RU2730399C1 - Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии - Google Patents
Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730399C1 RU2730399C1 RU2019122679A RU2019122679A RU2730399C1 RU 2730399 C1 RU2730399 C1 RU 2730399C1 RU 2019122679 A RU2019122679 A RU 2019122679A RU 2019122679 A RU2019122679 A RU 2019122679A RU 2730399 C1 RU2730399 C1 RU 2730399C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mixture
- bees
- liquid chromatography
- performance liquid
- acetonitrile
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к совместному определению остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел при отравлении с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии включает отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин, в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты. Техническим результатом является повышение чувствительности, избирательности и сокращение времени проведения анализа. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к совместному определению остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел при их отравлении с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Среди многообразия пестицидов используемых в сельском хозяйстве особое место занимают неоникотиноиды. Вещества этой группы широко используются для борьбы с вредителями растений, паразитами животных, характеризуются относительной дешевизной, небольшими нормами расхода на единицу площади, простотой применения и высокой эффективностью.
По сравнению с другими пестицидами неоникотиноиды имеют очень продолжительный период действия и проявляют высокую острую токсичность по отношению к пчелам. В связи с этим необходимы исследования, дополняющие и расширяющие сведения о потенциальной опасности неоникотиноидов, что в конечном итоге будет способствовать безопасному их использованию в растениеводстве и ветеринарии.
Для аналитического контроля остаточных количеств неоникотиноидных инсектицидов в кормах, воде, объектах сельского хозяйства и окружающей среды используют высокоэффективную жидкостную хроматографию и газовую хроматографию с масс-спектрометрией.
Интенсивная разработка теоретических основ, организация промышленного выпуска необходимых сорбентов и аппаратуры в последние десятилетия способствовали бурному развитию жидкостной хроматографии, как высокоэффективного метода.
Известен способ определения имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах, включающий экстракцию имидаклоприда гексаном, с последующей переэкстракцией в дихлорметан, фильтрацию, дегидратацию безводным натрия сульфатом, упаривание и хроматографирование на жидкостном хроматографе с ультрафиалетовым детектором (Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1390-03).
Существует способ определения имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке, которое заключается в отборе проб, экстракции, фильтрации, дегидратации безводным натрия сульфатом, упаривании, хроматографировании на жидкостном хроматографе с ультрафиалетовым детектором и обработки результатов (Методические указания по определению имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке хроматографическими методами. Сборник №30: Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. Киев, 2001. - С. 80-87).
Известен способ определения тиаклоприда в воде, включающий экстракцию тиаклоприда гексаном, с последующей переэкстракцией в дихлорметан, фильтрацию и дегидратацию безводным натрия сульфатом, упаривание и хроматографирование на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором (Определение остаточных количеств тиаклоприда в воде, почве и яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографировании. Методические указания МУК 4.1.1399-03).
Существует способ определения тиаметоксама в капусте, зеленой массе, семенах рапса, масле рапса и горчицы, смородине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий экстракцию, очистку экстрактов перераспределением инсектицида в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем (Определение остаточных количеств тиаметоксама в капусте, зеленой массе, семенах рапса, масле рапса и горчицы, смородине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1805-03).
Известен способ определения ацетамиприда в ботве и корнеплодах сахарной свеклы, включающий экстракцию ацетамиприда ацетоном, фильтрацию, дегидратацию натрия сульфатом безводным, упаривание, введение растворенного сухого остатка в хроматограф с ультрафиолетовым детектором (Определение остаточных количеств ацетомиприда в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.3188-14).
Существует способ определения тиаклоприда в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в ботве, корнеплодах сахарной свекле, зерне гороха, в плодах томатов и томатном соке. Метод состоит из отбора пробы, экстракции, центрифугировании, фильтрации, очистки и введении растворенного остатка в жидкостной хроматограф (Определение остаточных количеств тиаклоприда в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в ботве, корнеплодах сахарной свекле, зерне гороха, в плодах томатов и томатном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.3209-14).
Известные способы хорошо себя зарекомендовали и пригодны для определения инсектицидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако ни один из перечисленных способов не подходит для исследования данного объекта и не позволяет одновременно и за короткий промежуток времени определить весь комплекс неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ определения остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр а аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа (Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике отравлений животных пестицидами из группы неоникотиноидов. М. 2018, с. 27-30).
Недостатками данного способа является наличие большого количества примесей в пробе, приводящие к снижению чувствительности, избирательности и увеличению длительности проведения анализа.
Технический результат на достижение которого направлено изобретение, состоит в повышении чувствительности и избирательности способа, а также в сокращении продолжительности проведения анализа.
Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе, включающем отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при t 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношением 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты. А в качестве хроматографа используют жидкостной хроматограф «Agilent 1265 Infiniti» с хроматографической колонкой ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм с размером частиц сорбента 1,8 мкм.
