RU2765043C1 - Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием - Google Patents
Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2765043C1 RU2765043C1 RU2020139546A RU2020139546A RU2765043C1 RU 2765043 C1 RU2765043 C1 RU 2765043C1 RU 2020139546 A RU2020139546 A RU 2020139546A RU 2020139546 A RU2020139546 A RU 2020139546A RU 2765043 C1 RU2765043 C1 RU 2765043C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasminogen
- solution
- component
- modified
- recombinant
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики. 1 объект представляет собой набор для получения фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, состоящий из двух компонентов, в котором первый компонент содержит лиофилизированные из раствора с рН 4,5-5,5 модифицированный рекомбинантный плазминоген, представляющий собой полипептид, содержащий каталитический домен плазминогена, 5-й крингл-домен плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена, и рекомбинантную проурокиназу, представляющую собой модифицированную рекомбинантную проурокиназу мАПУТ22, в качестве активатора, причем первый компонент характеризуется следующим соотношением ингредиентов, мас.%: модифицированный рекомбинантный плазминоген 11,6-18,7, модифицированная рекомбинантная проурокиназа 0,06-0,07, ацетат натрия 18,6-20,3, натрий хлористый до 100; второй компонент представляет собой буферный раствор с рН 7,5-8,5. 2 объект - способ получения фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, согласно которому компоненты набора смешивают перед применением для образования активного действующего вещества плазмина. Технический результат заключается в повышении эффективности использования за счет получения раствора плазмина непосредственно перед его введением в организм человека. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается новой фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, которая может быть использована в медицине для лечения тромбозов различной этиологии, приводящих, в частности, к инфаркту миокарда, инсульту, тромбоэмболии, внутриглазным кровоизлияниям и т.п.
Тромбозы и их лечение - очень острая проблема в медицине. Тромбоз - образование внутрисосудистых сгустков крови, препятствующих нормальному кровотоку. Тромбоз в системе коронарного кровообращения ведет к инфаркту миокарда, тромбоз сосудов мозга - к инсульту. При отрыве тромба может произойти эмболия - внезапная закупорка сосудистого русла оторвавшимся кусочком тромба.
Известны рекомбинантные активаторы плазминогена, которые непосредственно активизируют превращение плазминогена в плазмин, такие как «Актилиза», «Тенектеплаза» (Германия, Берингер) на основе рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (tPA) или «Пуролаза» (Россия, ФГБУ «РКНПК Минздрава РФ») на основе рекомбинантного урокиназного активатора плазминогена (uPA). Однако их применяют в основном на догоспитальном этапе, а их воздействие эффективно только при условии быстрого (до 3-6 часов) применения после возникновения окклюзии.
При других тромбозах больные обращаются к врачу, как правило, когда применение активаторов плазминогена уже малоэффективно.
Для восстановления кровотока необходимо растворить фибриновые нити, из которых состоит тромб. Растворение тромба, происходит оно физиологически или фармакологически, обусловлено активной короткоживущей сериновой протеазой плазмином. В нормальных физиологических условиях плазминоген, синтезируемый в печени, циркулирует в кровотоке и лимфотоке в концентрации около 1-2 мкМ. Плазмин получается из плазминогена, циркулирующего в плазме гликопротеина, с помощью активаторов: tPA, uPA.
Плазмин проявляет прямую фибринолитическую активность, не требуя плазминогена или плазминоген-активатора. По сравнению с плазминоген-активаторами эта независимость от эндогенного плазминогена позволяет плазмину эффективно растворять протяженные образования.
Активный плазмин рассматривали как тромболитический агент еще полстолетия назад. Впервые опробованный более 40 лет назад, плазмин оказался неэффективным при внутривенном введении, так как нейтрализовался антиплазмином плазмы. С развитием методов малоинвазивной хирургии возобновился интерес к применению плазмина в качестве тромболитика. Непосредственная доставка плазмина к тромбу через катетер предотвращает нейтрализацию плазмина и он проявляет свою тромболитическую активность.
