RU2764793C1

RU2764793C1 - Yeast transformant ogataea haglerorum producing beta-mannanase, containing synthetic mans gene in chromosome

Info

Publication number: RU2764793C1
Application number: RU2020134335A
Authority: RU
Inventors: Марина Геннадьевна Тарутина; Марина Николаевна Лазарева; Анастасия Романовна Лаптева; Владимир Сергеевич Коробов; Александр Сергеевич Федоров; Сергей Павлович Синеокий
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-01-21

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: yeast transformant Ogataea haglerorum producing β-mannanase EC 3.2.1.78 from Bacillus subtilis, containing optimized synthetic gene in chromosome, encoding the specified β-mannanase is proposed, a nucleotide sequence of which is given in the sequence list under SEQ ID NO: 1.

EFFECT: invention provides for the expansion of the arsenal of recombinant microorganisms producing β-mannanase.

1 cl, 4 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения рекомбинантного штамма дрожжей Ogataea haglerorum N107 - продуцента β-маннаназы.The invention relates to the field of biotechnology and concerns the production of a recombinant yeast strain Ogataea haglerorum N107 - a producer of β-mannanase.

β-маннаназа (эндо-β-1,4-маннаназа β-1,4-D-маннаназа, 1,4-β-D-маннан манногидролаза, Е.С. 3.2.1.78) относится к гемицеллюлазам, к классу ферментов О-гликозид-гидролаз и катализирует расщепление внутренних β-1,4-гликозидных связей в основной полимерной цепи молекулы маннана.β-mannanase (endo-β-1,4-mannanase β-1,4-D-mannanase, 1,4-β-D-mannan mannohydrolase, E.C. 3.2.1.78) belongs to hemicellulases, to the class of enzymes O -glycoside hydrolases and catalyzes the cleavage of internal β-1,4-glycosidic bonds in the main polymer chain of the mannan molecule.

Маннан - важный компонент гемицеллюлозной фракции клеточной стенки многих растений, полисахарид, который в зависимости от строения подразделяют на четыре субсемейства: линейный маннан, галактоманнан, глюкоманнан или галактоглюкоманнан [Carbohydr Polym. 2001, 44, 107-112; Process Biochem. 2010, 45, 1203-1213]. В каждом из этих полисахаридов основная цепь состоит из остатков D-маннозы или комбинации остатков D-маннозы и D-глюкозы, связанных β-1,4-гликозидными связями.Mannan is an important component of the hemicellulose fraction of the cell wall of many plants, a polysaccharide, which, depending on the structure, is divided into four subfamilies: linear mannan, galactomannan, glucomannan or galactoglucomannan [Carbohydr Polym. 2001, 44, 107-112; Process Biochem. 2010, 45, 1203-1213]. In each of these polysaccharides, the backbone consists of D-mannose residues or a combination of D-mannose and D-glucose residues linked by β-1,4-glycosidic bonds.

Полная деградация маннана требует комплекса маннолитических ферментов, включающих β-маннаназу, β-1,4-маннозидазу (ЕС 3.2.1.25) и β-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.21).Complete degradation of mannan requires a complex of mannolytic enzymes including β-mannanase, β-1,4-mannosidase (EC 3.2.1.25) and β-glucosidase (EC 3.2.1.21).

Основную роль в разрушении маннана играет β-маннаназа, которая катализирует случайный гидролиз маннана до низкомолекулярных манноолигосахаридов, преимущественно до маннобиозы и маннотриозы [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Низкомолекулярные манноолигосахариды и манноза могут усваиваться живыми организмами.The main role in the destruction of mannan is played by β-mannanase, which catalyzes the random hydrolysis of mannan to low molecular weight mannooligosaccharides, mainly to mannobioses and mannotrioses [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Low molecular weight mannooligosaccharides and mannose can be absorbed by living organisms.

β-маннаназу применяют в целлюлозно-бумажной промышленности для отбеливания пульпы, в пищевой промышленности (растворимый кофе, экстракция растительных масел из семян, диетические пищевые продукты), производстве синтетических моющих средств, получении биотоплива из лигноцеллюлозы [Appl Microbiol Biotechnol. 2008, 79, 165-178. DOI 10.1007/s00253-008-1423-4]. Важной областью применения β-маннаназы является кормовая промышленность. Наличие маннанов в кормах приводит к повышению вязкости содержимого желудочно-кишечного тракта птицы и животных с однокамерным желудком из-за способности маннанов связывать свободную воду. Введение в корма животных β-маннаназы увеличивает их питательную ценность и энергетический уровень, уменьшает вязкость перевариваемого субстрата, способствует улучшению физиологического состояния животных, приросту их массы и продуктивности [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Манноза - продукт расщепления маннанов, легко усваивается организмом. Неусвояемые формы манноолигосахаридов - маннотриоза и маннобиоза, являются хорошим субстратом для роста бифидобактерий и способствуют улучшению показателей здоровья птицы. Введение маннаназы и других ферментов, разрушающих растительные субстраты, в рацион животных с однокамерным желудком и птиц позволяет использовать такие дешевые корма, как ячмень, овес и отходы сельскохозяйственного производства (отруби, жом), содержащие трудноусвояемые компоненты.β-mannanase is used in the pulp and paper industry for pulp bleaching, in the food industry (instant coffee, extraction of vegetable oils from seeds, dietary foods), the production of synthetic detergents, obtaining biofuels from lignocellulose [Appl Microbiol Biotechnol. 2008, 79, 165-178. DOI 10.1007/s00253-008-1423-4]. An important area of application for β-mannanase is the feed industry. The presence of mannans in feed leads to an increase in the viscosity of the contents of the gastrointestinal tract of birds and animals with a single-chamber stomach due to the ability of mannans to bind free water. The introduction of β-mannanase into animal feed increases their nutritional value and energy level, reduces the viscosity of the digestible substrate, improves the physiological state of animals, increases their weight and productivity [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Mannose is a breakdown product of mannans and is easily absorbed by the body. Indigestible forms of mannooligosaccharides - mannotriose and mannobiose, are a good substrate for the growth of bifidobacteria and contribute to the improvement of poultry health indicators. The introduction of mannanase and other enzymes that destroy plant substrates into the diet of monogastric animals and birds makes it possible to use such cheap feeds as barley, oats, and agricultural waste (bran, beet pulp) containing difficult-to-digest components.

Природными источниками β-маннаназ являются преимущественно бактерии и грибы. Среди грамположительных бактерий преобладают виды рода Bacillus и Clostridium [Carbohydr Polym. 2006, 66, 88-96; J Food Biochem. 2011, 35, 1451-1460; J. Bacteriol. 2004, 186 (19), 6544-6552]. β-Маннаназы синтезируются некоторыми штаммами грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas [Biochem J. 1995, 305, 1005-1010], Vibrio [Biosci Biotechnol Biochem. 2009, 73, 109-116]. Обширная группа маннолитиков среди грибов представлена родами Aspergillus и Trichoderma [J. Biotechnol. 1998, 63, 199-210; PLOS One. 2011, 6(12), e29302. doi:10.1371/journal. Pone.0029302].Natural sources of β-mannanases are predominantly bacteria and fungi. Gram-positive bacteria are dominated by species of the genus Bacillus and Clostridium [Carbohydr Polym. 2006, 66, 88-96; J Food Biochem. 2011, 35, 1451-1460; J. Bacteriol. 2004, 186 (19), 6544-6552]. β-Mannanases are synthesized by some strains of Gram-negative bacteria such as Pseudomonas [Biochem J. 1995, 305, 1005-1010], Vibrio [Biosci Biotechnol Biochem. 2009, 73, 109-116]. An extensive group of mannolytics among fungi is represented by the genera Aspergillus and Trichoderma [J. Biotechnol. 1998, 63, 199-210; PLOS One. 2011, 6(12), e29302. doi:10.1371/journal. Pone.0029302].

