RU2795014C1 - Олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 - Google Patents
Олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795014C1 RU2795014C1 RU2022126124A RU2022126124A RU2795014C1 RU 2795014 C1 RU2795014 C1 RU 2795014C1 RU 2022126124 A RU2022126124 A RU 2022126124A RU 2022126124 A RU2022126124 A RU 2022126124A RU 2795014 C1 RU2795014 C1 RU 2795014C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- delhv69
- mutation
- seq
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 10
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 21
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 9
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 8
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 6
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 6
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 description 3
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 2
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101100203795 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 S gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2, прямой праймер d6Acv-F, обратный праймер d6Acv-R, флуоресцентный зонд d6Ocv-Z1Y, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 соответственно. При этом для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Alpha (В. 1.1.7), Omicron (В.1.1.529), Eta (В.1.525), В. 1.620, С.36.3. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:delHV69-70. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и может применяться для идентификации геновариантов S ARS-CoV-2 при эпидемиологических исследованиях.
Коронавирусная инфекция (COVID-19) это инфекционное заболевание, вызванное SARS-CoV-2. Вирус передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Изменения в структуре генома SARS-CoV-2 приводят к возникновению вариантов, которые ВОЗ обозначила как вызывающие интерес (VOIs, Variants of Interest), вызывающие озабоченность (VOCs, Variants of Concern) и линии VOC под мониторингом (VOC lineages under monitoring (VOC-LUM). Определение мутаций в геноме SARS-CoV-2 и их классификация на VOIs и VOCs и VOC-LUM является важным элементом молекулярно-генетического мониторинга штаммов новой коронавирусной инфекции. Мутации, детекция которых необходима, перечислены в докладах Технической консультативной группы по эволюции вируса SARS-CoV-2 (TAG-VE) ВОЗ [https://www.who.int/publications/m/item/terms-of-reference-for-the-technicsl-advisory-group-on-sars-cov-2-virus-evolution-(tag-ve)].
Для определения геновариантов вируса и проведения молекулярно-генетического мониторинга SARS-CoV-2 используются методы полногеномного и фрагментного секвенирования, которые являются дорогостоящими, трудоемкими методами. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].
Известные протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:
- ORF1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];
- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2];
- ORF1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-l-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];
- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];
- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];
-N
[https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];
- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6 2].
При этом, проведенный анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2 показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложно отрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка.
Из уровня техники известна стратегия скрининга для выявления доминирующего варианта SARS-CoV-2 [A screening strategy for identifying the dominant variant of S ARS-COV-2 in the fifth peak of Kurdistan- Iran population using HRM and Probe-based RT-PCR assay. Mohammad Moradzadac, Hasan Soltani, Hamid Salehi, Khaled Rahmani, Dariush Khateri, Mohammad Zaid Rahimi, Diman Az, Shohreh Fakhari, Journal of Virological Methods, Volume 304, June 2022, 114514, https://doi.org/10.1016 j.jviromet.2022.114514]. где детекцию мутации S-белка S:delHV69-70 осуществляют с использованием анализа плавления с высоким разрешением.