Отличительными признаками предложенного способа являются дополнительная очистка гексаном для проб - подмора пчел от воска, жировых компонентов, использование в качестве элюента смеси ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 с 0,2% муравьиной кислоты, это позволяет повысить чувствительность и избирательность способа, за счет избавления от хроматографических пиков фоновых веществ матрицы, и снизить продолжительность проведения анализа в 2 раза.
Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом.
Предварительно пробы подмора пчел искусственно контаминировали смесью стандартных растворов неоникотиноидов в различных дозах от 1 до 5 мкг/кг. Экспозиция заражения составляла 24 часа.
Брали навеску павших пчел массой 1 г, искусственно зараженную смесью стандартных растворов неоникотиноидов, помещали в коническую колбу емкостью 100 см3, заливали 100 мкл дистиллированной воды и 500 мкл ацетонитрила, тщательно измельчали и добавляли 500 мкл гексана. В полученную массу при перемешивании добавляли 30 мг сульфата магния и 5 мг ацетата натрия, перемешивали в течение 5 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирали в отдельную пробирку и добавляли 20 мг сорбента (PSA или Amberlite XAD-2). Пробирку встряхивали 10 мин, фильтровали от сорбента, а растворитель упаривали в токе азота при температуре 40°С.Остаток растворяли в 300 мкл смеси метанол-вода (10:90) и пропускали через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал. Конечный объем вносили в жидкостный хроматограф «Agilent 1265 Infiniti», оснащенный термостатом колонок, кватернарным насосом и диодно-матричным детектором (ДМД). Рабочая длина волны 266 нм. Колонка ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм, с размером частиц сорбента 1,8 мкм. Скорость потока мобильной фазы 0,7 мл/мин. Температура колонки - 30°С. В качестве элюента использовали подвижную фазу ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 с 0,2% муравьиной кислоты. Длина волны - 266 нм.
Время удерживания неоникотиноидов представлены в таблице.
Обработку результатов анализа проводили методом абсолютной градуировки, содержание неоникотиноидов в анализируемой пробе (X, мг/кг) вычисляли по формуле:
X - содержание неоникотиноида в пробе, мг/кг;
К - концентрация стандартного раствора неоникотиноида, введенного в хроматограф, мкг/см3;
S1 - площадь хроматографического пика стандарта неоникотиноида, мм2;
S2 - площадь хроматографического пика стандарта неоникотиноида в пробе, мм2;
V - общий объем конечного раствора пробы, мл;
m - масса пробы, г;
М - среднее значение определения, найденное предварительно, %.
При анализе неоникотиноидных пестицидов, установили, что лучшие результаты при совместном определении остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел дает предлагаемый нами способ. В хроматограмме мы получили острые, симметричные пики неоникотиноидов при дозе 1 мкг/кг, по сравнению с прототипом (фиг. 1, фиг. 2), а также сократили время их удерживания в колонке в 2 раза, что повышает чувствительность и избирательность способа. Данный способ позволяет получить наиболее высокую степень извлекаемости неоникотиноидов, что составило 80,5%. Усовершенствованный нами способ определения неоникотиноидов в подморе пчел методом ВЭЖХ прост и экономичен в осуществлении, может быть применен в лабораториях для осуществления диагностики отравлений пчел.
Предлагаемый способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием ВЭЖХ был апробирован в лаборатории химического анализа ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».
Источники информации
1. Методические указания по определению имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке хроматографическими методами. Сборник №30: Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. - Киев, 2001, с. 80-87.
2. Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды: Сборник методических указаний. Выпуск 3, М, 2009, с. 127-133.
3. Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1390-03. Выпуск 3, М., 2006. - 11 с.
4. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике животных пестицидами из группы неоникотиноидов / В.И. Егоров (и др.). - М, 2018. - 33 с.