Известны штаммы-продуценты рекомбинантного плазминогена человека, а также различные мутантные формы этого белка и исследования их эффективности (Comparison of local thrombolytic efficacy of plasmin and rt-PA in an in-vitro flow system; a pilot study. Bizjak N, Bajd F, Vidmar J, Blinc A, Marder VJ, Novokhatny V, Sersa I. Blood Coagul Fibrinolysis. 2013 Oct;24(7):711-4. doi: 10.1097/MBC.0bO13e328361bd48.).
Исследование препарата на кроликах показало, что плазмин в отличие от тканевого активатора плазминогена не вызывает геморрагий, (Novokhatny V.V. et al., Locally delivered plasmin: why should it be superior to plasminogen activators for direct thrombolysis, Trends Pharmacol. Sci., 2004, 25(2), p. 72-75; Shlansky-Goldberg R.D. et al., A first-in-human phase I trial of locally delivered human plasmin forhemodialysis graft occlusion, Thrombosis and Haemostasis, 2008, 6(6), p. 944-950). Таким образом, плазмин более пригоден и более безопасен, чем активаторы плазминогена при растворении протяженных кровяных тромбов у человека. Его единственным ожидаемым недостатком является очень короткое время жизни в кровотоке.
Рекомбинантный делеционный вариант плазмина, лишенный всех крингл-доменов, (окриплазмин), нашел применение в офтальмологии для лечения витреомакулярного тракционного синдрома (Ophthalmol Retina. 2019 Jan;3(l):32-41.0criplasmin Treatment Leads to Symptomatic Vitreomacular Adhesion/Vitreomacular Traction Resolution in the Real-World Setting: The Phase IV ORBIT Study). Препарат получил название Jetrea, он представляет собой инъекционный раствор, должен храниться при -20 градусах в замороженном виде и размораживаться непосредственно перед применением, что неудобно и при перевозке и при хранении.
Поскольку плазмин является активным ферментом, нестабилен и разлагается на всех стадиях выделения, хранения и применения, производить и хранить его значительно удобнее в виде плазминогена или его модификаций, активируя непосредственно перед применением или в процессе применения. Плазминоген весьма стабилен в виде раствора при рН 4,5-5,5, хорошо хранится и не активируется в присутствии урокиназы (или проурокиназы). При нейтральном значении рН плазминоген быстро переходит в активную форму - плазмин.
Недостатки всех известных препаратов можно охарактеризовать тем, что при рН ниже 5 плазминоген стабилен, но не активен. Чтобы его активировать, нужно изменить рН до 7, но при этом продукт неустойчив в хранении. Поэтому уже активированный аналогичный препарат приходится хранить при -20 (что очень неудобно в перевозке).
Задачей настоящего изобретения является создание эффективной двухкомпонентной фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, позволяющей получать раствор плазмина с физиологичными значениями рН непосредственно перед его введением в организм человека, удобной в хранении и использовании.
Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности использования.
Это достигается тем, что заявляемая двухкомпонентная фармацевтическая композиция согласно изобретению, состоит (мас.%) из модифицированного рекомбинантного плазминогена 11,6-18,7 и рекомбинантной проурокиназы 0,058-0,07 лиофилизированных из раствора с рН 4,5-5,5, смешиваемых перед применением с буферным раствором с рН 7,5-8,5 при соотношении плазминогена к активатору 200/1 до 300/1, при этом качестве модифицированного рекомбинантного плазминогена используют полипептид, содержащий каталитический домен плазминогена, 5-ый крингл-домен плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена, а в качестве рекомбинантной проурокиназы используют модифицированную рекомбинантную проурокиназу мАПУТ22.
