RU2756202C1 - Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS - Google Patents

Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS Download PDF

Info

Publication number
RU2756202C1
RU2756202C1 RU2020140474A RU2020140474A RU2756202C1 RU 2756202 C1 RU2756202 C1 RU 2756202C1 RU 2020140474 A RU2020140474 A RU 2020140474A RU 2020140474 A RU2020140474 A RU 2020140474A RU 2756202 C1 RU2756202 C1 RU 2756202C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
tularemia
maldi
tof
magnosorbent
distilled water
Prior art date
Application number
RU2020140474A
Other languages
English (en)
Inventor
Анна Самвеловна Геогджаян
Татьяна Владимировна Жарникова
Светлана Александровна Курчева
Ирина Викторовна Жарникова
Елена Анатольевна Котенева
Ольга Александровна Гнусарева
Егор Сергеевич Котенев
Александр Васильевич Калинин
Александра Геннадьевна Кошкидько
Диана Владимировна Русанова
Original Assignee
Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2020140474A priority Critical patent/RU2756202C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2756202C1 publication Critical patent/RU2756202C1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS. Заявленный способ отличается тем, что включает в себя стадию активирования магносорбента, заключающуюся в том, что к магносорбенту приливают дистиллированную воду, содержащую перхлорат натрия, инкубируют, отмывают дистиллированной водой, стадию получения магнитного иммуносорбента, заключающуюся в том, что к 10% взвеси активированного магносорбента приливают туляремийные иммуноглобулины с концентрацией белка 2,5 мг/мл, отмывают от несвязавшегося лиганда и стадию проведения селективного концентрирования возбудителя туляремии, заключающуюся в том, что в микропробирку с разработанными магноиммуносорбентами вносят взвеси туляремийного микроба, инкубируют 20 мин, промывают дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и элюируют KOH, переносят надосадочную жидкость в чистую микропробирку и осуществляют постановку метода MALDI-TOF MS. Изобретение расширяет арсенал способов получения иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды. 3 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и в частности, к способу получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования патогенов с последующей детекцией методом масс-спектрометрии (МС).
В связи с тем, что концентрация патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды может быть очень низкой, а исследуемые образцы контаминированы посторонней микрофлорой, процедура выявления возбудителя в пробах из объектов окружающей среды должна включать стадию селективного концентрирования. Это довольно длительный процесс, требующий материальных и трудовых затрат.
Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки биологического объекта - осаждение белков. Однако в этом случае полностью освободиться от матричного эффекта не удается при использовании метода MALDI-TOF MS. При анализе биологических образцов после процедуры осаждения белков может наблюдаться ионная супрессия, поскольку этот путь не позволяет эффективно удалять эндогенные компоненты биологической матрицы (липиды, фосфолипиды, жирные кислоты и др.). Коэлюирование таких соединений с определяемым компонентом влияет на процесс десольватации капель электроспрея [1, 2].
Известна работа Цимбалистова М.В. с соавт. [3], в которой описано сравнительное изучение белковых профилей типичных вирулентных и изогенных авирулентных ЛПС-дефектных штаммов туляремийного микроба с помощью масс-спектрометрического анализа. Пробоподготовку образцов вирулентных штаммов проводили методом экстракции этиловым спиртом и муравьиной кислотой в соответствии с рекомендациями MP 4.2.0089-14 [4].
Недостатком данной работы является то, что описанный метод не является селективным и применяется только для исследований чистых культур. Известно, что при анализе методом MALDI основной проблемой является получение воспроизводимых и информативных масс-спектров. Это особенно важно при исследовании высокоразвитых поверхностей, которые могут, как увеличивать, так и уменьшать эффективность ионизации, а, следовательно, может снижаться предел чувствительности метода. Также возникает проблема при исследовании объектов окружающей среды, когда необходимо выявить патоген из большого объема и сильно загрязненной пробы. Решить эти проблемы можно путем селективного концентрирования целевых аналитов на стадии пробоподготовки образца с использованием сорбентов. При этом сокращается число стадий выделения аналитов из сложных матриц.
Элюаты, получаемые с использованием сорбционного концентрирования - твердофазной экстракции, значительно чище. Это продемонстрировано в работе Yadav М., 2012 [5].