Claims (2)
1. Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин, в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, отличающийся тем, что предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хроматографа используют жидкостный хроматограф «Agilent 1265 Infiniti» с хроматографической колонкой ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм с размером частиц сорбента 1,8 мкм.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019122679A RU2730399C1 (ru) | 2019-07-15 | 2019-07-15 | Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019122679A RU2730399C1 (ru) | 2019-07-15 | 2019-07-15 | Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2730399C1 true RU2730399C1 (ru) | 2020-08-21 |
Family
ID=72237750
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019122679A RU2730399C1 (ru) | 2019-07-15 | 2019-07-15 | Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2730399C1 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114636768A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-06-17 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
CN114813991A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-07-29 | 上海交通大学医学院 | 一种人体尿液中新烟碱类杀虫剂的检测方法 |
CN115406994A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-11-29 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 超高效液相色谱串联质谱测定草地贪夜蛾农药含量的方法 |
CN117388406A (zh) * | 2023-11-03 | 2024-01-12 | 东莞市鸿馥生物科技有限公司 | 一种1-甲基-2α-(6-甲基-3-吡啶基)吡咯烷手性拆分的测定方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105203685A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-12-30 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 基于介孔氧化硅和氧化石墨烯分析茶汤中烟碱类农药的前处理方法 |
CN106053699A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-10-26 | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法 |
WO2018213596A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Spogen Biotech Inc. | Devices, systems, and methods for agrochemical detection and agrochemical compositions |
-
2019
- 2019-07-15 RU RU2019122679A patent/RU2730399C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105203685A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-12-30 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 基于介孔氧化硅和氧化石墨烯分析茶汤中烟碱类农药的前处理方法 |
CN106053699A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-10-26 | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种蜂蜜中新烟碱类杀虫剂的高效检测方法 |
WO2018213596A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Spogen Biotech Inc. | Devices, systems, and methods for agrochemical detection and agrochemical compositions |
Non-Patent Citations (3)
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114813991A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-07-29 | 上海交通大学医学院 | 一种人体尿液中新烟碱类杀虫剂的检测方法 |
CN114636768A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-06-17 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
CN114636768B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-11-07 | 广西-东盟食品检验检测中心 | 一种茉莉花中噻虫嗪残留的检测方法 |
CN115406994A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-11-29 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 超高效液相色谱串联质谱测定草地贪夜蛾农药含量的方法 |
CN115406994B (zh) * | 2022-09-05 | 2024-04-30 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 超高效液相色谱串联质谱测定草地贪夜蛾农药含量的方法 |
CN117388406A (zh) * | 2023-11-03 | 2024-01-12 | 东莞市鸿馥生物科技有限公司 | 一种1-甲基-2α-(6-甲基-3-吡啶基)吡咯烷手性拆分的测定方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2730399C1 (ru) | Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии | |
Hunter | High-Performance liquid chromatographic strategies for the determination and confirmation of anticoagulant rodenticide in animal tissues | |
Cheng et al. | Determination of pyrethroids in porcine tissues by matrix solid-phase dispersion extraction and high-performance liquid chromatography | |
Zubairi et al. | The effects of raw material particles size, types of solvents and solvent-to-solid ratio on the yield of rotenone extracted from Derris elliptica roots | |
Fabiyi et al. | Environmental Sustainability: Bioactivity of Leucaena leucocephala Leaves and Pesticide Residue analysis in Tomato Fruits. | |
Heath et al. | Sex pheromone of Cylas formicarius: History and implications of chemistry in weevil management | |
RU2484458C1 (ru) | Способ определения имидаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии | |
Levi-Zada et al. | Reevaluation of the sex pheromone of the lesser date moth, Batrachedra amydraula, using autosampling SPME-GC/MS and field bioassays | |
Ashraf et al. | Determination of pesticide residues from grapes procured from different markets using through high performance liquid chromatography (HPLC) | |
Brown et al. | Analytical methods used in the United Kingdom Wildlife Incident Investigation Scheme for the detection of animal poisoning by pesticides | |
CN103472150A (zh) | 气相色谱法检测土壤中7种拟除虫菊酯农药残留量 | |
Dost et al. | Determination of boscalid, pyraclostrobin and trifloxystrobin in dried grape and apricot by HPLC/UV method | |
Ong et al. | Insecticide residues on poultry manures: Field efficacy test on selected insecticides in managing Musca Domestica population | |
Kathpal et al. | Improved cleanup technique for the estimation of endosulfan and endrin residues | |
Sharma et al. | Allelopathic influences of Artemisia Dubia Wall. ex. Besser on seed germination and seedling vigor of Parthenium hysterophorus L | |
Tamilselvan et al. | Determination of bispyribac sodium 10% SC (herbicide) residue level in straw, grain and soil using HPLC method | |
TAN et al. | Research on effect of four natural ultraviolet light absorbers on photostabilization of azadirachtin-A | |
RU2517075C1 (ru) | Способ определения тиаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии | |
da Silva et al. | Larvicidal activity and docking study of Ramalina complanata and Cladonia verticillaris extracts and secondary metabolites against Aedes aegypti | |
Ata et al. | Analytical investigation of selected pesticide residues from fruits and vegetables by an improved extraction method using reverse phase High Performance Liquid Chromatograph | |
CN102578094B (zh) | (+)-表枇杷素的农药用途 | |
CN101595872B (zh) | 瑞香狼毒中2-甲基-5-异丙基苯酚在农药中的应用 | |
Hussein | “Soil Purification” Analysis of Pesticide Residues in the Soil | |
RU2269780C1 (ru) | Способ определения o-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-n-метилкарбамата в биологическом материале | |
CN101653141B (zh) | 瑞香狼毒中3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇在农药中的用途 |