Предлагаемая фармацевтическая композиция состоит из двух компонентов. Компонент А содержит модифицированный рекомбинантный плазминоген и рекомбинантную проурокиназу, которые лиофилизированы из раствора с рН 4,5-5,5. Компонент Б представляет собой буферный раствор с рН 7,5-8,5. Оба компонента смешивают перед применением с целью образования активного действующего плазмина.
В качестве модифицированного рекомбинантного плазминогена могут быть использованы, например, полипептиды, содержащие каталитический домен плазминогена, 5-ый крингл-домен плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена (патент РФ №2432397), рекомбинантные полипептиды со свойствами плазминогена человека, содержащие каталитический домен плазминогена, 5-ый и 4-й крингл-домены плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 4-му крингл-домену плазминогена (патент РФ №2432396), микроплазминоген (US patent for BLA №125422), а также полноразмерный рекомбинантный плазминоген. Наиболее предпочтительным вариантом взгляд являются полинептиды, содержащие каталитический домен плазминогена, 5-ый крингл-домсн плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена (патент РФ №2432397).
В качестве рекомбинантной проурокиназы могут быть использованы различные ее модификации, наиболее предпочтительной из которых является модифицированная рекомбинантная проурокиназа типа мАПУТ22 (Патент РФ №2216348).
В качестве буфера при получении компонента А могут быть использованы растворы Натрия ацетата с рН 4,5-5,5.
В качестве компонента Б могут быть использованы буферные растворы фосфатные или цитратно-фосфатные с рН 7,5-8,5.
Наиболее предпочтительным вариантом предлагаемой двухкомпонентной композиции является композиция, в которой компонент А содержит составляющие в следующем соотношении, мас.%:
| Полипептид, содержащий каталитический домен | 11,6-18,7 |
| плазминогена, 5-ый крингл-домен плазминогена | |
| и видоизмененный фрагмент аминокислотной | |
| последовательности, предшествующий 5-му | |
| крингл-домену плазминогена | |
| Модифицированная рекомбинантная | 0,06-0,07 |
| проурокиназа мАПУТ22 | |
| Ацетат натрия, обеспечивающий рН 4,5-5,5 | 18,6-20,3 |
| Натрий хлористый | Остальное |
Примеры создания двухкомпонентной фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием.
Пример 1
1.1 Получение компонента А.
1.1.1. Получение раствора с рН 4,5.
Очищенный с помощью хроматографических стадий модифицированный рекомбинантный плазминоген - полипептид, который содержит каталитический домен плазминогена, 5-й крингл-домен плазминогена и фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (Патент РФ №2432397), далее миниплазминоген 1, в виде раствора (50 мл) с концентрацией 2 мг/мл наносят на колонку с Сефакрилом S-200 (200 мл, GE), заполненную буферным раствором с рН 4,5±0,2 (натрия ацетат 10 мМ, натрия хлорид 100 мМ) и собирают фракции по 5 мл. Фракции с наибольшей концентрацией белка объединяют, измеряют концентрацию белка и рН раствора.
К полученному раствору с рН 4,5 добавляют раствор рекомбинантой проурокиназы мАПУТ22 в физрастворе (Патент РФ №2216348). При этом молярное соотношение модифицированного рекомбинантного плазминогена (миниплазминогена 1) и рекомбинантной проурокиназы мАПУТ22 составляет 200:1. В таком виде компонент А устойчив в течение длительного времени при комнатной температуре, что позволяет провести подготовку к лиофилизации, розлив раствора во флаконы по 20 мг и провести лиофилыюе высушивание раствора.
Таким образом, лиофилыю высушенный компонент А имеет следующий состав, мас.%:
| Миниплазминоген 1 | 14,6 |
| Модифицированная рекомбинантная | 0,07 |
| проурокиназа мАПУТ22 | |
| Натрий ацетат | 19,8 |
| Натрий хлористый | 65,53 |
1.2. Анализ стабильности и отсутствия активации компонента А.
Раствор, полученный по п.1.1.1. стабилен при комнатной температуре (20-25°С), не активируется проурокиназой и не проявляет амидолитической активности.
