RU2806650C1

RU2806650C1 - Усовершенствованный способ получения радиозащитного средства 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида

Info

Publication number: RU2806650C1
Application number: RU2023125102A
Authority: RU
Inventors: Марина Владимировна Филимонова; Людмила Ивановна Шевченко; Александр Сергеевич Филимонов; Раиса Дмитриевна Грекова; Пётр Викторович Шегай; Андрей Дмитриевич Каприн
Filing date: 2023-09-29
Publication date: 2023-11-02

Abstract

Изобретение относится к способу получения радиозащитного средства 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, со структурной формулой (I). Способ заключается в том, что смесь изобутаноилтиомочевины в количестве N ммоль, изопропилбромида в количестве N×(1,4÷1,6) ммоль и сухого ацетонитрила в объеме N×(0,24÷0,27) мл нагревают в запаянной ампуле при температуре 90°C в течение 10 часов. Затем содержимое ампулы переносят в колбу, упаривают ацетонитрил в течение 20 минут, остаток отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром в объеме N×(0,45÷0,55) мл. После чего дважды перекристаллизовывают из этилацетата: первый раз – с активированным порошковым углем Silicarbon CW20 в количестве N×(6÷9) мг, второй раз – без угля, причем выход конечного продукта составляет: N×(0,36÷0,42) ммоль. Технический результат - повышение выхода конечного продукта, снижение длительности процесса получения конечного продукта 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида. 6 табл., 4 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно к новым лекарственным средствам, которые могут найти применение в химико-фармацевтической и медицинской промышленности, конкретно к производным изотиурония, которые обладают радиозащитным действием и могут применяться в качестве радиопротекторов и средств профилактики осложнений лучевой терапии.

Уровень техники

По мнению специалистов в области радиационной медицины и радиационной безопасности, имеющийся арсенал противолучевых средств, допущенных к применению для человека, не удовлетворяет в полной мере современные практические потребности, возросшие в последние годы в связи с нарастанием террористической активности и геополитической нестабильности, а также широким применением радиологических методов диагностики и лечения (Рождественский Л.М. Проблемные вопросы разработки противолучевых средств. Радиац. биология. Радиоэкология. 2019. 59(2): 117-26. Singh V.K., Newman V.L., Romaine P.L. et al. Radiation countermeasure agents: an update (2011-2014). Expert. Opin. Ther. Pat. 2014. 24(11): 1229-55).

В настоящее время известно значительное число соединений различных химических классов, снижающих при профилактическом применении частоту и тяжесть острых радиационных поражений (Гребенюк А.Н., Гладких В.Д. Современное состояние и перспективны разработки лекарственных средств для профилактики и ранней терапии радиационных поражений. Радиац. биология. Радиоэкология. 2019. 59(2): 132-49. Singh V.K., Seed N.V., Olabisi A.O. Drug discovery strategies for acute radiation syndrome. Expert Opin Drug Discov. 2019. 14(7): 701-15). Вместе с тем низкая переносимость и потенциальная токсичность для человека остаются непреодолимыми препятствиями для возможности клинического применения многих известных радиопротекторов (Филимонова М.В., Филимонов А.С. Современные проблемы и перспективы разработки и внедрения отечественных противолучевых лекарственных средств. Радиац. биология. Радиоэкология. 2019. 59(2): 127-31; Singh V.K., Seed T.M. A review of radiation countermeasures focusing on injury-specific medicinals and regulatory approval status: Part I. Radiation subsyndromes, animal models and FDA-approved countermeasures. Int. J. Radiat. Biol. 2017. 93: 851–69). Так, например, единственным препаратом, допущенным к клиническому применению для профилактики осложнений радиотерапии, во всем мире, по-прежнему, остается только радиопротектор амифостин. Но его применение имеет много противопоказаний и проводится при тщательном врачебном контроле в связи с рисками развития острых негативных эффектов, требующих неотложной коррекции (Hensley M.L., Hagerty K.L., Kewalramani T. et al. American Society of Clinical Oncology 2008 clinical practice guideline update: use of chemotherapy and radiation therapy protectants. J. Clin. Oncol. 2009. 27(1): 127–45).

Такие обстоятельства диктуют необходимость поиска и разработки более совершенных противолучевых фармакологических средств, имеющих приемлемый для клинического применения уровень безопасности.

