RU2794288C1

RU2794288C1 - Method for obtaining natural bull sex pheromones

Info

Publication number: RU2794288C1
Application number: RU2022101844A
Authority: RU
Inventors: Олег Борисович Сеин; Дмитрий Олегович Сеин; Нигина Нобоваровна Субботина
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-04-14

Abstract

FIELD: veterinary medicine.

SUBSTANCE: invention relates to methods for producing biologically active drugs to stimulate sexual function in female cattle. The claimed method consists in grinding the testicles of sexually mature bulls to a mince-like state, followed by homogenization to a homogeneous mass in the presence of TWEEN-80 polysorbate together with the tissues of the bladder wall, incubation of the resulting homogenizate at a temperature of 37–39°C for 50–60 minutes and adding the urine of mature bulls, distillation of the resulting homogenizate using a rotary evaporator; to obtain a preparation of bull sex pheromones in the form of a condensate, these components are used in the following ratio: testes 200–250 g, tissues of the bladder wall 200–250 g, TWEEN-80 0.15–0.20 ml, urine — up to 1 liter.

EFFECT: obtaining natural bovine sex pheromones with high biological activity, which can be used to stimulate reproductive function in female cattle.

1 cl, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к способам получения биологически активных препаратов для стимуляции половой функции у самок крупного рогатого скота.The invention relates to veterinary medicine, in particular, to methods for producing biologically active drugs to stimulate sexual function in female cattle.

Известен способ получения половых феромонов из мочи быков, который заключается в том, что мочу от половозрелых быков адсорбируют на обезвоженный силикагель и помещают его в герметически закрытый сосуд над пятиокисью фосфора для поглощения воды из силикагеля. Затем из силикагеля экстрагируют половые феромоны 95-96%-ным этанолом при соотношении 1:1,0-1,5 в течение 20-24 час при 18-20°С. Полученный раствор феромонов в спирте отделяют от силикагеля фильтрацией (Патент РФ №1666102. - 1991 г., авт. В.П. Кононов, Ж.Ж. Нурахметов). Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, для которого необходимы дефицитные реактивы и квалифицированное обеспечение.A known method of obtaining sex pheromones from the urine of bulls, which consists in adsorbing urine from mature bulls on dehydrated silica gel and placing it in a hermetically sealed vessel over phosphorus pentoxide to absorb water from silica gel. Then sex pheromones are extracted from silica gel with 95-96% ethanol at a ratio of 1:1.0-1.5 for 20-24 hours at 18-20°C. The resulting solution of pheromones in alcohol is separated from silica gel by filtration (RF Patent No. 1666102. - 1991, author V.P. Kononov, Zh.Zh. Nurakhmetov). The disadvantage of this method is the complexity of the process, which requires scarce reagents and qualified support.

Известен способ получения препарата 2α-метил-5α-андрост-16-ен-3-он, который используют в качестве обонятельного стимулятора воспроизводительной функции у свиней и коров (Патент РФ №2183640. - 2002 г., авт. Э.П. Зинкевич и др.). Однако данный препарат является синтетическим аналогом половых феромонов самцов и не включает всех компонентов свойственных натуральным половым феромонам. В этой связи его биологическая активность относительно низкая.A known method of obtaining the drug 2α-methyl-5α-androst-16-en-3-one, which is used as an olfactory stimulator of reproductive function in pigs and cows (RF Patent No. 2183640. - 2002, author E.P. Zinkevich and etc.). However, this drug is a synthetic analogue of male sex pheromones and does not include all the components characteristic of natural sex pheromones. In this regard, its biological activity is relatively low.

