RU2788347C1 - Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum - Google Patents
Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788347C1 RU2788347C1 RU2022130780A RU2022130780A RU2788347C1 RU 2788347 C1 RU2788347 C1 RU 2788347C1 RU 2022130780 A RU2022130780 A RU 2022130780A RU 2022130780 A RU2022130780 A RU 2022130780A RU 2788347 C1 RU2788347 C1 RU 2788347C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- chloraremomycin
- antibiotic
- aridum
- chloreremomycin
- Prior art date
Links
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 claims abstract description 25
- 241000203796 Kibdelosporangium aridum Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 6
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 6
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 6
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- VHFGEBVPHAGQPI-LXKZPTCJSA-N oritavancin Chemical compound O([C@@H]1C2=CC=C(C(=C2)Cl)OC=2C=C3C=C(C=2O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(NCC=4C=CC(=CC=4)C=4C=CC(Cl)=CC=4)C2)OC2=CC=C(C=C2Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]2C(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](C1=CC(O)=CC(O)=C1C=1C(O)=CC=C2C=1)C(O)=O)=O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 VHFGEBVPHAGQPI-LXKZPTCJSA-N 0.000 description 3
- 229960001607 oritavancin Drugs 0.000 description 3
- 108010006945 oritavancin Proteins 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- 229920001670 16S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 1
- 240000007474 Aloe arborescens Species 0.000 description 1
- 235000004509 Aloe arborescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001430312 Amycolatopsis orientalis Species 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000019483 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108091022077 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N Inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 Inositol Drugs 0.000 description 1
- 241000203790 Kibdelosporangium Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 229940041033 Macrolides Drugs 0.000 description 1
- 241000204102 Pseudonocardiaceae Species 0.000 description 1
- 241001655323 Pseudonocardiales Species 0.000 description 1
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N Quinoxaline Chemical compound N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N Raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N Rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N VANCOMYCIN Chemical class O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- XJHXLMVKYIVZTE-LOALFDMRSA-N chloroeremomycin Chemical compound O([C@@H]1C2=CC=C(C(=C2)Cl)OC=2C=C3C=C(C=2O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(N)C2)OC2=CC=C(C=C2Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]2C(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](C1=CC(O)=CC(O)=C1C=1C(O)=CC=C2C=1)C(O)=O)=O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 XJHXLMVKYIVZTE-LOALFDMRSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- -1 lures Chemical compound 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolites Natural products 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 продуцент хлорэремомицина. Применение указанного штамма для получения хлорэремомицина. Способ получения хлорэремомицина осуществляют следующим образом. Культивируют указанный штамм и выделяют антибиотик хлорэремомицин из культуральной жидкости с последующей очисткой. Группа изобретений обеспечивает увеличение продуктивности штамма-продуцента хлорэремомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицина, высокую биохимическую активность и повышенную устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе при хранении и культивировании. 3 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового штамма-продуцента антибиотика хлорэремомицина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ.
Хлорэремомицин - гликопептидный антибиотик класса ванкомицинов, имеет в составе своей структуры три сахара, одну D-глюкозу и два L-4-эпи-ванкозамина, присоединенные к сшитому гептапептидному остову тремя гликозилтрансферазами, GtfA, -B и –C (Lu W, et al. Characterization of a regiospecific epivancosaminyl transferase GtfA and enzymatic reconstitution of the antibiotic chloroeremomycin// Proc Natl Acad Sci U S A.- 2004 Mar 30.-101(13):4390-5. Epub 2004 Mar 18).
Хлорэремомицин является предшественником полусинтетического антибиотика оритаванцина (Wang, W.-Y. et al. Enhancement of A82846B yield and proportion by overexpressing the halogenase gene in Amycolatopsis orientalis SIPI18099, Appl. Microbiol. Biotech.- 2018.- P.5635-5643).
Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработаны на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актиномицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка Actinomycetales являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептотрицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиномицетов — продуцентов биологически активных соединений разрабатываются различные методы селективной изоляции новых штаммов (Синёва О.Н. Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens// Антибиотики и Химиотерапия.- 2021.- 66(9-10):4-11).