Ранее нами было разработано вазоконстрикторное средство (RU 2475479 С1), которое применяется в качестве противолучевых средств N,S-замещенных изотиомочевин с общей структурной формулой:

где R = (CH₃)₂CH; C₂H_5,которые являются ингибиторами синтаз оксида азота (ингибиторы NOS), обладают сосудосуживающим и радиозащитным действием.

В последующих исследованиях нами было показано, что в ряду изотиомочевин, описанных в RU 2475479, наиболее перспективной для дальнейшей фармакологической разработки является – гидробромид 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (далее, соединение Т1023):

В радиологических исследованиях in vitro на изолированных изоформах NOS установлено, что соединение Т1023 является эффективным ингибитором NOS с существенной (в 10-15 раз) избирательностью к eNOS и iNOS (IC50: 52,3 мкмоль для nNOS; 3,2 мкмоль для iNOS; 5,1 мкмоль для eNOS). При пероральном и парентеральном введении Т1023 in vivo в дозах свыше 1/60 ЛД10 (5 мг/кг) развивается сосудосуживающее действие. При дозах Т1023 свыше 1/8 ЛД10 (40 мг/кг) этот сосудистый эффект вызывает рефлекторные изменения в гемодинамике (снижение сердечного выброса на 30-40% в течение 90-120 минут), способствующие развитию транзиторной гипоксии, повышающей радиорезистентность биологических тканей. При этом в оптимальных дозах (70-80 мг/кг за 15-20 минут до облучения) Т1023 обеспечивает выраженное противодействие развитию костномозговой и кишечной форм острой лучевой болезни у лабораторных животных, не уступая в эффективности (ФИД – 1,6-1,9) защитному действию таких известных радиопротекторов, как амифостин, цистамин, индралин, мексамин, серотонин (ФИД – 1,4-1,6) (Filimonova M.V. et al. Radioprotective activity of the nitric oxide synthase inhibitor T1023. Toxicological and biochemical properties, cardiovascular and radioprotective effects. Radiat. Res. 2020. 194(5): 532-543).

Такой механизм противолучевого действия позволяет соединению Т1023 также обеспечивать эффективную (ФИД – 1,4-1,7) профилактику острых и отдаленных осложнений лучевой терапии солидных опухолей, не уступая при этом в профилактической эффективности амифостину – единственному на сегодняшний день противолучевому средству, допущенному для клинического применения (Filimonova M.V. et al. The ability of the nitric oxide synthases inhibitor Т1023 to selectively protect the non-malignant tissues. Int. J. Mol. Sci. 2021. 22(17): 9340).

В пользу перспективности Т1023 в качестве противолучевого средства свидетельствуют также и фармакологические показатели его безопасности. Оценки радиозащитной широты (ЛД50/ЕД50 – 6,1) и терапевтического индекса (ЛД10/ЕД50 – 4,7) этого соединения в 2-3 раза превышают соответствующие показатели, характерные для таких известных радиопротекторов, как меркамин, цистамин, амифостин (ЛД50/ЕД50 – 2,2-3,5) (Vasin M.V., Ushakov I.B. Comparative efficacy and the window of radioprotection for adrenergic and serotoninergic agents and aminothiols in experiments with small and large animals. J. Radiat. Res. 2014, 56: 1–10).

Однако, в химико-технологических работах по синтетической реализации Т1023 было установлено, что исходный общий способ лабораторного получения, описанный нами ранее в патенте RU 2475479 для четырех производных изотиомочевины, в отношении получения гидробромида 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины является неоптимальным, и в этом случае имеет существенные недостатки.

Согласно патенту RU 2475479, исходный способ получения группы изотиомочевин, в которую входит и соединение Т1023, состоит в том, что 1-изобутаноилтиомочевину подвергают алкилированию двукратным избытком соответствующего галоидного алкила в инертном органическом растворителе в течение 20 часов в запаянной ампуле при температуре 100°C. Предпочтительным растворителем является ацетонитрил, используемый в объеме 2,5-5 мл на 1 г изобутаноилтиомочевины. Далее растворитель упаривают, осадок отфильтровывают и трижды перекристаллизовывают из 4-метил-2-пентанона.

Применительно к соединению Т1023, исходный способ синтеза состоит в проведении в описанных условиях алкилирования изобутаноилтиомочевины двукратным избытком изопропилбромида:

В последующих химико-технологических экспериментах был установлен ряд особенностей синтеза соединения Т1023:

- прохождение реакции алкилирования достигается в присутствии меньшего количества изопропилбромида – не при двукратном избытке (200%), а при избытке 140-160%;

- оптимальная реакционная среда для алкилирования создается в ацетонитриле, используемом в меньшем объеме – не 2-5 мл на 1 г изобутаноилтиомочевины, а 1,6-1,8 мл на 1 г изобутаноилтиомочевины;

- полное прохождение алкилирования в запаянной ампуле достигается за 10 часов при температуре 90˚C.

