RU2785901C1 - Recombinant strain of ogataea haglerorum yeast - producer of escherichia coli phytase - Google Patents
Recombinant strain of ogataea haglerorum yeast - producer of escherichia coli phytase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785901C1 RU2785901C1 RU2021127304A RU2021127304A RU2785901C1 RU 2785901 C1 RU2785901 C1 RU 2785901C1 RU 2021127304 A RU2021127304 A RU 2021127304A RU 2021127304 A RU2021127304 A RU 2021127304A RU 2785901 C1 RU2785901 C1 RU 2785901C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- phytase
- ogataea
- haglerorum
- yeast
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 241000081017 Ogataea haglerorum Species 0.000 title claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 15
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241001112159 Ogataea Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 4
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical class OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 229940091771 Aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 101700047609 aphA Proteins 0.000 description 2
- 101700011523 appA Proteins 0.000 description 2
- 101710011713 apxIIA Proteins 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 101710010431 shlA Proteins 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060000428 AOX Proteins 0.000 description 1
- 102100010989 AOX1 Human genes 0.000 description 1
- 101700013479 ASL Proteins 0.000 description 1
- 101710025308 AUX22B Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 240000005093 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N Ammonium heptamolybdate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo] QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 101710003554 CPA2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229950002499 Fytic acid Drugs 0.000 description 1
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N Inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 Inositol Drugs 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N Myoinositol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001099341 Ogataea polymorpha Species 0.000 description 1
- 241001221837 Ogataea thermomethanolica Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000123255 Peniophora Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101700021258 RTM1 Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N Rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 229940083982 Sodium Phytate Drugs 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000607481 Yersinia intermedia Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 101710008935 hisHF Proteins 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 102220082204 rs753215899 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается получения рекомбинантных штаммов дрожжей Ogataea haglerorum - продуцентов фитазы.The invention relates to the field of microbiology and biotechnology and concerns the production of recombinant yeast strains Ogataea haglerorum - phytase producers.
Фосфор является важным минералом, необходимым для роста и развития животных. Источником фосфора являются фитаты (мио-инозитол гексакисфосфаты), которые содержатся в зерновых и бобовых культурах - основных ингредиентах кормов в животноводстве [Adv. Food Res. 1982, 28, 1-92]. Некоторые животные, такие как домашняя птица, свиньи и рыбы не способны утилизировать фитатный фосфор из-за отсутствия ферментов для гидролиза фитатов в их пищеварительной системе, что снижает пищевую ценность корма [Can. J. Anim. Sci. 2013, 93, 9-21]. Фитаты препятствуют эффективному усвоению кальция, натрия, магния и других минеральных веществ из кормов, а также могут связываться с белками в широком диапазоне рН, образуя нерастворимые белково-фитатные или белок-минерал-фитатные комплексы, недоступные для переваривания [J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 878-896].Phosphorus is an essential mineral necessary for the growth and development of animals. The source of phosphorus is phytates (myo-inositol hexakisphosphates), which are found in cereals and legumes - the main ingredients of animal feed [Adv. food res. 1982, 28, 1-92]. Some animals, such as poultry, pigs, and fish, are unable to utilize phytate phosphorus due to the lack of enzymes for phytate hydrolysis in their digestive system, which reduces the nutritional value of the feed [Can. J. Anim. sci. 2013, 93, 9-21]. Phytates prevent the effective absorption of calcium, sodium, magnesium and other minerals from feed, and can also bind to proteins in a wide pH range, forming insoluble protein-phytate or protein-mineral-phytate complexes that are inaccessible for digestion [J. sci. Food Agric. 2015, 95, 878-896].
Фитаза является одним из наиболее востребованных кормовых ферментов. Фитазы (мио-инозитол гексакисфосфат 3- или 6-фосфогидролазы, ЕС 3.1.3.8 или ЕС 3.1.3.26) гидролизуют фитат до лшо-инозитол производных и неорганического фосфата и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвоение фосфора [J. Sci. Food Agric, 2015, 95, 878-896. doi: 10.1002/j sfa.6998]. Они обеспечивают высвобождение не только фитат-связанного фосфора, но также белков, макро- и микроэлементов, повышая питательные свойства кормов и устраняя дефицит фосфатов [British Poultry Science, 2004, 45(1), 101-108].Phytase is one of the most demanded feed enzymes. Phytases (myo-inositol hexakisphosphate 3- or 6-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8 or EC 3.1.3.26) hydrolyze phytate to lso-inositol derivatives and inorganic phosphate and are successfully used as a feed additive, significantly increasing the absorption of phosphorus [J. sci. Food Agric, 2015, 95, 878-896. doi:10.1002/jsfa.6998]. They release not only phytate-bound phosphorus, but also proteins, macro- and microelements, increasing the nutritional properties of feed and eliminating phosphate deficiency [British Poultry Science, 2004, 45(1), 101-108].
