RU2746055C1

RU2746055C1 - Method for diagnosing mutation c.-23+1g>a (rs80338940) of the gjb2 gene

Info

Publication number: RU2746055C1
Application number: RU2020114858A
Authority: RU
Inventors: Елена Анатольевна Лоломадзе; Денис Владимирович Ребриков
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2021-04-06

Abstract

FIELD: biotech.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, namely to molecular biology, medical genetics and otorhinolaryngology. Disclosed are synthetic oligonucleotides for the diagnosis (genotyping) of the c-23+1G>A(rs80338940) mutation of the GJB2 gene in human biomaterial. The primers are combined into kits for detecting DNA in blood and other biological materials by polymerase chain reaction.

EFFECT: invention enables highly sensitive diagnostics of congenital hereditary deafness of a person in biological material. The use of this method also provides a highly sensitive and objective description of the human genotype with the determination of homozygous and heterozygous carriers of this mutation.

1 cl, 2 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной биологии, медицинской генетике и оториноларингологии.The invention relates to the field of biotechnology, namely to molecular biology, medical genetics and otorhinolaryngology.

Потеря слуха является одним из наиболее распространенных сенсорных расстройств у людей и имеет самый высокий уровень инвалидности в мире [1]. Приблизительно половина случаев потери слуха имеет генетическую этиологию с аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным, X-сцепленным или митохондриальным типами наследования [2]. Врожденная глухота является одним из частых заболеваний человека, регистрируемая с частотой 1:1000 новорожденных детей. Потеря слуха является как медицинской, так и социальной проблемой. По данным ВОЗ, в мире насчитывается 466 млн. человек с инвалидизирующей потерей слуха, что составляет около 5% от всей популяции земного шара. В России людей с нарушениями слуха насчитывается более 13 млн. человек, из которых более 3 млн. нуждаются в слухопротезировании.Hearing loss is one of the most common sensory disorders in humans and has the highest rate of disability in the world [1]. Approximately half of cases of hearing loss have a genetic etiology with autosomal dominant, autosomal recessive, X-linked or mitochondrial inheritance patterns [2]. Congenital deafness is one of the most common human diseases, registered with a frequency of 1: 1000 newborns. Hearing loss is both a medical and a social problem. According to the WHO, there are 466 million people in the world with disabling hearing loss, which is about 5% of the entire population of the globe. There are more than 13 million people in Russia with hearing impairments, of which more than 3 million need hearing aids.

Среди наследственных нарушений слуха наиболее частая форма (около 80%) наследственной потери слуха - несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота (DFNB1) [3, 4], относится к сенсоневральным нарушениям слуха, при которых страдает процесс звуковосприятия. Исследования в европейских и азиатских популяциях выявили мутации в генах семейства белков-коннексинов: GJB2 (gap junction β2) и GJB6 (gap junction β6), являющиеся наиболее частой причиной возникновения заболевания. Локализованы эти гены в 13 хромосоме в области 13q11-q13, кодирующих коннексин 26 (Сх26) и коннексин 30 (Сх30) - белки межклеточных щелевых контактов [5].Among hereditary hearing impairments, the most common form (about 80%) of hereditary hearing loss - non-syndromic autosomal recessive deafness (DFNB1) [3, 4], refers to sensorineural hearing impairments in which the process of sound perception suffers. Studies in European and Asian populations have identified mutations in the genes of the connective protein family: GJB2 (gap junction β2) and GJB6 (gap junction β6), which are the most common cause of the disease. These genes are localized on chromosome 13 in the region 13q11-q13, encoding connexin 26 (Cx26) and connexin 30 (Cx30), proteins of intercellular gap junctions [5].

GJB2, кодирующий белок коннексин-26 ответственен за более чем половину случаев, за которыми следует SLC26A4, MY015A, OTOF, Cdh23 и ТМС1 [6]. Эти мутации происходят с различной частотой в разных популяциях [7], причем c.35delG, c.167delT и c.235delC преобладают в популяциях кавказских, ашкеназских евреев и Восточной Азии соответственно [8-12]. Кроме того, мутации синдрома Пегента в SLC26A4 составляют 10% наследственной потери слуха в большинстве населения мира. В Китае почти 50% пациентов с несиндромальной потерей слуха имеют мутации GJB2 или SLC26A4 [12]. Выявление этих мутаций представляет основной интерес для генетического консультирования. Хотя большое количество случаев вызвано мутациями горячих точек этих генов, как показали молекулярные эпидемиологические исследования, редкие мутации также могут способствовать потере слуха.GJB2, encoding the connexin-26 protein, is responsible for more than half of the cases, followed by SLC26A4, MY015A, OTOF, Cdh23, and TMC1 [6]. These mutations occur with different frequencies in different populations [7], with c.35delG, c.167delT, and c.235delC prevailing in the populations of Caucasian, Ashkenazi Jews, and East Asia, respectively [8-12]. In addition, mutations in Pagent's syndrome in SLC26A4 account for 10% of hereditary hearing loss in most of the world's population. In China, almost 50% of patients with non-syndromic hearing loss have GJB2 or SLC26A4 mutations [12]. Identifying these mutations is of primary interest for genetic counseling. Although a large number of cases are caused by hotspot mutations in these genes, molecular epidemiological studies have shown that rare mutations can also contribute to hearing loss.

Более 300 патогенных вариаций GJB2 были зарегистрированы в базе данных мутаций генов человека [13]. Многие из них имеют высокую этногеографическую специфику распространенности [14].More than 300 pathogenic variations of GJB2 have been registered in the human gene mutation database [13]. Many of them have a high ethnogeographic specificity of prevalence [14].

Мутации GJB2 делают фенотип очень вариабельным. Факторы окружающей среды, модифицирующие гены и другие гены коннексина могут играть роль в потере слуха и его фенотипе [14]. Хотя большинство мутаций GJB2 сосредоточены в кодирующей области экзона 2, несколько мутаций были обнаружены в некодирующей области гена [15-17]. После обследования пациентов с рецессивной мутацией в кодирующей области был выявлен ряд мутаций патогена в некодирующей области GJB2, которые были ответственны за потерю слуха [18, 19]. Реконструкция структуры GJB2, окружающей геномные области, указывает на то, что основатель разветвился во всем мире за последние два или три столетия. Соответственно, мутации GJB2reH могли возникнуть во время миграции человека. Эти выводы имеют важное значение для подхода к политике диагностики и профилактики наследственной глухоты во всем мире [14].GJB2 mutations make the phenotype highly variable. Environmental factors that modify genes and other connexin genes may play a role in hearing loss and its phenotype [14]. Although most of the GJB2 mutations are concentrated in the coding region of exon 2, several mutations have been found in the noncoding region of the gene [15-17]. After examining patients with a recessive mutation in the coding region, a number of pathogen mutations in the non-coding region of GJB2 were identified, which were responsible for hearing loss [18, 19]. The reconstruction of the GJB2 structure surrounding the genomic regions indicates that the founder has branched out around the world over the past two or three centuries. Accordingly, GJB2reH mutations could have arisen during human migration. These findings are important for the approach to the policy of diagnosis and prevention of hereditary deafness around the world [14].