Большое количество генов β-маннаназ экспрессировано в гетерологичных хозяевах. Гены β-маннаназ из бактериальных источников экспрессированы в Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris, Kluyveromyces cicerisporous, гены β-маннаназ из грибов экспрессированы в Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Aspergillus sp., Trichoderma reesei [Biotechnology Advances. 2016. doi:10.1016/j.biotechadv.2016.11.00; Process Biochemistry 2010, 45, 1203-1213. doi:10.1016/j.procbio.2010.05.011].A large number of β-mannanase genes are expressed in heterologous hosts. β-mannanase genes from bacterial sources are expressed in Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris, Kluyveromyces cicerisporous, β-mannanase genes from fungi are expressed in Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Aspergillus sp., Trichoderma reesei [Biotechnology Advances . 2016. doi:10.1016/j.biotechadv.2016.11.00; Process Biochemistry 2010, 45, 1203-1213. doi:10.1016/j.procbio.2010.05.011].

Штаммы грибов, как правило, продуцируют комплекс ферментов, относящихся к карбогидразам и разрушающих растительные субстраты, а именно, β-маннаназу, ксиланазу, целлюлазу, глюканазу и пектиназу. В этом ферментном коктейле на долю β-маннаназ приходится не более 3% [Carbohydr Polym. 2004, 57, 23-29].Fungal strains typically produce a complex of carbohydrase enzymes that degrade plant substrates, namely β-mannanase, xylanase, cellulase, glucanase, and pectinase. In this enzyme cocktail, β-mannanases account for no more than 3% [Carbohydr Polym. 2004, 57, 23-29].

Для производства моноферментных препаратов используют рекомбинантные дрожжевые штаммы.For the production of monoenzymatic preparations, recombinant yeast strains are used.

Наиболее продуктивные рекомбинантные штаммы - продуценты β-маннаназы получены на основе дрожжей Pichia pastoris.The most productive recombinant strains producing β-mannanase were obtained from the yeast Pichia pastoris.

Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris являются модельным организмом для экспрессии гетерологичных генов под контролем сильного регулируемого метанолом промотора гена АОХ1. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(6), 741-750]. Процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24:45-66, doi: 10.111 l/j.l574-6976.2000.tb00532.x].The methylotrophic yeast Pichia pastoris is a model organism for the expression of heterologous genes under the control of a strong methanol-regulated promoter of the AOX1 gene. When using non-fermentable carbon sources (glycerol, methanol, etc.), the yeast Pichia pastoris is capable of growing with the formation of a high density biomass, which makes it possible to obtain significant amounts of a heterologous protein [Appl. microbiol. Biotechnol., 2000, 54(6), 741-750]. The cultivation process of methylotrophic yeast is quite simple, since their growth is not blocked by metabolic products [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24:45-66, doi: 10.111 l/j.l574-6976.2000.tb00532.x].

На базе дрожжей Pichia pastoris получены рекомбинантные штаммы, содержащие гены маннаназ из грибов.On the basis of Pichia pastoris yeast, recombinant strains containing fungal mannanase genes were obtained.

В дрожжах Pichia pastoris Х-33 экспрессирован ген manM Aspergillus sulphureus с кодонами, адаптированными для этого вида дрожжей. Штамм продуцирует 3 мг/мл белка, активность фермента составляет 1100 ед./мл КЖ через 96 ч культивирования в 10 л ферментере. Рекомбинантная β-маннаназа имеет максимальную активность при рН 2,4 и температуре 50°С, удельная активность фермента 344,8 ед./мг [Biologia 2009, 64/2, 235-238. doi: 10.2478/sl 1756-009-0043-5].The yeast Pichia pastoris X-33 expresses the Aspergillus sulphureus manM gene with codons adapted for this yeast species. The strain produces 3 mg/ml of protein, the enzyme activity is 1100 units/ml QOL after 96 hours of cultivation in a 10 l fermenter. Recombinant β-mannanase has a maximum activity at pH 2.4 and a temperature of 50°C, the specific activity of the enzyme is 344.8 units/mg [Biologia 2009, 64/2, 235-238. doi: 10.2478/sl 1756-009-0043-5].

β-Маннаназы грибного происхождения, в основном, проявляют максимальную активность при кислых значениях рН (2.0-4.5) и характеризуются невысокой удельной активностью по сравнению с бактериальными β-маннаназами.β-Mannanases of fungal origin, in general, show maximum activity at acidic pH values (2.0-4.5) and are characterized by low specific activity compared to bacterial β-mannanases.

Известны примеры создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе дрожжей Pichia pastoris, содержащих гены бактериальных β-маннаназ, преимущественно из бактерий рода Bacillus. Бактериальные β-маннаназы проявляют максимальную активность при нейтральных и щелочных значениях рН и характеризуются в массе своей относительно высокой удельной активностью по сравнению с грибными β-маннаназами, например, удельная активность очищенной β-маннаназы из Bacillus subtilis SA-22 составляет 34780 ед./мг, из Bacillus circulans М-21 -19373 ед./мг, из Bacillus subtilis WY34 - 8302 ед./мг, из Bacillus sp.MSJ-5 - 5383 ед./мг [Int J Pharm Bio Sci. 2014, 5(1): (B), 176-192] и, в целом, более термостабильны, чем грибные β-маннаназы, что важно для промышленного использования фермента [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93, 1817-1830. DOI 10.1007/s00253-012-3887-5].Known examples of the creation of highly productive recombinant producer strains based on the yeast Pichia pastoris containing the genes of bacterial β-mannanases, mainly from bacteria of the genus Bacillus. Bacterial β-mannanases show maximum activity at neutral and alkaline pH values and are characterized in bulk by their relatively high specific activity compared to fungal β-mannanases, for example, the specific activity of purified β-mannanase from Bacillus subtilis SA-22 is 34780 U/mg , from Bacillus circulans M-21 - 19373 U/mg, from Bacillus subtilis WY34 - 8302 U/mg, from Bacillus sp.MSJ-5 - 5383 U/mg [Int J Pharm Bio Sci. 2014, 5(1): (B), 176-192] and, in general, are more thermostable than fungal β-mannanases, which is important for the industrial use of the enzyme [Appl. microbiol. Biotechnol. 2012, 93, 1817-1830. DOI 10.1007/s00253-012-3887-5].

Получен продуцент на основе штамма P. pastoris GS115, в котором экспрессирован ген β-маннаназы из Bacillus megaterium FBI01. Активность маннаназы составляет 22000 ед./мл через 120 ч ферментации и не меняется при увеличении времени культивирования до 190 ч. Удельная активность фермента в КЖ составляет 3427 ед./мг, очищенного фермента - 16718 ед./мг. Фермент проявляет максимальную активность при рН 6.5 и температуре 55°С [WO 2012079222].A producer was obtained based on the P. pastoris GS115 strain, in which the β-mannanase gene from Bacillus megaterium FBI01 is expressed. The activity of mannanase is 22000 U/mL after 120 h of fermentation and does not change with increasing cultivation time to 190 h. The enzyme exhibits maximum activity at pH 6.5 and a temperature of 55°C [WO 2012079222].

Ген β-маннаназы mannS из Bacillus subtilis MAFIC-S11, имеющий адаптированные для дрожжей P. pastoris ко доны, экспрессирован в дрожжах P. pastoris. Для секреции использована модифицированная сигнальная последовательность [Biotechnology and Bioengineering 2009, 103, 1192-1201]. Штамм секретирует 6,6 мг/мл белка, активность маннаназы составляет 24600 ед./мл через 144 ч ферментации в 10 л ферментере. Фермент имеет максимальную активность при рН 6,0 и температуре 50°С [Appl Biochem Biotechnol. 2013,169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].The mannS β-mannanase gene from Bacillus subtilis MAFIC-S11, which has codons adapted for the yeast P. pastoris, is expressed in the yeast P. pastoris. A modified signal sequence was used for secretion [Biotechnology and Bioengineering 2009, 103, 1192-1201]. The strain secretes 6.6 mg/ml of protein, the activity of mannanase is 24600 units/ml after 144 hours of fermentation in a 10 l fermenter. The enzyme has a maximum activity at pH 6.0 and a temperature of 50°C [Appl Biochem Biotechnol. 2013.169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].