В настоящее время фитазы получают микробиологическим путем с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов, потребность промышленности в которых постоянно растет [Afr. J. Biotechnol., 2009, 8(17), 4229-4232.]. Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [Journal of Biotechnology. 2015, 202, 118-134. doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.01.027; J. Cell Physiol. 2020, 1-15. DOI: 10.1002/jcp.29583], которые обладают мощными системами экспрессии и секреции рекомбинантных белков (в том числе, фитаз) и для которых разработаны питательные среды и отработан процесс ферментации с использованием культуры высокой плотности. Процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24, 45-66. doi: 10.1111/j.l574-6976.2000.tb00532.x].Currently, phytases are obtained microbiologically using recombinant producer strains, the need for industry in which is constantly growing [Afr. J. Biotechnol., 2009, 8(17), 4229-4232.]. The methylotrophic yeast Pichia pastoris [Journal of Biotechnology. 2015, 202, 118-134. doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.01.027; J. Cell Physiol. 2020, 1-15. DOI: 10.1002/jcp.29583], which have powerful systems for the expression and secretion of recombinant proteins (including phytase) and for which nutrient media have been developed and the fermentation process has been developed using a high-density culture. The cultivation process of methylotrophic yeast is quite simple, since their growth is not blocked by metabolic products [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24, 45-66. doi: 10.1111/j.l574-6976.2000.tb00532.x].
Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenula). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи Pichia pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Pichia pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а также при культивировании в биореакторе позволяют получать биомассу с высокой плотностью клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fhz052].Another known methylotrophic system for heterologous expression is the thermotolerant yeast Ogataea (Hansenula). Yeasts of the genus Ogataea, like yeast Pichia pastoris, have a unique organization and regulation of metabolism in the presence of methanol due to the presence of strong promoters induced by methanol. Like Pichia pastoris, yeasts of the genus Ogataea combine the advantages of being easy to grow on an inexpensive growth medium with high secretion ability, and when cultivated in a bioreactor, they can produce biomass with a high cell density, which contributes to a high yield of the target product [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. cell fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fhz052].
В отличие от Pichia pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре не ниже 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.Unlike Pichia pastoris, yeasts of the genus Ogataea are thermotolerant, which allows fermentation at a temperature not lower than 37°C. Increasing the temperature of the fermentation process reduces contamination and the cost of cooling the bioreactor [Appl. microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] and as a result shortens the fermentation time.
Известны примеры создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов фитазы на основе дрожжей Ogataea {Hansenula) polymorpha, в которых ген фитазы из грибов рода Aspergillus находится под контролем промотора гена FMD, кодирующего формат дегидрогеназу, и имеет природную сигнальную последовательность. Так штаммы О. polymorpha за 160 ч культивирования в 15 л ферментере на минеральной среде с глюкозой продуцируют фитазы из грибов Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus (вариант Q27L) и Aspergillus fumigatus (вариант консенсус) в количестве 4,46 г/л, 6,11 г/л и 13,5 г/л, соответственно, [Biotechnology and Bioengineering. 1999, 63 (3), 373-381], что иллюстрирует высокий потенциал системы экспрессии дрожжей рода Ogataea для производства рекомбинантного белка.Examples of the creation of highly productive recombinant phytase-producing strains based on the yeast Ogataea {Hansenula) polymorpha are known, in which the phytase gene from fungi of the genus Aspergillus is under the control of the FMD gene promoter encoding the dehydrogenase format and has a natural signal sequence. So strains of O. polymorpha for 160 hours of cultivation in a 15 l fermenter on a mineral medium with glucose produce phytases from the fungi Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus (option Q27L) and Aspergillus fumigatus (option consensus) in the amount of 4.46 g/l, 6.11 g/l and 13.5 g/l, respectively, [Biotechnology and Bioengineering. 1999, 63(3), 373-381], which illustrates the high potential of the Ogataea yeast expression system for recombinant protein production.
Штамм О. thermomethanolica, содержащий ген фитазы Aspergillus niger ВСС18081 под контролем конститутивного промотора гена GAP, кодирующего глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, и с сигнальной последовательностью MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирует фитазу с активностью 134 ед./мл КЖ за 41 ч культивировании в 15 л ферментере на минеральной среде при температуре 34°С и использовании в качестве источника углерода столового сахара [Appl Biochem Biotechnol. 2016. DOI 10.1007/s12010-016-2191-8].The O. thermomethanolica strain, containing the Aspergillus niger BCC18081 phytase gene under the control of the constitutive GAP gene promoter encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and with the MFα signal sequence from the yeast Saccharomyces cerevisiae, produces phytase with an activity of 134 U/mL QOL for 41 h of cultivation in a 15 l fermenter on a mineral medium at a temperature of 34°C and using table sugar as a carbon source [Appl Biochem Biotechnol. 2016. DOI 10.1007/s12010-016-2191-8].