Мутация с.-23 + 1G> А локализована в некодирующих областях экзона 1, что влияет на сплайсинг транскрипта GJB2 и представляет собой однонуклеотидную замену "G" на "А" в позиции 20,192,782 в хромосоме 13 [20]. Мутация с.-23 + 1G> А была впервые идентифицирована Denoyelle et al. [15], затем гетерозиготность и гомозиготность были доказаны у разных пациентов [17, 20-22].The c.-23 + 1G> A mutation is localized in the non-coding regions of exon 1, which affects the splicing of the GJB2 transcript and represents a single nucleotide "G" to "A" substitution at position 20,192,782 in chromosome 13 [20]. The c-23 + 1G> A mutation was first identified by Denoyelle et al. [15], then heterozygosity and homozygosity were proved in different patients [17, 20-22].

Поскольку мутация с.-23 + 1G> A (chr13: 20766921: C> Т) находится в некодирующей области, она была рассмотрена в меньшем количестве глобальных исследований; однако исследования также изучали некодирующие области в дополнение к области кодирования. Мутация с.-23 + 1G> А представляет собой патогенную мутацию, вызванную аутосомно-рецессивной глухоты, которая находится в некодирующей области экзона 1, которая влияет на сплайсинг транскрипта GJB2 [20].Since the mutation c.-23 + 1G> A (chr13: 20766921: C> T) is in the non-coding region, it has been considered in fewer global studies; however, studies have also examined non-coding regions in addition to the coding region. The c.-23 + 1G> A mutation is a pathogenic mutation caused by autosomal recessive deafness, which is located in the non-coding region of exon 1, which affects the splicing of the GJB2 transcript [20].

Эта мутация отмечается с различной частотой среди разных популяций и особенно часто встречается в монгольской, якутской, чешской, венгерской и турецкой популяциях с потерей слуха [23-25]. Некоторые ученые утверждают [14], что мутация в Восточной Азии, Северной и Южной Америке не распространена и имеет наибольшую частоту в Южной Азии и некоторых частях Ближнего Востока и допускает возможность того, что эти районы являются регионом-основателем, из которого они могут распространиться в другие регионы [14].This mutation is noted with different frequencies among different populations and is especially common in the Mongolian, Yakut, Czech, Hungarian and Turkish populations with hearing loss [23-25]. Some scientists argue [14] that the mutation in East Asia, North and South America is not widespread and has the highest frequency in South Asia and parts of the Middle East, and suggests the possibility that these regions are a founding region from which they can spread to other regions [14].

Эта мутация уменьшалась с севера на юг и с запада на восток, пока не достигла нуля в южных регионах. Можно сказать, что источником этой мутации является северный Иран, который распространился на другие регионы Ирана. Различные исследования показали, что эта мутация является второй наиболее распространенной мутацией после мутации c.35delG в Европе [26] и Иране [27].This mutation decreased from north to south and from west to east until it reached zero in the southern regions. It can be said that the source of this mutation is northern Iran, which has spread to other regions of Iran. Various studies have shown that this mutation is the second most common mutation after the c.35delG mutation in Europe [26] and Iran [27].

Как известно, анамнестические и клинические данные являются недостаточными для постановки правильного диагноза в случае наследственной глухоты. Кроме того, своевременная и точная диагностика этого наследственного дефекта позволит наиболее качественно и в самые ранние сроки начинать лечение и реабилитационные мероприятия для обеспечения полноценной социальной адаптации лиц с наследственными дефектами слуха.As you know, anamnestic and clinical data are insufficient to make a correct diagnosis in the case of hereditary deafness. In addition, timely and accurate diagnosis of this hereditary defect will make it possible to begin treatment and rehabilitation measures with the highest quality and at the earliest possible time to ensure the full-fledged social adaptation of persons with hereditary hearing impairments.

Известно большое количество методов определения генетического полиморфизма, использующих различные способы для анализа уникальной нуклеотидной последовательности ДНК человека. Сюда относят методы, основанные на применении ферментов (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP); полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и пр.), химические методы (химическое расщепление гетеродуплексов, химическое лигирование), методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК, детекция на твердой фазе, хроматографические методы, физические методы.A large number of methods for determining genetic polymorphism are known, using various methods to analyze the unique nucleotide sequence of human DNA. This includes methods based on the use of enzymes (amplified fragment length polymorphism (AFLP); restriction fragment length polymorphism (RFLP), etc.), chemical methods (chemical cleavage of heteroduplexes, chemical ligation), methods based on different electrophoretic mobility of polymorphic DNA regions , detection on a solid phase, chromatographic methods, physical methods.

В частности, полиморфизмы гена GJB2 были исследованы во многих работах [9-11, 28]. Среди способов выявления мутаций в этом гене известен способ обнаружения мутаций 35delG, 167delT и 235delC гена GJB2 с помощью гетеродуплексного анализа [29]. Существенными недостатками метода являются низкая чувствительность, использование дорогостоящих вариантов гелей, а также невозможность определения точной локализации SNP внутри исследуемого фрагмента. Известен также метод SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК), предложенный в 1989 году и широко применяемый для детекции однонуклеотидных делеций [30]. Однако этот анализ является достаточно трудоемким и нуждается в дорогостоящих оборудовании и реактивах, а также его длительность составляет около 5 суток. Позже появился способ детекции мутаций методом мультиплексной системы полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одной трубкой. Этот способ использовался в том числе и для выявления распространенных мутаций в гене Connexin-26 и был описан в работе Baris I. с соавторами [31]. В данной работе приводится описание проведения эксперимента, включающего выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции и амплификацию фрагментов ДНК, содержащих мутации 35delG, 167delT и 235delC гена GJB2. С помощью данного метода можно выявлять гетерозиготное носительство мутаций гена GJB2.In particular, polymorphisms of the GJB2 gene have been investigated in many works [9-11, 28]. Among the methods for detecting mutations in this gene, a method for detecting 35delG, 167delT, and 235delC mutations in the GJB2 gene using heteroduplex analysis is known [29]. Significant disadvantages of the method are low sensitivity, the use of expensive gels, and the impossibility of determining the exact localization of SNPs within the studied fragment. Also known is the SSCP method (analysis of conformational polymorphism of single-stranded DNA), proposed in 1989 and widely used for the detection of single-nucleotide deletions [30]. However, this analysis is rather laborious and requires expensive equipment and reagents, and its duration is about 5 days. Later, a method for detecting mutations by the method of a multiplex polymerase chain reaction (PCR) system with one tube appeared. This method was also used to identify common mutations in the Connexin-26 gene and was described by Baris I. et al. [31]. This paper describes an experiment that includes DNA isolation from peripheral blood lymphocytes, multiplex polymerase chain reaction, and amplification of DNA fragments containing 35delG, 167delT, and 235delC mutations of the GJB2 gene. Using this method, it is possible to identify the heterozygous carriage of mutations in the GJB2 gene.

Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения.The following analogs of the present invention are known from the prior art.

Патент № RU 2317547 С1 «СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ GJB2, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ РАЗВИТИЕМ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОЙ ГЛУХОТЫ» [Джемилева Л.У. и др., 2008].Patent No. RU 2317547 C1 "A METHOD FOR DETECTING MUTATIONS IN THE GJB2 GENE ACCOMPANYING THE DEVELOPMENT OF NON-SYNDROMAL AUTOSOMIC-RECESSIVE DEAFNESS" [Dzhemileva L.U. et al., 2008].

Предметом данного изобретения является проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции, в которой амплифицируют одновременно три участка гена GJB2. При наличии определенных аллелей диагностируют гетерозиготное либо гомозиготное носительство мутаций 35delG, 167delT и 235delC.The subject of the present invention is a multiplex polymerase chain reaction in which three regions of the GJB2 gene are simultaneously amplified. In the presence of certain alleles, heterozygous or homozygous carriage of 35delG, 167delT and 235delC mutations is diagnosed.