Известен способ получения препарата натуральных половых феромонов самцов (хряков, быков, жеребцов), который включает механическое измельчение семенников, их гомогенизацию, инкубирование, центрифугирование, смешивание с мочой и перегонку с водяным паром. При этом в гомоге-низат вносят фермент протосубтилин в количестве 1,0-1,5% от общей массы и инкубируют в течение 50-60 мин при 37-39°С. Полученную смесь смешивают с мочой самца в соотношении 1:2,0-2,5 (Патент РФ №2159597.-2000 г., авт. Ю.В. Фурман, О.Б. Сеин, Е.Р. Братчик, Р.А. Ершов, Н.Ф. Ерыженская). Недостатком указанного способа является получение препарата с относительно низкой биологической активностью, а также малый выход конечного продукта.A known method of obtaining a preparation of natural male sex pheromones (boars, bulls, stallions), which includes mechanical grinding of the testes, their homogenization, incubation, centrifugation, mixing with urine and distillation with water vapor. At the same time, the protosubtilin enzyme is added to the homogenizate in an amount of 1.0-1.5% of the total mass and incubated for 50-60 minutes at 37-39°C. The resulting mixture is mixed with the urine of a male in a ratio of 1: 2.0-2.5 (RF Patent No. 2159597.-2000, ed. Yu.V. Furman, O.B. Sein, E.R. Bratchik, R. A. Ershov, N.F. Eryzhenskaya). The disadvantage of this method is to obtain a drug with a relatively low biological activity, as well as a low yield of the final product.

В качестве прототипа выбран способ получения половых феромонов самцов домашних животных (Патент РФ №2623085.-2017 г., авт. О.Б. Сеин, Д.О. Сеин, Н.В. Оленина, О.А. Гладких, В.А. Дураков). Данный способ заключается в том, что для изготовления препарата используют семенники и мочу половозрелых самцов (быков, хряков, баранов), которые получают в условиях мясокомбината или боенских площадок. Семенники освобождают от соединительной ткани и подвергают измельчению на мясорубке, а затем в гомогенизаторе до однородной массы, в которую вносят фермент протосубтилин ГЗ х 23636 - 79 в количестве 1,1-1,5% и полисорбат ТВИН-80 в количестве 0,5-1,0% от общей массы исходного сырья. Полученную смесь инкубируют при температуре 37-39°С в течение 50-60 мин и центрифугируют до разделения на две фракции. Надосадочную жидкость смешивают с мочой в соотношении 1,0:3,0-3,5 и перегоняют с водяным паром. Конденсат является препаратом половых феромонов быка.As a prototype, a method for obtaining sex pheromones of male domestic animals was chosen (RF Patent No. 2623085.-2017, author O.B. Sein, D.O. Sein, N.V. Olenina, O.A. Gladkikh, V. A. Durakov). This method consists in the fact that the testes and urine of sexually mature males (bulls, boars, rams) are used for the manufacture of the drug, which are obtained in the conditions of a meat processing plant or slaughterhouses. The testicles are freed from connective tissue and subjected to grinding in a meat grinder, and then in a homogenizer to a homogeneous mass, into which the enzyme protosubtilin GZ x 23636 - 79 is added in an amount of 1.1-1.5% and polysorbate TVIN-80 in an amount of 0.5- 1.0% of the total weight of the feedstock. The resulting mixture is incubated at a temperature of 37-39°C for 50-60 min and centrifuged to separate into two fractions. The supernatant is mixed with urine in a ratio of 1.0:3.0-3.5 and distilled with water vapor. The condensate is a preparation of bull sex pheromones.

Недостатком способа-прототипа является получение препарата с относительно низкой биологической активностью. Это связано с использованием в технологическим процессе фермента протосубтилина ГЗ х 23636 - 79, который разрушает белковую часть половых феромонов и тем самым снижает их биологическую активность.The disadvantage of the prototype method is to obtain a drug with a relatively low biological activity. This is due to the use in the technological process of the enzyme protosubtilin G3 x 23636 - 79, which destroys the protein part of sex pheromones and thereby reduces their biological activity.

Технической задачей изобретения является получение препарата натуральных половых феромонов быка с высокой биологической активностью, который можно использовать для стимуляции репродуктивной функции у самок крупного рогатого скота.The technical objective of the invention is to obtain a preparation of natural bovine sex pheromones with high biological activity, which can be used to stimulate reproductive function in female cattle.