Мультиплексные наборы реагентов для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР, разработаны несколькими компаниями-производителями. Предложенная компанией ThermoFisher Scientific методика основана на использовании зондов типа TaqMan для определения сразу нескольких мутаций, специфичных для разных геновариантов [SARS-CoV-2 Variants Detection Using TaqMan SARS-CoV-2 Mutation Panel Molecular Genotyping Assays. Puja Neopane, Jerome Nypaver, Rojeet Shrestha, Safedin Sajo Beqaj, https://doi.org/10.2147/IDR.S3355831. Наборы, в которых предусмотрена мультиплексная ПЦР-РВ после проведения обратной транскрипции отличаются удобством для пользователя [1) Two-step strategy for the identification of SARS-CoV-2 variant of concern 202012/01 and other variants with spike deletion H69-V70, France, August to December 2020. Antonin Bal, Gregory Destras, Alexandre Gaymard, Karl Stefic, Julien Marlet, Sebastien Eymieux, Hadrien Regue, Quentin Semanas, Constance d'Aubarede, Genevieve Billaud, Frederic Laurent, Claudia Gonzalez, Yahia Mekki, Martine Valette, Maude Bouscambert, Catherine Gaudy-Graffin, Bruno Lina, Florence Morfin, Laurence Josset, Jean-Sebastien Casalegno, Emilie Frobert, Vanessa Escuret, Vinca Icard, Marion Jeannoel, Marie-Paule Milon, Christophe Ramiere, Caroline Scholtes, Jean-Claude Tardy, Mary-Anne Trabaud, Isabelle Schuffenecker, DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2021.26.3.2100008; 2) Recurrent emergence of SARS-CoV-2 spike deletion H69/V70 and its role in the Alpha variant В. 1.1.7. Bo Meng, Steven A Kemp, Guido Papa, Rawlings Datir, Isabella ATM Ferreira, Sara Marelli, William T Harvey, Spyros Lytras, Ahmed Mohamed, Giulia Gallo, Nazia Thakur, Dami A Collier, Petra Mlcochova, COVID-19 Genomics UK (COG-UK) Consortium, Lidia M Duncan, Alessandro M Carabelli, Julia С Kenyon, Andrew M Lever, Anna De Marco, Christian Saliba, Katja Culap, Elisabetta Cameroni, Nicholas J Matheson, Luca Piccoli, Davide Corti, Leo С James, David L Robertson, Dalan Bailey, Ravindra К Gupta, DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109292; 3) Whole-genome sequencing of SARS-CoV-2 showed wide spread of B. 1.525 in February 2021 in Libya. Inas M Alhudiri, Ahmad M Ramadan, Khaled M Ibrahim, Adel Abdalla, Mouna Eljilani, Mohamed Ali Salem, Hajer Mohamed Elgheriani, Salah Edin El Meshri, Adam Elzagheid, https://doi.org/10.1080/19932820.2021.2001210; 4) The challenge of screening SARS-CoV-2 variants of concern with RT-qPCR: One variant can hide another. Jose Valter Joaquim Silva Junior, higryd Merchioratto, Pablo Sebastian Britto de Oliveira, Thaisa Regina Rocha Lopes, Patricia Chaves Brites, Elehu Moura de Oliveira, Rudi Weiblen, Eduardo Furtado Flores, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2021.114248; 5) Rapid and simultaneous identification of three mutations by the Novaplex™ SARS-CoV-2 variants I assay kit. Wakaki Kami, Takeshi Kinjo, Wakako Arakaki, Hiroya Oki, Daisuke Motooka, Shota Nakamura, Jiro Fujita, https://doi.org/10.1016/j.jcv.2021.104877; 6) Патент CN 113817868, 08.07.2021, 21.12.2021; 7) Патент CN 113215312, 28.04.2021, 06.08.2021; 8) Патент CN 113005226, 07.02.2021, 22.06.2021.]. Однако, использование данных наборов не предполагает быстрой возможности замены мишеней для детекции новых геновариантов, содержащих миссенс мутации или замены.
Детекция дополнительных специфичных для возникающих геновариантов мишеней, так же, как и исключение из анализа мишеней для циркулирующих геновариантов позволяет повысить эффективность лабораторного исследования в целом. В связи с этим существует потребность в разработке олигонуклеотидов для выявления мутации S:delHV69-70 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2: праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для проведения ПЦР-РВ.
Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление мутации S:delHV69-70 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 с высокой степенью специфичности посредством таких олигонуклеотидов - праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, которые позволяют эффективно определять геновариант S ARS-CoV-2 с использованием широко доступных методик и материалов.
Технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения наличия мутации S:delHV69-70 в биологическом образце с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, имеющих следующий олигонуклеотидный состав:
прямой праймер d6Acv-F - SEQ ID NO: 1;
обратный праймер d6Acv-R - SEQ ID NO: 2;
флуоресцентный зонд d60cv-Z1Y - SEQ ID NO: 3.
Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего мутацию S:delHV69-70 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, флуоресцентно-меченый конформационно-блокированный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.
Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе известной последовательности S-гена SARS-CoV-2, взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), в результате которого выбран фрагмент для детекции мутации S-гена S:delHV69-70. К выбранному фрагменту подобраны праймеры и зонд для амплификации 133/127 пар оснований: прямой праймер d6Acv-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер d6Acv-R - SEQ ID NO: 2 и флуоресцентный зонд d60cv-Z1Y - SEQ ID NO: 3.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках совершенствования молекулярно-генетического мониторинга вариантов SARS-CoV-2, проведенной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов, взятые из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:delHV69-70 (Alpha (В. 1.1.7), Omicron (В. 1.1.529), Eta (В. 1.525), В. 1.620, С.36.3.). Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, SnapGene Viewer, MEGA, Unipro UGENE. Составляют перечень значимых мутаций, характерных для геновариантов. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченого зонда. Для детекции образцов, содержащих мутацию S:delHV69-70, используют канал для детекции флуорофора R6G. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.