Описано использование штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 для экспрессии генов фитазы из бактерий Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, и показано, что при культивировании в пробирках активность фитазы в КЖ составляет 56,2 ед./мл и 135,2 ед./мл, соответственно [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56].The use of the strain Ogataea haglerorum VKPM Y-2584 for the expression of phytase genes from the bacteria Citrobacter freundii and Yersinia intermedia is described, and it is shown that, when cultivated in test tubes, the activity of phytase in CL is 56.2 units/ml and 135.2 units/ml, respectively [Biotechnology, 2019, 35 (6), 51-56].
Одним из востребованных на сегодняшний день ферментов является фитаза Escherichia coli. Ген аррА, кодирующий фитазу Е. coli, был клонирован в 1985 г, затем секвенирован, а фитаза охарактеризована [Mol. Gen. Genet. 1985, 200, 68-73; J. Bacteriol. 1990, 172, 5497-5500; Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303, 107-113]. Рекомбинантная фитаза E.coli, наработанная клетками дрожжей P. pastoris, обладает промышленно-ценными свойствами и в настоящее время коммерчески доступна в форме препаратов Quantum® и OptiPhos® [J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 878-896. doi:10.1002/jsfa.6998; Annu. Rev. Anim. Biosci. 2013, 1, 1.1-1.27. doi: 10.1146/annurev-animal-031412-103717]. Введение в корма фитазы Е. coli более эффективно влияет на зоотехнические показатели, чем добавление фитаз из грибов Aspergillus и Peniophora, так как фитаза Е. coli более устойчива к действию пепсина, работает в более кислой области рН, что соответствует физиологическим условиям желудочно-кишечного тракта животных, а также характеризуется высокой удельной активностью по сравнению с фитазами из других организмов [J. Anim. Sci. 2003, 81(2), 474-483. doi: 10.2527/2003.812474х; Octa Journal of Biosciences, 2013, 1(2):158-169].One of the enzymes in demand today is Escherichia coli phytase. The appA gene encoding E. coli phytase was cloned in 1985, then sequenced and the phytase characterized [Mol. Gen. Genet. 1985, 200, 68-73; J. Bacteriol. 1990, 172, 5497-5500; Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303, 107-113]. Recombinant E. coli phytase produced by P. pastoris yeast cells has industrially valuable properties and is currently commercially available in the form of Quantum® and OptiPhos® preparations [J. sci. Food Agric. 2015, 95, 878-896. doi:10.1002/jsfa.6998; Annu. Rev. Anim. biosci. 2013, 1, 1.1-1.27. doi: 10.1146/annurev-animal-031412-103717]. The introduction of E. coli phytase into feed has a more effective effect on zootechnical parameters than the addition of phytases from Aspergillus and Peniophora fungi, since E. coli phytase is more resistant to pepsin, works in a more acidic pH range, which corresponds to the physiological conditions of the gastrointestinal tract animals, and is also characterized by high specific activity compared with phytases from other organisms [J. Anim. sci. 2003, 81(2), 474-483. doi: 10.2527/2003.812474x; Octa Journal of Biosciences, 2013, 1(2):158-169].
Получен продуцент KM71-61 на основе штамма P. pastoris КМ71 (his4 aoxl::ARG4 arg4 MutS; Invitrogen), содержащий природный ген аррА E.coli, транскрипция которого находится под контролем промотора гена АОХ1. Штамм КМ71-61 во время ферментации в культуре с высокой плотностью клеток продуцирует 6,4 мг/мл белка, активность фитазы составляет 4946 ед./мл КЖ через 192 ч культивирования при 30°С в 5 л ферментере [Enzyme and Microbial Technology. 2004, 35, 315-320].A KM71-61 producer was obtained based on the P. pastoris strain KM71 (his4 aoxl::ARG4 arg4 Mut S ; Invitrogen) containing the natural E. coli appA gene, whose transcription is under the control of the AOX1 gene promoter. The strain KM71-61 during fermentation in culture with high cell density produces 6.4 mg/ml protein, phytase activity is 4946 units/ml QOL after 192 hours of cultivation at 30°C in a 5 l fermenter [Enzyme and Microbial Technology. 2004, 35, 315-320].
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазу Е. coli.The objective of the claimed invention is to expand the arsenal of recombinant microorganisms producing E. coli phytase.
