RU2731646C1 - Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита - Google Patents

Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита Download PDF

Info

Publication number
RU2731646C1
RU2731646C1 RU2019127385A RU2019127385A RU2731646C1 RU 2731646 C1 RU2731646 C1 RU 2731646C1 RU 2019127385 A RU2019127385 A RU 2019127385A RU 2019127385 A RU2019127385 A RU 2019127385A RU 2731646 C1 RU2731646 C1 RU 2731646C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
electrode
enzyme molecule
conjugate
enzyme
nanoparticle
Prior art date
Application number
RU2019127385A
Other languages
English (en)
Inventor
Ангелика ФЮРСТ
Даниэль КАММЕРЕР
Райнхольд МИШЛЕР
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Application granted granted Critical
Publication of RU2731646C1 publication Critical patent/RU2731646C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен электрод для электрохимического сенсора, электрохимический сенсор для измерения концентрации аналита, способ изготовления электрода и способ измерения аналита в среде. Электрод содержит проводящую поверхность и конъюгат. Конъюгат включает обеспечивающую образование и/или расходование НОферментную молекулу и металлическую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом. Причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода. Сенсор содержит указанный выше электрод. Способ изготовления электрода включает модификацию обеспечивающей образование и/или расходование HOферментной молекулы, функционализирующим реагентом, получение конъюгата из ферментной молекулы и металлической наночастицы и ковалентное связывание конъюгата с проводящей поверхностью электрода. Способ измерения аналита включает применение указанных выше или электрохимического сенсора. Изобретения обеспечивают эффективный ферментный электрод, процесс изготовления которого является простым и воспроизводимым. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 пр., 4 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к ферментному электроду, содержащему проводящую поверхность, с которой ковалентно связан конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу. Такой электрод пригоден для непрерывного контроля аналита, в частности для непрерывного мониторирования гликемии (НМГ), т.е. мониторного наблюдения за концентрацией глюкозы, с использованием в качестве ферментной молекулы глюкозооксидазы (GOD). Кроме того, изобретение относится к содержащему такой ферментный электрод электрохимическому сенсору для измерения концентрации аналита, например глюкозы, в условиях in vivo.
Применение нежидкостных сенсоров с имплантируемыми или вводимыми в тело электродами облегчает измерение физиологически значимых аналитов, таких, например, как лактат или глюкоза, в организме пациента. Во многих случаях электроды нежидкостных сенсоров покрывают электрически проводящими слоями, с которыми связаны ферментные молекулы. Ферментные молекулы могут катализировать окислительно-восстановительную реакцию, порождая тем регистрируемый электрическими средствами сигнал. Такого рода сенсор называют ферментным нежидкостным (ENF - сокр. от англ. "enzymatic non-fluidic") сенсором.
Сенсор для измерения глюкозы может содержать, например, фермент глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4), катализирующий превращение глюкозы как определяемого аналита в глюконолактон. В отсутствие синтетического окислительно-восстановительного медиатора косубстрат кислород О2 превращается на поверхности сенсора в перекись водорода Н2О2. Образовавшаяся Н2О2 может каталитически разлагаться до Н2О с выработкой электрического тока, соотносящегося с концентрацией глюкозы.
Известным сенсорам часто свойственны недостатки, состоящие в том, что места образования Н2О2 на каталитическом участке фермента и ее разложения на поверхности электрода разнесены в пространстве. Таким образом, превращение Н2О2 на рабочем электроде является неэффективным, т.е. степень такого превращения недостаточна. Кроме того, длительное присутствие Н2О2 в ферментном слое может инактивировать ферментные молекулы.
В публикации US 6284126 В1 раскрыт сенсор, содержащий капсулированные гидрогелем ферментные молекулы, нанесенные на поверхность электрода. Однако капсулированным гидрогелем ферментам свойственен еще один недостаток, заключающийся в том, что в контакте с водными средами гель набухает. Как следствие, на протяжении всего времени набухания могут происходить изменения амперометрического измерительного сигнала, приводящие к дрейфу сенсора.
В сенсорах других типов ферментный слой дополнительно содержит синтетический окислительно-восстановительный медиатор. Во избежание дрейфа сенсора окислительно-восстановительный медиатор и фермент приходится ковалентно включать в полимерную структуру. Однако это приводит к неэффективности переноса электронов от фермента к медиатору, поскольку мобильность таких соединений ограничена ввиду их включения в полимерную структуру. Следовательно, образование перекиси водорода на ферменте конкурирует с переносом электронов к медиатору, что приводит к кислородной зависимости. Кроме того, процессы набухания полимерных структур могут создавать возмущение.