Кроме того, было показано, что упрощение очистки субстанции соединения Т1023 до необходимого уровня чистоты и снижение при этом потерь конечного продукта достигается:

- при начальном промывании отфильтрованного осадка диэтиловым эфиром в объеме 3-3,7 мл на 1 г изобутаноилтиомочевины;

- при перекристаллизации осадка из растворителя с более низкой температурой кипения – не из 4-метил-2-пентанона, а из этилацетата;

- при применении при первой перекристаллизации активированного порошкового угля (Silicarbon CW20) в количестве 40-60 мг на 1 г изобутаноилтиомочевины.

Как будет показано ниже, реализация совокупности этих изменений в исходном способе позволяет получить идентичную исходной (по химическим, физико-химическим, токсикологическим и радиозащитным характеристикам) субстанцию 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида. И при этом позволяет достичь существенных преимуществ в сравнении с исходным способом получения по экономически значимым аспектам, а именно:

- повышение выхода конечного продукта – на 22-25%;

- снижение стоимости химических реагентов, необходимых для полного цикла получения конечного продукта – на 20% (на 33% – для получения 1 г продукта);

- снижение длительности полного цикла получения конечного продукта – на 40%.

Учитывая высокую перспективность соединения Т1023 к дальнейшей разработке в качестве противолучевого средства, отмеченный характер и уровень преимуществ усовершенствованного способа имеет высокое практическое значение для химико-фармацевтической и медицинской промышленности, и является основанием для подачи заявки на способ получения 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа получения 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида.

Задача решается тем, что при получении 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида со структурной формулой:

,

при этом смесь изобутаноилтиомочевины в количестве N ммоль, изопропилбромида в количестве N×(1,4÷1,6) ммоль и сухого ацетонитрила в объеме N×(0,24÷0,27) мл нагревают в запаянной ампуле при температуре 90°C в течение 10 часов, после чего содержимое ампулы переносят в колбу, упаривают ацетонитрил в течение 20 минут, остаток отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром в объеме N×(0,45÷0,55) мл и затем дважды перекристаллизовывают из этилацетата: первый раз – с активированным порошковым углем (Silicarbon CW20) в количестве N×(6÷9) мг, второй раз – без угля, причем выход конечного продукта составляет: N×(0,36÷0,42) ммоль (36-42%).

Полученный технический результат позволит повысить выход конечного продукта, снизить стоимость химических компонентов, необходимых для получения конечного продукта, снизить длительность процесса получения конечного продукта при лабораторном получении субстанции 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, имеющей химическую, физико-химическую, токсикологическую и фармакологическую (радиозащитную) идентичность с субстанцией этого соединения, полученной исходным способом.

Осуществление изобретения

Возможности предложенного способа синтеза соединения Т1023, а также физико-химическая, токсикологическая и фармакологическая (радиозащитная) идентичность субстанции 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученной исходным (RU 2475479) и предложенным способом, и аргументы, доказывающие достижение заявленного технического результата, отражены в последующих примерах.

Пример 1. Сопоставление характеристик конечного продукта и экономически значимых аспектов исходного и предложенного способов получения.

Для детального сопоставления исходного и предложенного способов получения соединения Т1023, в этом примере изучаются характеристики конечных продуктов – субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, а также экономически значимые аспекты процессов получения этих продуктов исходным и предложенным способами при использовании равного количества предшествующей ацилированной тиомочевины – из 6 г (40 ммоль) изобутаноилтиомочевины.

Получение Т1023 по исходному способу (RU 2475479)

Смесь изобутаноилтиомочевины – 6 г (40 ммоль), изопропилбромида – 9,8 г (80 ммоль) и сухого ацетонитрила – 15 мл, в запаянной ампуле инкубировали в лабораторной бане при температуре 100˚C в течение 20 часов. Далее растворитель упаривали 20 минут, осадок отфильтровывали и трижды перекристаллизовывали из 4-метил-2-пентанона. Выход чистого продукта: 3,4 г (31,6% по изобутаноилтиомочевине).