Техническим результатом заявляемого изобретения является рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий фитазу, содержащий в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена phyEc-mod и чувствительный к генетицину (G418).The technical result of the claimed invention is a recombinant yeast strain Ogataea haglerorum, producing phytase, containing an optimized phyEc-mod gene sequence in the chromosome and sensitive to geneticin (G418).
Заявляемый штамм получают из штамма-продуцента фитазы Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856, содержащего более 2-х копий синтетического гена phyEc-mod, кодирующего фитазу Е. coli, и маркерного гена КтМХ, обеспечивающего устойчивость к генетицину (G418), путем удаления маркерного гена из хромосомной ДНК.The claimed strain is obtained from the phytase producer strain Ogataea haglerorum 255 VKPM Y-4856, containing more than 2 copies of the synthetic phyEc-mod gene encoding E. coli phytase, and the KtMX marker gene providing resistance to geneticin (G418), by removing the marker gene from chromosomal DNA.
Чувствительность заявляемого штамма к антибиотикам существенно упрощает его промышленное использование, так как облегчает утилизацию клеточной биомассы.The sensitivity of the proposed strain to antibiotics greatly simplifies its industrial use, as it facilitates the utilization of cell biomass.
Штамм является продуцентом фитазы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика как Ogataea haglerorum N260 ВКПМ Y-4951.The strain is a phytase producer and deposited in the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) NRC "Kurchatov Institute"-GosNIIgenetika as Ogataea haglerorum N260 VKPM Y-4951.
Штамм характеризуется следующими признаками:The strain is characterized by the following features:
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:Cultural and morphological characteristics of the proposed strain:
При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultivated at a temperature of 37°C for 48 hours on YP agar medium (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose - 2 (wt.%), the cells have an oval shape, 3-4 microns in diameter. Cells bud, while budding is true, multilateral. True mycelium does not form.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают до 4 аскоспор.Sporulation occurs when the culture is incubated on an agar medium of the following composition (wt.%): potassium chloride - 0.5, sodium acetate - 1.0, agar - 2.0, water - the rest at 25°C for 3-4 days. Asci have a tetrahedral shape, include up to 4 ascospores.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.On YP agar medium supplemented with glucose (2, wt %), light beige colonies with a smooth edge, matte surface, lenticular profile, and pasty consistency.
При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода -остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.During growth in a liquid YP medium (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) with the addition of glucose - 2 (wt.%), at 37°C for 24 hours of cultivation - cloudy liquid, white precipitate , coagulation is not observed, it does not form parietal films.
Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:Physiological and biochemical characteristics of the proposed strain:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.The strain is capable of growth under both aerobic and anaerobic conditions.
В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.The strain is capable of using glucose, glycerol, methanol, ethanol, L-rhamnose, sucrose, and maltose as the only source of carbon; unable to assimilate D-gluconate, L-arabinose, succinate, lactose, starch.
Штамм способен синтезировать фитазу при культивировании в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) с последующей индукцией метанолом.The strain is capable of synthesizing phytase when cultivated in liquid YP medium with glucose (2 wt %) followed by induction with methanol.
Пример 1. Конструирование заявленного штамма дрожжей О. haglerorum, продуцирующего фитазу Е. coliExample 1. Construction of the claimed yeast strain O. haglerorum producing E. coli phytase
Заявляемый штамм получают из штамма Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856 путем удаления из хромосомной ДНК селективного маркера КтМХ методом рекомбинации по 1ох сайтам в присутствии Сrе рекомбиназы [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197].The inventive strain is obtained from the strain Ogataea haglerorum 255 VKPM Y-4856 by removing the KtMX selective marker from chromosomal DNA by recombination at 1ox sites in the presence of Cre recombinase [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197].
Штамм Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856 выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и генетицина в количестве 300 мкг/мл при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD600) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола, приготовленном на воде SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин. и собирают центрифугированием в течение 10 мин. при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCl2, приготовленном на воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 200 нг ДНК плазмиды с Сrе рекомбиназой и инкубируют на льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. при качании.The strain Ogataea haglerorum 255 VKPM Y-4856 is grown in a liquid nutrient medium YP (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt.%) and geneticin in an amount of 300 μg / ml at 37°C for 6 h until the culture reaches an optical density (OD 600 ) of 1.5. Cells are harvested by centrifugation (hereinafter 6000 rpm) for 10 minutes. at room temperature, resuspended in TED buffer composition: 100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8.0, 25 mM dithiothreitol, prepared in SQ water, incubated at 37°C for 15 min. and harvested by centrifugation for 10 min. at room temperature. Next, the cells are washed twice with cold STM buffer of the composition: 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCl2 prepared in SQ water, and harvested by centrifugation for 10 min at 5°C. The cells thus treated are resuspended in cold STM solution at a concentration of 1-5×10 9 cells/ml. A 60 µl aliquot of the cell suspension was transferred to a chilled eppendorf, 200 ng of plasmid DNA with Cre recombinase was added and incubated on ice for 5 minutes. The mixture of cells and DNA is transferred to a pre-chilled electroporation cuvette. Electroporation is carried out at 1500 V, 200 ohms, 25uF. After electroporation, 1 ml of liquid YP medium with glucose (2 wt %) is added to the cells, the cell suspension is transferred into sterile 1.5 ml tubes and incubated at 37°C for 60 min. when swinging.
Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и гигромицином в количестве 200 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.The selection of transformants is carried out on YP agar medium with glucose (2 wt %) and hygromycin in the amount of 200 μg/ml at 37°C for 4 days.
Биомассу трех независимых трансформантов переносят в три пробирки с 3 мл среды YP с гигромицином в количестве 200 мкг/мл и метанолом, используемым в качестве источника углерода и индуктора биосинтеза Сrе рекомбиназы. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 48 ч при качании. Затем делают рассев культуры из пробирок до отдельных колоний на среду YP с глюкозой (2 мас. %) на три чашки Петри. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение 72 ч. Анализируют 100 независимо отобранных колоний с каждой чашки. В лунки репликатора добавляют 200 мкл стерильной воды, в каждую лунку репликатора переносят с помощью зубочистки биомассу одной колонии, затем делают реплику из репликатора на три чашки Петри со средами YP с глюкозой (2 мас. %), YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином в количестве 300 мкг/мл и YP с глюкозой (2 мас. %) и гигромицином в количестве 200 мкг/мл. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение 48 ч. Отбирают колонии, которые растут на среде YP с глюкозой (2 мас. %), но не растут на средах с антибиотиками.The biomass of three independent transformants was transferred into three test tubes with 3 ml of YP medium containing 200 μg/ml of hygromycin and methanol used as a carbon source and inducer of Cre recombinase biosynthesis. The tubes are incubated at 37° C. for 48 hours while shaking. Then the culture is sieved from test tubes to individual colonies on YP medium with glucose (2 wt. %) on three Petri dishes. Cups are incubated in a thermostat at 37°C for 72 hours Analyze 100 independently selected colonies from each cup. 200 μl of sterile water is added to the wells of the replicator, the biomass of one colony is transferred to each well of the replicator with a toothpick, then a replica is made from the replicator into three Petri dishes with YP with glucose (2 wt. %), YP with glucose (2 wt. %) ) and geneticin at 300 µg/ml and YP with glucose (2 wt %) and hygromycin at 200 µg/ml. The dishes are incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours. Colonies are selected that grow on YP medium with glucose (2 wt.%), but do not grow on media with antibiotics.
Проводят культивирование отобранных колоний в пробирках по следующей схеме:The selected colonies are cultivated in test tubes according to the following scheme:
- Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.- The inoculum is grown in test tubes (50 ml) with 5 ml of YP liquid nutrient medium supplemented with glucose (2 wt %) at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm). The inoculation of the fermentation medium is carried out in a ratio of 1/10.
- Ферментацию проводят при 37°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 дней. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об.%, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования. В качестве контроля используют штамм Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856.- Fermentation is carried out at 37°C on a rocking chair (250 rpm) in YP nutrient medium with the addition of glucose (2 wt.%) for 5 days. After 24 hours of cultivation, induction with methanol is started, which is added in an amount of 3 vol.%, then the same amount of methanol is added for 48 hours of cultivation. The strain Ogataea haglerorum 255 VKPM Y-4856 is used as a control.
Продуктивность оценивают по активности фитазы в среде культивирования. Для этого клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения фитазной активности модифицированным методом Фиске-Субарроу [J. Biol. Chem. 1925, 66, 376-400; J. Microbiol. Methods. 1999, 39(1), 17-22]. За единицу ферментативной активности фитазы (1 ед.) принимают количество фермента, способного высвободить 1 мкмоль неорганического фосфата из фитата натрия за 1 мин. в стандартных условиях (температура 37°С, значение рН 4,5, продолжительность гидролиза 30 минут).Productivity is assessed by the activity of phytase in the culture medium. For this, transformant cells are pelleted by centrifugation, and the supernatant is used to determine phytase activity by the modified Fiske-Subarrow method [J. Biol. Chem. 1925, 66, 376-400; J. Microbiol. methods. 1999, 39(1), 17-22]. A unit of phytase enzymatic activity (1 unit) is taken as the amount of enzyme capable of releasing 1 µmol of inorganic phosphate from sodium phytate in 1 min. under standard conditions (temperature 37°C, pH value 4.5, hydrolysis time 30 minutes).