Решение технической задачи достигается тем, что проводят отбор семенников и мочевых пузырей у половозрелых быков во время убоя. Отвешивают 200-250 г семенников и 200-250 г тканей стенки мочевых пузырей и измельчают вначале до фаршеобразного состояния, а затем гомогенизируют в присутствии 0,15-0,20 мл полисорбата ТВИН-80 с последующим инкубированием при температуре 37-39°С в течение 50-60 мин. В полученную массу вносят мочу половозрелых быков до 1 л, смешивают и помещают в роторный испаритель R-213B (КНР), с использованием которого получают конденсат, являющийся препаратом натуральных половых феромонов быка. Полученный препарат представляет собой прозрачную жидкость с желтоватым оттенком со слабовыраженным запахом.The solution of the technical problem is achieved by the selection of testes and bladders from mature bulls during slaughter. 200-250 g of testicles and 200-250 g of bladder wall tissues are weighed and firstly crushed to a mince-like state, and then homogenized in the presence of 0.15-0.20 ml of TWEEN-80 polysorbate, followed by incubation at a temperature of 37-39 ° C in within 50-60 min. Urine of sexually mature bulls is added to the resulting mass up to 1 liter, mixed and placed in a rotary evaporator R-213B (PRC), with the use of which a condensate is obtained, which is a preparation of natural bull sex pheromones. The resulting preparation is a clear liquid with a yellowish tinge with a slight odor.

Отличительный особенностью получения заявляемого препарата является использование в технологическом процессе роторного испарителя R-213В, который позволяет понижать температуру кипения обрабатываемой массы. Это происходит за счет создания в системе испарителя пониженного давления с помощью вакуумного насоса. В результате жидкая часть смеси, помещенная в испарительную колбу и содержащая половые феромоны испаряется при более низкой температуре, конденсируется в холодильнике и собирается в колбе приемнике. Процесс испарения при более низкой температуре позволяет получать больше препарата половых феромонов быков с высокой биологический активностью.A distinctive feature of obtaining the claimed preparation is the use of a rotary evaporator R-213B in the technological process, which makes it possible to lower the boiling point of the processed mass. This is done by creating a reduced pressure in the evaporator system using a vacuum pump. As a result, the liquid part of the mixture, placed in an evaporation flask and containing sex pheromones, evaporates at a lower temperature, condenses in a refrigerator and is collected in a receiver flask. The evaporation process at a lower temperature makes it possible to obtain more bovine sex pheromone preparation with high biological activity.

Пример получения препарата натуральных половых феромонов быка. Для получения препарата половых феромонов проводили отбор семенников и мочевых пузырей у половозрелых быков в условиях мясокомбината. Взвешивали 200 г семенников и 200 г тканей стенки мочевых пузырей и измельчали их вначале до фаршеобразного состояния, а затем добавляли 0,20 мл полисорбата ТВИН - 80 и гомогенизировали до однородного состояния. Полученный гомогенизат инкубировали при температуре 37-39°С в течение 50-60 мин. В полученную массу вносили мочу половозрелых быков до 1 л, смешивали и помещали в испарительную колбу роторного испарителя R-213B. При вращении испарительной колбы ее содержимое перемешивалось, а одновременное нагревание колбы в водяной бане повышало давление пара жидкой части смеси, что ускоряло испарение. Нагревание испарительной колбы регулировали путем ее погружения в водяную баню, а для понижения температуры испарения жидкой части смеси уменьшали давление в системе с использованием вакуумного насоса. В результате жидкость испарялась из смеси при более низкой температуре, что способствовало более высокому содержанию половых феромонов в препарате.An example of obtaining a preparation of natural bovine sex pheromones. To obtain a preparation of sex pheromones, testicles and bladders were selected from mature bulls in a meat processing plant. Weighed 200 g of the testes and 200 g of bladder wall tissues and crushed them first to a mince-like state, and then added 0.20 ml of TWEEN-80 polysorbate and homogenized until homogeneous. The resulting homogenizate was incubated at a temperature of 37-39°C for 50-60 minutes. Urine of sexually mature bulls was added to the resulting mass up to 1 liter, mixed and placed in an evaporation flask of an R-213B rotary evaporator. When the evaporation flask rotated, its contents were mixed, and the simultaneous heating of the flask in a water bath increased the vapor pressure of the liquid part of the mixture, which accelerated evaporation. The heating of the evaporation flask was controlled by immersing it in a water bath, and to lower the evaporation temperature of the liquid part of the mixture, the pressure in the system was reduced using a vacuum pump. As a result, the liquid evaporated from the mixture at a lower temperature, which contributed to a higher content of sex pheromones in the preparation.