Рекомбинантный штамм Pichia pastoris, содержащий искусственно созданный ген маннаназы ManGold, секретирует 3,25 мг/мл фермента, активность маннаназы составляет 35000 ед./мл через 96 ч ферментации [CN 110093331].A recombinant strain of Pichia pastoris containing an artificially created ManGold mannanase gene secretes 3.25 mg/ml of the enzyme, mannanase activity is 35,000 units/ml after 96 hours of fermentation [CN 110093331].

Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenuld). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи Pichia pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Pichia pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а также при культивировании в биореакторе позволяют получать биомассу с высокой плотностью клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052].Another known methylotrophic system for heterologous expression is the thermotolerant yeast Ogataea (Hansenuld). Yeasts of the genus Ogataea, like yeast Pichia pastoris, have a unique organization and regulation of metabolism in the presence of methanol due to the presence of strong promoters induced by methanol. Like Pichia pastoris, yeasts of the genus Ogataea combine the advantages of being easy to grow on an inexpensive growth medium with high secretion ability, and when grown in a bioreactor, they can produce a biomass with a high cell density, which contributes to a high yield of the target product [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. cell fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052].

В отличие от Pichia pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре не ниже 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.Unlike Pichia pastoris, yeasts of the genus Ogataea are thermotolerant, which allows fermentation at a temperature not lower than 37°C. Increasing the temperature of the fermentation process reduces contamination and the cost of cooling the bioreactor [Appl. microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] and as a result shortens the fermentation time.

Вид Ogataea haglerorum выделен из дрожжей рода Ogataea в 2017 г. в результате проведения анализа последовательностей D1/D1 гена LSU rRNA, ITS1-5.8S-ITS2, фактора элонгации трансляции EF-1α и комплексного генетического анализа Наумовым Г.И. с соавторами [Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012].The species Ogataea haglerorum was isolated from the yeast of the genus Ogataea in 2017 as a result of analysis of the D1/D1 sequences of the LSU rRNA gene, ITS1-5.8S-ITS2, translation elongation factor EF-1α and complex genetic analysis by Naumov G.I. et al. [Int. J. Syst. Evol. microbiol. 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012].

Для дрожжей Ogataea haglerorum разработаны генетические технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионный вектор и метод введения ДНК в клетки реципиента [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56]. Описано использование штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 для экспрессии различных генов фитазы. Других сведений об использовании дрожжей Ogataea haglerorum для экспрессии гетерологичных генов не выявлено.For the yeast Ogataea haglerorum, genetic technologies have been developed for constructing producer strains, including an expression vector and a method for introducing DNA into recipient cells [Biotechnology, 2019, 35 (6), 51-56]. The use of the strain Ogataea haglerorum VKPM Y-2584 for the expression of various phytase genes is described. No other information on the use of the yeast Ogataea haglerorum for the expression of heterologous genes was found.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-маннаназу.The objective of the claimed invention is to expand the arsenal of recombinant microorganisms producing β-mannanase.

Задача решена путем получения трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующего β-маннаназу из Bacillus subtilis, содержащего в составе хромосомы оптимизированный синтетический ген MANS, кодирующий указанную β-маннаназу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:l.The problem was solved by obtaining a transformant of the yeast Ogataea haglerorum producing β-mannanase from Bacillus subtilis, containing in the chromosome an optimized synthetic MANS gene encoding the indicated β-mannanase, the nucleotide sequence of which is given in the sequence listing under the number SEQ ID NO:l.

В заявляемом изобретении термотолерантные метилотрофные дрожжи рода Ogataea впервые использованы для гетерологичной экспрессии β-маннаназы.In the claimed invention, thermotolerant methylotrophic yeast of the genus Ogataea is used for the first time for the heterologous expression of β-mannanase.

Получение заявляемого трансформанта включает:Obtaining the claimed transformant includes:

- трансформацию в клетки дрожжей Ogataea haglerorum экспрессионной кассеты, содержащей синтетический ген MANS β-маннаназы из Bacillus subtilis; нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID N0:1, промотор, работающий в дрожжах Ogataea (Hansenuld), сигнальный пептид для осуществления секреции фермента в культуральную жидкость, терминатор, маркерный ген и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосому. Интеграцию осуществляют путем как гомологичной, так и негомологичной рекомбинации. Трансформацию экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Ogataea (Hansenuld) осуществляют любым подходящим методом, например, методом электоропорации [http://tools.thermofisher.coni/content/sfs/manuals/pich_man.pdf] или методом с использованием полиэтиленгликоля или протопластов [http://vvfww.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001];- transformation into yeast Ogataea haglerorum cells of an expression cassette containing a synthetic gene MANS β-mannanase from Bacillus subtilis; the nucleotide sequence of which is shown in the sequence listing under the number SEQ ID N0:1, a promoter operating in the yeast Ogataea (Hansenuld), a signal peptide for secreting the enzyme into the culture fluid, a terminator, a marker gene and, preferably, a site for homologous integration into the chromosome. Integration is carried out by both homologous and non-homologous recombination. Transformation of the expression cassette into Ogataea (Hansenuld) yeast cells is carried out by any suitable method, for example, the electroporation method [http://tools.thermofisher.coni/content/sfs/manuals/pich_man.pdf] or the method using polyethylene glycol or protoplasts [http: //vvfww.thermofisher.com/order/catalog/product/K173001];

- отбор репликативного трансформанта, способного продуцировать β-маннаназу;- selection of a replicative transformant capable of producing β-mannanase;

- отбор трансформанта, способного к синтезу β-маннаназы, с множественной интеграцией экспрессионной кассеты в состав хромосомы.- selection of a transformant capable of synthesizing β-mannanase with multiple integration of the expression cassette into the chromosome.

Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Ogataea (Hansenuld). В качестве промоторов могут быть использованы МОХ, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, РМА1, АОХ, MAL, АМО, TEF1, РЕХ14, РЕХ11 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, 1-6; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278].The construction of the expression cassette is carried out by standard methods of genetic engineering [Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] using genetic elements suitable for working with yeasts of the genus Ogataea (Hansenuld). MOX, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, PMA1, AOX, MAL, AMO, TEF1, PEX14, PEX11 can be used as promoters [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, 1-6; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278].

В качестве сигнальных пептидов используют лидерную последовательность PHO1, пре-про-лидерную последовательность MFa из Saccharomyces cerevisiae или Ogataea thermomethanolica, GAM1 из Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178, 710-724].PHO1 leader sequence, pre-proleader MFa sequence from Saccharomyces cerevisiae or Ogataea thermomethanolica, GAM1 from Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178, 710-724].

В качестве терминаторов транскрипции используют МОХ, AMO1, PHO5, АОХ1 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184].MOX, AMO1, PHO5, AOX1 are used as transcription terminators [Appl. microbiol. Biotechnol., 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184].

В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418), гигромицину В, норзеотрицину или бластицидину а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме дрожжей рода Ogataea, например, LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, МЕТб, ADE11 [FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; Yeast, 1995, 11, 343-353].As selectable markers, any suitable markers are used, for example, genes for resistance to antibiotics zeocin, geneticin (G418), hygromycin B, norseothricin or blasticidin, as well as genes complementing auxotrophic mutations in the genome of the yeast of the genus Ogataea, for example, LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, METb, ADE11 [FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; Yeast, 1995, 11, 343-353].