Получение Т1023 по усовершенствованному способу

Смесь изобутаноилтиомочевины – 6 г (40 ммоль), изопропилбромида – 7,4 г (60 ммоль) и сухого ацетонитрила – 10 мл, в запаянной ампуле инкубировали в лабораторной бане при температуре 90˚C в течение 10 часов. Далее растворитель упаривали 20 минут, осадок отфильтровывали, промывали 20 мл эфира и дважды перекристаллизовывали из этилацетата (первый раз – с 0,3 г активированного порошкового угля Silicarbon CW20). Выход чистого продукта: 4,1 г (38,1% по изобутаноилтиомочевине).

Для того чтобы детально, на уровне требований действующей фармакопеи, сопоставить качество субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных по исходному и предложенному способам, необходимо применение верифицированных методов высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии количественного определения изобутаноилизопропилизотиомочевины гидробромида и содержания родственных, сопутствующих и посторонних примесей. В настоящее время такие методы еще не разработаны, и проведение их разработки и верификации планируется на этапе доклинических исследований соединения Т1023 в качестве радиозащитного средства. Поэтому в этом случае мы ограничиваемся «стандартными» физико-химические исследованиями, используемыми в органической и медицинской химии для идентификации и доказательства структуры соединений и оценки их чистоты. Такие методы, хотя и более качественно, тем не менее, также позволяют сопоставить между собой полученные субстанции (Таблица 1).

Таблица 1

Физико-химические показатели субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных по исходному и предложенному способу

Показатель	Исходный способ	Предложенный способ
Спектр ¹H ЯМР	1.1 (d, 6H), 1.36 (d, 6H), 2.73 (m, 1H), 4.1 (m, 1H), 10.9 (tr, 2H)	1.1 (d, 6H), 1.37 (d, 6H), 2.72 (m, 1H), 4.1 (m, 1H), 10.9 (tr, 2H)
Элементный анализ	Расчет (%): C 35.69; H 6.37; N 10.41 Найдено: C 35.76; H 6.51; N 10.45	Расчет (%): C 35.69; H 6.37; N 10.41 Найдено: C 35.67; H 6.44; N 10.43
T плавления	129-131°C	130-131°C
Rf *	0.35	0.35
pH **	3.73	3.77

Примечание: * - ТСХ в системе бензол-этанол-триэтиламин (9:1:0,1);

** - для 1% водного раствора при 20°C.

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют, что доминирующая часть обеих субстанций представлена одним и тем же, идентичным, химическим соединением – наблюдается практически полное совпадение параметров их 1H ЯМР-спектров и результатов элементного анализа. Также есть основания полагать, что обе субстанции имеют сходное, низкое содержание примесей. В пользу такого вывода свидетельствуют результаты тонкослойной хроматографии (ТСХ) – обе субстанции при движении по ТСХ-пластинам не дают расслоений и формируют по одному четкому пятну, положение которого соответствует коэффициенту замедления (Rf) с одним и тем же значением; а также данные pH-метрии стандартных фармакопейных растворов субстанций, различия водородных показателей которых не превышают точности метода (<0,05). Вместе с тем, есть основание считать, что субстанция Т1023, полученная предложенным способом, имеет более высокую чистоту: диапазон температур, в которых регистрируется фазовый переход (плавление) этой субстанции более узкий (130-131°C), чем у субстанции, полученной исходным способом (129-131°C), и его ширина не превышает 1°C. Такой узкий диапазон температур плавления характерен для чистых веществ фармакопейной категории «общее содержание примесей <1%» (Таблица 2).

Таблица 2

Количество и стоимость химических реагентов при получении близкого количества субстанции 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида по исходному и предложенному способу, выход конечного продукта

Наименование	Исходный способ		Предложенный способ
Наименование	Количество	Стоимость, руб.	Количество	Стоимость, руб.
Изобутаноилтиомочевина	6 г	1033,2	6 г	1033,2
Изопропилбромид	9,8 г	572,9	7,4 г (Δ = -24,5%)	432,6
Сухой ацетонитрил	15 мл	126,3	10 мл (Δ = -33,3%)	84,2
4-метил-2-пентанон	60 мл	302,3	-	-
Диэтиловый эфир	-	-	20 мл	12,1
Этилацетат	-	-	90 мл	60,4
Уголь Silicarbon CW20	-	-	0,3 г	0,7
Суммарная стоимость реактивов		2034,7		1623,2 (Δ = -20,2%)
Суммарная стоимость реактивов на 1 г конечного продукта		598,4		395,9 (Δ = -33,8%)
Выход конечного продукта, % #	31.3 ± 2.9		38.6 ± 3.5 (p = 0,0074)

Примечание: стоимость реагентов рассчитана по розничным ценам в компании ООО «ХимМед» по состоянию на май 2023 года;

# – статистика (M±SD) по 5-м независимым синтезам обеими способами,

p – уровень значимости статистического различия между способами получения

по U-критерию Манна-Уитни.