1.2.1. Амидолитический тест.
К 50 мкл компонента А добавляют равный объем буферного раствора (натрия ацетат 10 мМ, натрия хлорид 100 мМ рН 4,5) и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов, отбирая пробы через 30 минут.Далее 5 мкл из каждой инкубационной смеси добавляют к 195 мкл раствора ингибитора активатора плазминогена (РАН, Sigma-Aldrich), конечная концентрация которого равна 0,11 мкМ, в 0.1% растворе БСА в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7.5). РАН нужен для предотвращения активации проурокиназы во время амидолитической реакции. Затем добавляют 40 мкл раствора хромогенного субстрата S2251 (D-норвалил-циклогекснлаланил-лизил-паранитроанилид, конечная концентрация 1,66 мМ) и через 2, 4, 6, 8 и 10 минут отбирают 40 мкл в пробирку, содержащую 200 мкл 5% уксусной кислоты. В пробах измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нМ и определяют скорость амидолитической реакции, которая характеризует активность плазмина.
На Фиг. 1 представлена зависимость амидолитической активности компонента А при рН 4,5 от времени инкубации при комнатной температуре. Амидолитическая активность компонента А пренебрежимо мала и не меняется при инкубации при комнатной температуре в течение 3 часов (время по оси абсцисс). По оси ординат -скорость реакции с хромогенным субстратом, специфичным к плазмину.
Таким образом, при комнатной температуре и рН 4,5±0,2 не происходит активации плазминогена по крайней мере в течение 3 часов.
1.2.2. Электрофоретический тест в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях.
Пробы, отобранные после инкубации при комнатной температуре по п. 1.2.1. подвергают электрофорезу. Для неактивированного плазминогена после окрашивания электрофореграммы в геле Кумасси голубым R-250 может присутствовать одна полоса, соответствующая миниплазминогену 1 (38,9 кДа). Количество активатора слишком мало, чтобы быть визуализированным.
В случае активации должна визуализироваться полоса с молекулярной массой 27,4 кДа соответствующая плазмину (активированной форме плазминогена).
Для проведения электрофореза используют прибор Mini-Protean II фирмы Bio-Rad (США) или аналогичный. Разделение белка проводят в геле, состоящем из двух частей (разделяющий гель и формирующий гель), в восстанавливающих условиях. Раствор для разделяющего геля (готовят непосредственно перед употреблением)
- 15% раствор акриламид: N,N'-метиленбисакриламид (37,5:1)
- 0,375 M Трис-HCl, рН 8,8
- 0,1% раствор натрия додецилсульфата
- 0,05% раствора аммония персульфата
- 0,05% N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД)
Раствор для формирующего геля (готовят непосредственно перед употреблением)
- 4% раствор акриламид: N,N'-метиленбисакриламид (37,5:1)
- 0,125 M Трис-HCl рН 6,8
- 0,1% раствор натрия додецилсульфата
- 0,075% раствора аммония персульфата
- 0,15% N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) Подготовка проб для электрофореза:
В отдельную коническую пробирку отбирают из полученного раствора 6 мкл и добавляют 5 мкл раствора для нанесения образцов на гель. Тщательно перемешивают и прогревают в течение 10 мин в сухом контактном термостате при 95±5°С (можно использовать кипящую водяную баню). Получают раствор, готовый для нанесения на гель.
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма в денатурирующем полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях образцов компонента А после инкубации при рН 4,5 при комнатной температуре в течение 60 мин (2), 120 мин (3) и 180 мин (4). Контроль - (1) - миниплазминоген 1 без добавления активатора (рекомбинантой проурокиназы мАПУТ22). У всех образцов наблюдается наличие полосы, соответствующей массе неактивированного миниплазминогена 1 (38,9 кДа). В то же время не наблюдается появления ниже расположенной полосы, соответствующей активированному плазминогену (плазмину с масой 27,4 кДа).