Отбирают наиболее продуктивный клон №260, который продуцирует фитазу Е. coli с активностью 915 ед./мл за 120 ч ферментации в пробирках при температуре 37°С (против активности 806 ед./мл у штамма О. haglerorum 255 ВКПМ Y-4856).The most productive clone No. 260 is selected, which produces E. coli phytase with an activity of 915 units/ml for 120 hours of fermentation in test tubes at a temperature of 37°C (against the activity of 806 units/ml in the strain O. haglerorum 255 VKPM Y-4856) .
Клон Ogataea haglerorum N260 является продуцентом фитазы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1) как штамм Ogataea haglerorum N260 ВКПМ Y-4951.The clone Ogataea haglerorum N260 is a phytase producer and was deposited at the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) of the National Research Center "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika (117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1) as a strain of Ogataea haglerorum N260 VKPM Y-4951 .
Пример 2. Получение фитазы путем культивирования заявляемого штамма Ogataea haglerorum N260 в колбахExample 2. Obtaining phytase by cultivating the proposed strain Ogataea haglerorum N260 in flasks
Посевную культуру готовят в пробирках в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирки инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л с 50 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %) переносят 5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин.) в течение 6 дней. Метанол (2 об.%) добавляют к культуре через 24, 48 и 72 часа культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.The inoculum is prepared in test tubes in 5 ml of YP medium with glucose (2 wt %). The tubes are incubated at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm). Into a 0.75 L flask with 50 ml of YP liquid medium with glucose (2 wt %), 5 ml of inoculum are transferred and the flask is incubated at 37° C. on a shaker (250 rpm) for 6 days. Methanol (2 vol.%) is added to the culture after 24, 48 and 72 hours of cultivation. The biomass is separated by centrifugation for 15 minutes.
Культуральную жидкость без биомассы (КЖ) используют для определения активности фитазы по методу ДНС и определения количества секретируемого белка по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США).Culture fluid without biomass (QOL) is used to determine the activity of phytase by the CSN method and to determine the amount of secreted protein by the Bradford method using the Quick Start Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, USA).
Рекомбинантный штамм Ogataea haglerorum N260 ВКПМ Y-4951 продуцирует белок в количестве 1.3±0.2 мг/мл, активность фермента фитазы составляет 1030±60 ед./мл.The recombinant strain Ogataea haglerorum N260 VKPM Y-4951 produces a protein in the amount of 1.3±0.2 mg/ml, the activity of the phytase enzyme is 1030±60 units/ml.
Пример 3. Получение фитазы путем культивирования заявляемого штамма Ogataea haglerorum N260 ВКПМ Y-4951 в 10 л ферментереExample 3. Obtaining phytase by cultivating the proposed strain Ogataea haglerorum N260 VKPM Y-4951 in a 10 l fermenter
В качестве образца сравнения используется штамм О. haglerorum 255 ВКПМ Y-4856.The strain O. haglerorum 255 VKPM Y-4856 is used as a reference sample.
Из суточной биомассы штамма Ogataea haglerorum N260 с чашки Петри со средой YP с глюкозой (2 мас. %) готовят суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде для определения оптической плотности (OD600). В качалочные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 110 мл жидкой посевной среды YP с глюкозой (2 мас. %) вносят приготовленную суспензию клеток до получения OD600, равной 0.1 единиц. Колбы инкубируют при температуре 37°С на качалке при 220 об/мин. до достижения культурой оптической плотности равной 12.From the daily biomass of the Ogataea haglerorum N260 strain from a Petri dish with YP medium with glucose (2 wt %), a cell suspension is prepared in sterile distilled water to determine the optical density (OD 600 ). In shaking flasks with a volume of 750 ml with a working volume of 110 ml of YP liquid seed medium with glucose (2 wt.%), the prepared cell suspension is added until an OD 600 of 0.1 units is obtained. The flasks are incubated at 37°C on a shaker at 220 rpm. until the culture reaches an optical density of 12.
Основную ферментацию проводят в ферментере объемом 10 литров, входящим в состав линии ферментеров BLBIO-10-10-100 SLA (Lianyungang Bailun Bio -Technology Co., Ltd), содержащем 5 л среды следующего состава (табл.1).The main fermentation is carried out in a 10-liter fermenter, which is part of the BLBIO-10-10-100 SLA fermenter line (Lianyungang Bailun Bio-Technology Co., Ltd), containing 5 liters of the medium of the following composition (Table 1).