В качестве последовательностей, обеспечивающих эффективную трансформацию и автономную репликацию, используют HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gen Genet. 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178 (15), 4420-4428].As sequences that provide efficient transformation and autonomous replication, use HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gene Genet. 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178(15), 4420-4428].

В качестве плечей для гомологичной интеграции используют, в частности, последовательности генов МОХ, TRP, URA3, LEU2, GAP, кластер генов для рибосомальной ДНК, HARS, АМО, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Ogataea.As arms for homologous integration, in particular, the sequences of the MOX, TRP, URA3, LEU2, GAP genes, the gene cluster for ribosomal DNA, HARS, AMO, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278] or other sequences homologous to regions of the chromosome of the yeast genus Ogataea.

Синтетический ген MANS размером 1032 п.н. с проведенной нами оптимизацией ко донов для метил отрофных дрожжей синтезирован в компании ООО «Иннова плюс» (Санкт-Петербург) по заказу НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика. Нуклеотидная последовательность синтетического гена MANS приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.Synthetic MANS gene 1032 bp in size. with our optimization of codons for methyl otrophic yeast, it was synthesized at Innova Plus LLC (St. Petersburg) by order of the National Research Center "Kurchatov Institute" - State Research Institute of Genetics. The nucleotide sequence of the synthetic MANS gene is shown in the sequence listing under SEQ ID NO:1.

Ген MANS кодирует белок ManS, который по последовательности аминокислот наиболее близок к β-маннаназам из бактерий рода Bacillus subtilis. На основании анализа, проведенного с использованием программы BLAST, установлено, что β-маннаназа ManS идентична β-маннаназам из Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 [GenBank accession number: JX426102], Bacillus subtilis WL-7 [GenBank accession number: AAT27435], Bacillus subtilis 168 [GenBank accession number: CAB 12407] на 97.4-97.7%.The MANS gene encodes the ManS protein, which is closest in amino acid sequence to β-mannanases from bacteria of the genus Bacillus subtilis. Based on the analysis performed using the BLAST program, it was found that β-mannanase ManS is identical to β-mannanases from Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 [GenBank accession number: JX426102], Bacillus subtilis WL-7 [GenBank accession number: AAT27435], Bacillus subtilis 168 [GenBank accession number: CAB 12407] by 97.4-97.7%.

β-Маннаназа из Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 экспрессирована в дрожжах Pichia pastoris. Ген β-маннаназы mannS (1029 п. н.) из Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 с адаптированными кодонами для дрожжей Pichia pastoris кодирует полипептид размером 342 аминокислоты (расчетный мол. вес 38.7 кДа). Рекомбинантный белок имеет молекулярный вес около 40 кДа. Фермент показал максимальную активность при рН 6.0 и температуре 50°С, удельная активность 3706 ед./мг. Кинетические параметры K_m и V_max определены как 8 мг/мл и 20000 ед./мг, соответственно [Appl Biochem Biotechnol. 2013,169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].β-Mannanase from Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 is expressed in the yeast Pichia pastoris. The mannS β-mannanase gene (1029 bp) from Bacillus subtilis MAFIC-SI 1 with adapted codons for the yeast Pichia pastoris encodes a 342 amino acid polypeptide (calculated molecular weight 38.7 kDa). The recombinant protein has a molecular weight of about 40 kDa. The enzyme showed maximum activity at pH 6.0 and 50°C, specific activity 3706 units/mg. Kinetic parameters K _m and V _{max are} defined as 8 mg/ml and 20,000 units/mg, respectively [Appl Biochem Biotechnol. 2013.169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].

β-Маннаназа из Bacillus subtilis WL-7, продуцируемая клетками Escherichia coli, -фермент с молекулярным весом 38 кДа - проявляет максимальную активность при рН 6.0 и температуре 55°С, удельная активность 10080 ед./мг [J. Microbiol. Biotechnol. 2004, 14(6), 1295-1302].β-Mannanase from Bacillus subtilis WL-7 produced by Escherichia coli cells, an enzyme with a molecular weight of 38 kDa, exhibits maximum activity at pH 6.0 and a temperature of 55°C, the specific activity is 10080 U/mg [J. microbiol. Biotechnol. 2004, 14(6), 1295-1302].

β-Маннаназа из Bacillus subtilis 168 (1011 п.н., 336 аминокислот, молекулярный вес 38 кДа) проявляет оптимальную активность при рН 6.0-6.5 и температуре 40-45°С [WO 1999/64573].β-Mannanase from Bacillus subtilis 168 (1011 bp, 336 amino acids, molecular weight 38 kDa) exhibits optimal activity at pH 6.0-6.5 and temperature 40-45°C [WO 1999/64573].

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.The invention is illustrated by the following figures.

Фиг. 1. Экспрессионный вектор pMOX-Km-HARSFig. 1. Expression vector pMOX-Km-HARS

Фиг. 2. Экспрессионная кассета.Fig. 2. Expression cassette.

Фиг. 3 Зависимость активности β-маннаназы от рН и стабильность фермента при разных значениях рН.Fig. 3 Dependence of β-mannanase activity on pH and enzyme stability at different pH values.

Фиг. 4 Зависимость активности β-маннаназы от температуры и стабильность фермента при разной температуре.Fig. 4 Temperature dependence of β-mannanase activity and enzyme stability at different temperatures.

Пример 1. Конструирование трансформантов дрожжей Ogataea haglerorum, содержащих оптимизированный ген, кодирующий β-маннаназу из Bacillus subtilisExample 1 Construction of Yeast Ogataea haglerorum Transformants Containing an Optimized Gene Encoding β-mannanase from Bacillus subtilis

Ген MANS амплифицируют с матрицы методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов manS-F и manS-R:The MANS gene is amplified from the matrix by PCR using manS-F and manS-R oligonucleotides:

manS-F: 5'-ctgaattcagatctagatctgaagctcac-3',manS-F: 5'-ctgaattcagatctagatctgaagctcac-3',

manS-R: 5'-cagcggccgcttactactcaacgattggagtc-3'.manS-R: 5'-cagcggccgcttactactcaacgattggagtc-3'.

Амплификацию проводят в присутствии Кара-полимеразы (KapaBiosystems, США) при следующих условиях:Amplification is carried out in the presence of Kara-polymerase (KapaBiosystems, USA) under the following conditions:

1 цикл: 98°С - 2 мин.1 cycle: 98°C - 2 min.

35 циклов: 98°С - 20 с, 53°С - 15 с, 72°С - 60 с35 cycles: 98°C - 20 s, 53°C - 15 s, 72°C - 60 s

1 цикл: 72°С - 3 мин.1 cycle: 72°C - 3 min.

Полученную последовательность ДНК по сайтам EcoRI и NotI встраивают в состав экспрессионного вектора pMOX-Km-HARS (рис 1), созданного на основе коммерческого вектора pBluescript II KS+(Х52327, Stratagene) [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56].The resulting DNA sequence at the EcoRI and NotI sites is inserted into the expression vector pMOX-Km-HARS (Fig. 1), created on the basis of the commercial vector pBluescript II KS+ (X52327, Stratagene) [Biotechnology, 2019, 35 (6), 51-56] .

Получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету (фиг. 2), в состав которой входят следующие генетические элементы.Get a plasmid containing the expression cassette (Fig. 2), which includes the following genetic elements.