Таким образом, данные электрофореза подтверждают, что в процессе инкубации компонента А при комнатной температуре в течение по крайней мере 3 часов не проходит активация миниплазминогена 1 до плазмина.
1.3. Анализ активности двухкомпонентной композиции после смешения компонентов А и Б.
Приготовление раствора Б: 50 мл 0,2 M калия дигидрофосфата смешивают с 46.8 мл 0,2 M раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора до 200 мл. рН полученного раствора 8,0.
Лиофильно высушенный компонент А по п. 1.1.2 смешивают с 10 мл компонента Б. Полученную композицию инкубируют при комнатной температуре в течение 180 минут, отбирая пробы для определения активности через 2,5, 5,10, 15, 30, 45, 60, 80, 120, 150 и 180 мин инкубации. Реакцию с хромогенным субстратом проводят как в п. 1.2.1.
Скорость амидолитической реакции соответствует активности активированного плазмина. Активация происходит за 10 минут при комнатной температуре.
Таким образом, через 10 минут после смешения препарат готов к использованию в качестве прямого фибринолитика. Пример иллюстрируют Фиг. 3 и Фиг. 4.
На Фиг. 3 представлена зависимость амидолитической активности плазмина после смешения компонентов А и Б (т.е. двухкомпонентной композиции) при комнатной температуре от времени инкубации.
На Фиг. 4 представлена электрофореграмма в денатурирующем полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях активированного миниплазминогена 1 (плазмина) после смешения компонентов А и Б через 0 мин (1), 15 мин (2). 30 мин (3) и 60 мин (4). Контролем служит дорожка 1, представляющая неактивированный миниплазминоген 1.
Электрофореграмма иллюстрирует, что уже через 15 минут после смешения компонентов происходит полное расщепление молекулы рекомбинантного миниплазминогена (38,9 Да) с образованием активного плазмина (25 кДа).
Пример 2.
2.1 Получение компонента А.
2.1.1. Получение раствора с рН 5,4.
Очищенный с помощью хроматографических стадий модифицированный рекомбинантный плазминоген - полипептид, который содержит каталитический домен плазминогена, 5-ый и 4-й крингл-домены плазминогена, видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 4-му крингл-домену плазминогена с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:3 (Патент РФ №2432396), далее - мидиплазминоген 3, в виде раствора (50 мл) с концентрацией 2 мг/мл наносят на колонку с Сефакрилом S-200 (200 мл, GE), заполненную буферным раствором с рН 5,4±0,2 (натрия ацетат 10 мМ, натрия хлорид 100 мМ) и собирают фракции по 5 мл. Фракции с наибольшей концентрацией белка объединяют, измеряют концентрацию белка и рН рас твора.
К полученному раствору с рН 5,4 добавляют рекомбинантную проурокиназу мАПУТ22 растворенную в физрастворе (Патент РФ №2216348). При этом молярное соотношение модифицированного рекомбинантного мидиплазминогена 3 и рекомбинантной проурокиназы мАПУТ22 составляет 300: 1. Затем проводят лиофилизацию, розлив раствора во флаконы по 20 мг и его лиофильное высушивание.
Таким образом, лиофильно высушенная композиция - компонент А - имеет следующий состав, мас.%:
| Мидиплазминоген 3 | 18,7 |
| Модифицированная рекомбинантная | 0,04 |
| проурокиназа мАПУТ22 | |
| Натрий ацетат | 18,6 |
| Натрий хлористый | 62,66 |
Анализ стабильности и отсутствия активации компонента А (амидолитический и электрофоретический тест в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях) проводят аналогично примеру 1 и получают аналогичные результаты.
2.2. Приготовление компонента Б:
К 4,3 мл 0,1 M раствора лимонной кислоты (21 г/л) добавляют 95,7 мл 0,2 M раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного. Полученный раствор с рН 7,8 доводят дистиллированной водой до 200 мл.