Вместе с тем, по экономически значимым аспектам, таким как выход конечного продукта, количество и стоимость реагентов для проведения цикла синтеза равного объема, время выполнения цикла синтеза равного объема, между исходным и усовершенствованным способом получения прослеживались существенные различия.

Как отмечено в патенте RU 2475479, выход в ряду описанных изотиомочевин (в том числе и Т1023) в исходном способе получения в значительной степени определяется объемом алкильного радикала в алкилирующем агенте: так, выход Т1023 (алкилирование изобутаноилтиомочевины избытком изопропилбромида (алкил C4)) составляет около 31-33%, а выход соединения Т1032 (алкилирование изобутаноилтиомочевины избытком менее объемного этилбромида (алкил C2)) при тех же условиях составляет 60-64%.

Это «ограничение» глубины алкилирования изобутаноилтиомочевины избытком изопропилбромида, возможно, сохраняется и в предложенном способе. Тем не менее, как показано выше в примерах получения Т1023, при предложенном способе наблюдается умеренное повышение (на 6,5%) абсолютного выхода конечного продукта. Для более точной оценки этого эффекта нами было выполнено по пять независимых синтезов исходным и предложенным способами. И результаты анализа выхода конечного продукта в этих технологических экспериментах позволяют утверждать (таблица 2), что предложенный способ получения стабильно и статистически достоверно (p = 0,0074) обеспечивает более высокий на 7-8% абсолютный выход конечного продукта: от (31.3±2.9)% – при исходном способе, до (38.6±3.5)% – при предложенном способе (относительное возрастание выхода продукта – на 22,4-25,6%).

Этот позитивный эффект, по нашему мнению, связан со снижением потерь продукта при очистке субстанции в предложенном способе.

Во-первых, применение в новом способе предварительной промывки осадка эфиром, а также использование сорбента (угля Silicarbon CW20) позволили снизить число перекристаллизаций без потери качества чистоты конечной субстанции.

Во-вторых, в предложенном способе получения для перекристаллизаций используется более приемлемый растворитель. Применяемый в исходном способе 4-метил-2-пентанон имеет высокую температуру кипения (133°C), превышающую температуру плавления Т1023 (130-131°C). И растворение в таком кипящем растворителе кристаллического Т1023 сопровождается разложением некоторой части продукта. Используемый в предложенном способе этилацетат имеет более низкую точку кипения (77°C), что способствует снижению масштабов этих потерь.

Второй экономически значимый аспект, в котором прослеживаются уже более выраженные различия между исходным и предложенным способами, касается количества и стоимости химических реагентов, необходимых для выполнения равных по объему циклов получения 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида (таблица 2). В предложенном способе для проведения эквивалентного по объему синтеза требуется существенно меньшее количество растворителя (ацетонитрил, -33%) и алкилирующего агента (изопропилбромид, -25%) в сравнении с исходным способом. Кроме того, при очистке субстанции в предложенном способе применяется растворитель (этилацетат), имеющий значительно (в 5 раз) меньшую стоимость, чем растворитель (4-метил-2-пентанон), применяемый для этого в исходном способе. В результате этого суммарная стоимость химических компонентов, необходимых для проведения полного цикла получения конечного продукта по предложенному способу на 20% ниже, чем аналогичная стоимость по исходному способу. А возросший выход конечного продукта еще более увеличивает этот выигрыш: в предложенном способе стоимость химических компонентов для получения 1 г конечного продукта на 34% меньше этой стоимости по исходному способу получения.

Не менее выраженные преимущества предложенного способа прослеживаются и по хронометрическим показателям процесса (Таблица 3).

Таблица 3

Хронометрические показатели цикла получения сходного количества субстанции

1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида по исходному и предложенному способу

Стадия процесса	Время, час
Стадия процесса	Исходный способ	Предложенный способ
Химический синтез	20,8	10,8 (Δ = -48,1%)
Выделение субстанции	0,6	0,6
Очистка субстанции	3,8	2,7 (Δ = -28,9%)
Вакуумная сушка субстанции	2,5	2,5
Общая длительность получения	27,7	16,6 (Δ = -40,1%)

В предложенном способе повышение концентрации химических реагентов в реакционной среде (за счет снижения объема растворителя ацетонитрила на 33%) позволяет достичь такой же глубины алкилирования изобутаноилтиомочевины избытком изопропилбромида в значительно более короткие сроки: не за 20 часов, а за 10 часов. Это сокращает время проведения стадии синтеза в предложенном способе на 48%, в сравнении с исходным способом. Кроме того, снижение числа перекристаллизаций субстанции в предложенном способе значительно, на 29%, сокращает время стадии очистки. И в результате этого, общая длительность полного цикла получения конечного продукта по предложенному способу сокращается на 40% в сравнении с исходным способом получения.