Еще один известный сенсор, описанный, например, в публикации ЕР 2348964 В1, содержит электрод, покрытый ферментным слоем, представляющим собой проводящую пасту, содержащую полимерное связующее вещество, частицы углерода, ферментные молекулы и каталитический окислительно-восстановительный медиатор, и нанесенную на поверхность электрода. Однако недостатком такого сенсора является задержка во времени, необходимая для достижения стабильного рабочего состояния, поскольку такого рода ферментный слой должен быть полностью смочен и поляризован. Кроме того, ферментный слой на основе пасты непрочен, и потому его нельзя наносить на поверхности электрода большой площади, особенно если тело сенсора имеет искривленную форму.
В публикации WO 2009/153777 раскрыт электрод, содержащий проводящую поверхность и связанный с ней матрикс, причем матрикс содержит по меньшей мере два вида соединений, а именно по меньшей мере один вид, включающий ферменты, и по меньшей мере один вид, включающий наночастицы металла, причем соединения ковалентно связаны друг с другом через первые связующие группы, а матрикс ковалентно связан с поверхностью через одну или несколько одинаковых или разных вторых связующих функциональных групп (частей молекулы). Матрикс может быть связан с поверхностью за счет образования на проводящей поверхности слоя реактивного (реакционноспособного) соединения и контактирования покрытой таким слоем проводящей поверхности с наночастицами и ферментными молекулами, и те и другие из которых содержат реактивные группы, и последующей электрополимеризации соединений в слое, вызывающей связывание реактивных групп друг с другом с образованием матрикса.
Эта раскрытая в публикации WO 2009/153777 структура электрода имеет определенные недостатки, заключающиеся в том, что ее изготовление с применением электрополимеризации является сложным, поскольку требует проведения нескольких стадий, включающих химическую модификацию металлических наночастиц. Из-за своей сложности этот процесс является труд невоспроизводимым.
Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в том, чтобы предложить эффективный ферментный электрод, процесс изготовления которого является простым и воспроизводимым. Эта цель достигается за счет применения композиции ферментных молекул, ковалентно связанных с наночастицами и поверхностью электрода, но при этом металлические наночастицы не связаны ковалентно с поверхностью электрода.
Первым объектом настоящего изобретения является электрод, содержащий проводящую поверхность и конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом, причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через по меньшей мере одну ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода.
Предлагаемый в изобретении электрод покрыт конъюгатом, включающим по меньшей мере одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу. В предпочтительном случае такой конъюгат содержит одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу.
Как правило, ферментная молекула представляет собой оксидоредуктазу, т.е. ферментную молекулу, катализирующую окислительно-восстановительную реакцию. В частности, фермент катализирует окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой образуется и/или расходуется перекись водорода Н2О2. Преимущественно фермент катализирует реакцию, в ходе которой образуется Н2О2, например из О2 как косубстрата. Конкретными примерами таких ферментов являются глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4), гексозооксидаза (КФ 1.1.3.5), холестериноксидаза (КФ 1.1.3.6), галактозооксидаза (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидаза (КФ 1.1.3.13), оксидаза (S)-2 гидроксикислоты (КФ 1.1.3.15), L-глутаматоксидаза (КФ 1.4.3.11)), или L-аспартатоксидаза (КФ 1.4.3.16). В особенно предпочтительном случае ферментной молекулой является глюкозооксидаза, например глюкозооксидаза, полученная из грибов, относящихся к родам Aspergillus или Penicillum.
В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одна ферментная молекула конъюгата ковалентно связана как с проводящей поверхностью электрода, так и с по меньшей мере одной проводящей наночастицей. Ковалентная связь с поверхностью и с наночастицей может быть реализована посредством одинаковых или разных функциональных групп. В некоторых вариантах осуществления изобретения такая связь реализована посредством одинаковых функциональных групп. Например, такая связь может быть реализована через серосодержащие функциональные группы, в частности через сульфидные или дисульфидные группы, которые могут образовывать ковалентные связи с проводящей поверхностью электрода и с наночастицей.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ферментная молекула содержит два или более аминокислотных остатка с серосодержащей боковой цепью, способной непосредственно связываться с поверхностью электрода и/или наночастицей, например цистеиновый остаток, содержащий сульфидную (SH) группу, или цистеиновый мостик, содержащий дисульфидную группу (-S-S-). В других, обычно более предпочтительных, вариантах осуществления изобретения ферментная молекула модифицирована путем включения в нее одной или нескольких серосодержащих функциональных групп, в частности сульфидных или дисульфидных групп. Такая модификация может предусматривать функционализацию первичных аминогрупп на ферментной молекуле, например амино-конца и/или аминогрупп боковой цепи аминокислотных остатков внутри ферментной молекулы, например аминогрупп боковой цепи лизиновых и/или аргининовых остатков, в частности аминокислотных групп боковой цепи лизиновых остатков. В других вариантах осуществления изобретения модификация может предусматривать функционализацию карбоксильного конца и/или карбоксильных групп боковой цепи аспартатного и/или глутаматного остатков.