Патент № RU2555755 C1 «СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ MYO7A, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ РАЗВИТИЕМ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОЙ ГЛУХОТЫ И СИНДРОМОМ УШЕРА» [Джемилева Л.У. и др., 2015].Patent No. RU2555755 C1 "A METHOD FOR DETECTING MUTATIONS IN THE MYO7A GENE ACCOMPANIED BY THE DEVELOPMENT OF NON-SYNDROMAL AUTOSOMIC-RECESSIVE DEAFNESS AND USHER'S SYNDROME" [Dzhemileva L.U. et al., 2015].

Способ, описанный в данном изобретении включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проведение ПЦР, амплификацию 18 участков гена MYO7A, детекцию в денатурирующем акриламидном геле и секвенирование. ПЦР проводят с использованием специально подобранных последовательностей олигонуклеотидов, фланкирующих области 18 экзонов гена MYO7A с возможным содержанием различных мутаций.The method described in this invention includes isolation of DNA from peripheral blood lymphocytes by phenol-chloroform extraction, PCR, amplification of 18 regions of the MYO7A gene, detection in denaturing acrylamide gel and sequencing. PCR is carried out using specially selected sequences of oligonucleotides flanking regions of 18 exons of the MYO7A gene with the possible content of various mutations.

Патент № RU 2448163 C2 «СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ 17 МУТАЦИЙ ГЕНОВ GJB2 И GJB6 ПРИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ ГЛУХОТЕ» [Барашков Н.А. и др., 2012]Patent No. RU 2448163 C2 "METHOD FOR DETECTING 17 GJB2 AND GJB6 GENES MUTATIONS IN HEREDITARY NON-SYNDROMAL DEAFNESS" [Barashkov N.А. et al., 2012]

Данное изобретение направлено на детекцию 17 связанных с данным заболеванием мутаций в генах GJB2 и GJB6 с помощью ПЦР-амплификации соответствующих областей этих генов, которую проводят в 8 реакционных смесях с использованием специфичных пар праймеров, и последующего анализа полученных ампликонов, проводимого либо без предварительного расщепления эндонуклеазами (при определении мутаций c.312del14, с. 333-334delAA, ΔGJB6-D13S1830, ΔGJB6-D13S1854), либо после гидролиза соответствующими специфичными рестриктазами (при определении мутаций IVS1+1G>A, c.35delG, c.71G>A, c.79G>A, c.167delT, c.235delC, c.224G>A, c.299-300delAT, c.360delGAG, c.341A>G, c.269T>C, с.101Т>С, c.109G>A).The present invention is directed to the detection of 17 disease-related mutations in the GJB2 and GJB6 genes by PCR amplification of the corresponding regions of these genes, which is carried out in 8 reaction mixtures using specific primer pairs, and subsequent analysis of the resulting amplicons, either carried out without prior cleavage with endonucleases. (when determining mutations c.312del14, p. 333-334delAA, ΔGJB6-D13S1830, ΔGJB6-D13S1854), or after hydrolysis with the corresponding specific restrictases (when determining mutations IVS1 + 1G> A, c.35delG, c.71G> A, c .79G> A, c.167delT, c.235delC, c.224G> A, c.299-300delAT, c.360delGAG, c.341A> G, c.269T> C, c.101T> C, c.109G > A).

Патент № RU 2505608 C1 «СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ с.-53-2A>G В ГЕНЕ ПРЕСТИНА (SLC26A5), ВЫЗЫВАЮЩЕЙ РАЗВИТИЕ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОЙ ГЛУХОТЫ» [Джемилева Л.У. и др., 2014]Patent No. RU 2505608 C1 "METHOD FOR DETECTING MUTATION p. -53-2A> G IN THE PRESTINA GENE (SLC26A5), CAUSING THE DEVELOPMENT OF NON-SYNDROMAL AUTOSOMO-RECESSIVE DEAFNESS" [Dzhemileva L.U. et al., 2014]

Способ, описанный в данном изобретении включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Проводят полимеразную цепную реакцию с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке. Амплифицируют одновременно два участка гена SLC26A5 в смеси двух пар последовательностей олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой:

фланкирующих область с возможным содержанием мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5.The method described in this invention includes the isolation of DNA from peripheral blood lymphocytes by phenol-chloroform extraction. A polymerase chain reaction is carried out with the ability to conduct an endpoint fluorescence analysis. Simultaneously amplify two regions of the SLC26A5 gene in a mixture of two pairs of fluorescently labeled oligonucleotide sequences:

flanking the region with possible mutation c.-53-2A> G in the SLC26A5 gene.

Патент № RU 2688180 C1 «Способ выявления мутаций гена GJB2, обуславливающих аутосомно-рецессивную глухоту 1А типа» [Пшенникова В.Г. и др., 2019]Patent No. RU 2688180 C1 "Method for detecting mutations in the GJB2 gene, causing autosomal recessive deafness type 1A" [Pshennikova V.G. et al., 2019]

В данном изобретении предложен способ, включающий детекцию трех наиболее распространенных в Якутии мутаций c.-23+1G>A, c.35delG и c.109G>A с использованием праймеров и с последующим проведением анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием эндонуклеаз AsuHPI, Bsc4I, HindII.This invention proposes a method comprising the detection of the three most common mutations in Yakutia c.-23 + 1G> A, c.35delG and c.109G> A using primers and subsequent analysis of restriction fragment length polymorphism using endonucleases AsuHPI, Bsc4I , HindII.

Патент № RU 2627115 C2 «Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний» [Саввина М.Т. и др., 2017]Patent No. RU 2627115 C2 "Method for the simultaneous diagnosis of hereditary diseases" [M.T. Savvina. et al., 2017]

В данном изобретении предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно.This invention proposes a method for the simultaneous diagnosis of hereditary diseases based on the use of a biochip with oligonucleotide targets immobilized on its surface, including the detection of point in genes CUL7, NBAS, DIA1, FAH and causing 3M syndrome, SOPH syndrome, hereditary enzymopenic methemoglobinemia type 1, 1 type and hereditary non-syndromic type 1A deafness, respectively.

Патент № CN 103352080 В «Набор для определения генов при наследственной потере слуха» [Zheng Weiguo Meng Xiang et al., 2014]Patent No. CN 103352080 B "Kit for the determination of genes in hereditary hearing loss" [Zheng Weiguo Meng Xiang et al., 2014]

Изобретение раскрывает набор, способный обнаруживать 17 несиндромальных генов предрасположенности к потере слуха. Набор состоит из 17 пар специфичных праймеров для проведения генотипирования генов восприимчивости к потере слуха и позволяет обнаружить одновременно 17 мутаций в четырех наиболее распространенных китайских генах в одной пробирке в течение 3 часов. Набор включает праймерные комбинации 17 полиморфных участков наследственной тугоухости на GJB2 (СХ26) ген, ген SLC26A4 (PDS), ген GJB3 и ген 12SrRNA (MTRNR1), они могут быть использованы для точной оценки дикого типа, типа чистого мутанта или гибридного типа из 17 сайтов, а также для диагностики и скрининга генов потери слуха. Суть предлагаемого набора заключается в обнаружении сайта полиморфизма генетического маркера третьего поколения (однонуклеотидный полиморфизм) и комбинации с техникой обнаружения, применяя флуоресценцию к несиндромальному гену наследственного нарушения слуха.The invention discloses a kit capable of detecting 17 non-syndromic hearing loss predisposition genes. The kit consists of 17 pairs of specific primers for genotyping of genes for susceptibility to hearing loss and allows simultaneous detection of 17 mutations in the four most common Chinese genes in one test tube for 3 hours. The kit includes primer combinations of 17 polymorphic regions of hereditary hearing loss on the GJB2 (CX26) gene, the SLC26A4 gene (PDS), the GJB3 gene and the 12SrRNA gene (MTRNR1), they can be used to accurately assess the wild type, pure mutant type or hybrid type from 17 sites and for the diagnosis and screening of genes for hearing loss. The essence of the proposed set consists in detecting the site of polymorphism of the third generation genetic marker (single nucleotide polymorphism) and combining it with a detection technique by applying fluorescence to a non-syndromic gene of hereditary hearing impairment.