1. Синтетический ген MANS, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, транскрипция которого находится под контролем промотора рМОХ, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 (линия CBS4732);1. Synthetic MANS gene inserted into the reading frame with the nucleotide sequence of the MFα signal peptide from the yeast Saccharomyces cerevisiae, the transcription of which is under the control of the pMOX promoter generated from chromosomal DNA from the strain Ogataea polymorpha VKPM Y-1546 (line CBS4732);

2. Терминатор транскрипции tMOX, наработанный с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546;2. Transcription terminator tMOX generated from chromosomal DNA from Ogataea polymorpha strain VKPM Y-1546;

3. Дрожжевой селективный маркер KmMX, фланкированный сайтами 1ох66 и 1ох71, транскрипция которого находится под контролем промотора pGAPD гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546, и терминатора транскрипции tTEF. Маркер КтМХ обеспечивает устойчивость дрожжей Ogataea haglerorum к антибиотику генетицину (G418);3. Yeast selective marker KmMX, flanked by sites 1ox66 and 1ox71, whose transcription is under the control of the pGAPD promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, generated from chromosomal DNA from the Ogataea polymorpha strain VKPM Y-1546, and the transcription terminator tTEF. The CtMX marker ensures the resistance of the yeast Ogataea haglerorum to the antibiotic geneticin (G418);

4. Последовательность HARS, наработанная с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-916 (линия DL1), обеспечивающая сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма и являющаяся возможным местом интеграции;4. The HARS sequence generated from chromosomal DNA from the strain Ogataea polymorpha VKPM Y-916 (line DL1), which ensures the preservation of the transformable DNA in the cells of the recipient strain and is a possible site of integration;

5. Область интеграции - нуклеотидная последовательность 3'- области региона МОХ.5. Integration region - nucleotide sequence of the 3' region of the MOX region.

Экспрессионную кассету трансформируют в штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD₆₀₀) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола в 1 л воды SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин. и собирают центрифугированием в течение 10 мин. при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCh в 1 л воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 500 нг ДНК экспрессионной кассеты и инкубируют во льду 5 минут.Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. при качании.The expression cassette is transformed into the strain Ogataea haglerorum VKPM Y-2584, which is preliminarily grown in a liquid YP nutrient medium (wt. %: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt. %) at 37° C for 6 hours until the culture reaches an optical density (OD ₆₀₀ ) of 1.5. Cells are harvested by centrifugation (hereinafter 6000 rpm) for 10 minutes. at room temperature, resuspended in TED buffer composition: 100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8.0, 25 mM dithiothreitol in 1 l of SQ water, incubated at 37°C for 15 min. and harvested by centrifugation for 10 min. at room temperature. Next, the cells are washed twice with cold STM buffer composition: 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCh in 1 L water SQ, harvested by centrifugation for 10 min at 5°C. The cells thus treated are resuspended in cold STM solution at a concentration of 1-5×10 ⁹ cells/ml. A 60 μl aliquot of the cell suspension is transferred to a chilled Eppendorf, 500 ng of DNA expression cassette is added and incubated on ice for 5 minutes. The mixture of cells and DNA is transferred to a pre-chilled electroporation cuvette. Electroporation is carried out at 1500 V, 200 ohms, 25uF. After electroporation, 1 ml of liquid YP medium with glucose (2 wt %) is added to the cells, the cell suspension is transferred into sterile 1.5 ml tubes and incubated at 37°C for 60 min. when swinging.

Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (G418) в количестве 200 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.The selection of transformants is carried out on YP agar medium with glucose (2 wt %) and geneticin (G418) in the amount of 200 μg/ml at 37°C for 4 days.

Для последующего отбора трансформантов с наибольшей активностью β-маннаназы осуществляют их культивирование в пробирках в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (0,02 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Затем проводят индукцию метанолом, который добавляют дважды в количестве 3 об. % через 24 и 48 ч культивирования при 37°С на качалке (250 об/мин). Общее время культивирования 6 дней. В качестве контроля используют штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584, содержащий экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS.For the subsequent selection of transformants with the highest activity of β-mannanase, they are cultivated in test tubes in liquid YP medium with glucose (2 wt.%) and geneticin (0.02 wt.%) at 37°C for 24 h on a shaker (250 vol. /min). Then carry out the induction with methanol, which is added twice in the amount of 3 vol. % after 24 and 48 hours of cultivation at 37°C on a shaker (250 rpm). The total cultivation time is 6 days. The strain Ogataea haglerorum VKPM Y-2584 containing the pMOX-Km-HARS expression vector is used as a control.

Активность β-маннаназы в культуральной жидкости (КЖ) определяют методом ДНС с использованием динитросалициловой кислоты [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428], используя маннозу как стандарт. В качестве субстрата используют галактоманнан Locust bean gum (LBG, Sigma, США). Стандартная реакционная смесь состоит из 0,1 мл 1% раствора субстрата в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,0 и 0,1 мл рабочего раствора анализируемого образца. Рабочий раствор анализируемого образца готовят из КЖ путем разведения ее дистиллированной водой таким образом, чтобы значение оптической плотности при длине волны 540 нм (OD₅₄₀) находилось в пределах рабочей зоны градуировочного графика. Реакционную смесь инкубируют при 45°С в течение 10 мин, затем добавляют 0,3 мл раствора ДНС и инкубируют при 98°С в течение 5 мин. Оптическую плотность OD₅₄₀ измеряют в плашке на 96 лунок на спектрофотометре Multiskan spectrum (Thermo scientific).The activity of β-mannanase in the culture fluid (QOL) is determined by the method of DNS using dinitrosalicylic acid [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428], using mannose as a standard. Galactomannan Locust bean gum (LBG, Sigma, USA) was used as a substrate. The standard reaction mixture consists of 0.1 ml of a 1% substrate solution in 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, and 0.1 ml of the working solution of the analyzed sample. The working solution of the analyzed sample is prepared from QOL by diluting it with distilled water so that the value of optical density at a wavelength of 540 nm (OD ₅₄₀ ) is within the working area of the calibration curve. The reaction mixture is incubated at 45°C for 10 min, then 0.3 ml of the CSN solution is added and incubated at 98°C for 5 min. The absorbance of OD _{540 was} measured in a 96-well plate on a Multiskan spectrum spectrophotometer (Thermo scientific).

За единицу ферментативной активности маннаназы (1 ед.) принимают количество фермента, действующего на субстрат с высвобождением 1 μМ восстанавливающих Сахаров (маннозы) за одну минуту.A unit of enzymatic activity of mannanase (1 unit) is the amount of enzyme acting on the substrate with the release of 1 μM of reducing sugars (mannose) in one minute.

12 независимо отобранных трансформантов культивируют в пробирках и определяют активность β-маннаназы в бесклеточной культуральной жидкости (КЖ). Результаты определения приведены в табл.1. В КЖ контрольного образца - штамма ВКПМ Y-2584, содержащего экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS, активность β-маннаназы не тестируется.12 independently selected transformants are cultivated in test tubes and the activity of β-mannanase in cell-free culture fluid (CL) is determined. The results of the determination are shown in table.1. In the QOL of the control sample - strain VKPM Y-2584, containing the expression vector pMOX-Km-HARS, the activity of β-mannanase is not tested.

По результатам ферментации отбирают трансформант Т1 с наибольшей активностью β-маннаназы в КЖ.According to the results of fermentation, the T1 transformant with the highest activity of β-mannanase in QOL is selected.

Трансформант Т1 растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 37°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективных условий в пробирки со свежей средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %), культивируя каждый раз при тех же условиях, после чего рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и контрольной среде - YP с глюкозой (2 мас. %). Появление отдельных колоний, не растущих на селективной среде с антибиотиком, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках трансформанта Т1 в виде автономно-реплицирующейся ДНК.The T1 transformant is grown under non-selective conditions in a liquid YP medium with glucose (2 wt.%), in test tubes on a shaker at 37°C for 24 h, then five successive transfers of the culture are made from non-selective conditions into test tubes with fresh YP medium containing glucose (2 wt.%), cultivating each time under the same conditions, after which the culture is seeded to individual colonies on Petri dishes with agarized non-selective YP medium containing glucose (2 wt.%). Using a replicator, 100 independent colonies are selected and analyzed for their ability to grow on YP medium with glucose (2 wt.%) and geneticin (200 μg/ml) and control medium - YP with glucose (2 wt.%). The appearance of individual colonies that do not grow on a selective medium with an antibiotic indicates that the expression cassette is contained in the cells of the T1 transformant in the form of autonomously replicating DNA.