Модификация ферментной молекулы может выполняться путем использования функционализирующего реагента, содержащего группу, способную модифицировать полипептид, например аминореактивную группу или карбоксиреактивную группу. Кроме того, функционализирующий реагент содержит функциональную группу, например серосодержащую функциональную группу, или группу, к которой может быть прикреплена функциональная группа, например серосодержащая функциональная группа. Предпочтительно используется реагент, содержащий аминореактивную группу, выбранную, например, из сложного эфира N-гидроксисукцинимида, изоцианата, изотиоцианата и серосодержащей функциональной группы, например сульфидной или дисульфидной группы. Функциональная группа может быть непосредственно присоединена к аминореактивной группе или может быть присоединена к аминореактивной группе посредством спейсера, который может иметь длину цепи от 1 до 5, например от 1 до 3 атомов. Особенно предпочтительным аминореактивным реагентом, содержащим серосодержащую функциональную группу, является ди-N-гидроксисукцинимидовый сложный эфир 3,3'-дитиодипропионовой кислоты (DSP), также известный как реагент Ломанта.
Введение функциональных групп может предусматривать реакцию ферментной молекулы с функционализирующим реагентом в условиях, в которых функционализируются поверхностно-экспонированные боковые цепи ферментной молекулы. Регулируя молярное отношение ферментной молекулы к функционализирующему реагенту, можно регулировать степень функционализации ферментной молекулы. Как правило, молярное отношение ферментной молекулы к функционализирующему реагенту составляет примерно 1:1 или выше, например примерно от 1:1 примерно до 1:10, примерно от 1:1 примерно до 1:2, примерно от 1:2 примерно до 1:5 или примерно от 1:5 примерно до 1:10.
Конъюгат, используемый для покрытия электрода, также содержит по меньшей мере одну проводящую наночастицу, т.е. наночастицу, имеющую проводящую поверхность или состоящую из проводящего материала. Наночастица может быть металлической наночастицей, например частицей платины, палладия, иридия, золота, серебра или любого их сплава. В частности, наночастица способна каталитически разлагать Н2О2, как, например, платиновая или палладиевая наночастица. Как правило, наночастицы могут иметь средний размер 100 нм или менее, например средний размер от 1 до 50 нм или от 5 до 15 нм, при измерении методом динамического рассеяния света.
Конъюгат ферментных молекул и наночастиц можно получать, обеспечивая ферментную молекулу, имеющую по меньшей мере одну функциональную группу, например серосодержащую функциональную группу, в частности сульфидную и/или дисульфидную группу, и вводя ферментную молекулу в реакцию с наночастицей в условиях, в которых между ферментной молекулой и наночастицей может образоваться ковалентная связь. Собственно наночастицы не содержат функциональных групп, способных к образованию ковалентной связи с поверхностью электрода. Соответствующие количества реагентов можно регулировать за счет того, что конъюгаты содержат ферментные молекулы и наночастицы при молярном отношении ферментных молекул к наночастицам, составляющем примерно от 1:1 примерно до 1:3, в частности примерно от 1:1 примерно до 1:2.
Конъюгат, образовавшийся в результате такой реакции, содержит по меньшей мере одну ферментную молекулу, конъюгированную с по меньшей мере одной наночастицей, причем на ферментной молекуле в конъюгате присутствует по меньшей мере одна свободная функциональная группа. Средний размер конъюгата может составлять примерно от 10 нм примерно до 300 нм, например, примерно от 50 нм примерно до 100 нм, при измерении размера методом динамического рассеяния света.
В соответствии с настоящим изобретением описанный выше конъюгат наносят на проводящую поверхность электрода, при этом свободная функциональная группа на ферментной молекуле конъюгата образует ковалентную связь с поверхностью электрода.
Проводящая поверхность электрода может быть металлической поверхностью, такой, например, как поверхность из золота, платины, палладия, иридия, серебра или их сплава. Проводящая поверхность также может быть металлооксидной поверхностью, например поверхностью из оксида индия и олова, или графитовой поверхностью. В частности, такая поверхность представляет собой золотую поверхность.
Конъюгат образует на поверхности электрода ферментный слой. Для практических применений этот ферментный слой может быть покрыт дополнительным полимерным слоем, обладающим сопротивлением диффузии измеряемого аналита и поэтому действующим в качестве диффузионного барьера. Диффузионный барьер может содержать, например, блок-сополимеры с чередующимися гидрофильными и гидрофобными блоками, как это описано в публикации ЕР 2697388 В1. Диффузионный барьер может непрерывно простираться по существу по всей площади проводящей поверхности электрода. На диффузионном барьере может быть расположена дополнительная биосовместимая мембрана в качестве спейсера, устанавливающего минимальное расстояние между ферментным слоем на электроде и клетками окружающей ткани организма. Это мероприятие выгодно тем, что создает резервуар, из которого молекулы аналита могут достигать соответствующего ферментного слоя в случае кратковременного возмущения или изменения жидкости в окрестностях ферментного слоя. Предпочтительные спейсеры, изготовленные из сополимеров (мет)акрилатов, описаны в публикации ЕР 2697388 В1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат может дополнительно содержать другие компоненты, например синтетический окислительно-восстановительный медиатор. В других, обычно более предпочтительных, вариантах осуществления изобретения конъюгат не содержит синтетического окислительно-восстановительного медиатора. Кроме того, в других, обычно предпочтительных вариантах осуществления изобретения конъюгат состоит главным образом или полностью из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы, в частности одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы, например одной или двух наночастиц.