Условия ферментации: температура 37°С; начальное перемешивание: 350 об/мин., начальная аэрация: 1.0 л воздуха на каждый л начальной среды в мин. Уровень рН поддерживают на значении 4.6 путем титрования 25%-ным водным раствором аммиака, а значение рО2 - на уровне 20.0% (от насыщения среды воздухом) путем использования каскадной регулировки скорости вращения мешалки.Fermentation conditions: temperature 37°C; initial agitation: 350 rpm, initial aeration: 1.0 liters of air for every liter of initial medium per minute. The pH level is maintained at a value of 4.6 by titration with a 25% aqueous ammonia solution, and the pO 2 value is at a level of 20.0% (from the saturation of the medium with air) by using a cascade control of the stirrer rotation speed.
Раствор микроэлементов РТМ1 имеет состав (табл. 2).A solution of microelements RTM1 has a composition (Table 2).
В рабочий ферментер вносят культуру, выращенную на качалке в колбах, достартового значения оптической плотности, равной 2.0. Наращивание биомассы осуществляют в два этапа. На первом этапе рост биомассы производят на глюкозе, введенной в ферментер с начальной средой (10 часов). На втором - наращивание биомассы обеспечивают путем подачи в ферментер глюкозной подпитки состава (мас. %): глюкоза - 36.0, раствор микроэлементов РТМ1 -1.2 (об./об.), биотин - 0.0005167, вода - остальное до значения сырого веса биомассы 15±1 (мас. %).In a working fermenter, a culture grown on a shaker in flasks is introduced, with a pre-start value of optical density equal to 2.0. Biomass growth is carried out in two stages. At the first stage, the growth of biomass is carried out on glucose introduced into the fermenter with the initial medium (10 hours). On the second stage, biomass growth is ensured by feeding the following composition (wt %) into the fermenter: glucose - 36.0, microelement solution РТМ1 - 1.2 (v/v), biotin - 0.0005167, water - the rest up to the fresh weight value of biomass 15± 1 (wt %).
Далее в ферментер со скоростью 6,25 мл/л н.с.в час подают раствор метанольной подпитки состава (мас. %): метанол - 95.9, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.2 об./об., биотин - 0.00044, вода - остальное. Индукция метанолом продолжается в течение 164 ч.Further, a methanol feed solution of the composition (wt. %) is fed into the fermenter at a rate of 6.25 ml/l n.s. per hour: methanol - 95.9, a solution of microelements РТМ1 - 1.2 v/v, biotin - 0.00044, water - the rest . The induction with methanol continues for 164 h.
В процессе культивирования заявляемого штамма периодически отбирают образцы КЖ для определения активности фитазы при рН 4.03 и температуре 37°С с использованием молибдата аммония и метаванадата аммония, на основании модифицированной методики определения активности фитазы по ГОСТ 31487-2012 «Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы» [ГОСТ 31487-2012]. Концентрацию белка в отобранных образцах КЖ определяют по методу, предложенному Layne [Layne, Е. "Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins." Methods in Enzymology 3 (1957): 447-454.]. Результаты приведены в табл. 3.In the process of cultivating the claimed strain, CL samples are periodically taken to determine phytase activity at pH 4.03 and a temperature of 37°C using ammonium molybdate and ammonium metavanadate, based on a modified method for determining phytase activity according to GOST 31487-2012 “Enzymatic preparations. Methods for determining the enzymatic activity of phytase” [GOST 31487-2012]. The protein concentration in the selected QOL samples is determined by the method proposed by Layne [Layne, E. "Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins." Methods in Enzymology 3 (1957): 447-454]. The results are shown in table. 3.
Приведенные результаты показывают, что при культивировании в 10-ти литровом ферментере штамм Ogataea haglerorum N260 продуцирует 23,7 мг/мл белка, при этом активность фитазы через 187 ч культивирования при 37°С составляет 17660 ед./мл КЖ (против 20 мг/мл белка и активности 16530 ед./мл КЖ у штамма Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856).These results show that when cultivated in a 10-liter fermenter, the Ogataea haglerorum N260 strain produces 23.7 mg/ml of protein, while the phytase activity after 187 hours of cultivation at 37°C is 17660 units/ml QOL (against 20 mg/ml). ml of protein and activity of 16530 units/ml QOL in the strain Ogataea haglerorum 255 VKPM Y-4856).
Таким образом, заявляемый штамм обладает большей продукцией (15%) и не содержит генов устойчивости к антибиотикам, что делает его использование в промышленности более выгодным и экологичным.Thus, the claimed strain has a higher production (15%) and does not contain antibiotic resistance genes, which makes its use in industry more profitable and environmentally friendly.