Известен штамм-продуцент Кibdelosporangium aridum JH100-32B16B промежуточного продукта синтеза оритаванцина, депонированный в Общем центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC) под номером CGMCC №17931 (CN113493748, опубл. 12.10.2021).
Известен рекомбинантный штамм Kibdelosporangium aridum, продуцирующий антибиотик A82846B, который является важным предшественником полусинтетического гликопептидного антибиотика оритаванцина (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar 16. - 10(1):52). Указанный штамм рассматривался авторами настоящего изобретения в качестве близкого аналога.
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления хлорэремомицина известные ранее штаммы.
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицин, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма по настоящему изобретению к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Из образца дерново–подзолистой почвы (Мордовия) был выделен штамм дикого типа, продуцирующий антибиотик хлорэремомицин.
Для повышения секреции хлорэремомицина штамм дикого типа подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах.
Далее полученный высокопродуктивный штамм, который получил внутреннее наименование CLE 20-36, был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рРНК.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.
Полученный новый штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент хлорэремомицина Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 для получения антибиотика хлорэремомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика хлорэремомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и выделение хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.
Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты). Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика хлорэремомицина).
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика хлорэремомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в условиях биореактора, выраженному в граммах хлорэремомицина на литр культуральной жидкости.
При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.
На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и наработки хлорэремомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент хлорэремомицина - штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
Культурально-морфологические признаки: аэроб; окраска по Граму – положительная, при культивировании на плотной среде нижеуказанного состава типичные колонии имеют цвет от светло-бежевого до серо-бежевого, коническую форму, диаметр 3-5 мм, приподняты над агаром, поверхность неровная.
Физиолого-биохимические характеристики: Хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу; умеренно лактозу, рамнозу, ксилозу, не утилизирует рафинозу. Обладает протеолитической активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: растворимый крахмал –15.0-19.0; глюкоза – 8.0-10.0; дрожжевой экстракт – 3.0-4.0; ферментативный гидролизат казеина – 4.0-4.5; гидрофосфат калия – 0.3 - 0.5; агар-агар - 18.0-21.0; вода очищенная; рН среды 6.7±0.3.
Условия культивирования для выделения единичных колоний- 10-12 суток, при температуре 27-32°С.
ПРИМЕРЫ
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
Пример 1. Способ селективного выделения из штамма - продуцента хлорэремомицина из образца почвы.
Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.
Для выделения штамма дикого типа - продуцента хлорэремомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.
Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.
Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента хлорэремомицина.
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент хлорэремомицина CLE 20-36.
Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0oC. Полученному штамму был присвоен внутренний номер CLE 20-36.
Пример 3. Идентификация штамма CLE 20-36 до вида с помощью анализа 16s РНК.
Выделение ДНК штамма CLE 20-36 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).
Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:
8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:
1. 95оС - 3мин.
2. 35 циклов
95оС - 30 сек.
57оС - 30 сек.
72оС - 1 мин. 30 сек.
3. 72оС - 5 мин.
Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.
Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.
Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Kibdelosporangium.
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.
Обработку секвенированных последовательностей проводились при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.
По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.
Пример 4. Методика культивирования.
Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.
Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.
Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.
Пример 5. Определение содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.
Анализ содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования – 254 нм.
Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании
| Штамм | Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л) | ||
| в ферментере объемом 5 литров | в ферментере объемом 15 литров | в ферментере объемом 100 литров | |
| Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 |
5,5 5,7 6,4 |
6,8 7,0 7,4 |
15,1 15,8 16,2 |
Согласно литературным данным продуктивность известного штамма Kibdelosporangium aridum составляла 1,45 г/л (CN113493748, опубл. 12.10.2021). А продуктивность генетически модифицированного штамма Kibdelosporangium aridum достигала 2,52 г/л (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar.- 16;10(1):52).
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика хлорэремомицина.
Пример 6. Методика выделения хлорэремомицина.
После культивирования микроорганизма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, а отработанную биомассу утилизировали.