Прототипом заявляемого изобретения является способ, описанный в заявке RU 2016136727 А, ООО «ТВОЙ ГЕН», Жмырко Е.В., 2018 «Набор олигонуклеотидных праймеров, зондов и способ выявления мутации гена методом аллель-специфической ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте». Выявление мутации гена, с использованием набора праймеров и зондов, методом аллель-специфической ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте проводят по результатам ПЦР в режиме реального времени; при этом наличие/отсутствие гетерозиготного носительства мутации определяют по испускаемому сигналу флуоресценции, при наличии сигнала по каналу FAM генотип интерпретируется как наличие мутации гена в исследуемом образце, при наличии сигнала по каналу HEX - как норма, а при наличии двух сигналов как - гетерозиготное состояние, носительство мутации гена.The prototype of the claimed invention is the method described in the application RU 2016136727 A, LLC "TVOI GEN", Zhmyrko EV, 2018 "A set of oligonucleotide primers, probes and a method for detecting gene mutations by allele-specific PCR amplification in hereditary non-syndromic deafness." Identification of gene mutations, using a set of primers and probes, by allele-specific PCR amplification in hereditary non-syndromic deafness is carried out according to the results of real-time PCR; in this case, the presence / absence of heterozygous carriage of the mutation is determined by the emitted fluorescence signal, in the presence of a signal through the FAM channel, the genotype is interpreted as the presence of a gene mutation in the test sample, in the presence of a signal through the HEX channel, as a norm, and in the presence of two signals, as a heterozygous state, carriage of a gene mutation.

Анализ показывает, что в описанных аналогах, как в прототипе, недостатком является сравнительно невысокая достоверность результатов исследования из-за небольшой разницы между получаемыми кривыми флуоресценции для разных аллелей.The analysis shows that in the described analogs, as in the prototype, the disadvantage is the relatively low reliability of the research results due to the small difference between the obtained fluorescence curves for different alleles.

Настоящее изобретение направлено на повышение достоверности диагностики на наличие либо отсутствие гетерозиготной / гомозиготной мутации с.-23+1G>А (rs80338940) гена GJB2, определение генотипа человека в биологическом материале (цельная кровь, слюна), а также повышения доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании.The present invention is aimed at increasing the reliability of diagnosis for the presence or absence of heterozygous / homozygous mutation c.-23 + 1G> A (rs80338940) of the GJB2 gene, determining the human genotype in biological material (whole blood, saliva), as well as increasing the availability of such studies, since the method can be carried out on standard known equipment.

Преимущество состоит в уникальности состава реакционной смеси, в частности в нуклеотидной последовательности праймеров и зондов для диагностики гетерозиготной / гомозиготной мутации с.-23+1G>А (rs80338940) гена GJB2 в биоматериале человека. Определение вариабельных позиций в ДНК осуществляется более надежным методом с использованием стандартного оборудования.The advantage lies in the uniqueness of the composition of the reaction mixture, in particular in the nucleotide sequence of primers and probes for the diagnosis of heterozygous / homozygous c.-23 + 1G> A (rs80338940) mutations of the GJB2 gene in human biomaterial. Determination of variable positions in DNA is carried out in a more reliable way using standard equipment.

Предложен способ диагностики гетерозиготной и гомозиготной мутаций c.-23+1G>A (rs80338940) гена GJB2 в биоматериале человека методом ПЦР-РВ.A method for the diagnosis of heterozygous and homozygous mutations c.-23 + 1G> A (rs80338940) of the GJB2 gene in human biomaterial by RT-PCR is proposed.

Использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) - является наиболее перспективным. Принцип метода ПЦР основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающегося в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой. Основным достоинством метода ПЦР как молекулярно-биологического исследования является его чрезвычайно высокая чувствительность.The use of the polymerase chain reaction (PCR) method for this purpose is the most promising. The principle of the PCR method is based on the use of the DNA amplification process, which consists in repeated cycles of temperature denaturation of DNA, annealing of primers with complementary sequences, and subsequent extension of polynucleotide chains from these primers with Taq polymerase. The main advantage of the PCR method as a molecular biological study is its extremely high sensitivity.

В смесь для амплификации введены сигнальные зонды, содержащие флуоресцентные метки Fam и Hex, на каждый вариант определяемого генетического полиморфизма. После окончания ПЦР проводится раунд температурного плавления дуплексов, образованных ампликонами и сигнальными зондами, в результате чего изменяется уровень флуоресценции, который фиксируется и представляется программным обеспечением прибора в виде графика. Если сигнальный зонд частично комплементарен ДНК-мишени, температура плавления такого дуплекса будет ниже температуры плавления дуплекса в случае полной комплементарности зонда. На основании температуры плавления сигнальных зондов проводится интерпретация результатов анализа.Signaling probes containing fluorescent labels Fam and Hex were introduced into the mixture for amplification for each variant of the determined genetic polymorphism. After the end of the PCR, a round of thermal melting of the duplexes formed by the amplicons and signal probes is carried out, as a result of which the fluorescence level changes, which is recorded and represented by the instrument software in the form of a graph. If the signaling probe is partially complementary to the target DNA, the melting temperature of such a duplex will be lower than the melting temperature of the duplex in the case of complete complementarity of the probe. The analysis results are interpreted based on the melting point of the signal probes.

Использование трех флуоресцентных красителей позволяет одновременно определять два аллеля и оценивать количество геномной ДНК в одной пробирке. Исследование с использованием комплектов реагентов для определения генетических полиморфизмов состоит из следующих этапов: выделение ДНК (пробоподготовка) и ПЦР-амплификация в режиме реального времени.The use of three fluorescent dyes makes it possible to simultaneously determine two alleles and estimate the amount of genomic DNA in one tube. A study using reagent kits for the determination of genetic polymorphisms consists of the following stages: DNA extraction (sample preparation) and real-time PCR amplification.

Работа над созданием олигонуклеотидов, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.The work on the creation of oligonucleotides that are used in such kits usually proceeds as follows.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей генов человека либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого гена выбирается участок гена, в котором возможен генетический полиморфизм (мутация с-23+1G>А).1) With the help of open and commercial databases of nucleotide sequences of human genes or as a result of independent determination of the nucleotide sequence of the gene under study, a section of the gene is selected in which genetic polymorphism is possible (mutation c-23 + 1G> A).

2) На основании выбранного участка гена с помощью программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции.2) Based on the selected region of the gene, using the software, the sequence of oligonucleotides used for the PCR reaction is selected.

3) Изготовление праймеров заказывается в сервисном центре.3) Manufacturing of primers is ordered from the service center.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для диагностики гетерозиготной / гомозиготной мутации с.-23+1G>А (rs80338940) гена GJB2 в биоматериале человека).4) Practical experiments prove the suitability of the selected sequences for specific purposes (for example, for the diagnosis of heterozygous / homozygous mutation c.-23 + 1G> A (rs80338940) of the GJB2 gene in human biomaterial).