Следует также отметить, что штаммы О. haglerorum в отличие от продуцентов фитазы P. pastoris, способны синтезировать и секретировать фермент при температуре культивирования 37°С, что перспективно для разработки более экономичной технологии культивирования и получения товарной формы ферментного препарата фитазы.It should also be noted that strains of O. haglerorum, unlike P. pastoris phytase producers, are able to synthesize and secrete the enzyme at a cultivation temperature of 37°C, which is promising for the development of a more economical cultivation technology and the production of a commercial form of the phytase enzyme preparation.
Заявляемый штамм по своим биотехнологическим показателям сравним с лучшими зарубежными штаммами - продуцентами фитазы.The claimed strain is comparable in its biotechnological parameters with the best foreign strains - phytase producers.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2785901C1 true RU2785901C1 (en) | 2022-12-14 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2737623C1 (en) * | 2019-12-03 | 2020-12-01 | Акционерное Общество "Биоамид" | Recombinant pichia pastoris yeast strain with increased production of escherichia coli phytase |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2737623C1 (en) * | 2019-12-03 | 2020-12-01 | Акционерное Общество "Биоамид" | Recombinant pichia pastoris yeast strain with increased production of escherichia coli phytase |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAYER A.F. et al. An expression system matures: a highly efficient and cost-effective process for phytase production by recombinant strains of Hansenula polymorpha. Biotechnol Bioeng. 1999 May 5;63(3):373-81. doi: 10.1002/(sici)1097-0290(19990505)63:33.0.co;2-t. CHAROENRAT T. et al. High Cell Density Process for Constitutive Production of a Recombinant Phytase in Thermotolerant Methylotrophic Yeast Ogataea thermomethanolica Using Table Sugar as Carbon Source. Appl Biochem Biotechnol. 2016 Dec;180(8):1618-1634. doi: 10.1007/s12010-016-2191-8. NAUMOV G., NAUMOVA E. Ogataea haglerorum sp. Nov., a novel member of the species complex, Ogataea (Hansenula) polymorpha. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017, 67:2465-2469. * |
| ТAРУТИНA М.Г. и др. Cравнительная характеристика фитаз из Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, экспрессированных в метилотрофных дрожжах Ogataea polymorpha и Pichia pastoris. Биотехнология, 2019, Т. 35, N 6, с.51-56. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2595380C2 (en) | Fermentation medium for producing pravastatin and method of producing pravastatin | |
| CN1495259A (en) | Production of valuable compound by using chemically defined culture medium and adopting industrial scal fermentation process | |
| Ruanglek et al. | Cloning, expression, characterization, and high cell-density production of recombinant endo-1, 4-β-xylanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris | |
| Vohra et al. | A cost‐effective cane molasses medium for enhanced cell‐bound phytase production by Pichia anomala | |
| US10472656B2 (en) | Method for fermenting sugars using genetically engineered yeast | |
| AU2018202269A1 (en) | Endogenous dnase activity to reduce dna content | |
| Edelman et al. | Myco-protein-a new food. | |
| JP2004515249A (en) | A method for the production of heterologous proteins by fungi. | |
| RU2701498C1 (en) | Recombinant yeast strain pichia pastoris - phytase producer | |
| Selvamohan et al. | Optimization of phytase production by Pseudomonas Sp. Isolated from poultry faces | |
| RU2785901C1 (en) | Recombinant strain of ogataea haglerorum yeast - producer of escherichia coli phytase | |
| RU2737623C1 (en) | Recombinant pichia pastoris yeast strain with increased production of escherichia coli phytase | |
| RU2771079C1 (en) | Yeast transformant ogataea haglerorum - producer of phytase escherichia coli | |
| RU2504579C2 (en) | RECOMBINANT YEAST STRAIN Yarrowia lipolytica - PRODUCER OF PHYTASE | |
| CN109161489B (en) | Aspergillus niger strain with high yield of acid protease | |
| JP4149253B2 (en) | Microbial culture method | |
| CN109251867B (en) | High-yield strain of acid protease and application thereof | |
| NZ279286A (en) | Modifying a filamentous microorganism (fungi) through culturing and selecting for desired morphology | |
| RU2751595C2 (en) | Recombinant strain of pichia pastoris yeast - producer of escherichia coli phytase | |
| CN105779317A (en) | Pichia pastoris strain with high methanol protein yield and application | |
| RU2805486C1 (en) | Komagataella phaffii transformant is a producer of recombinant chymosin in active form | |
| RU2764793C1 (en) | Yeast transformant ogataea haglerorum producing beta-mannanase, containing synthetic mans gene in chromosome | |
| RU2756330C1 (en) | Komagataella phaffii yeast transformant that produces cronobacter turicensis phytase | |
| RU2747782C1 (en) | Recombinant yeast strain ogataea haglerorum producing beta-mannanase bacillus subtilis | |
| RU2771582C1 (en) | Komagataella phaffi yeast transformant - citrobacter gillenii phytase producer |