Полученный препарат представлял собой прозрачную жидкость с желтоватым оттенком и со слабовыраженным специфическим запахом. При появлении мутной жидкости процесс получения феромонов прекращали. Выход готового препарата составлял 800-850 мл.The resulting preparation was a clear liquid with a yellowish tint and a slight specific odor. When a cloudy liquid appeared, the process of obtaining pheromones was stopped. The output of the finished product was 800-850 ml.

Пример научно-производственной апробации полученного препарата натуральных половых феромонов быка.An example of scientific and industrial approbation of the obtained preparation of natural bull sex pheromones.

Биологическую активность разработанного препарата половых феромонов быка определяли на неполовозрелых телках 10-месячного возраста. Было проведено два эксперимента.The biological activity of the developed preparation of bull sex pheromones was determined on immature heifers of 10 months of age. Two experiments were carried out.

Первый эксперимент проводили в условиях учебно-опытного хозяйства Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Было сформировано три группы телок-аналогов черно-пестрой породы по 10 голов в каждой. Телки 1 группы являлись контрольными и стимуляции не подвергались. Телок 2 опытной группы стимулировали препаратом-прототипом. Животных 3 опытной группы стимулировали изготовленным препаратом. Стимуляцию телок феромонами проводили ежедневно два раза в день утром и вечером в течение 10 дней. Применяли феромоны интра-назально путем распыления в каждый носовой ход по 0,5 мл. Для этого использовали пульверизатор со специальной насадкой. Животным контрольной группы в носовые ходы распыляли дистиллированную воду в той же дозе и кратности, что и половые феромоны.The first experiment was carried out in the conditions of the educational and experimental farm of the Kursk State Agricultural Academy named after I.I. Ivanova. Three groups of Black-and-White heifers were formed, 10 heads each. Heifers of the 1st group were control and were not stimulated. Heifers 2 experimental group stimulated drug prototype. Animals of the 3rd experimental group were stimulated with the prepared preparation. Stimulation of heifers with pheromones was performed daily twice a day in the morning and evening for 10 days. Pheromones were used intranasally by spraying 0.5 ml into each nasal passage. For this, a spray gun with a special nozzle was used. Animals of the control group were sprayed with distilled water into the nasal passages in the same dose and frequency as the sex pheromones.

Активность изготовленного препарата и препарата-прототипа определяли с применением поведенческого биологического теста по проявлению «флемен-рефлекса» (В.Е. Соколов. Химическая коммуникация животных.-М.: Наука, 1986), а также по содержанию половых гормонов (эстрадиола-17β и прогестерона) в крови подопытных животных. Гормоны определяли иммуноферментным методом с использованием реактивов «Хеми-Медика» и спектрофотометра «Униплан» до начала эксперимента, а также на 10-й и 20-й дни эксперимента.The activity of the manufactured drug and the prototype drug was determined using a behavioral biological test for the manifestation of the "flehmen reflex" (V.E. Sokolov. Chemical communication of animals.-M .: Nauka, 1986), as well as the content of sex hormones (estradiol-17β and progesterone) in the blood of experimental animals. Hormones were determined by enzyme immunoassay using Chemi-Medic reagents and a Uniplan spectrophotometer before the start of the experiment, as well as on the 10th and 20th days of the experiment.

В ходе проведенных исследований было установлено, что изготовленный препарат половых феромонов быка по заявляемому способу не оказывал отрицательного влияния на организм подопытных животных. После обработки телок препаратом общие клинические параметры (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений) у животных находились в пределах физиологических границ. При этом у телок непосредственно после стимуляции повышалась двигательная активность, они поднимали голову, принюхивались, издавали звуки в виде непродолжительного мычания, корм в это время животные не принимали. В поведении телок контрольной группы во время эксперимента существенных изменений выявлено не было.In the course of the studies, it was found that the prepared preparation of bull sex pheromones according to the claimed method did not have a negative effect on the body of experimental animals. After treatment of heifers with the drug, the general clinical parameters (body temperature, pulse rate, number of respiratory movements) in animals were within physiological limits. At the same time, motor activity increased in heifers immediately after stimulation, they raised their heads, sniffed, made sounds in the form of a short lowing, the animals did not take food at this time. No significant changes were found in the behavior of the heifers of the control group during the experiment.