Очищенную от биомассы культуральную жидкость наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали очищенной водой. Элюат собирали и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 40 °С. Полученный концентрат снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали очищенной водой. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ. Элюат фракционировали, отдельные фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие хлорэремомицин с чистотой не менее 80 % объединяли. Менее чистые фракции утилизировали. Очищенный раствор хлорэремомицина депигментировали перемешиванием в течение 30 мин с 0.5 масс. % угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля. Далее раствор хлорэремомицина концентрировали при помощи ротационного испарителя в вакууме до 1/3 от первоначального объема. Концентрат охлаждали, выпавший осадок отделяли фильтрованием.
Claims (3)
1. Штамм Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 продуцент хлорэремомицина.
2. Применение штамма по п.1 для получения хлорэремомицина.
3. Способ получения хлорэремомицина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение антибиотика хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788347C1 true RU2788347C1 (ru) | 2023-01-17 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2621866C1 (ru) * | 2016-04-12 | 2017-06-07 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Технология Лекарств" | ШТАММ Amycolatopsis orientalis - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРЕМОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРЕМОМИЦИНА |
| CN113493748A (zh) * | 2020-04-07 | 2021-10-12 | 上海键合医药科技有限公司 | 一株奥利万星中间体产生菌及其应用 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2621866C1 (ru) * | 2016-04-12 | 2017-06-07 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Технология Лекарств" | ШТАММ Amycolatopsis orientalis - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРЕМОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРЕМОМИЦИНА |
| CN113493748A (zh) * | 2020-04-07 | 2021-10-12 | 上海键合医药科技有限公司 | 一株奥利万星中间体产生菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОРЛОВА Т. И. и др. Биологически активные нерибосомальные пептиды. I. Нерибосомальные антибиотики полипептиды, Антибиотики и химиотерапия, 2011, 56, 3-4, с. 57-68. XUN TIAN et al. Enhancing A82846B production by artificial attB‑assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI‑3927, AMB Express (2020) 10:52, р.1-10;. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108676757B (zh) | 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用 | |
| JP2005534332A (ja) | チアクマイシン生産 | |
| US20070191415A1 (en) | Production of tacrolimus (fk-506) using new streptomyces species | |
| JP6367957B2 (ja) | アクチノプラーネス菌株及びその使用 | |
| CN108794368B (zh) | 一种具有多样抑菌活性的生物碱类化合物及其制备方法及应用 | |
| US10301690B2 (en) | Streptomyces filamentosus variant and method for producing daptomycin using same | |
| KR890001289B1 (ko) | 항종양 항생제(ll-e33288 복합체) 및 그의 제법 | |
| CN101563353B (zh) | 氨基噻唑大环类、它们作为抗菌化合物的用途以及制备它们的方法 | |
| RU2788347C1 (ru) | Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum | |
| CN109280034B (zh) | 一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用 | |
| WO2023016387A1 (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用 | |
| CZ279307B6 (cs) | Rebeccamycinový analog, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje | |
| RU2789838C1 (ru) | Новый штамм-продуцент рамопланина actinoplanes ramoplaninifer | |
| RU2788348C1 (ru) | Новый штамм - продуцент ванкомицина amycolatopsis japonica | |
| RU2801749C1 (ru) | Новый штамм-продуцент ванкомицина amycolatopsis keratiniphila | |
| RU2802575C1 (ru) | Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis | |
| CN115850409A (zh) | 一种抗多种病原菌的无前导肽细菌素subticin A3及制备方法与应用 | |
| EP2501821B1 (en) | Process for producing primycin, primycin component(s), precursors and metabolites thereof via fementation by the use of bacterial species saccharomonospora azurea | |
| RU2724537C1 (ru) | Штамм Amycolatopsis rifamycinica - продуцент антибиотика тетраценомицина Х | |
| KR102707891B1 (ko) | 항-남조류 활성 물질을 생산하는 신규 스트렙토마이세스 속 nibr000498259 균주 | |
| JP3523290B2 (ja) | 化合物３１６６８ｐおよび３１６６８ｕ、それらの製造方法およびそれらの使用 | |
| RU2784815C1 (ru) | Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью | |
| US5171740A (en) | Coumamidine compounds | |
| CN109312298B (zh) | 米氏硫胺素芽孢杆菌菌株及其用途 | |
| CN117467556A (zh) | 一株产生naggn的耐盐小单孢菌及其应用 |