Далее проводят селекцию на стабилизацию (многокопийную интеграцию) экспрессионной кассеты. Трансформант Т1 инкубируют в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Переносят 1/10 объема культуры в свежую жидкую среду YP с глюкозой (2 мас. %) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Затем 1/50 объема культуры переносят в колбу с 50 мл селективной среды YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Затем рассевают культуру до отдельных колоний на чашки с селективной средой YP с глюкозой (2 мас. %) и разной концентрацией генетицина (200, 400 и 600 мкг/мл). Через 3-е суток инкубации при 37°С наблюдают появление гетерогенных по размеру колоний. Отбирают колонии крупного размера, клетки которых стабильно наследуют способность сохранять устойчивость к генетицину после продолжительного роста культуры в неселективных условиях. Отобранные колонии культивируют в пробирках в неселективных условиях с индукцией метанолом и определяют активность β-маннаназы и количество секретируемого белка (табл. 2).Next, selection is made for stabilization (multicopy integration) of the expression cassette. Transformant T1 is incubated in liquid YP medium with glucose (2 wt %) at 37°C for 24 h on a shaker (250 rpm). Transfer 1/10 of the culture volume to fresh YP liquid medium with glucose (2 wt %) and incubate at 37° C. for 24 h on a shaker (250 rpm). Then 1/50 of the culture volume is transferred into a flask with 50 ml of YP selective medium with glucose (2 wt.%) and geneticin (200 μg/ml) and incubated at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm.) . Then, the culture is seeded to individual colonies on plates with YP selective medium with glucose (2 wt.%) and different concentrations of geneticin (200, 400 and 600 μg/ml). After 3 days of incubation at 37°C, the appearance of colonies heterogeneous in size is observed. Large colonies are selected whose cells stably inherit the ability to maintain resistance to geneticin after prolonged culture growth under non-selective conditions. The selected colonies are cultured in test tubes under nonselective conditions with methanol induction and the activity of β-mannanase and the amount of secreted protein are determined (Table 2).

Как следует из результатов, представленных в табл.2, полученные трансформанты стабильно сохраняют устойчивость к генетицину после продолжительного роста культуры в неселективных условиях, и при этом обладают сравнимой или большей активностью β-маннаназы по сравнению с трансформантом Т1.As follows from the results presented in Table 2, the obtained transformants stably retain resistance to geneticin after prolonged culture growth under non-selective conditions, and at the same time have comparable or greater activity of β-mannanase compared to the T1 transformant.

Наилучшими показателями по активности β-маннаназы и количеству секретируемого в КЖ белка, обладает трансформант Ogataea haglerorum N107.Transformant Ogataea haglerorum N107 has the best indicators in terms of β-mannanase activity and the amount of protein secreted in CL.

Пример 2. Получение β-маннаназы при культивировании трансформанта Ogataea haglerorum N107 в колбахExample 2. Obtaining β-mannanase when cultivating the transformant Ogataea haglerorum N107 in flasks

Посевную культуру готовят в пробирках в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирки инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л с 50 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %) переносят 5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин.) в течение 6 дней. Метанол (3 об. %) добавляют к культуре через 24 и 48 часов культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.The inoculum is prepared in test tubes in 5 ml of YP medium with glucose (2 wt %). The tubes are incubated at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm). Into a 0.75 L flask with 50 ml of YP liquid medium with glucose (2 wt %), 5 ml of inoculum are transferred and the flask is incubated at 37° C. on a shaker (250 rpm) for 6 days. Methanol (3 vol.%) is added to the culture after 24 and 48 hours of cultivation. The biomass is separated by centrifugation for 15 minutes.

Культуральную жидкость без биомассы (КЖ) используют для определения активности β-маннаназы по методу ДНС и определения количества секретируемого белка по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США).Culture fluid without biomass (QOL) is used to determine the activity of β-mannanase by the CSN method and to determine the amount of secreted protein by the Bradford method using the Quick Start Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, USA).

Рекомбинантный трансформант продуцирует белок в количестве 1.0±0.2 мг/мл, активность неочищенного фермента β-маннаназы составляет 12000±500 ед./мл КЖ.The recombinant transformant produces protein in the amount of 1.0±0.2 mg/ml, the activity of the crude β-mannanase enzyme is 12000±500 U/ml QOL.

Пример 3. Характеристика рекомбинантной β-маннаназыExample 3 Characterization of recombinant β-mannanase

Для определения оптимального значения рН для функционирования фермента активность β-маннаназы по отношению к субстрату LBG (галактоманнан Locust bean gum, Sigma, США) измеряют в диапазоне значений рН 1.0-10.0 с использованием 0.1М растворов цитратного (рН 1.0-3.0), ацетатного (рН 4.0-5.0), фосфатного (рН 6.0-8.0) и боратного (рН 9.0-10.0) буферов. Реакцию проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Относительную активность рассчитывают как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех независимых реакциях в диапазоне значений рН 1.0-10.0. Для функционирования β-маннаназы, синтезированной дрожжами Ogataea haglerorum, содержащими ген MANS, оптимальными являются значения рН 5.0-6.0 (фиг.3).To determine the optimal pH value for the functioning of the enzyme, the activity of β-mannanase with respect to the LBG substrate (galactomannan Locust bean gum, Sigma, USA) was measured in the pH range of 1.0–10.0 using 0.1 M solutions of citrate (pH 1.0–3.0), acetate ( pH 4.0-5.0), phosphate (pH 6.0-8.0) and borate (pH 9.0-10.0) buffers. The reaction is carried out at a temperature of 45°C for 10 minutes. Relative activity is calculated as a percentage of the average maximum activity of the enzyme, measured in three independent reactions in the pH range of 1.0-10.0. For the functioning of β-mannanase synthesized by the yeast Ogataea haglerorum containing the MANS gene, pH values of 5.0-6.0 are optimal (figure 3).

Стабильность полученной β-маннаназы при разных рН определяют путем измерения остаточной активности (в %) после инкубации фермента в течение 24 ч при температуре 35°С в 0,1М буферных растворах с рН 1.0-10.0. Реакцию с субстратом LBG проводят при рН 5.0 и температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от активности образца фермента (хранится при +5°С в холодильнике), измеренной в 0,1 М ацетатном буфере (рН 5.0) и температуре 45°С (фиг. 3).The stability of the obtained β-mannanase at different pH is determined by measuring the residual activity (in %) after incubation of the enzyme for 24 hours at 35°C in 0.1M buffer solutions with pH 1.0-10.0. The reaction with the LBG substrate is carried out at pH 5.0 and 45°C for 10 min. Residual activity (enzyme stability) is calculated as a percentage of the activity of the enzyme sample (stored at +5°C in the refrigerator), measured in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) and at 45°C (Fig. 3).

Установлено, что фермент стабилен при значениях рН от 5.0 до 10.0 (сохраняет более 90% активности). В кислой области рН от 1.0 до 3.0 фермент сохраняет около 30% активности, при рН 4.0 - 75% активности.It was found that the enzyme is stable at pH values from 5.0 to 10.0 (retains more than 90% of activity). In the acidic range of pH from 1.0 to 3.0, the enzyme retains about 30% of activity, at pH 4.0 - 75% of activity.