Пример 2. Токсикологические характеристики субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных предложенным и исходным способом.

Исследование острой токсичности субстанции соединения Т1023, полученной исходным способом (RU 2475479), было ранее проведено нами по методу Литчфилда-Уилкоксона на самцах белых аутбредных мышей при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 150-600 мг/кг (Filimonova M.V. et al. Radioprotective activity of the nitric oxide synthase inhibitor T1023. Toxicological and biochemical properties, cardiovascular and radioprotective effects. Radiat. Res. 2020. 194(5): 532-543). И в данном случае, для адекватного сопоставления, токсикологические характеристики субстанции Т1023, полученной предложенным способом, также были исследованы по Литчфилду-Уилкоксону на таких же животных, при тех же дозах и способе введения. Соединение Т1023 применяли в виде 1,5-6% растворов, которые вводили животным однократно, внутрибрюшинно в объеме 10 мл/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток.

Результаты клинических наблюдений в этих исследованиях свидетельствовали о сходстве токсического действия субстанций соединения Т1023, полученных исходным и предложенным способом. В обоих случаях при применении токсических доз (свыше 250 мг/кг) развивалась сходная картина интоксикации, и отмечалась близкая временная динамика и количественная выраженность летального действия. Токсическая идентичность субстанций соединения Т1023, полученных разными способами, в этих исследованиях также подтверждалась близостью рассчитанных по Литчфилду-Уилкоксону стандартных параметров острой токсичности (Таблица 4). Слабые различия величин этих параметров не превышали точности метода и статистических погрешностей.

Таблица 4

Параметры острой токсичности субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных исходным и предложенным способом, при однократном внутрибрюшинном введении аутбредным мышам

Способ получения	ЛД10, мг/кг	ЛД16, мг/кг	ЛД50, мг/кг	ЛД84, мг/кг
Исходный *	317	333	410 ± 17	488
Предложенный	313	331	412 ± 19	494

Примечание: * - ранее полученные данные.

Пример 3. Радиозащитная активность субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных предложенным и исходным способом.

Сравнительное исследование противолучевой активности субстанций соединения Т1023, полученных исходным и предложенным способом, проведено на самцах мышей F1 (CBA×C57BL/6) по стандартному тесту 30-суточной выживаемости (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. 2-изд., перераб. и доп. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. 832 с.) после воздействия γ-излучения в дозах 8 и 12 Гр, при которых у мышей развивается, соответственно, костномозговая и кишечная форма острой лучевой болезни.

Для каждой дозы γ-излучения использовали по 3 группы мышей (15 особей в каждой): контрольную и две опытных. Животные контрольной группы получали только лучевое воздействие. Мышам первой опытной группы за 30 минут до облучения однократно, внутрибрюшинно вводили Т1023, полученное исходным способом, а мышам второй группы в такие же сроки и таким же способом вводили Т1023, полученное предложенным способом. Дозы обеих субстанций составляли 75 мг/кг (0,75% растворы вводили в объеме 10 мл/кг). Тотальное воздействие γ-излучением ⁶⁰Co на мышей проводили в группах по 7-8 особей на установке «Луч-1» (Россия) с мощность дозы 1,5 Гр/мин. Состояние животных и их гибель контролировали при 2-кратном ежедневном осмотре в течение 30 суток после лучевого воздействия.

Таблица 5

Влияние субстанций 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученных исходным и предложенным способом, на выживаемость мышей при воздействии γ-излучения в дозах 8 и 12 Гр

Доза γ-излучения	Группа	Выживаемость, %
Доза γ-излучения	Группа	6-суточная	12-суточная	30-суточная
8 Гр	Контроль	95 (19/20)	70 (14/20)	20 (4/20)
	Т1023, исходный способ	100 (20/20)	100 (20/20)	90 (18/20) *
	Т1023, предложенный способ	100 (20/20)	100 (20/20)	100 (20/20) *
12 Гр	Контроль	55 (11/20)	5 (1/20)	0 (0/20)
	Т1023, исходный способ	100 (20/20) *	95 (19/20) *	35 (7/20) *
	Т1023, предложенный способ	100 (20/20) *	100 (20/20) *	50 (10/20) *

Примечание: * - статистически достоверное различие с контролем по точному критерию Фишера с поправками Холма-Бонферрони для множественного сравнения.