Сорбенты занимают важное место среди разнообразия пористых и высокодисперсных материалов при решении задач химии, медицины, фармацевтики и т.д. В качестве сорбентов известно использование различных типов саж: графитированная термическая сажа Carbopack, графитированная печная сажа ПМ-16Э, печная сажа ПМ-75 и Vulcan ХС 72R. Показано, что добавление к исследуемым сажам хлорида серебра позволяет повысить информативность и чувствительность определения исследуемых соединений. Метод MALDI с применением предложенных сорбентов позволяет проводить анализ с минимальной пробоподготовкой [6]. Недостатком является то, что данный сорбент нельзя использовать для селективного концентрирования, что снижает выявляемость аналита.
Известен способ получения магноиммуносорбента для обнаружения антигенов микроорганизмов путем получения биомагноиммуносорбента на основе полиакролеиновых латексных микросфер с лигированием специфических антител [7]. Способ включает получение иммуносорбента на основе магнитных полиакролеиновых латексных частиц, содержащих оксид железа. Ферромагнитный материал - оксид железа - вводят в микросферы полиакролеиновых магноиммуносорбентов не в момент их синтеза, а после его завершения. Недостатком данного способа является многостадийность получения магноиммуносорбентов. Использование глутарового альдегида для сшивки сорбентов с антителами может приводить к неспецифической реакции. Данный метод применим только для иммуноферментного анализа (ИФА).
Известен способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов на основе биоматериала (биологических клеток: эритроцитов барана, микробных клеток - грамположительных и грамотрицательных) с лигированием на нем специфических антител для обнаружения антигенов особо опасных инфекций (ООИ). Предлагаемый способ включает получение магнитного биоматериала (магнитных клеток), содержащих оксид железа (магнетит), лигирование на их поверхности компетентных видоспецифических иммуноглобулинов из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл и постановку серологической иммуноферментной реакции с биомагноиммуносорбентом на основе магнитных эритроцитов, клеток вакцинных штаммов чумного, сибиреязвенного микробов, кишечной палочки и Вас. cereus, содержащих магнетит [8]. Недостатком способа является то, что в качестве сорбентов применяется нестабильный и не стандартизованный биоматериал. Так, например, поверхностные свойства наружной мембраны эритроцитов широко варьируются в зависимости от многих условий, таких как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови, источника выделения и методов предварительной обработки.
Наиболее близким к заявляемому методу является применение магнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы [9]. Но данный сорбент, применяемый для ИФА и ПЦР, показал отрицательные результаты при постановке масс-спектрометрического анализа.
Цель изобретения - получение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования и детекции F. tularensis в полевом материале и объектах окружающей среды методом MALDI-TOF MS.
Технический результат изобретения заключается в разработке магнитной матрицы, иммобилизованной антителами туляремийного микроба для пробоподготовки возбудителя туляремии с последующей постановкой масс-спектрометрического анализа.
Первоначальной стадией является получение магносорбента по схеме описанной нами ранее [10]: окисление сульфата железа (II) - FeSO4 нагретой гидроокисью калия (KOH), прокаливание, измельчение. При этом формируется гидроксид железа, обладающий сорбционными, магнитными свойствами.
Отмечается преимущество магнитных сорбентов при пробоподготовке для извлечения и концентрирования аналитов из сложных матриц, т.к. разделение можно осуществить в одну стадию с помощью магнита, без центрифугирования или фильтрации.
Магносорбенты затем используются для химического модифицирования активными группами, применяемыми для ковалентной иммобилизации лигандов. Для данной цели нами разработан метод модифицирования твердофазного носителя окислением с помощью перхлората натрия (NaClO4). Синтез проводили следующим образом: к 1 г полученного магносорбента приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 г перхлората натрия. Инкубировали при температуре (22±4)°С в течение 1 ч в темноте. Затем сорбент отмывали дистиллированной водой (5 кратно, по 60-80 мл). Качественной реакцией на наличие перхлорат-иона является появление фиолетового цвета при действии метиленового голубого.
Определена концентрация альдегидных групп активированных сорбентов в соответствии с методом, описанным в работе В.А. Климовой (1971), которая составила 0,64 мг-экв/г. Содержание альдегидных групп на единицу поверхности носителя обеспечивает высокую концентрацию иммобилизованного лиганда.
Для получения магнитных иммуносорбентов использовали IgG туляремийные, выделенные из сыворотки крови гипериммунных животных, с помощью ПЭГ-6000. Иммобилизацию иммуноглобулинов туляремийных на поверхности магносорбента проводили следующим образом: к 0,4 мл 10% взвеси магносорбента приливали 1 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 2,5 мг/мл, что явилось оптимальным для полного насыщения сорбента антителами. Иммобилизированный сорбент отмывали на спектрофотометре при длине волны 280 нм 0,1 М фосфатно-солевым раствором до отсутствия показаний белка в надосадке. Далее использовали для концентрирования возбудителя туляремии с последующей постановкой масс-спектрометрии.
Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы в различном аппаратурном исполнении. Нами использован batch-вариант, в котором сорбент помещен в микропробирку, что позволяет патогенам дольше взаимодействовать с ним. В результате взаимодействия патогенов в течение 20-30 мин происходит максимальная адсорбция на сорбенте.
Для процесса пробоподготовки использовали магнитный концентратор. Процесс заключался в следующем: в микропробирку с 50 мкл разработанных активированных магнитных иммуносорбентов вносили по 100 мкл микробной взвеси туляремийного микроба, инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий раствор - 0,03 М KOH на 10 мин, переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку.
Параллельно проводили постановку контрольных проб: контроль магноиммуносорбентов (без инкубации с микробной взвесью) и контроль микробной взвеси (отсутствие магнитных сорбентов).
Согласно методическим рекомендациям (MP 4.2.0089-14) экстракцию белков проводят с использованием 80% раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). В связи с этим, нами апробирован данный вариант использования ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF проводили по традиционной схеме, согласно MP 4.2.0089-14 с автоматической идентификацией на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных. В работе использовали мишени MSP 96 Anchor Chip.
Эксперименты проводились как с чистыми культурами, так и контаминированными пробами. В результате, получены идентичные положительные данные.
Частицы сорбента имеют высокую магнитную восприимчивость. Их преимущество на стадии пробоподготовки для извлечения и концентрирования патогенов из сложных объектов заключается в том, что разделение можно осуществить в одну стадию с помощью магнита, без центрифугирования или фильтрации. А использование аффинных свойств сорбента позволяет проводить селективное концентрирование возбудителя туляремии для пробоподготовки патогена с последующей постановкой масс-спектрометрического анализа без осуществления предварительного посева исследуемого материала.
Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1. Разработка туляремийных магноиммунносорбентов для селективного концентрирования возбудителя туляремии (при использовании чистых культур музейных штаммов) с последующей постановкой масс-спектрометрии.
Способ получения аффинного магноиммуносорбента включал следующие основные стадии:
получение активированного магносорбента: к 1 г магносорбента приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 г перхлората натрия. Инкубировали при температуре (22±4)°С в течение 1 часа в темноте. Затем сорбент отмывали дистиллированной водой (5 кратно, по 60-80 мл);
получение магнитного иммусорбента: к 0,4 мл 10% взвеси активированного магносорбента приливали 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией белка 2,5 мг/мл;
отмывали от несвязавшихся антител дистиллированной водой и использовали для концентрирования возбудителя туляремии, с последующей постановкой масс-спектрометрии.
Для процесса пробоподготовки применяли магнитный концентратор. В микропробирку с 50 мкл разработанных активированных туляремийных магнитных иммуносорбентов вносили 100 мкл взвеси туляремийного микроба (1×106 м.к./мл), инкубировали 20 мин, промывали дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и вносили элюирующий раствор - 0,03 М KOH на 10 мин, переносили надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку. Проводили постановку контрольных проб: контроль магноиммуносорбентов (без инкубации с микробной взвесью) и контроль микробной взвеси (отсутствие магнитных сорбентов). Для контроля специфичности использовали гетерологичные штаммы: Br.abortus 544, Br.melitensis 16-M, Br.suis 133O, Y.enterocolitica 64, 178, 383.
Экстракцию белков проводили с использованием 80% раствора ТФУ. Далее постановку метода MALDI-TOF осуществляли по схеме, согласно MP 4.2.0089-14, используя мишени MSP 96 AnchorChip.Автоматическую идентификацию проводили на основании сравнения собранных исходных спектров с референтными спектрами базы данных F. tularensis. В результате установлено присутствие возбудителя в исследуемых образцах, подтверждаемое совпадением спектров экспериментальных образцов с базой данных, при отсутствии совпадения спектров с референтными спектрами гетерологичных штаммов.
Для процесса идентификации образцов, подозрительных на наличие возбудителя туляремии, в Ставропольском противочумном институте разработаны и депонированы в ФИПС следующие базы:
1. Электронная база данных «Белковые профили масс-спектры микроорганизмов I-II групп патогенности» ГР №2-16620345;
2. «ЭБД Протеомных профилей штаммов Francisella tularensis sp.holarctica, выделенных на территории природного очага туляремии в Ставропольском крае и референтных штаммов сравнения в среде программы Biotyper v. 3.0.» ГР №2019620236.