Анализ заявляемых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST продемонстрировал, что прямой праймер d6Acv-F (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер d6Acv-R (SEQ ID NO: 2) амплифицируют участок, в котором располагается мутация S:delHV69-70 со 100% специфичностью.
В качестве биологического материала используются мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 (например, после проведения анализа на наборе реагентов АмплиСенс® COVTD-19-FL).
Выделение РНК из биологического материала проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения РНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения РНК. Оптимальная концентрация РНК 103 - 105 копий в 10 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для проведения реакции ОТ может быть использован комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный набор. Готовый препарат кДНК может храниться при температуре от 2 до 8°С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16°С в течение 6 мес.и при температуре не выше минус 68°С в течение года.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.
Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С)-праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.
Анализ данных проводится на основе детекции амплификатором уровня флуоресцентного сигнала испускаемого интеркалирующим красителем. При увеличении числа копий анализируемого участка детектируется экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала. В результате наблюдается S-образная кривая в случае наличия специфичного флуоресцентному зонду сигнала, или ее отсутствие, в случае неспецифичной для зонда последовательности. Анализ кривых позволяет судить об отсутствии или наличии мутации в исследуемых образцах.
ПЦР-РВ проводится с применением заявляемых, представленных в Таблице 1, олигонуклеотидов - праймеров и зонда, для детекции мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
ПЦР-РВ проводят при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мМ;
- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3 - 0,2 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразы, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl2, например, 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(d) полученная методом обратной транскрипции кДНК - 10 мкл.
Амплификацию проводят на приборе с возможностью флуоресцентной детекции, например, «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 2-5 каналами детекции в соответствии с инструкцией производителя.
Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G.
Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delHV69-70. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными, то есть содержат мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов использованы фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) дикого типа SARS-CoV-2 и геновариантов Alpha (В. 1.1.7), refseq MZ344997 (NCBI); Omicron (В. 1.1.529), refseq OL672836 (NCBI). Для поиска мутаций использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Unipro UGENE, олигокалькулятор (Oligo Calculators) Integrated DNA Technologies, Inc. (Oligo Analyzer (idtdna.com)). Подобран участок S-гена, характерного только для мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2, к которому подобраны олигонуклеотидные последовательности прямого d6Acv-F и обратного d6Acv-R праймеров, а также флуоресцентный зонд d60cv-Z1Y.
Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что прямой d6Acv-F и обратный d6Acv-R праймеры амлифицируют участок с мутацией S:delHV69-70 со 100% специфичностью.
Олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2- прямой праймер d6Acv-F, обратный праймер d6Acv-R, флуоресцентный зонд d6Ocv-Z1Y, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.
Пример 2. Детекция мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ.
Определение мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 проводят методом ПЦР-РВ при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - no 0,7 мМ;
- флуоресцентный зонд: SEQ ID NO: 3 - 0,2 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.
(c) 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2.
(d) полученная после реакции обратной транскрипции («РЕВЕРТА-L» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) кДНК - 10 мкл.
ПЦР-РВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).
Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-3, используют для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Пример 3. Обнаружение мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 выбрано 88 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, содержащие РНК S ARS-CoV-2. Наличие РНК вируса S ARS-CoV-2 подтверждено лабраторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия).
Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.
Наличие РНК SARS-CoV-2 подтверждено лабораторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Чувствительность данного набора в отношении мазков/отделяемых носоглотки и ротоглотки, согласно инструкции, составляет 1*104. Специфичность- 100%. ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delHV69-70. Для 87 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
Для данных 87 образцов наличие мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 1 образце без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.
Таким образом, из всей выборки выявлено 87 образца, содержащих мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
Пример 4. Обнаружение мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 выбрано 96 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, содержащие РНК SARS-CoV-2.
Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Наличие РНК вируса SARS-CoV-2 подтверждено лабораторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Чувствительность данного набора в отношении мазков/отделяемых носоглотки и ротоглотки, согласно инструкции, составляет 1*104 копий/мл. Специфичность - 100%.
ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «Real-time CFX96 Touch» («Bio-Rad», США) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С 10 секунд / 60°С 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delHV69-70. Для 71 образца кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2. Отсутствие мутации в 25 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.
Таким образом, из всей выборки выявлен 71 образец, содержащий мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2.
Пример 5. Обнаружение мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 выбрано 5 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, содержащие РНК SARS-Cov-2. Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Наличие РНК SARS-CoV-2 подтверждено лабораторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Чувствительность данного набора в отношении мазков/отделяемых носоглотки и ротоглотки, согласно инструкции, составляет 1*104. Специфичность - 100%.
ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delHV69-70. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие мутацию S:delHV69-70 вируса SARS-CoV-2.
Наличие других мутаций вируса SARS-CoV-2 в данных 5 образцах и отсутствие мутации S:delHV69-70 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific)), США).
Заявляемое изобретение позволяет выявлять мутацию S:delHV69-70 SARS-CoV-2 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК вируса SARS-CoV-2. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:delHV69-70.
Claims (6)
1. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2, имеющий следующий состав:
прямой праймер d6Acv-F - SEQ ID NO: 1;
обратный праймер d6Acv-R - SEQ ID NO: 2;
флуоресцентный зонд d6Ocv-Z1Y - SEQ ID NO: 3.
2. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Alpha (B.1.1.7), Omicron (B.1.1.529), Eta (B.1.525), B.1.620, C.36.3.
3. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 по п. 1, где флуоресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор R6G и гаситель флуоресценции BHQ1, позволяющий детектировать амплифицированный фрагмент.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2795014C1 true RU2795014C1 (ru) | 2023-04-27 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021211331A1 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Point Of Care Inc. | METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE |
| WO2021211332A2 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Laboratories | Methods and kits for detecting or determining an amount of an anti-β-coronavirus antibody in a sample |
| RU2772362C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-05-19 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
| US20220290221A1 (en) * | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021211331A1 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Point Of Care Inc. | METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE |
| WO2021211332A2 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Laboratories | Methods and kits for detecting or determining an amount of an anti-β-coronavirus antibody in a sample |
| US20220290221A1 (en) * | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| RU2772362C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-05-19 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Немного о мутациях SARS-CoV-2, 19.01.2022, найдено в интернет 07.12.2022 https://habr.com/ru/post/646487/. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhudevi et al. | Fluorogenic RT–PCR assay (TaqMan) for detection and classification of bovine viral diarrhea virus | |
| JP2012005500A (ja) | 食道癌、結腸癌、頭頸部癌、およびメラノーマにおけるマーカーの同定 | |
| US11802317B2 (en) | Kits for detecting Mycobacterium avium/intracellulare nucleic acid | |
| Zhao et al. | Identification of aged bloodstains through mRNA profiling: experiments results on selected markers of 30-and 50-year-old samples | |
| CN115852056B (zh) | 呼吸道病毒检测的荧光pcr试剂盒及检测方法 | |
| WO2010102460A1 (zh) | 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒 | |
| US20170268074A1 (en) | HEV Assay | |
| KR101097560B1 (ko) | 핵산 검출 방법 | |
| RU2795014C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 | |
| RU2791958C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2 | |
| RU2795016C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 | |
| Kim et al. | Diagnostic performance of cross-priming amplification-based lateral flow assay (CPA-LFA) and real-time PCR for koi herpesvirus (KHV) detection | |
| RU2795017C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 | |
| RU2765497C1 (ru) | Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2 | |
| US7074561B2 (en) | Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA | |
| RU2795018C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 | |
| CN116790817A (zh) | 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法 | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| JP2024523655A (ja) | 核酸分析のための方法および組成物 | |
| WO2024005656A1 (es) | Kit de sexado temprano no invasivo mediante pcr en tiempo real para paiche (arapaima gigas) | |
| WO2009140198A2 (en) | Pathogen detection and screening | |
| RU2835209C1 (ru) | Тест-система для обнаружения вируса хлоротической пятнистости листьев яблони методом пцр в реальном времени | |
| Mallus et al. | Usefulness of capillary electrophoresis-based multiplex PCR assay for species-specific identification of Candida spp. | |
| US20240110252A1 (en) | Compositions and Kits for Rapid Detection of SARS-CoV-2 and Methods of Production and Use Thereof | |
| KR102578751B1 (ko) | 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트 |