Кроме того, настоящее изобретение относится к электрохимическому сенсору для измерения концентрации аналита, содержащему по меньшей мере один электрод, описанный выше.
Предлагаемый в изобретении сенсор пригоден для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, например в ткани, коже или физиологической (биологической) жидкости. Сенсор пригоден, в частности, для внутрикожного или подкожного измерения.
Аналитом может быть любого рода соединение, содержание которого в организме, например в ткани и/или физиологической жидкости, поддается измерению. К примерам аналитов можно отнести эндогенные аналиты, т.е. вырабатываемые в организме соединения, или экзогенные аналиты, например введенные в организм аналиты. Например, аналиты могут выбираться из сахаридов, кислот, в том числе жирных кислот и аминокислот, пептидов, белков, солей и газов. Интерес представляют глюкоза, мочевина, глицерин, лактат, пируват, кислород, диоксид углерода, катионы натрия и хлорид-ионы. Особый интерес представляют аналиты, способные окисляться или восстанавливаться с образованием Н2О2, такие как глюкоза, лактат, холестерин, гексоза, галактоза или спирт.
Предлагаемый в изобретении сенсор пригоден для краткосрочного или долгосрочного измерения. Такой сенсор особенно подходит для многократного, например непрерывного, контроля концентрации одного или нескольких аналитов в течение более длительного периода времени, составляющего от 3 до 12 месяцев, или в течение более короткого периода времени, составляющего от 3 до 14 суток.
Предлагаемый в изобретении сенсор представляет собой электрохимический сенсор, содержащий по меньшей мере один электрод и соответствующие электрические схемы. Такой сенсор предпочтительно представляет собой амперометрический электрохимический сенсор, содержащий по меньшей мере один рабочий (индикаторный) электрод, имеющий проводящую поверхность, с которой ковалентно связан конъюгат, описанный выше. Как правило, такой сенсор содержит по меньшей мере еще один электрод, в частности противоэлектрод и/или электрод сравнения (опорный электрод). Рабочий электрод чувствителен к измеряемому аналиту при напряжении поляризации, которое прикладывается между рабочим электродом и электродом сравнения и регулируется потенциостатом. Измерительный сигнал можно получать в виде электрического тока между противоэлектродом и рабочим электродом. В некоторых вариантах осуществления изобретения отдельный противоэлектрод отсутствует, а присутствует псевдоэлектрод сравнения, действующий также в качестве противоэлектрода. Таким образом, сенсор аналита обычно содержит набор из по меньшей мере двух, предпочтительно - из трех, электродов. В частном варианте осуществления изобретения ферментная молекула связана с проводящей поверхностью только рабочего электрода.
В еще одном частном варианте осуществления изобретения ферментной молекулой является глюкозооксидаза, например глюкозооксидаза, химически модифицированная, как описано выше, а аналитом является глюкоза. В этом варианте осуществления изобретения предложен электрохимический сенсор для измерения концентрации глюкозы. Преимущественно речь идет о сенсоре для непрерывного измерения концентрации глюкозы.
Еще одним объектом изобретения является способ изготовления описанного выше электрода, включающий:
а) получение конъюгата из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы в условиях, при которых ферментная молекула в конъюгате имеет свободные функциональные группы для ковалентного связывания с проводящей поверхностью электрода, а наночастица в конъюгате не имеет свободных функциональных групп для ковалентного связывания с проводящей поверхностью, и
б) ковалентное связывание указанного конъюгата с проводящей поверхностью электрода, причем связывание происходит исключительно через свободные функциональные группы на ферментной молекуле.
Еще одним объектом изобретения является способ измерения аналита, например глюкозы, в среде, например в условиях in vivo, в частности в ткани и/или в физиологической жидкости субъекта, в частности человека, включающий применение электрода или электрохимического сенсора, описанных выше. В качестве альтернативы предлагаемый в изобретении способ также включает измерение аналита в условиях in vitro, например в полученной у субъекта, в частности человека, пробе физиологической жидкости.
Далее настоящее изобретение описывается в контексте следующих чертежей и примеров.
На фиг. 1 показан рассматриваемый в качестве примера вариант выполнения предлагаемого в изобретении рабочего электрода.