Результаты исследования гормонального статуса у подопытных телок показали, что содержание половых гормонов у животных, обработанных разработанным препаратом, было выше по сравнению с препаратом-прототипом, о чем свидетельствуют данные, представленные в таблице 1.The results of the study of the hormonal status in experimental heifers showed that the content of sex hormones in animals treated with the developed drug was higher compared to the prototype drug, as evidenced by the data presented in table 1.

Второй эксперимент был проведен в ООО «Сапфир Агро» Хомутовского района Курской области.The second experiment was carried out in Sapphire Agro LLC, Khomutovsky district, Kursk region.

Было сформировано две группы неполовозрелых телок-аналогов черно-пестрой породы 10-месячного возраста. Телки 1 (контрольной) группы в течение 10 дней один раз в день в течение 30 минут контактировали с быком-пробником. Телки 2 (опытной) группы подвергались стимуляции изготовленным препаратом половых феромонов быка два раза в день в дозе 0,5 мл/гол утром и вечером в течение 10 дней. У животных обеих групп исследовали в крови содержание эстрадиола-17β и прогестерона до начала эксперимента, а также на 10-й и 20-й дни эксперимента.Two groups of immature black-and-white heifers of 10 months of age were formed. Heifers of the 1st (control) group were in contact with a test bull once a day for 30 minutes for 10 days. Heifers of the 2nd (experimental) group were stimulated with a manufactured preparation of bull sex pheromones twice a day at a dose of 0.5 ml/head in the morning and evening for 10 days. In animals of both groups, the content of estradiol-17β and progesterone in the blood was studied before the start of the experiment, as well as on the 10th and 20th days of the experiment.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2, из данных которой следует, что содержание половых гормонов в крови телок, подвергавшихся стимуляции изготовленным препаратом было незначительно (р>0,05) меньше по сравнению с животными, контактировавшими с быком-пробником.The results of the studies are presented in Table 2, from the data of which it follows that the content of sex hormones in the blood of heifers subjected to stimulation with the manufactured drug was slightly (p> 0.05) less compared to the animals that were in contact with the test bull.

Таким образом, изготовленный препарат натуральных половых феромонов быка оказывает выраженное стимулирующее действие на структуры обонятельного анализатора, связанные с гипоталамо-гипофизарно-овариальным комплексом самок. В результаты у телок активизируется функция яичников и в крови повышается содержание половых гормонов.Thus, the prepared preparation of natural bovine sex pheromones has a pronounced stimulating effect on the structures of the olfactory analyzer associated with the hypothalamic-pituitary-ovarian complex of females. As a result, ovarian function is activated in heifers and the content of sex hormones in the blood increases.

При этом, если учесть затраты на хирургическую подготовку быков-пробников, их содержание и проведение стимуляции, то использование изготовленного препарата натуральных половых феромонов экономически оправдано.At the same time, if we take into account the costs of surgical preparation of probe bulls, their maintenance and stimulation, then the use of the manufactured preparation of natural sex pheromones is economically justified.

Claims

A method for obtaining natural bull sex pheromones, including grinding the testicles of mature bulls to a mince-like state, followed by homogenization to a homogeneous mass in the presence of TVIN-80 polysorbate, incubation of the resulting homogenizate at a temperature of 37-39 ° C for 50-60 minutes and adding the urine of mature bulls, characterized in that the grinding and homogenization of the testicles is carried out together with the tissues of the bladder wall and the resulting homogenizate is distilled using a rotary evaporator, and to obtain a bovine sex pheromone preparation formed in the form of a condensate, these components are used in the following ratio:

testicles 200-250 g bladder wall tissue 200-250 g TVIN-80 0.15-0.20 ml urine up to 1 l