Предлагаемым подходом к детекции генетического полиморфизма является использование двух аллель-специфичных и меченых разными флуоресцентными метками олигонуклеотидов, а также олигонуклеотида, несущего гаситель флуоресценции и гибридизирующегося на матрицу рядом с аллель-специфичным олигонуклеотидом. Гибридизация аллель-специфичного олигонуклеотида на матрицу ведет к переносу энергии с находящегося на нем флуорофора-донора на гаситель флуоресценции расположенного рядом «гасящего» олигонуклеотида. Регистрацию результатов амплификации ведут по окончании ПЦР путем снятия спектра флуоресценции при изменении температуры реакционной смеси в диапазоне от 25 до 80 градусов по Цельсию (так называемые «кривые плавления»). При получении графиков флуоресценции возможен как нагрев, так и охлаждение реакционной смеси в указанном интервале температур. Предлагаемое изобретение делает определение вариабельных позиций в ДНК более надежным и удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования.The proposed approach to the detection of genetic polymorphism is the use of two allele-specific oligonucleotides labeled with different fluorescent labels, as well as an oligonucleotide carrying a fluorescence quencher and hybridizing to a template next to the allele-specific oligonucleotide. Hybridization of the allele-specific oligonucleotide to the template leads to the transfer of energy from the donor fluorophore located on it to the fluorescence quencher of the adjacent “quenching” oligonucleotide. Registration of amplification results is carried out at the end of PCR by taking a fluorescence spectrum when the temperature of the reaction mixture changes in the range from 25 to 80 degrees Celsius (the so-called "melting curves"). When obtaining graphs of fluorescence, both heating and cooling of the reaction mixture in the specified temperature range is possible. The proposed invention makes the determination of variable positions in DNA more reliable and reduces the cost of such studies due to the use of standard equipment.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверная диагностика на наличие либо отсутствие гетерозиготной / гомозиготной мутации c.-23+1G>A (rs80338940) гена GJB2, определение генотипа человека в биологическом материале (цельная кровь, плазма крови, слюна, образцы тканей), а также повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Данный метод вдобавок обеспечивает возможность проводить исследование в одной пробирке, что снижает затраты на исследование.The technical result, which the present invention is aimed at, is a reliable diagnosis for the presence or absence of heterozygous / homozygous mutation c.-23 + 1G> A (rs80338940) of the GJB2 gene, determination of the human genotype in biological material (whole blood, blood plasma, saliva, tissue samples), as well as increasing the availability of such studies, since the method can be carried out on standard known equipment. In addition, this method provides the ability to conduct research in one test tube, which reduces research costs.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для диагностики гетерозиготной / гомозиготной мутации с.-23+1G>А (rs80338940) гена GJB2, вызывающей потерю слуха, включающего в себя одну пару из прямого и обратного праймеров (yakms1 и yakma1 соответственно) и два аллель-специфичных зонда соответствующие генотипу дикого типа и мутантному (yakmpt1 и yakmpt2 соответственно), а также зонд-гаситель (yakmpt3), гибридизирующийся на матрицу рядом с аллель-специфичными зондами:This result is achieved by using a set of synthetic oligonucleotides for the diagnosis of heterozygous / homozygous c.-23 + 1G> A (rs80338940) mutation of the GJB2 gene, which causes hearing loss, which includes one pair of forward and reverse primers (yakms1 and yakma1, respectively ) and two allele-specific probes corresponding to the wild-type and mutant genotypes (yakmpt1 and yakmpt2, respectively), as well as a quencher probe (yakmpt3) hybridizing to the template next to the allele-specific probes:

где FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду А на 3'-конце пробы, HEX - флуоресцентный краситель HEX, присоединенный к нуклеотиду А на 3'-конце пробы, BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции.where FAM is a FAM fluorescent dye attached to nucleotide A at the 3'-end of the probe, HEX is a fluorescent HEX dye attached to nucleotide A at the 3'-end of the probe, BHQ1 means a dark fluorescence quencher attached to the 5'-terminal nucleotide.

Каждый комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени включает:Each set of reagents for the determination of genetic polymorphisms by the method of polymerase chain reaction in real time includes:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и зонды, специфичные к определенному участку гена GJB2 на каждый вариант определяемого генетического полиморфизма, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (80 мМ Tris-HCl (рН 8.6 при 25°С), 20 мМ (NH₄)₂SO₄, 3 мМ MgCl₂).1) Test tubes with a reaction mixture sealed with paraffin. This mixture includes the indicated primers and probes specific to a certain region of the GJB2 gene for each variant of the determined genetic polymorphism, a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates, a reaction buffer (80 mM Tris-HCl (pH 8.6 at 25 ° C), 20 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 3 mM MgCl ₂ ).

И праймеры, и зонды представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку гена, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Зонды (тоже специфичные к данному участку ДНК) имеют в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Праймеры в реакции выступают в качестве компонентов, обеспечивающих прохождение реакции, а зонды - в качестве компонента, обеспечивающего наблюдение за ходом реакции.Both primers and probes are synthetic oligonucleotides. Primers specific to the marker region of the gene are introduced into the reaction directly for amplification (production) of the product. Probes (also specific to a given DNA region) contain a fluorescent label, the fluorescence intensity of which indicates the amount of the product being formed, which, in turn, depends on the efficiency of the primers, the amount of starting material, and other reaction parameters. The primers in the reaction act as the components that ensure the passage of the reaction, and the probes as the component for monitoring the progress of the reaction.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.2) A solution of the enzyme Taq-polymerase.

3) Минеральное масло.3) Mineral oil.

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.4) Negative control sample - a sample that is introduced into an experiment to control possible contamination of reagents with products of previous reactions. A positive result in this sample indicates the need to replace reagents and rearrange the experiment.

Кроме того, в состав смесей для амплификации, специфичных для каждого генетического полиморфизма, включена система для амплификации фрагмента геномной ДНК человека, которая позволяет контролировать количество ДНК в амплификационной пробирке и исключить ошибки генотипирования. Система для амплификации геномной ДНК человека включает ДНК-зонд, который содержит флуоресцентную метку (Су5) и гаситель флуоресценции.In addition, a system for amplifying a fragment of human genomic DNA is included in the composition of amplification mixtures specific for each genetic polymorphism, which allows you to control the amount of DNA in the amplification tube and eliminate genotyping errors. The system for amplifying human genomic DNA includes a DNA probe that contains a fluorescent label (Cy5) and a fluorescence quencher.

При этом смесь для амплификации специфична для каждого генетического полиморфизма. ПЦР-буфер, Taq-AT-полимераза, минеральное масло - универсальные реагенты для всех комплектов реагентов для определения генетических полиморфизмов.Moreover, the mixture for amplification is specific for each genetic polymorphism. PCR buffer, Taq-AT polymerase, mineral oil - universal reagents for all reagent kits for the determination of genetic polymorphisms.

Аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры для диагностики гетерозиготной / гомозиготной мутации с.-23+1G>А (rs80338940) гена GJB2 в крови и других биологических материалах человека неизвестны.Similar sets, as well as reaction mixtures, primers for the diagnosis of heterozygous / homozygous c.-23 + 1G> A (rs80338940) mutation of the GJB2 gene in blood and other biological materials of a person are unknown.

Осуществление (реализация) изобретения.Implementation (implementation) of the invention.