При исследовании чистых культур и небольших объемов проб получены аналогичные результаты, как с применением магнитных иммуносорбентов, так и без них.
Пример 2. Сорбент получали по методике, описанной в примере №1 с целью применения его для селективного концентрирования возбудителя туляремии на разработанном магнитном иммуносорбенте. Отличием являлось исследование проб из объектов окружающей среды.
В процессе эксперимента получены положительные результаты только при применении магнитных иммуносорбентов. Установлено, что происходило совпадение спектров экспериментальных образцов с референтными спектрами базы данных.
Выявить возбудитель туляремии из загрязненных проб объектов окружающей среды при использовании традиционного метода подготовки образцов (без использования магнитных иммуносорбентов) для масс-спектрометрических исследований не удалось.
Пример 3. Сорбент получали по методике описанной в примере 2 с целью применения его для селективного концентрирования возбудителя туляремии на разработанном магноиммуносорбенте. Отличием являлось время инкубации (30 мин) разработанных активированных туляремийных магноммуносорбентов с пробами, подозрительными на наличие возбудителя туляремии, из объектов окружающей среды. Получены результаты аналогичные примеру 2. Увеличение времени инкубации не повлияло на результат реакции.
Используемая литература
1. Bakhtiar R., Majumdar Т. Tracking problems and possible solutions in the quantitative determination of small molecule drugs and metabolites in biological fluids using liquid chromatography-mass spectrometry // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2007. V. 55. P. 262.
2. Chambers E., Wagrowski-Diehl D., Lu Z., Mazzeo J. Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses // J. Chromatogr. B. 2007. V. 852. P. 22.
3. Цимбалистова M.B., Павлович H.B., Аронова H.B., Чайка И.А., Чайка C.O., Водопьянов А.С. Масс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микроба. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (4): С. 92-96.
4. MP 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности».
5. Yadav М., Trivedi V., Upadhyay V., Shah G., S. Goswami G.A Baxi, Shrivastav S. Comparison of extraction procedures for assessment of matrix effect for selective and reliable determination of atazanavir in human plasma by LC-ESI-MS/MS // J. Chromatogr. B. 2012. V. 885. P. 138-149.
6. Кузнецова E.C., Буряк A.K. // Физикохимия поверхности и защита материалов. 2011. Т. 47. №6. С.586-593.
7. Кальной С.М., Жарникова И.В., Зайцев А.А. Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов // Патент РФ №2246968 A61K 39/02 G01N 33/543. Заявка №2003109118. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 27.02. 2005. Бюл. №6.
8. Кальной С.М., Жарникова И.В. Способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов (варианты) // Патент РФ №2271540 С2, G01N 33/543. Заявка №2003123051. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10.03.2006.
9. Тюменцева И.С., Курчева С.А., Афанасьев Е.Н., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Старцева О.Е., Гаркуша Ю.Ю., Семирчева А.А. Особенности пробоподготовки с использованием иммуномагнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы Военно-медицинский журнал. 2018. Т. 339, №5. С. 42-46.
10. Геогджаян А.С., Жарникова И.В., Курчева С.А., Кошкидько А.Г., Гнусарева О.А., Котенева Е.А., Жарникова Т.В., Калинин А.В. Разработка эффективного способа пробоподготовки с применением магнитных сорбентов при исследовании образцов в масс-спетрометрии // Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания: матер. VI Всеросс.междисциплинарной науч.-практ.конф. с международным участием, г. Сочи, 30 окт. - 2 ноября 2019 г. Краснодар: Новация, 2019. С. 58-59.

Claims (4)

  1. Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS, включающий:
  2. активирование магносорбента: к 1 г магносорбента приливают 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 г перхлората натрия, инкубируют при температуре (22±4)°С в течение 1 ч, отмывают дистиллированной водой (5-кратно, по 60-80 мл);
  3. получение магнитного иммуносорбента: к 0,4 мл 10% взвеси активированного магносорбента приливают 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией белка 2,5 мг/мл, отмывают от несвязавшегося лиганда;
  4. проведение селективного концентрирования возбудителя туляремии: в микропробирку с 50 мкл разработанных магноиммуносорбентов вносят 100 мкл взвеси туляремийного микроба, инкубируют 20 мин, промывают дважды дистиллированной водой от несвязавшихся антигенов и элюируют 0,03 М KOH в течение 10 мин, переносят надосадочную жидкость (элюированный антиген) в чистую микропробирку и осуществляют постановку метода MALDI-TOF MS.
