емкости, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости; ресуспендированием осадка после первого центрифугирования путем добавления 2 мл физиологического раствора натрия хлорида в емкость через предустановленную иглу, а также аспирированием стромально-васкулярной фракции после второго центрифугирования из нижней части емкости через иглу, соединенную со шприцом.
Способ осуществляют следующим образом: в пустую стерильную емкость, например, в пробирку, устанавливают инъекционную иглу, так чтобы кончик иглы доходил до дна емкости, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости, затем в эту емкость помещают эмульгированный механическим либо ферментативным способом липоаспират в объеме 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугируют при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут с помощью лабораторной центрифуги 80-2S Apex Lab (Китай). После первого цикла центрифугирования проводят ресуспендирование осадка путем добавления через предустановленную иглу в емкость с липоаспиратом 2 мл физиологического раствора натрия хлорида для перемешивания компонентов нижней части липоаспирата. Объемы липоаспирата и физиологического раствора натрия хлорида соотносятся как 2:1 и были подобраны эмпирическим путем. Далее производят второй цикл центрифугирования при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут с помощью лабораторной центрифуги 80-2S Apex Lab (Китай).
На фиг. 1 представлен результат повторного центрифугирования. В верхней части пробирки располагается жировая фракция, в ее дне - стромально-васкулярная фракция, которая не смешивается с жировой фракцией и легко достижима для аспирации предустановленной в пробирку иглой.
После окончания повторного центрифугирования стромально-васкулярную фракцию аспирируют через предустановленную иглу из нижней части емкости через иглу, соединив ее со шприцом.
Данная методика позволяет получить очищенную стромально-васкулярную фракцию из емкости с липоаспиратом, исключив смешивание компонентов липоаспирата, сохранив максимально возможное количество клеток стромально-васкулярной фракции в конечном продукте.
Примеры конкретного выполнения:
Пример 1. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его ферментативную обработку раствором коллагеназы. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 6 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологический раствор с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Микроскопия мазков полученной стромально-васкулярной фракции с окраской по Май Грюнвальду показала, что адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего в 50 мкл жидкости было получено около 8500 клеток, имеющих морфологию фибробласта, то есть 170 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.
Пример 2. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его фильтрацию анаэробными клеточными трансферами с внутренним диаметром отверстий 1,4 мм и 1,2 мм поочередно, затем эмульгирующим сетчатым клеточным фильтром с диаметром отверстий 0,5 мм, с помощью 30 пассажей липоаспирата через каждый клеточный фильтр. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 9 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологического раствора натрия хлорида с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. После центрифугирования на дне пробирки осели белые хлопья, которые при помощи иглы забрали шприцом объемом 5 мл через предустановленную иглу. Для примерного подсчета количества фибробластоподобных клеток жидкость нанесли на предметное стекло в объеме 50 мкл и фиксировали формалином. Далее мазки окрасили по Май Грюнвальду и произвели подсчет всех клеток, имеющих морфологию фибробласта. Фибробластоподобные клетки находились в основном группой в количестве 30-50 штук и были связаны между собой небольшими соединительнотканными перемычками, что говорит о выделении также и остатков соединительной ткани. Адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего определялось примерно 150 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл полученной стромально-васкулярной фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.
Пример 3. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его фильтрацию анаэробными клеточными трансферами с внутренним диаметром отверстий 1,4 мм и 1,2 мм поочередно с помощью 30 пассажей липоаспирата через каждый, затем эмульгирующим сетчатым клеточным фильтром с диаметром отверстий 0,5 мм с помощью 10 пассажей. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 9 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологического раствора натрия хлорида с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов и частицами фрагментированных соединительнотканных волокон. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. После центрифугирования на дне пробирки осели белые хлопья, которые при помощи иглы забрали шприцом объемом 5 мл через предустановленную иглу. Для примерного подсчета количества фибробластоподобных клеток жидкость нанесли на предметное стекло в объеме 50 мкл и фиксировали формалином. Далее мазки окрасили по Май Грюнвальду и произвели подсчет всех клеток, имеющих морфологию фибробласта. Фибробластоподобные клетки находились в основном группой в количестве 40-50 штук и были связаны между собой небольшими соединительнотканными перемычками, что говорит о выделении также и остатков соединительной ткани. Адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего определялось примерно 160 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл полученной стромально-васкулярной фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.