На фиг. 2 показаны результаты исследования реакционных смесей глюкозооксидазы (GOD) и реагента Ломанта (DSP) при различных молярных отношениях методом электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях.
На фиг. 3 показано распределение по размерам для различных конъюгатов глюкозооксидазы и платиновых наночастиц, измеренное методом динамического рассеяния света.
На фиг. 4 показаны результаты трех различных измерений на рабочем электроде, с которым связан конъюгат глюкозооксидазы и платиновой наночастицы, причем на диаграмме (А) показан ток во время цикла измерения при трех напряжениях (0,20 В - 0,35 В - 0,20 В), а на диаграмме (В) показан средний ток при трех напряжениях во время цикла измерения.
На фиг. 1 показан рассматриваемый в качестве примера вариант выполнения рабочего электрода для измерения глюкозы. С поверхностью электрода, например с золотой (Аu) поверхностью электрода, ковалентно связана через серосодержащую функциональную группу ферментная молекула. Кроме того, через другую серосодержащую функциональную группу ферментная молекула ковалентно связана по меньшей мере с одной наночастицей, например платиновой (Pt) наночастицей.
Ферментной молекулой является глюкозооксидаза, модифицированная на поверхностно-экспонированной аминогруппе боковой цепи реагентом Ломанта с образованием серосодержащих функциональных групп. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы до глюконолактона с образованием Н2О2. На наночастице происходит каталитическое разложение Н2О2 до Н2О, в результате чего возникает поток электронов (е-). Таким образом вырабатывается электрический ток, сила которого соотносится с концентрацией глюкозы.
В предлагаемом в изобретении электроде используется естественно существующая медиаторная система О2/Н2О2. Синтетический окислительно-восстановительный медиатор отсутствует. В присутствии каталитической наночастицы образовавшаяся Н2О2 эффективно разлагается до Н2O.
Благодаря ковалентной связи каталитических наночастиц и ферментных молекул с рабочим электродом удается избежать потери молекул из ферментного слоя. Кроме того, благодаря присутствию проводящей металлической наночастицы отсутствует переходное сопротивление между ферментным слоем и электрическим проводником рабочего электрода.
Таким образом, предлагаемый в изобретении электрод и содержащий его сенсор предоставляют простую и эффективную конструкцию, которую можно легко получить путем нанесения конъюгата наночастиц и функционализированного фермента на проводящую поверхность электрода.
Пример 1: Связывание платиновых наночастиц с глюкозооксидазой
Глюкозооксидаза (GOD) из черного аспергилла (Aspergillus niger) имеет три цистеиновых остатка. Цистеиновый остаток 164 образует цистеиновый мостик с цистеиновым остатком 206, а третий цистеиновый остаток 521 не экспонирован на поверхности. Таким образом, глюкозооксидаза была биохимически модифицирована функциональным сульфидом, а именно реагентом Ломанта (ди-N-гидроксисукцинимидовый сложный эфир 3,3'-дитиодипропионовой кислоты, сокращенно - DSP) производства компании Sigma Aldrich. N-гидроксисукцинимидовая эфирная группа реагирует с поверхностно-экспонированными лизиновыми боковыми цепями глюкозооксидазы, тем самым вводя в ферментную молекулу серосодержащие группы.
Было получено несколько образцов модифицированной сульфидом глюкозооксидазы с различными молярными отношениями глюкозооксидазы к реагенту Ломанта, для чего соответствующие композиции при молярных отношениях глюкозооксидазы к DSP, составляющих 1:1, 1:10, 1:100 и 1:200, выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. Продукты реакции проанализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях, получив показанные на фиг. 2 результаты.
Поперечную сшивку молекул глюкозооксидазы наблюдали уже при молярном отношении GOD к DSP, составлявшем 1:1. При молярном отношении 1:200 были сшиты почти все молекулы глюкозооксидазы, и образовались агрегаты с высокой молекулярной массой. Для контроля использовали глюкозооксидазу без ее модификации посредством DSP (на фиг. 2 - GOD).
Ко всем представленным на фиг. 2 образцам добавили 1 мл дисперсии платиновых наночастиц (0,5 мг/мл; размер частиц <15 нм) и выдержали в течение 12 часов, оставив на ночь при комнатной температуре, по методике из Cao et al. (Biosens. Bioelectron. 26(2010), 87-91) для получения ковалентной связи частиц с модифицированной сульфидными группами глюкозооксидазой.
На следующий день образцы измерили методом динамического рассеяния света (DLS) для определения размера поперечно-сшитых частиц. Результаты показаны на фиг. 3.
В образце A3 (молярное отношение GOD:DSP=1:100) и образце А4 (молярное отношение GOD:DSP=1:200) агрегаты обнаруживались визуально. Эти крупные частицы имеют размер, превышающий предел измерений устройства DLS, равный 10 мкм, и представлены как отсеченный пик.