1) Биологический материал (цельная кровь, слюна) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для ПЦР;1) Biological material (whole blood, saliva) before carrying out PCR using the proposed set of reagents is carried out through the procedure of sample preparation using another set (the set of reagents for sample preparation is not the subject of this patent); during this procedure, DNA is isolated from biological material, which, in turn, is used for PCR;

2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфичные синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;2) The required number of tubes with the prepared reaction mixture containing specific synthetic oligonucleotide primers and probes is marked according to the number of analyzed samples;

3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;3) Taq-polymerase solution is added to all labeled tubes without damaging the paraffin layer;

4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), вносится выделенная согласно п. 1) ДНК;4) In all labeled tubes (except for K- tubes (negative control sample), the DNA extracted according to clause 1) is added;

5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец;5) A negative control sample is introduced into a test tube marked with K-;

6) Все пробирки устанавливаются в блок термоциклера, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим термоциклером автоматически во время амплификации (устройства: детектирующие термоциклеры ДТ-322, ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология»).6) All tubes are installed in the thermal cycler unit, amplification is carried out according to the modes prescribed in the instructions for the kit. The detection of the results is carried out by a detecting thermal cycler automatically during amplification (devices: detecting thermal cyclers DT-322, DT-96 (NPO DNA-Technology LLC).

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.The analysis of the results is carried out in accordance with the instructions for the device.

При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) возрастает пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации.When a specific product is formed, the DNA probe is destroyed, the effect of the quencher on the fluorescent label is terminated, which leads to an increase in the level of fluorescence. The number of destroyed probes (and, consequently, the level of fluorescence) increases in proportion to the number of specific amplicons formed and is measured at each amplification cycle.

Пробирки (приготовленные как описано выше) устанавливали в детектирующий амплификатор ДТ-прайм (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) и проводили реакцию со следующими параметрами циклирования:Tubes (prepared as described above) were installed in a DT-prime detecting amplifier (NPO DNA-Technology LLC, Moscow) and a reaction was performed with the following cycling parameters:

Использованный нами способ генотипирования является вариантом классического метода «примыкающих проб». При определении замен одиночных нуклеотидов вначале проводили ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затем температуру реакционной смеси снижали для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизирующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов метили флуорофором, другой - гасителем флуоресценции. В реакции использовали один общий олигоиуклеотид с гасителем флуоресценции и пару аллель-специфичных (сиквенс-специфичных) олигонуклеотидов, несущих флуорофор. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, метили различными флуорофорами, что позволило определять оба варианта в одной пробирке. Определение генотипа проводили после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц (или наоборот -гибридизации). Данное измерение проводили в режиме реального времени, его результатом являлись кривые плавления. Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в температурах плавления совершенного и несовершенного дуплексов. Таким образом, если анализируемый образец содержал только один вариант последовательности, т.е. был гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, была существенно выше, нежели для пробы, образующей несовершенный дуплекс. Если же анализировали гетерозиготный образец, температуры плавления были практически одинаковы.The method of genotyping used by us is a variant of the classical method of "adjoining samples". When determining substitutions of single nucleotides, first, PCR was performed with primers common to both sequence variants, then the temperature of the reaction mixture was reduced to hybridize the resulting template with oligonucleotide probes. To determine the sequence variant, two types of oligonucleotides hybridizing to a matrix side by side were used. One of the oligonucleotides was labeled with a fluorophore, the other with a fluorescence quencher. One common oligonucleotide with a fluorescence quencher and a pair of allele-specific (sequence-specific) oligonucleotides carrying a fluorophore were used in the reaction. Oligonucleotide probes corresponding to one or another variant of the sequence were labeled with different fluorophores, which made it possible to determine both variants in one test tube. The genotype was determined after PCR and hybridization by measuring the fluorescence level during temperature denaturation of oligonucleotide duplexes and the resulting templates (or vice versa - hybridization). This measurement was performed in real time and resulted in melting curves. The reaction conditions were selected so as to maximize the difference in the melting temperatures of perfect and imperfect duplexes. Thus, if the analyzed sample contained only one variant of the sequence, i.e. was homozygous for this polymorphism, the melting point for the sample forming a perfect duplex was significantly higher than for the sample forming an imperfect duplex. If a heterozygous sample was analyzed, the melting points were practically the same.

На основании экспериментальных данных при сравнении образцов крови методом ПЦР-РВ «в реальном времени» были получены и проанализированы результаты. Детекция и учет результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически. После окончания программы амплификации на экране появится соответствующее информационное сообщение и будет предложено перейти к анализу результатов.On the basis of experimental data when comparing blood samples by the RT-PCR method "in real time", the results were obtained and analyzed. Detection and accounting of results is carried out by the detecting amplifier automatically. After the end of the amplification program, a corresponding information message will appear on the screen and it will be offered to proceed to the analysis of the results.

Для отрицательных контрольных образцов программа фиксирует недостоверный результат. При получении положительного значения (определение генотипа) результаты всей постановочной серии считают недостоверными. В этом случае необходимо проведение мероприятий для устранения возможной контаминации.For negative control samples, the program records an unreliable result. Upon receipt of a positive value (determination of the genotype), the results of the entire production series are considered unreliable. In this case, it is necessary to take measures to eliminate possible contamination.

Температуры плавления продуктов амплификации отражаются на графике в виде температурных баров. Образцы, гомозиготные по полиморфизму, определяемому каналом Fam, будут автоматически покрашены в синий цвет; гомозиготные по каналу Hex - в зеленый; гетерозиготные - в красный; сомнительные и недостоверные - в желтый (см. фиг 1-2). При этом отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю проводят по форме кривых плавления ДНК (по максимуму первой производной графиков флуоресценции); наличие одного пика на графике свидетельствует о гомозиготности образца по аллелю, соответствующему более тугоплавкой флуоресцентно-меченой аллель-специфичной олигонуклеотидной пробе, а наличие двух пиков на графике свидетельствует о гетерозиготности образца.The melting points of the amplification products are plotted as temperature bars. Samples homozygous for the Fam channel polymorphism will automatically be colored blue; homozygous for the Hex channel - in green; heterozygous - red; doubtful and unreliable - in yellow (see Fig. 1-2). In this case, the assignment of a sample to a homozygote or heterozygote for a given allele is carried out in the form of DNA melting curves (according to the maximum of the first derivative of the fluorescence graphs); the presence of one peak on the graph indicates that the sample is homozygous for the allele corresponding to the more refractory fluorescently labeled allele-specific oligonucleotide probe, and the presence of two peaks on the graph indicates the heterozygosity of the sample.

На фиг. 1 представлен пример интерпретации результатов (канал Fam).FIG. 1 shows an example of the interpretation of the results (Fam channel).

На фиг. 2 представлен пример интерпретации результатов (канал Hex).FIG. 2 shows an example of interpretation of results (Hex channel).

Список использованных источниковList of sources used

1. Vos, Т.; Allen, С; Arora, М.; Barber, R.M.; Bhutta, Z.A.; Brown, А.; Carter, A.; Casey, D.C.; Charlson, F.J.; Chen, A.Z.; et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet 2016, 388, 1545-16021. Vos, T .; Allen, C; Arora, M .; Barber, R.M .; Bhutta, Z.A .; Brown, A .; Carter, A .; Casey, D. C .; Charlson, F.J .; Chen, A.Z .; et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet 2016, 388, 1545-1602

2. Morton CC: Genetics, genomics and gene discovery in the auditory system. Hum Mol Genet. 11:1229-1240. 2002.2. Morton CC: Genetics, genomics and gene discovery in the auditory system. Hum Mol Genet. 11: 1229-1240. 2002.