Для определения температурного профиля активности фермента β-маннаназы проводят реакции образцов с субстратом LBG в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) в диапазоне температур от 25 до 80°С с шагом 5°С. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех реакциях в диапазоне значений температур от 25 до 80°С. Результаты приведены на фиг. 4.To determine the temperature profile of the activity of the β-mannanase enzyme, the samples are reacted with the LBG substrate in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) in the temperature range from 25 to 80°C with a step of 5°C. Relative activity is calculated as a percentage of the average maximum activity of the enzyme, measured in three reactions in the temperature range from 25 to 80°C. The results are shown in FIG. 4.

Установлено, что фермент проявляет максимальную активность при температуре 55°С. В интервале температур 35-45°С (температура тела животного) фермент сохраняет 45-65% активности. При температурах выше 65°С активность фермента значительно падает.It was found that the enzyme exhibits maximum activity at a temperature of 55°C. In the temperature range of 35-45°C (animal body temperature), the enzyme retains 45-65% of activity. At temperatures above 65°C, the activity of the enzyme drops significantly.

Перед определением термостабильности β-маннаназы образцы выдерживают в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) при температурах от 25°С до 60°С с шагом 5°С в течение 24 ч. Реакцию с субстратом проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от наибольшей активности фермента.Before determining the thermal stability of β-mannanase, the samples are kept in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) at temperatures from 25°С to 60°С in 5°С increments for 24 h. The reaction with the substrate is carried out at 45°С for 10 min . Residual activity (enzyme stability) is calculated as a percentage of the highest enzyme activity.

Фермент проявляет высокую стабильность (сохраняет более 90% активности) в диапазоне температур 25-40°С (фиг. 4), близкой к температуре желудочно-кишечного тракта животных.The enzyme exhibits high stability (retains more than 90% of activity) in the temperature range of 25-40°C (Fig. 4), close to the temperature of the gastrointestinal tract of animals.

Для определения молекулярного веса полученной β-маннаназы проводят электрофоретическое разделение белков из образца КЖ в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad (Bio-Rad США). Для визуализации белков используют Кумасси бриллиантовый синий R250.To determine the molecular weight of the resulting β-mannanase, electrophoretic separation of proteins from a QOL sample in 12% polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE) in a Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad vertical electrophoresis chamber (Bio-Rad USA) is carried out. For protein visualization, Coomassie Brilliant Blue R250 was used.

Установлено, что β-маннаназа, синтезированная трансформантом Ogataea haglerorum N107, имеет молекулярный вес 40 кДа (фиг. 5).The β-mannanase synthesized by the Ogataea haglerorum N107 transformant was found to have a molecular weight of 40 kDa (Fig. 5).

Таким образом, заявляемый трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, содержащий в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена MANS, проявляет стабильность и продуцирует рекомбинантную β-маннаназу, обладающую высокой удельной активностью, проявляющую максимальную активность при рН 5.0-6.0 и температуре 55°С, стабильную при значениях рН от 5.0 до 10.0 и в диапазоне температур ниже 40°С.Thus, the claimed transformant of the yeast Ogataea haglerorum, containing the optimized MANS gene sequence in the chromosome, is stable and produces recombinant β-mannanase, which has a high specific activity, exhibiting maximum activity at pH 5.0-6.0 and a temperature of 55°C, stable at pH values from 5.0 to 10.0 and in the temperature range below 40°C.

Пример 4. Получение β-маннаназы при культивировании трансформанта Osataea haslerorum N107 в ферментереExample 4. Obtaining β-mannanase when cultivating the Osataea haslerorum N107 transformant in a fermenter

Из суточной биомассы трансформанта Ogataea haglerorum N107 с чашки Петри со средой YP с глюкозой (2 мас. %) готовят суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде, определяют оптическую плотность клеточной суспензии (OD₆₀₀). В качалочные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 110 мл жидкой посевной среды YP с глюкозой (2 мас. %) вносят суспензию клеток до получения OD₆₀₀ равной 0.1. Колбы инкубируют при температуре 37°С на качалке при 220 об/мин. до достижения культурой оптической плотности равной 12.From the daily biomass of the transformant Ogataea haglerorum N107 from a Petri dish with YP medium with glucose (2 wt. %), a cell suspension is prepared in sterile distilled water, and the optical density of the cell suspension (OD ₆₀₀ ) is determined. In shaking flasks with a volume of 750 ml with a working volume of 110 ml of YP liquid inoculum medium with glucose (2 wt. %), a suspension of cells is introduced until an OD ₆₀₀ of 0.1 is obtained. The flasks are incubated at 37°C on a shaker at 220 rpm. until the culture reaches an optical density of 12.

Основную ферментацию проводят в ферментере КФ-103 (ООО-фирма «Проинтех») объемом 3 л на среде, состав которой указан в табл. 3.The main fermentation is carried out in the fermenter KF-103 (LLC-firm "Prointekh") with a volume of 3 l on the medium, the composition of which is indicated in table. 3.

Состав раствора микроэлементов РТМ1 указан в табл. 4.The composition of the solution of microelements RTM1 is indicated in Table. 4.

Исходный объем жидкости в ферментере составляет 1 л. Культивирование проводят при следующих параметрах: температура 37°С; начальное перемешивание 500 об/мин., аэрация 1.0 л/мин., рН 4.6 поддерживается титрованием 25% водным раствором аммиака. Значение рО₂ поддерживают на уровне 20.0% (от насыщения среды воздухом) с использованием каскадной регулировки скорости вращения мешалки.The initial volume of liquid in the fermenter is 1 liter. Cultivation is carried out under the following parameters: temperature 37°C; initial mixing 500 rpm, aeration 1.0 l/min, pH 4.6 maintained by titration with 25% aqueous ammonia solution. The pO ₂ value is maintained at 20.0% (from the saturation of the medium with air) using a cascade control of the stirrer rotation speed.

В рабочий ферментер вносят культуру, выращенную на качалке в колбах, до стартового значения оптической плотности равной 1.8. Наращивание биомассы осуществляют в два этапа. На первом этапе проводят рост биомассы на глюкозе, введенной в ферментер с начальной средой (16 часов). На втором этапе производят наращивание биомассы до значения сырого веса 18±1 (мас. %) путем подачи в ферментер глюкозной подпитки состава (мас. %): глюкоза - 28.6, раствор микроэлементов РТМ1 -1.1 (об./об.), биотин - 0.0004, вода - остальное.A culture grown on a shaker in flasks is introduced into the working fermenter to the starting value of the optical density equal to 1.8. Biomass growth is carried out in two stages. At the first stage, the growth of biomass is carried out on glucose introduced into the fermenter with the initial medium (16 hours). At the second stage, the biomass is increased to a fresh weight value of 18 ± 1 (wt. %) by feeding the following composition (wt. %) into the fermenter: glucose - 28.6, solution of trace elements RTM1 -1.1 (v/v), biotin - 0.0004, water - the rest.

Далее в ферментер со скоростью 1,2 г/ч на л подают раствор метанольной подпитки состава (мас. %): метанол - 95.9, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.4 об./об., биотин - 0.00054, вода - остальное. Индукцию метанолом продолжают в течение 134 ч.Next, a methanol feed solution of the composition (wt %) is fed into the fermenter at a rate of 1.2 g/h per liter: methanol - 95.9, a solution of trace elements РТМ1 - 1.4 v/v, biotin - 0.00054, water - the rest. The induction with methanol is continued for 134 hours.