Контрольный образец А5 (немодифицированная GOD) демонстрирует два дискретных пика. Образцы А1 (молярное отношение GOD:DSP=1:1) и А2 (молярное отношение GOD:DSP=1:10) имеют увеличенный размер частиц по сравнению с контрольным образцом А5, что свидетельствует о получении конъюгатов молекул GOD и наночастиц Pt.
Пример 2: Снабжение электрода покрытием
В качестве основы для рабочего электрода использовали золотую стружку QFX301 (LOT Darmstadt). Для последующего измерения использовали сенсор, выполненный по трехэлектродной схеме с рабочим электродом, электродом сравнения и противоэлектродом (золотая пленка Melinex).
На золотую стружку рабочего электрода нанесли пипеткой 80 мкл реакционной смеси образца А2 из Примера 1 и выдержали в течение 10 минут при комнатной температуре для получения ковалентной связи свободных сульфидных групп на конъюгатах с золотой поверхностью. После выдерживания несвязавшийся материал удалили несколькими окунаниями в фосфатный буферный раствор (PBS).
Пример 3: Измерение глюкозы
Сенсор по Примеру 2 испытали на потенциостате Gamry (С3 Analysentechnik
Figure 00000001
). Для этого при трех уровнях напряжения (200 мВ, 350 мВ, 200 мВ) выполнили хроноамперометрические измерения, при которых возникающий в результате ток каждый раз измеряли в течение 10 минут. Измерения проводили в фосфатном буферном растворе (PBS) в качестве контрольного измерения и в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л (mМ). Результаты показаны на фиг. 4.
При заданном напряжении 0,20 В значительного различия между полученными в указанных растворах сигналами обнаружено не было. При напряжении 0,35 В в обоих растворах обнаруживалось увеличение тока, причем в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л ток был значительно более высоким по сравнению с током в фосфатном буферном растворе (см. диаграмму А на фиг. 4). Этот результат демонстрирует, что снабженный покрытием рабочий электрод обладает чувствительностью к глюкозе. Средний электрический ток в течение последних пяти минут измерения при трех уровнях напряжения (0,20 В, 0,35 В, 0,20 В) цикла измерения показан на фиг. 4 на диаграмме В. Отчетливо видно значительное различие измерительных сигналов, полученных в фосфатном буферном растворе (PBS) и в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л при напряжении 0,35 В. Заметный дрейф сенсора наблюдался только в первые минуты измерения при данном напряжении, что свидетельствует о том, что сенсор имеет малое время калибровки.

Claims (18)

1. Электрод для электрохимического сенсора, предназначенного для измерения концентрации аналита, содержащий проводящую поверхность и конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу, обеспечивающую образование и/или расходование Н2О2, и по меньшей мере одну металлическую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом, причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через по меньшей мере одну ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода.
2. Электрод по п.1, в котором ферментная молекула является глюкозооксидазой (КФ 1.1.3.4), гексозооксидазой (КФ 1.1.3.5), оксидазой (S)-2 гидроксикислоты (КФ 1.1.3.15), холестериноксидазой (КФ 1.1.3.6), галактозооксидазой (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидазой (КФ 1.1.3.13), L-глутаматоксидазой (КФ 1.4.3.11) или L-аспартатоксидазой (КФ 1.4.3.16), преимущественно глюкозооксидазой.
3. Электрод по п.1 или 2, в котором ковалентная связь ферментной молекулы с поверхностью электрода реализована через серосодержащую функциональную группу, в частности через сульфидную или дисульфидную группу, и/или ковалентная связь ферментной молекулы с наночастицей реализована через серосодержащую функциональную группу, в частности через сульфидную или дисульфидную группу.
4. Электрод по одному из пп. 1-3, в котором ферментная молекула модифицирована с включением в нее по меньшей мере одной функциональной группы для ковалентной связи с поверхностью электрода и наночастицей, в частности, ферментная молекула модифицирована на амино-конце и/или на аминогруппе боковой цепи.
5. Электрод по п. 4, в котором ферментная молекула модифицирована путем проведения реакции фермента с функционализирующим реагентом, например, при молярном отношении фермента к функционализирующему реагенту, составляющем от 1:1 до 1:10.
6. Электрод по одному из пп. 1-5, в котором наночастицы представляют собой платиновые, палладиевые, иридиевые, золотые и/или серебряные наночастицы, преимущественно платиновые наночастицы.
7. Электрод по одному из пп. 1-6, в котором наночастицы имеют средний размер от 1 нм до 100 нм, в частности от 5 нм до 15 нм.
8. Электрод по одному из пп. 1-7, в котором конъюгат имеет средний размер от 10 нм до 300 нм.
9. Электрод по одному из пп. 1-8, в котором конъюгат не содержит окислительно-восстановительного медиатора.
10. Электрод по одному из пп. 1-9, в котором поверхность электрода представляет собой металлическую поверхность, в частности золотую поверхность.