3. Wu, X.; Wang, S.; Chen, S.; Wen, Y.; Liu, В.; Xie, W.; Li, D.; Liu, L.; Huang, X.; Sun, Y.; et al. Autosomal Recessive Congenital Sensorineural Hearing Loss due to a Novel Compound Heterozygous PTPRQ Mutation in a Chinese Family. Neural Plast. 2018, 2018, 9425725.3. Wu, X .; Wang, S .; Chen, S .; Wen, Y .; Liu, B .; Xie, W .; Li, D .; Liu, L .; Huang, X .; Sun, Y .; et al. Autosomal Recessive Congenital Sensorineural Hearing Loss due to a Novel Compound Heterozygous PTPRQ Mutation in a Chinese Family. Neural Plast. 2018, 2018, 9425725.

4. Adhikary, В.; Ghosh, S.; Paul, S.; Bankura, В.; Pattanayak, A.K.; Biswas, S.; Maity, В.; Das, M. Spectrum and frequency of GJB2, GJB6 and SLC26A4 gene mutations among nonsyndromic hearing loss patients in eastern part of India. Gene 2015,573,239-245.4. Adhikary, B .; Ghosh, S .; Paul, S .; Bankura, B .; Pattanayak, A.K .; Biswas, S .; Maity, B .; Das, M. Spectrum and frequency of GJB2, GJB6 and SLC26A4 gene mutations among nonsyndromic hearing loss patients in eastern part of India. Gene 2015,573,239-245.

5. Chan, D.K.; Chang, K.W. GJB2-associated hearing loss: Systematic review of worldwide prevalence, genotype, and auditory phenotype. Laryngoscope 2014, 124,E34-E535. Chan, D.K .; Chang, K.W. GJB2-associated hearing loss: Systematic review of worldwide prevalence, genotype, and auditory phenotype. Laryngoscope 2014, 124, E34-E53

6. Hilgert N, Smith RJ and Campa G: Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics. Mutat Res. 681:189-196. 2009.6. Hilgert N, Smith RJ and Campa G: Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics. Mutat Res. 681: 189-196. 2009.

7. Kenneson A, Van Naarden Braun К and Boyle C: GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review. Genet Med. 4:258-274. 2002.7. Kenneson A, Van Naarden Braun K and Boyle C: GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review. Genet Med. 4: 258-274. 2002.

8. Estivill X, Fortina P, Surrey S, et al: Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet. 351:394-398. 1998.8. Estivill X, Fortina P, Surrey S, et al: Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet. 351: 394-398. 1998.

9. Morell RJ, Kim HJ, Hood LJ, et al: Mutations in the connexin 26 gene (GJB2) among Ashkenazi Jews with nonsyndromic recessive deafness. N Engl J Med. 339:1500-1505. 1998.9. Morell RJ, Kim HJ, Hood LJ, et al: Mutations in the connexin 26 gene (GJB2) among Ashkenazi Jews with nonsyndromic recessive deafness. N Engl J Med. 339: 1500-1505. 1998.

10. Abe S, Usami S, Shinkawa H, Kelley PM and Kimberling WJ: Prevalent connexin 26 gene (GJB2) mutations in Japanese. J Med Genet. 37:41-43. 2000.10. Abe S, Usami S, Shinkawa H, Kelley PM and Kimberling WJ: Prevalent connexin 26 gene (GJB2) mutations in Japanese. J Med Genet. 37: 41-43. 2000.

11. Sobe T, Vreugde S, Shahin H, et al: The prevalence and expression of inherited connexin 26 mutations associated with nonsyndromic hearing loss in the Israeli population. Hum Genet. 106:50-57. 2000.11. Sobe T, Vreugde S, Shahin H, et al: The prevalence and expression of inherited connexin 26 mutations associated with nonsyndromic hearing loss in the Israeli population. Hum Genet. 106: 50-57. 2000.

12. Dai P, Yu F, Han B, et al: GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment. J Transl Med. 7:262009.12. Dai P, Yu F, Han B, et al: GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment. J Transl Med. 7: 262009.

13. Stenson PD, Mort M, Ball EV, Evans K, Hay den M, Heywood S, Hussain M, Phillips AD, Cooper DN. The human gene mutation database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Hum Genet. 2017;136:665-77.13. Stenson PD, Mort M, Ball EV, Evans K, Hay den M, Heywood S, Hussain M, Phillips AD, Cooper DN. The human gene mutation database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Hum Genet. 2017; 136: 665-77.

14. Azadegan-Dehkordi F., Ahmadi R., Koohiyan M., Hashemzadeh-Chaleshtori M. Update of spectrum c.35delG and c.-23+1G>A mutations on the GJB2 gene in individuals with autosomal recessive nonsyndromic hearing loss. Ann Hum Genet. 2019;83(1):1-10. doi: 10.1111/ahg. 12284.14. Azadegan-Dehkordi F., Ahmadi R., Koohiyan M., Hashemzadeh-Chaleshtori M. Update of spectrum c. 35delG and c. -23 + 1G> A mutations on the GJB2 gene in individuals with autosomal recessive nonsyndromic hearing loss. Ann Hum Genet. 2019; 83 (1): 1-10. doi: 10.1111 / ahg. 12284.

15. Denoyelle, F., Marlin, S., Weil, D., Moatti, L., Chauvin, P., Garabedian, E. N., & Petit, C. (1999).Clinical features of the prevalent form of childhood deafness, DFNB1, due to a connexin-26 gene defect: Implications for genetic counselling. Lancet, 353 (9161): 1298-1303.15. Denoyelle, F., Marlin, S., Weil, D., Moatti, L., Chauvin, P., Garabedian, EN, & Petit, C. (1999) Clinical features of the prevalent form of childhood deafness. DFNB1, due to a connexin-26 gene defect: Implications for genetic counseling. Lancet 353 (9161): 1298-1303.

16. A1-Qahtani, M. H., Baghlab, I., Chaudhary, A. G., Abuzenadah, A. M., et al (2010). Spectrum of GJB2 mutations in a cohort of nonsyndromic hearing loss cases from the Kingdom of Saudi Arabia. Genetic Testing and Molecular Biomarkers, 14(1), 79-83.16. A1-Qahtani, M. H., Baghlab, I., Chaudhary, A. G., Abuzenadah, A. M., et al (2010). Spectrum of GJB2 mutations in a cohort of nonsyndromic hearing loss cases from the Kingdom of Saudi Arabia. Genetic Testing and Molecular Biomarkers, 14 (1), 79-83.

17. Najmabadi, H., & Kahrizi, K. (2014). Genetics of non-syndromic hearing loss in the Middle East. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 78 (12), 2026-2036.17. Najmabadi, H., & Kahrizi, K. (2014). Genetics of non-syndromic hearing loss in the Middle East. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 78 (12), 2026-2036.

18. Matos, T.D., Simoes-Teixeira, H., Caria, H., Cascao, R., et al (2011). Assessing noncoding sequence variants of GJB2 for hearing loss association. Genetics Research International, 2011, 827469.18. Matos, T.D., Simoes-Teixeira, H., Caria, H., Cascao, R., et al (2011). Assessing noncoding sequence variants of GJB2 for hearing loss association. Genetics Research International, 2011, 827469.