RU2020140474A 2020-12-07 2020-12-07 Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS RU2756202C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020140474A RU2756202C1 (ru) 2020-12-07 2020-12-07 Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020140474A RU2756202C1 (ru) 2020-12-07 2020-12-07 Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2756202C1 true RU2756202C1 (ru) 2021-09-28

Family

ID=77999937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020140474A RU2756202C1 (ru) 2020-12-07 2020-12-07 Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2756202C1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2138813C1 (ru) * 1997-11-20 1999-09-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения иммуносорбента (варианты)
RU2246968C2 (ru) * 2003-03-31 2005-02-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов
RU2271540C2 (ru) * 2003-07-21 2006-03-10 Ставропольский научно-иследовательский противочумный институт Способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов (варианты)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2138813C1 (ru) * 1997-11-20 1999-09-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения иммуносорбента (варианты)
RU2246968C2 (ru) * 2003-03-31 2005-02-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов
RU2271540C2 (ru) * 2003-07-21 2006-03-10 Ставропольский научно-иследовательский противочумный институт Способ получения биомагноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов (варианты)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R Grunow et al. Detection of Francisella tularensis in biological specimens using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an immunochromatographic handheld assay, and a PCR. Clin Diagn Lab Immunol., 2000, vol. 7(1), p. 86-90. *
В.Г.Пушкарь, М.Я.Кулаков. Совершенствование метода приготовления иммуносорбентов с магнитными свойствами для хемилюминесцентного анализа. Проблемы особо опасных инфекций, 2013, вып. 4, 112-114. *
В.Г.Пушкарь, М.Я.Кулаков. Совершенствование метода приготовления иммуносорбентов с магнитными свойствами для хемилюминесцентного анализа. Проблемы особо опасных инфекций, 2013, вып. 4, 112-114. R Grunow et al. Detection of Francisella tularensis in biological specimens using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an immunochromatographic handheld assay, and a PCR. Clin Diagn Lab Immunol., 2000, vol. 7(1), p. 86-90. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4490112B2 (ja) 標的細菌性細胞を感染させるためにファージを使用する低濃度の標的細菌を検出するための方法
US11293918B2 (en) Method and kit for simultaneous detection of multi target molecules using magnetic bead-aptamer conjugate
US20020192676A1 (en) Method for determining if a type of bacteria is present in a mixture
Jiang et al. An immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis
JP2013508675A (ja) 質量分析によって少なくとも一つの微生物を特徴づける方法
Chen et al. Immunomagnetic separation and MS/SPR end-detection combined procedure for rapid detection of Staphylococcus aureus and protein A
Xiong et al. Ultra-sensitive chemiluminescent detection of Staphylococcus aureus based on competitive binding of Staphylococcus protein A-modified magnetic beads to immunoglobulin G
US20220162272A1 (en) Compositions and methods of determining a level of infection in a subject
CN109937363A (zh) 用于识别微生物的质谱方法和试剂盒
EP2663866A1 (en) Methods of capturing bindable targets from liquids
EP3508849B1 (en) Antibody measurement method using antigen-carrying insoluble carrier particles on which antigen is immobilized by different methods, and reagent for antibody measurement
RU2756202C1 (ru) Способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F. tularensis из объектов окружающей среды с последующей детекцией методом MALDI-TOF MS
CN111337686A (zh) 免疫富集联合maldi-tof ms检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及应用
RU2290641C1 (ru) Способ проведения иммуноферментного анализа (ифа)
Qin et al. Rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumonia based on bacitracin-modified Fe 3 O 4@ PDA magnetic beads combined with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
Liu et al. Characterization of membrane-associated glycoproteins using lectin affinity chromatography and mass spectrometry
CN111366726A (zh) 一种免疫富集联合maldi-tof ms检测食品中沙门氏菌的方法及应用
US20240011989A1 (en) Method for identification of viruses and diagnostic kit using the same
WO2018151938A2 (en) Compositions and methods of determining a level of infection in a subject
RU2762805C1 (ru) Способ получения магнитных сорбентов для концентрирования патогенов с последующей постановкой масс-спектрометрии
Jankovicova et al. Benefits of immunomagnetic separation for epitope identification in clinically important protein antigens: A case study using ovalbumin, carbonic anhydrase I and Tau protein
Buszewski et al. Determination of Pathogens by Electrophoretic and Spectrometric Techniques
RU2202800C2 (ru) Способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа
RU2196335C1 (ru) Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного
CN116859039A (zh) 一种磁性多孔材料的封闭剂及其应用