11. Электрохимический сенсор для измерения концентрации аналита, содержащий по меньшей мере один электрод по одному из пп. 1-10.
12. Сенсор по п. 11, в котором ферментной молекулой является глюкозооксидаза, в частности функционализированная глюкозооксидаза, а аналитом является глюкоза.
13. Сенсор по п. 11 или 12, предназначенный для применения in vivo или in vitro.
14. Способ изготовления электрода по одному из пп. 1-10, включающий:
а) модификацию по меньшей мере одной ферментной молекулы, обеспечивающей образование и/или расходование H2O2, функционализирующим реагентом, содержащим серосодержащую функциональную группу или группу, к которой может быть прикреплена функциональная группа,
б) получение конъюгата из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной металлической наночастицы в условиях, при которых только ферментная молекула, но не наночастица в конъюгате имеет свободные функциональные группы для ковалентного связывания с проводящей поверхностью наночастицы в конъюгате, и
в) ковалентное связывание указанного конъюгата с проводящей поверхностью электрода, причем связывание происходит исключительно через свободные функциональные группы на ферментной молекуле.
15. Способ измерения аналита в среде, в частности в ткани и/или физиологической жидкости, включающий применение электрода по одному из пп. 1-10 или электрохимического сенсора по одному из пп. 11-13.
RU2019127385A 2017-02-17 2018-02-16 Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита RU2731646C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17156652.4 2017-02-17
EP17156652.4A EP3363910B1 (en) 2017-02-17 2017-02-17 Continuous analyte monitoring electrode with crosslinked enzyme
PCT/EP2018/053917 WO2018149981A1 (en) 2017-02-17 2018-02-16 Continuous analyte monitoring electrode with crosslinked enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2731646C1 true RU2731646C1 (ru) 2020-09-07

Family

ID=58098490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127385A RU2731646C1 (ru) 2017-02-17 2018-02-16 Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11535881B2 (ru)
EP (1) EP3363910B1 (ru)
JP (1) JP6801119B2 (ru)
CN (1) CN109804076A (ru)
CA (1) CA3035410C (ru)
ES (1) ES2969074T3 (ru)
RU (1) RU2731646C1 (ru)
WO (1) WO2018149981A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020202825A (ja) * 2019-06-12 2020-12-24 王子ホールディングス株式会社 酵素固定化体及びそれを備えた測定装置ならびにアスパラギン及びｌ−アスパラギン酸の測定方法
US11918355B2 (en) * 2019-08-30 2024-03-05 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte sensors and sensing methods for the detection of alcohol

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009153777A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd Electrode, method and system for determining an analyte in a liquid medium
RU117011U1 (ru) * 2011-12-22 2012-06-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) Устройство для определения содержания глюкозы на основе глюкозооксидазы penicillium adametzii и кислородного электрода типа кларка
RU2489089C2 (ru) * 2009-03-16 2013-08-10 АРКРЭЙ, Инк. Способ непрерывного измерения концентрации субстрата

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS646856A (en) * 1987-06-30 1989-01-11 Toshiba Corp Enzyme immobilized electrode and its production
IL116921A (en) 1996-01-26 2000-11-21 Yissum Res Dev Co Electrochemical system for determination of an analyte in a liquid medium
US6139718A (en) 1997-03-25 2000-10-31 Cygnus, Inc. Electrode with improved signal to noise ratio
JP3158181B2 (ja) 1999-03-15 2001-04-23 北陸先端科学技術大学院大学長 バイオセンサー及び生体材料の固定化方法
JP3443768B2 (ja) 1999-06-21 2003-09-08 タニカ電器販売株式会社 酒燗器
JP2006225744A (ja) 2005-02-21 2006-08-31 Hitachi Maxell Ltd 機能性粒子及びその製造方法
WO2006132294A1 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Canon Kabushiki Kaisha Structure, porous body, sensor, process of structure and detecting method for specimen
JP4696723B2 (ja) 2005-06-28 2011-06-08 ソニー株式会社 バイオセンサー
JP2008007719A (ja) 2006-06-30 2008-01-17 Toyobo Co Ltd ポリエステル樹脂水分散体及びこれを用いた接着剤、コーティング剤、塗料
US8784624B2 (en) * 2006-07-12 2014-07-22 Arkray, Inc. Enzyme electrode
EP2017350A1 (de) 2007-07-19 2009-01-21 F. Hoffmann-La Roche AG Elektrochemischer Sensor mit kovalent gebundenem Enzym
EP2195446A4 (en) 2007-09-17 2011-06-22 Red Ivory Llc Self-activating signal-producing detection devices and methods
EP2163190A1 (de) 2008-09-11 2010-03-17 Roche Diagnostics GmbH Elektrodensystem für Messung einer Analytkonzentration in-vivo
EP2697388B1 (en) 2011-03-28 2015-05-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Improved diffusion layer for an enzymatic in-vivo sensor

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009153777A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd Electrode, method and system for determining an analyte in a liquid medium