19. Janecke, A. R., Hirst-Stadlmann, A., Gunther, В., Utermann, В., et al (2002). Progressive hearing loss, and recurrent sudden sensorineural hearing loss associated with GJB2 mutations-Phenotypic spectrum and frequencies of GJB2 mutations in Austria. Human Mutation, 111 (2), 145-153.19. Janecke, A. R., Hirst-Stadlmann, A., Gunther, B., Utermann, B., et al (2002). Progressive hearing loss, and recurrent sudden sensorineural hearing loss associated with GJB2 mutations-Phenotypic spectrum and frequencies of GJB2 mutations in Austria. Human Mutation, 111 (2), 145-153.

20. Angeli, S. I. (2008). Phenotype/genotype correlations in a DFNB1 cohort with ethnical diversity. Laryngoscope, 118 (11), 2014-2023.20. Angeli, S. I. (2008). Phenotype / genotype correlations in a DFNB1 cohort with ethnical diversity. Laryngoscope, 118 (11), 2014-2023.

21. Riahi, Z., Zainine, R., Mellouli, Y., Hannachi, R., Bouyacoub, et al (2013).Compound heterozygosity for dominant and recessive GJB2 mutations in a Tunisian family and association with successful cochlear implant outcome. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 77 (9), 1481-1484.21 Riahi, Z., Zainine, R., Mellouli, Y., Hannachi, R., Bouyacoub, et al (2013) Compound heterozygosity for dominant and recessive GJB2 mutations in a Tunisian family and association with successful cochlear implant outcome. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 77 (9), 1481-1484.

22. Medica, I., Rudolf, G., Balaban, M., & Peterlm, B. (2005). C.35delG/GJB2 and del(GJB6-D13S1830) mutations in Croatians with prelingual non-syndromic hearing impairment. BMC Ear, Nose and Throat Disorders, 5,11.22. Medica, I., Rudolf, G., Balaban, M., & Peterlm, B. (2005). C.35delG / GJB2 and del (GJB6-D13S1830) mutations in Croatians with prelingual non-syndromic hearing impairment. BMC Ear, Nose and Throat Disorders, 5.11.

23. Barashkov, N. A., Pshennikova, V. G., Posukh, O. L., Teryutin, et al (2016). Spectrum and frequency of the GJB2 gene pathogenic variants in a large cohort of patients with hearing impairment living in a subarctic region of Russia (the Sakha Republic). PLoS One, 11(5), e0156300.23. Barashkov, N. A., Pshennikova, V. G., Posukh, O. L., Teryutin, et al (2016). Spectrum and frequency of the GJB2 gene pathogenic variants in a large cohort of patients with hearing impairment living in a subarctic region of Russia (the Sakha Republic). PLoS One, 11 (5), e0156300.

24. Teryutin, F. M., Barashkov, N. A., Kunel'skaya, N. L., Pshennikova, V.G., & Solov'ev, A.V. (2016). The audiological analysis in the patients homozygous for the c.-23+1G>A mutation in the GJB2 gene presenting with the loss of hearing in Yakutiya. Vestn Otorinolaringol, 81 (1), 19-24.24. Teryutin, F. M., Barashkov, N. A., Kunel'skaya, N. L., Pshennikova, V.G., & Solov'ev, A.V. (2016). The audiological analysis in the patients homozygous for the c.-23 + 1G> A mutation in the GJB2 gene presenting with the loss of hearing in Yakutiya. Vestn Otorinolaringol, 81 (1), 19-24.

25. Yuan, Y., Yu, F., Wang, G., Huang, S., Yu, R., et al (2010). Prevalence of the GJB2 IVS1+1G>A mutation in Chinese hearing loss patients with monoallelic pathogenic mutation in the coding region of GJB2. Journal of Translational Medicine, 8, 127.25. Yuan, Y., Yu, F., Wang, G., Huang, S., Yu, R., et al (2010). Prevalence of the GJB2 IVS1 + 1G> A mutation in Chinese hearing loss patients with monoallelic pathogenic mutation in the coding region of GJB2. Journal of Translational Medicine, 8, 127.

26. Seeman, P., & Sakmaryova, I. (2006). High prevalence of the IVS 1+1 G to A/GJB2 mutation among Czech hearing impaired patients with monoallelic mutation in the coding region of GJB2. Clinical Genetics, 69(5), 410-413.26. Seeman, P., & Sakmaryova, I. (2006). High prevalence of the IVS 1 + 1 G to A / GJB2 mutation among Czech hearing impaired patients with monoallelic mutation in the coding region of GJB2. Clinical Genetics, 69 (5), 410-413.

27. Zeinali, S., Davoudi-Dehaghani, E., Azadmehr, S., DabbaghBagheri, et al (2015). GJB2 c.-23+1G>A mutation is second most common mutation among Iranian individuals with autosomal recessive hearing loss. European Archives of Otorhinolaryngology, 272 (9), 2255-2259.27. Zeinali, S., Davoudi-Dehaghani, E., Azadmehr, S., DabbaghBagheri, et al (2015). GJB2 c.-23 + 1G> A mutation is second most common mutation among Iranian individuals with autosomal recessive hearing loss. European Archives of Otorhinolaryngology, 272 (9), 2255-2259.

28. M.V. Zytsar, N.A. Barashkov, M.S. Bady-Khoo, O.A. Shubina-Olejnik et al. Updated carrier rates for c.35delG (GJB2) associated with hearing loss in Russia and common c.35delG haplotypes in Siberia BMC Medical Genetics volume 19, Article number: 138 (2018)28. M.V. Zytsar, N.A. Barashkov, M.S. Bady-Khoo, O.A. Shubina-Olejnik et al. Updated carrier rates for c.35delG (GJB2) associated with hearing loss in Russia and common c.35delG haplotypes in Siberia BMC Medical Genetics volume 19, Article number: 138 (2018)

29. Kelley P.M., Harris D.J., Comer B.C. et al. Novel mutations in the connexin 26 gene (GJB2) that cause autosomal recessive (DFNB1) hearing loss // American Journal of Human Genetics. - 1998. V. 62. P. 792-79929. Kelley P.M., Harris D.J., Comer B.C. et al. Novel mutations in the connexin 26 gene (GJB2) that cause autosomal recessive (DFNB1) hearing loss // American Journal of Human Genetics. - 1998. V. 62. P. 792-799

30. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Protocols Natl. Acad. Sci. - 1989. - V. 86. - P. 2766-277030. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Protocols Natl. Acad. Sci. - 1989. - V. 86. - P. 2766-2770

31. Baris I., Koksal V. et al. Myltiplex deletion of common mutations in the connexin-26 gene, Genetic Testing, 2003, v. 7, №1, pp. 63-6531. Baris I., Koksal V. et al. Myltiplex deletion of common mutations in the connexin-26 gene, Genetic Testing, 2003, v. 7, no. 1, pp. 63-65

Claims

A method for diagnosing the c.-23 + 1G> A (rs80338940) gene GJB2 mutation in a human biomaterial selected from whole blood, saliva, based on real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), characterized in that during PCR- PBs use primers and probes corresponding to the rs80338940 polymorphic region of the GJB2 gene:

where FAM is a FAM fluorescent dye attached to nucleotide A at the 3'-end of the sample, HEX is a fluorescent HEX dye attached to nucleotide A at the 3'-end of the sample, and BHQ1 means a dark fluorescence quencher attached to the 5'-terminal nucleotide, at Based on the obtained graphs of DNA melting curves, a mutation is determined, while in the presence of one peak on the graph, homozygous carriage is diagnosed, and in the presence of two peaks, heterozygous carriage is diagnosed.