Во время культивирования отбирают образцы КЖ для определения активности маннаназы при рН 5.0 и температуре 55°С по методу ДНС [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428]. Концентрацию белка в отобранных образцах КЖ определяют по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Результаты приведены в табл. 5During cultivation take samples of QOL to determine the activity of mannanase at pH 5.0 and a temperature of 55°C by the method of DNS [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428]. The protein concentration in the selected CL samples was determined by the Bradford method using the Quick Start Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, USA). The results are shown in table. 5

Таким образом, при культивировании в 3-х литровом ферментере трансформант Ogataea haglerorum N107 продуцирует 4.25 мг/мл белка, при этом активность β-маннаназы через 160 ч культивирования при 37°С составляет 51066 ед./мл КЖ.Thus, when cultivated in a 3-liter fermenter, the Ogataea haglerorum N107 transformant produces 4.25 mg/mL of protein, while the activity of β-mannanase after 160 h of cultivation at 37°C is 51066 units/mL QOL.

Отобранный трансформант Ogataea haglerorum N107 депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1) как Ogataea haglerorum N107 ВКПМ Y-4639.The selected transformant Ogataea haglerorum N107 was deposited at the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) of the National Research Center "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika (117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1) as Ogataea haglerorum N107 VKPM Y-4639.

Штамм характеризуется следующими признаками:The strain is characterized by the following features:

Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:Cultural and morphological characteristics of the proposed strain:

При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultivated at a temperature of 37°C for 48 hours on YP agar medium (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose - 2 (wt.%), the cells have an oval shape, 3-4 microns in diameter. Cells bud, while budding is true, multilateral. True mycelium does not form.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.Sporulation occurs when the culture is incubated on an agar medium of the following composition (wt.%): potassium chloride - 0.5, sodium acetate - 1.0, agar - 2.0, water - the rest at 25°C for 3-4 days. Asci have a tetrahedral shape, include 4 ascospores.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.On YP agar medium supplemented with glucose (2, wt %), light beige colonies with a smooth edge, matte surface, lenticular profile, and pasty consistency.

При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода -остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.During growth in a liquid YP medium (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) with the addition of glucose - 2 (wt.%), at 37°C for 24 hours of cultivation - cloudy liquid, white precipitate , coagulation is not observed, it does not form parietal films.

Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:Physiological and biochemical characteristics of the proposed strain:

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.The strain is capable of growth under both aerobic and anaerobic conditions.

В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.The strain is capable of using glucose, glycerol, methanol, ethanol, L-rhamnose, sucrose, and maltose as the only source of carbon; unable to assimilate D-gluconate, L-arabinose, succinate, lactose, starch.

Штамм способен синтезировать β-маннаназу при культивировании в жидкой среде YP в присутствии глюкозы, биосинтез фермента усиливается при культивировании в присутствии метанола.The strain is capable of synthesizing β-mannanase when cultivated in liquid YP medium in the presence of glucose; the biosynthesis of the enzyme is enhanced by cultivation in the presence of methanol.

--->--->

Перечень последовательностейSequence listing

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный<110> Federal State Budgetary Institution "State

научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленныхResearch Institute of Genetics and Selection of Industrial

микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовскийmicroorganisms of the National Research Center "Kurchatov

институт" (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика).Institute" (NRC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika).

State Research Institute for Genetics and Selection of IndustrialState Research Institute for Genetics and Selection of Industrial

Microorganisms of National Research Center «Kurchatov Institute»Microorganisms of National Research Center "Kurchatov Institute"

(NRC «Kurchatov Institute» – GOSNIIGENETIKA).(NRC "Kurchatov Institute" - GOSNIIGENETIKA).

<120> Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий<120> Ogataea haglerorum yeast transformant producing

бета-маннаназу, содержащий в составе хромосомы синтетический ген MANS beta- mannanase containing the synthetic MANS gene in the chromosome

<130> 20-02<130> 20-02

<160> 1<160> 1

<210> 1 <210> 1

<211> 1032 <211> 1032

<212> DNA <212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220> <220>

<223> синтетический ген MANS, кодирующий бета-маннаназу ManS из Bacillus <223> synthetic genemans,encodingbeta-mannanase Mans ofbacillus

subtilissubtilis

<400> 1<400> 1

agatctagat ctgaagctca cactgtttcc ccagtgaacc caaacgctca acaaactact 60 agatctagat ctgaagctca cactgtttcc ccagtgaacc caaacgctca acaaactact 60

aagactgtta tgaactggtt ggctcacttg ccaaacagaa ctgaaaacag agttttgtcc 120 aagactgtta tgaactggtt ggctcacttg ccaaacagaa ctgaaaacag agttttgtcc 120

ggtgctttcg gtggttactc tcacgacact ttctccatgg ctgaggctga cagaatcaga 180 ggtgctttcg gtggttactc tcacgacact ttctccatgg ctgaggctga cagaatcaga 180

tctgctactg gtcaatcccc agctatctac ggttgtgact acgctagagg ttggttggag 240 tctgctactg gtcaatcccc agctatctac ggttgtgact acgctagagg ttggttggag 240

actgctaaca tcgaggacac tatcgacgtt tcttgtaacg gagacttgat gtcctactgg 300 actgctaaca tcgaggacac tatcgacgtt tcttgtaacg gagacttgat gtcctactgg 300

aaaaacggtg gtatcccaca aatctctttg cacttggcta acccagcttt ccaatccggt 360 aaaaacggtg gtatcccaca aatctctttg cacttggcta acccagcttt ccaatccggt 360

cacttcaaga ctccaatcac taacgaccaa tacaagaaaa tcttggactc ttccactgct 420 cacttcaaga ctccaatcac taacgaccaa tacaagaaaa tcttggactc ttccactgct 420

gagggtaaga gattgaacgc tatgttgtcc aagatcgctg acggtttgca agagttggag 480 gagggtaaga gattgaacgc tatgttgtcc aagatcgctg acggtttgca agagttggag 480

aaccaaggtg ttccagtttt gttcagacca ttgcacgaga tgaacggtga gtggttctgg 540 aaccaaggtg ttccagtttt gttcagacca ttgcacgaga tgaacggtga gtggttctgg 540

tggggtttga cttcttacaa ccaaaaggac aacgagagaa tctccttgta caagcaattg 600 tggggtttga cttcttacaa ccaaaaggac aacgagagaa tctccttgta caagcaattg 600

tacaagaaaa tctaccatta catgactgac actagaggtt tggaccactt gatctgggtt 660 tacaagaaaa tctaccatta catgactgac actagaggtt tggaccactt gatctgggtt 660

tactctccag acgctaacag agacttcaag actgacttct acccaggtgc ttcctacgtt 720 tactctccag acgctaacag agacttcaag actgacttct acccaggtgc ttcctacgtt 720

gacatcgttg gtttggacgc ttacttccaa gacgcttact ccatcaacgg ttacgaccaa 780 gacatcgttg gtttggacgc ttacttccaa gacgcttact ccatcaacgg ttacgaccaa 780

ttgactgctt tgaacaaacc attcgctttc acagaggttg gtccacaaac tgctaacggt 840 ttgactgctt tgaacaaacc attcgctttc acagaggttg gtccacaaac tgctaacggt 840

tctttcgact actccttgtt catcaacgct atcaagcaaa gatacccaaa gactatctac 900 tctttcgact actccttgtt catcaacgct atcaagcaaa gatacccaaa gactatctac 900

ttcttggctt ggaacgacga gtggtctcca gctgttaaca agggtgcttc tgctttgtac 960 ttcttggctt ggaacgacga gtggtctcca gctgttaaca agggtgcttc tgctttgtac 960

cacgactcct ggactttgaa caagggtgag atttggaacg gtgactcctt gactccaatc 1020 cacgactcct ggactttgaa caagggtgag atttggaacg gtgactcctt gactccaatc 1020

gttgagtagt aa 1032 gttgagtagt aa 1032

<---<---

Claims

Yeast transformant Ogataea haglerorum producing β-mannanase EC 3.2.1.78 from Bacillus subtilis, containing in the chromosome an optimized synthetic gene encoding the indicated β-mannanase, the nucleotide sequence of which is shown in the sequence listing under the number SEQ ID NO: 1.