2.3. Компоненты А и Б смешивают и проводят анализ активности полученной композиции как описано в примере 1.
Скорость амидолитической реакции соответствует активности активированного плазмина. Активация происходит за 15 минут при комнатной температуре.
Пример 3
Была исследована эффективность заявляемой фармацевтической композиции при растворении венозных тромбов у крыс и кроликов при местном введении.
В качестве фибринолитика использовали композицию по примеру 1, инкубируя ее до введения животным на столе при комнатной температуре в течение 15 мин.
Исследования выполнены на 12 крысах Вистар - самцах (средний вес 465 г) и на 18 кроликах-самцах (средний вес 3150 г). Животных наркотизировали введением 5% раствора кетам и на. Образование венозных тромбов стимулировали введением внутривенно раствора тромбина в количестве 1 ед (50 мкл) в изолированный участок вены. Через 10 минут снималась верхняя (по течению) лигатура, и далее в течение 30 минут происходило созревание тромба. Общее время окклюзии составляло 40 мин. Образовывался плотный хорошо оформленный тромб, перекрывающий кровоток в сосуде. После образования тромба и снятия лигатуры вводили композицию по примеру 1.
Крысам в венозный тромб вводили 70-100 мкл (до 0,5 мг на кг веса). У крыс средний вес тромба в контроле составил 9,4±4 мг. Средний вес тромба после введения композиции - 3,5±1,6 мг, тромбы становились рыхлыми и остатки их отставали от стенок сосуда. На Фиг. 5 показан тромболитический эффект композиции А+Б для случая венозного тромба у крыс.
У кроликов при местном введении (в ту же вену вблизи тромба выше по кровотоку) композиции по п 1.3.2 инкубированной на столе в течение 15 мин в количестве 0,7 - 1 мл вес тромба уменьшался со 130±20 мг (контроль) до 28±8,9 мг, тромб был рыхлым и кровоток восстанавливался в 80% случаев. На Фиг. 6 показано изменение веса венозного тромба у кролика при местном введении композиции.
Claims (5)
1. Набор для получения фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, состоящий из двух компонентов, в котором
первый компонент содержит лиофилизированные из раствора с рН 4,5-5,5 модифицированный рекомбинантный плазминоген, представляющий собой полипептид, содержащий каталитический домен плазминогена, 5-й крингл-домен плазминогена и видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 5-му крингл-домену плазминогена, и рекомбинантную проурокиназу, представляющую собой модифицированную рекомбинантную проурокиназу мАПУТ22, в качестве активатора, причем первый компонент характеризуется следующим соотношением ингредиентов, мас.%:
второй компонент представляет собой буферный раствор с рН 7,5-8,5.
2. Способ получения фармацевтической композиции, обладающей фибринолитическим действием, согласно которому первый и второй компоненты набора по п. 1 смешивают перед применением для образования активного действующего вещества плазмина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139546A RU2765043C1 (ru) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139546A RU2765043C1 (ru) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2765043C1 true RU2765043C1 (ru) | 2022-01-25 |
Family
ID=80445318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020139546A RU2765043C1 (ru) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2765043C1 (ru) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2140453C1 (ru) * | 1999-04-06 | 1999-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Техноген" | Рекомбинантная плазмидная днк p ua bc22, кодирующая модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, нетранслируемый днк-элемент - искусственная межгенная последовательность мгп14 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа |
| RU2216348C1 (ru) * | 2002-11-14 | 2003-11-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическим и фибринолитическим действием |
| RU2247777C2 (ru) * | 2001-07-27 | 2005-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, последовательность днк, рекомбинантная плазмида, штамм-продуцент, способ получения модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа и фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическим действием |