Результаты этого исследования показали (таблица 5), что субстанции соединения Т1023, полученные исходным и предложенным способами, в использованных дозах обеспечивали выраженную профилактику как костномозговой (8 Гр), так и кишечной (12 Гр) формы острой лучевой болезни, что в данном случае проявлялось статистически достоверным повышением выживаемости облученных мышей в сравнении с облученным контролем. Причем при обоих лучевых синдромах радиозащитные эффекты субстанции Т1023, полученной предложенным способом, количественно были несколько более выражены. У мышей, получивших воздействие этого варианта Т1023, 30-суточная выживаемость на 10-15% превосходила аналогичные показатели мышей, получивших воздействие субстанции Т1023, полученной исходным способом. И хотя эти различия оставалось в пределах статистической тенденции (p = 0,1274-0,1902), нельзя исключить, что эта тенденция являлось отражением более высокой чистоты субстанции, полученной предложенным способом, и, соответственно, большего содержания в ней действующего вещества.

Пример 4. Сравнение радиозащитной активности субстанции 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученной предложенным способом, и эталонного радиопротектора амифостина.

Сравнительное исследование противолучевой активности субстанции соединения Т1023, полученной предложенным способом, и амифостина (Ethyol; USB Pharma, Бельгия) проведено на самцах мышей F1 (CBA×C57BL/6) по тесту 30-суточной выживаемости после воздействия γ-излучения в дозах 8 и 12 Гр, при которых у мышей развивается, соответственно, костномозговая и кишечная форма острой лучевой болезни.

Для каждой дозы γ-излучения использовали по 3 группы мышей (по 25 особей в каждой): контрольную и две опытных. Животные контрольной группы получали только лучевое воздействие. Мышам первой опытной группы за 30 минут до облучения однократно, внутрибрюшинно вводили Т1023, полученное предложенным способом, в дозе 75 мг/кг (0,75% раствор вводили в объеме 10 мл/кг), а мышам второй опытной группы в такие же сроки и таким же способом вводили амифостин в дозе 250 мг/кг (2,5% раствор вводили в объеме 10 мл/кг). Тотальное воздействие γ-излучением 60Co на мышей проводили в группах по 10 особей на установке «Луч-1» (Россия) с мощность дозы 1,3 Гр/мин. Состояние животных и их гибель контролировали при 2-кратном ежедневном осмотре в течение 30 суток после лучевого воздействия.

Результаты этого исследования показали, что при костномозговой форме лучевой болезни (8 Гр) амифостин и соединение Т1023 в использованных дозах реализовали выраженное, равное по эффективности радиозащитное действие. В опытных группах мышей, получивших превентивное воздействие этих радиопротекторов, до конца наблюдения сохранялась 100%-я выживаемость, в то время как в контрольной группе мышей, облученных в дозе 8 Гр, 30-суточная выживаемость составила 16% (Таблица 6).

Таблица 6

Влияние субстанции 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, полученной предложенным способом, и амифостина на выживаемость мышей при воздействии γ-излучения в дозах 8 и 12 Гр

Доза γ-излучения	Группа	Выживаемость, %
Доза γ-излучения	Группа	6-суточная	12-суточная	30-суточная
8 Гр	Контроль	92 (23/25)	64 (16/25)	16 (4/25)
	Амифостин	100 (25/25)	100 (25/25) *	100 (25/25) *
	Т1023, предложенный способ	100 (25/25)	100 (25/25) *	100 (25/25) *
12 Гр	Контроль	56 (14/25)	8 (2/25)	0 (0/25)
	Амифостин	100 (25/25) *	88 (22/25) *	20 (5/25) *
	Т1023, предложенный способ	100 (25/25) *	100 (25/25) *	52 (13/25) * #

Примечание:

* - статистически достоверное различие с контролем по точному критерию Фишера с поправками Холма-Бонферрони для множественного сравнения; # - статистически достоверное различие с группой, получавшей амифостин, по точному критерию Фишера с поправками Холма-Бонферрони для множественного сравнения.