RU2489089C2 (ru) * 2009-03-16 2013-08-10 АРКРЭЙ, Инк. Способ непрерывного измерения концентрации субстрата
RU117011U1 (ru) * 2011-12-22 2012-06-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) Устройство для определения содержания глюкозы на основе глюкозооксидазы penicillium adametzii и кислородного электрода типа кларка

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHARATHI S., NOGAMI M., A glucose biosensor based on electrodeposited biocomposites of gold nanoparticles and glucose oxidase enzyme // Analyst, 2001, 126, 1919-1922. *
BHARATHI S., NOGAMI M., A glucose biosensor based on electrodeposited biocomposites of gold nanoparticles and glucose oxidase enzyme // Analyst, 2001, 126, 1919-1922. ZHONG H. et al, In situ chemo-synthesized multi-wall carbon nanotube-conductive polyanilinenanocomposites: Characterization and application for a glucose amperometricbiosensor // Talanta, 85, 2011, p.104-111. *
ZHONG H. et al, In situ chemo-synthesized multi-wall carbon nanotube-conductive polyanilinenanocomposites: Characterization and application for a glucose amperometricbiosensor // Talanta, 85, 2011, p.104-111 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3363910B1 (en) 2023-12-06
WO2018149981A1 (en) 2018-08-23
CA3035410C (en) 2023-02-28
EP3363910C0 (en) 2023-12-06
ES2969074T3 (es) 2024-05-16
EP3363910A1 (en) 2018-08-22
CN109804076A (zh) 2019-05-24
JP2020507773A (ja) 2020-03-12
CA3035410A1 (en) 2018-08-23
JP6801119B2 (ja) 2020-12-16
US20190382819A1 (en) 2019-12-19
US11535881B2 (en) 2022-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ansari et al. Electrochemical cholesterol sensor based on tin oxide‐chitosan nanobiocomposite film
Zhang et al. Covalent attachment of glucose oxidase to an Au electrode modified with gold nanoparticles for use as glucose biosensor
Sulak et al. Amperometric glucose biosensor based on gold-deposited polyvinylferrocene film on Pt electrode
Comba et al. Mucin and carbon nanotube-based biosensor for detection of glucose in human plasma
Zhou et al. Glucose biosensor based on platinum microparticles dispersed in nano-fibrous polyaniline
US11078513B2 (en) Enzyme stabilization in electrochemical sensors
US8871068B2 (en) Continuous monitor sensor with covalently bound enzyme
Yang et al. Bienzymatic amperometric biosensor for choline based on mediator thionine in situ electropolymerized within a carbon paste electrode
Zhang et al. ZnS quantum dots derived a reagentless uric acid biosensor
Heller Amperometric biosensors
Narang et al. Construction of triglyceride biosensor based on nickel oxide–chitosan/zinc oxide/zinc hexacyanoferrate film
Wu et al. Direct electrochemistry of glucose oxidase in a colloid Au–dihexadecylphosphate composite film and its application to develop a glucose biosensor
Amini et al. Electrocatalytic determination of traces of insulin using a novel silica nanoparticles-Nafion modified glassy carbon electrode
Baş et al. Amperometric biosensors based on deposition of gold and platinum nanoparticles on polyvinylferrocene modified electrode for xanthine detection
RU2731646C1 (ru) Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита
Lee et al. Amperometric glucose biosensor based on screen-printed carbon electrodes mediated with hexacyanoferrate–chitosan oligomers mixture
Dalkıran et al. Construction of an electrochemical xanthine biosensor based on graphene/cobalt oxide nanoparticles/chitosan composite for fish freshness detection
Zhao et al. Unadulterated glucose biosensor based on direct electron transfer of glucose oxidase encapsulated chitosan modified glassy carbon electrode
Kafi et al. Development of a peroxide biosensor made of a thiolated-viologen and hemoglobin-modified gold electrode
Arlyapov et al. Biosensor based on screen-printed electrode and glucose-oxidase modified with the addition of single-walled carbon nanotubes and thermoexpanded graphite
Levent et al. Simultaneous electrochemical evaluation of ascorbic acid, epinephrine and uric acid at disposable pencil graphite electrode: highly sensitive determination in pharmaceuticals and biological liquids by differential pulse voltammetry
JP2020523565A (ja) 電気化学的バイオセンサー
Narwal et al. Construction of an amperometric lactate biosensor based on immobilization of lactate dehydrogenase nanoparticles onto pencil graphite electrode
Ma et al. Direct electrochemistry of glucose oxidase on the hydroxyapatite/Nafion composite film modified electrode and its application for glucose biosensing
Tamasko et al. An approach to in situ detection of hydrogen peroxide: application of a commercial needle-type electrode