| RU2323001C1 (ru) * | 2007-05-30 | 2008-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием |
| RU2432397C2 (ru) * | 2009-11-24 | 2011-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА ПРЕВРАЩАТЬСЯ ПРИ АКТИВАЦИИ В ПЛАЗМИН, КОТОРЫЙ КАТАЛИЗИРУЕТ РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА И ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА |
| RU2432396C2 (ru) * | 2009-11-24 | 2011-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА ПРЕВРАЩАТЬСЯ ПРИ АКТИВАЦИИ В ПЛАЗМИН, КОТОРЫЙ КАТАЛИЗИРУЕТ РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА И ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА |
-
2020
- 2020-12-02 RU RU2020139546A patent/RU2765043C1/ru active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2140453C1 (ru) * | 1999-04-06 | 1999-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Техноген" | Рекомбинантная плазмидная днк p ua bc22, кодирующая модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, нетранслируемый днк-элемент - искусственная межгенная последовательность мгп14 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа |
| RU2247777C2 (ru) * | 2001-07-27 | 2005-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, последовательность днк, рекомбинантная плазмида, штамм-продуцент, способ получения модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа и фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическим действием |
| RU2216348C1 (ru) * | 2002-11-14 | 2003-11-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическим и фибринолитическим действием |
| RU2323001C1 (ru) * | 2007-05-30 | 2008-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Техноген" | Фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием |
| RU2432397C2 (ru) * | 2009-11-24 | 2011-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА ПРЕВРАЩАТЬСЯ ПРИ АКТИВАЦИИ В ПЛАЗМИН, КОТОРЫЙ КАТАЛИЗИРУЕТ РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА И ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА |
| RU2432396C2 (ru) * | 2009-11-24 | 2011-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА ПРЕВРАЩАТЬСЯ ПРИ АКТИВАЦИИ В ПЛАЗМИН, КОТОРЫЙ КАТАЛИЗИРУЕТ РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА И ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КРЫЛОВ В.В. и др. Метод локального фибринолиза в хирургии нетравматических внутричерепных кровоизлияний // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2013. - Т. 68. - N. 7. - С. 24-31. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marder et al. | Plasmin induces local thrombolysis without causing hemorrhage: a comparison with tissue plasminogen activator in the rabbit | |
| AU784598B2 (en) | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin | |
| US6395270B1 (en) | Activated protein C formulations | |
| US6630137B1 (en) | Activated protein C formulations | |
| US4968617A (en) | Solid hydrochloride salt of t-PA | |
| US6964764B2 (en) | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin | |
| US5112609A (en) | Acidic formulations of t-PA | |
| JP2506521B2 (ja) | Ｌｙｓ−プラスミノ―ゲンを含有する医薬 | |
| JPH08510746A (ja) | 改良型▲ｖｉｉ▼因子 | |
| US6969515B2 (en) | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin | |
| CA1337046C (en) | Thrombolytic agent | |
| RU2765043C1 (ru) | Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием | |
| US5342616A (en) | Method of administering tissue plasminogen activator | |
| JPS6338327B2 (ru) | ||
| WO2005074979A1 (fr) | Utilisation de la prourokinase pour le traitement du syndrome pulmonaire thrombo-embolique ou de l'occlusion de l'artere centrale de la retine | |
| CA1338551C (en) | Medicament for thrombotic disorder containing t-pa | |
| JP2904893B2 (ja) | 医薬製剤 | |
| US7271143B1 (en) | Peptides for regulation of urokinase (uPA) and tissue type (tPA) plasminogen activator and method of optimizing therapeutic efficacy | |
| Waller et al. | Reteplase, a recombinant plasminogen activator | |
| Kline | Pharmacologic review of thrombolytic agents | |
| Cade | Thrombolytic therapy | |
| JP2002173447A (ja) | 脳塞栓症治療用医薬組成物 | |
| EP1561469A1 (en) | Activated Protein C Formulations | |
| JPH049334A (ja) | 線溶活性増強剤 | |
| JPH09176041A (ja) | α２プラスミンインヒビターを含有するＤＩＣ治療用薬剤 |