RU2717535C1

RU2717535C1 - Method for extracting pure culture of pasteurellosis activator pasteurella multocida

Info

Publication number: RU2717535C1
Application number: RU2019108911A
Authority: RU
Inventors: Владимир Викторович Каширин
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2020-03-23

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medical microbiology. Disclosed is a method for extracting a pure culture of pasteurellosis activator Pasteurella multocida. Method involves prosection an infected and pasteurellised bird or rabbit with body weight of 350 g, sampling blood from the heart, adding to sterile water at 20±1 °C in ratio of 1:9 by volume. Then precipitate is shaken, transferred into suspension, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes; supernatant fluid as Pasteurella isolate from blood in dilution 10^-1 diluted to 10^-2, 10^-3, sowing at 20±1 °C on nutrient broth and nutrient agar, crops are cultivated for 9–19 hours at 37 °C and 1 hour at 20 °C.

EFFECT: method provides isolation of pure Pasteurella multocida with high virulence.

1 cl, 5 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida.The present invention relates to the field of microbiology and biotechnology and is intended to isolate a pure culture (strain) of the pathogen pasteurellosis Pasteurella multocida.

Пастереллез («куриная холера», геморрагическая септицемия млекопитающих) вызывает бактерия Pasteurella multocida, способная многих и много (multi) убить (cid), представленная С.Т. Rosenbusch и I.A. Merchant (1939) типовым видом рода Pasteurella [5, 6, 9, 34]. Ее первая в бактериологии культура на искусственной среде (в бульоне) выделена из трупов кур при изучении «куриной холеры» Л. Пастером (1880) [32]. С тех пор культурой бактериальной называют популяцию жизнеспособных бактерий, выращенных на питательной среде, а прямое выделение ее из трупов (из патологического материала) применяют как основной способ бактериологического исследования [4, 6]. Наиболее чаще его используют в целях диагностики и таксономии. Идентификация и дифференциация бактерий могут быть проведены только при наличии их чистых культур [6]. Поэтому в случаях получения смешанной культуры микроорганизмов, ей инфицируют восприимчивый организм и затем прямым выделением из трупа получают чистую культуру возбудителя болезни [2]. В пассаже через восприимчивый организм с последующим тем же способом прямого выделения из трупа чистой культуры восстанавливают штаммы бактерий при поддержании в коллекции, при изготовлении и контроле биопрепаратов. Ему дополнением служит дробный посев исследуемого патологического материала на плотной питательной среде с последующим пересевом характерно растущей колонии бактерий (в частности, P. multocida) в питательный бульон и получением их чистой культуры [2]. Однако в этом случае чистая культура бактерий уже второй генерации на питательной среде после их размножения in vivo, несколько отличающаяся от исходной (первой) морфологией роста, то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации. По определению микробиологии, диссоциация (разъединение) - появление в популяции бактерий особей, отличающихся от исходного типа внешним видом и структурой колоний, а также наследственно закрепленными изменениями некоторых морфологических и биологических свойств [6]. Данные многих исследователей, в т.ч. и наши, показывают, что важным фактором вирулентности P. multocida служит капсула [2, 9, 15, 31]. Утрата или же восстановление капсулы и, как правило, вирулентности P. multocida сопровождаются изменением морфологии ее колоний, которые могут иметь гладкую радужную или не радужную (S-), слизистую или мукоидную (М-), шероховатую (R-) формы и S^R- и R^S-переходные формы [2, 9, 10, 11, 29, 30]. Однако это характеризует изменчивость P. multocida, но не раскрывает условия ее диссоциации. По этой причине не представляется возможным обеспечить единство методологии выделения чистой культуры P. multocida и достоверность оценки морфологических и биологических свойств бактерии. В этом заключается основной недостаток традиционного способа.Pasteurellosis (“chicken cholera”, mammalian hemorrhagic septicemia) is caused by the bacterium Pasteurella multocida, capable of killing many (multi) (cid), presented by S.T. Rosenbusch and IA Merchant (1939) as a type species of the genus Pasteurella [5, 6, 9, 34]. Its first culture in bacteriology on an artificial medium (in broth) was isolated from the corpses of chickens in the study of "chicken cholera" by L. Pasteur (1880) [32]. Since then, a bacterial culture has been called a population of viable bacteria grown on a nutrient medium, and its direct isolation from corpses (from pathological material) is used as the main method of bacteriological research [4, 6]. Most often it is used for diagnosis and taxonomy. Identification and differentiation of bacteria can only be carried out in the presence of their pure cultures [6]. Therefore, in cases where a mixed culture of microorganisms is obtained, a susceptible organism is infected with it and then, by direct isolation from the corpse, a pure culture of the pathogen is obtained [2]. In the passage through the susceptible organism, followed by the same method of direct isolation from the corpse of a pure culture, bacterial strains are restored while maintaining in the collection, in the manufacture and control of biological products. It is supplemented by fractional seeding of the studied pathological material on a solid nutrient medium, followed by reseeding of a characteristicly growing colony of bacteria (in particular, P. multocida) in a nutrient broth and obtaining their pure culture [2]. However, in this case, a pure culture of bacteria of the second generation on a nutrient medium after their propagation in vivo is somewhat different from the initial (first) growth morphology, that is, an observable sign of the phenomenon of dissociation. According to the definition of microbiology, dissociation (separation) is the appearance in the bacterial population of individuals that differ from the original type in the appearance and structure of the colonies, as well as hereditarily fixed changes in some morphological and biological properties [6]. The data of many researchers, including and ours, show that an important factor in the virulence of P. multocida is the capsule [2, 9, 15, 31]. The loss or restoration of the capsule and, as a rule, virulence of P. multocida is accompanied by a change in the morphology of its colonies, which may have a smooth iridescent or non-iridescent (S-), mucous or mucoid (M-), rough (R-) forms and S ^R - and R ^S transition forms [2, 9, 10, 11, 29, 30]. However, this characterizes the variability of P. multocida, but does not reveal the conditions for its dissociation. For this reason, it is not possible to ensure the unity of the methodology for isolating the pure culture of P. multocida and the reliability of assessing the morphological and biological properties of the bacterium. This is the main disadvantage of the traditional method.