При кишечной форме лучевой болезни (12 Гр) амифостин и соединение Т1023 в использованных дозах также реализовали достоверное профилактическое радиозащитное действие. Причем, при лучевом поражении γ-излучением в такой высокой, абсолютно летальной дозе радиозащитный эффект Т1023, полученного по предложенному способу, достоверно (p = 0,0378) превосходил защитный эффект амифостина: 30-суточная выживаемость мышей, получивших воздействие Т1023, на 32% превосходила этот показатель мышей, получивших воздействие амифостина.

Кроме того, следует отметить, что в данном случае между сопоставляемыми средствами присутствует еще одно существенное различие, которое касается уровня их безопасности. Амифостин имеет характерную для всех аминотиоловых радиопротекторов особенность – такие средства реализуют эффективное противолучевое действие только при их применении в высоких дозах, близких к максимально-переносимой (ЛД10). У мышей радиозащитное действие амифостина проявляется только при его применении в дозах выше 0,3⋅ЛД10, а выраженный эффект – при дозах свыше 0,5⋅ЛД10 (Singh V.K., Seed T.M. A review of radiation countermeasures focusing on injury-specific medicinals and regulatory approval status: Part I. Radiation subsyndromes, animal models and FDA-approved countermeasures. Int. J. Radiat. Biol. 2017. 93: 851–69). В связи с этим в данном эксперименте амифостин был применен в дозе 0,55⋅ЛД10. Соединение Т1023 относится к иному классу химических соединений, не имеет таких негативных особенностей, и его оптимальные радиозащитные дозы 70-80 мг/кг находятся на более безопасном уровне – соответствуют (0,21-0,24)⋅ЛД10 (Filimonova M.V. et al. Radioprotective activity of the nitric oxide synthase inhibitor T1023. Toxicological and biochemical properties, cardiovascular and radioprotective effects. Radiat. Res. 2020. 194(5): 532-543). В данном исследовании соединение Т1023 применено в дозе 0,22⋅ЛД10.

Таким образом, результаты этого исследования свидетельствуют, что при среднелетальных дозах γ-излучения, для которых характерно развитие костномозговой формы острой лучевой болезни, радиозащитное действие амифостина и соединения Т1023, полученного предложенным способом, является сходным, максимально выраженным, обеспечивающим 100%-ю 30-суточную выживаемость облученных животных. При сверхлетальных дозах γ-излучения, для которых характерно развитие кишечной формы острой лучевой болезни, соединение Т1023, полученное предложенным способом, реализует достоверно более эффективное радиозащитное действие, чем амифостин. Причем, в отличие от эталона, который эффективен только при применении в субтоксических дозах, Т1023 обеспечивал такое выраженное радиозащитное действие при его применении в существенно более безопасных дозах – в 4-5 раз меньше токсического порога.

Таким образом, совокупность данных, отраженных в приведенных примерах, свидетельствует, что предложенный способ позволяет получить субстанцию 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида с подтвержденной химической, химико-физической и токсикологической идентичностью субстанции этого соединения, полученной исходным способом (согласно патенту RU 2475479). При этом у субстанции Т1023, полученной предложенным способом, наблюдается умеренное возрастание радиозащитных способностей, и на моделях острой лучевой болезни у мышей она демонстрирует достоверные преимущества в противолучевой эффективности и безопасности над общепризнанным эталонным радиопротектором амифостином.

Усовершенствованный нами способ получения гидробромида 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины имеет ряд экономически значимых аспектов и позволяет:

- повысить выход конечного продукта на 22-25%,

- снизить стоимость химических реагентов, необходимых для полного цикла получения конечного продукта на 20%,

- снизить длительность полного цикла получения конечного продукта на 40%. Совокупность этих данных свидетельствует о достижении заявленного технического результата.

Claims

Усовершенствованный способ получения радиозащитного средства 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромида, со структурной формулой:
,
отличающийся тем, что смесь изобутаноилтиомочевины в количестве N ммоль, изопропилбромида в количестве N×(1,4÷1,6) ммоль и сухого ацетонитрила в объеме N×(0,24÷0,27) мл нагревают в запаянной ампуле при температуре 90°C в течение 10 часов, после чего содержимое ампулы переносят в колбу, упаривают ацетонитрил в течение 20 минут, остаток отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром в объеме N×(0,45÷0,55) мл и затем дважды перекристаллизовывают из этилацетата: первый раз – с активированным порошковым углем Silicarbon CW20 в количестве N×(6÷9) мг, второй раз – без угля, причем выход конечного продукта составляет: N×(0,36÷0,42) ммоль.