Таким образом, предлагаемый способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани является применимым в области практического здравоохранения, так как может быть воспроизведен неоднократно, позволяет получить стромально-васкулярную фракцию без использования ферментов и иных реактивов, повышая доступность и снижая себестоимость процедуры. Полученная механическим способом стромально-васкулярная фракция может быть использована в регенеративной медицине для ускорения репарации кожи и мягких тканей, усиления регенерации хрящей и суставных поверхностей, при лечении заболеваний опорно-двигательной системы.
Claims (1)
- Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем забора липоаспирата, эмульгирования его механическим способом, двойного центрифугирования, ресуспендирования нижней части липоаспирата, отличающийся тем, что перед центрифугированием в пустую емкость устанавливают инъекционную иглу таким образом, чтобы кончик иглы доходил до ее дна, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости, затем в емкость помещают липоаспират в объеме 4 мл; после первого центрифугирования осадок ресуспендируют путем добавления 2 мл физиологического раствора натрия хлорида в емкость через иглу, после второго центрифугирования аспирируют стромально-васкулярную фракцию из нижней части емкости через иглу, соединив ее со шприцом.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2806684C1 true RU2806684C1 (ru) | 2023-11-02 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2396345C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-08-10 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ получения популяции стромальных клеток жировой ткани, индуцированных к нейральной дифференцировке |
RU2609657C1 (ru) * | 2015-10-22 | 2017-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выделения мезенхимных стволовых клеток из орбитальной жировой ткани |
RU2015147257A (ru) * | 2015-11-03 | 2017-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" | Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения |
RU173796U1 (ru) * | 2017-03-02 | 2017-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" | Устройство для фракционирования жировой ткани и выделения из нее стромально-васкулярной фракции для применения в регенеративной медицине |
RU2796294C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-05-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ РК" Минздрава России) | Способ активации регенераторного потенциала стромально-васкулярной фракции жировой ткани низкоинтенсивным лазерным излучением красного диапазона |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2396345C1 (ru) * | 2008-12-15 | 2010-08-10 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ получения популяции стромальных клеток жировой ткани, индуцированных к нейральной дифференцировке |
RU2609657C1 (ru) * | 2015-10-22 | 2017-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ выделения мезенхимных стволовых клеток из орбитальной жировой ткани |
RU2015147257A (ru) * | 2015-11-03 | 2017-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" | Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения |
RU173796U1 (ru) * | 2017-03-02 | 2017-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" | Устройство для фракционирования жировой ткани и выделения из нее стромально-васкулярной фракции для применения в регенеративной медицине |
RU2796294C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-05-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ РК" Минздрава России) | Способ активации регенераторного потенциала стромально-васкулярной фракции жировой ткани низкоинтенсивным лазерным излучением красного диапазона |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10967110B2 (en) | System and methods for preparation of adipose-derived stem cells | |
US9463203B2 (en) | Methods of using regenerative cells in the treatment of cartilage defects | |
EP2882850B1 (en) | System for preparation of adipose-derived stem cells | |
US10119113B2 (en) | Systems for isolating and using clinically safe adipose derived regenerative cells | |
JP4731556B2 (ja) | 臨床的に安全な脂肪組織由来再生細胞を単離し、使用するためのシステムおよび方法 | |
EP1778293B1 (en) | Methods of using regenerative cells in the treatment of musculoskeletal disorders | |
US11766459B2 (en) | System and methods for preparation of adipose-derived stem cells | |
CN111542350B (zh) | 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法 | |
CN107921182B (zh) | 用于分离基质血管部分的机械仪器和方法 | |
CN112029717B (zh) | 无血清体外驯化培养人间充质干细胞 | |
RU2806684C1 (ru) | Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани | |
CN111925985B (zh) | 间充质干细胞的驯化培养方法 | |
US20170095593A1 (en) | Adipose-derived stem cell product | |
US20240016851A1 (en) | System and Methods for Preparation of Adipose-Derived Stem Cells | |
KR20090129069A (ko) | 줄기세포 분리방법 | |
Troell | Adipose-Derived Stem and Regenerative Cells: Harvesting, Processing, and Administration |