Согласно принятому в микробиологии определению, чистая культура бактерий, выделенная из какого-либо источника в определенное время, называется штаммом [4, 6]. Также известно, что стабильность патогенных свойств микроорганизмов - важнейший показатель при их использовании [7, 21, 27]. Однако в научных и практических целях выделяемые и применяемые штаммы P. multocida часто не отвечают этим критериям, а существующая методология не обеспечивает их восстановление в пассаже через восприимчивый организм. Исходя из этого, исторически сложившийся традиционный способ выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida из какого-либо источника в определенное время взят за прототип [4, 6]. За показатель «источник» принимают, как правило, зараженный организм или труп погибшего в заражении организма определенного вида и возраста. Показатель «определенное время» подробно не раскрыт и вероятнее всего указывает на дату выделения чистой культуры P. multocida. Ее же по-прежнему эмпирически выделяют от павших и вынужденно убитых больных, произвольно доставленных из эпизоотических очагов или воспроизведенных в экспериментальном заражении. Выделенные из одного и того же источника (трупа) культуры P. multocida нередко отличаются по морфологии роста, в частности - по форме колоний (то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации), по формообразованию и форме микробной клетки, а также по вирулентности. Адаптация и изменчивость пастерелл в изменяющихся условиях трупа с момента смерти не учитываются. Ввиду этого срок (своевременность) выделения чистой культуры (штамма) P. multocida и ряд других принципиально важных условий методически не предусмотрены. Однако от этого зависит типичность ее свойств и, как следствие, достоверность результата исследования. Очевидно, что традиционный способ (прототип) не обеспечивает условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза P. multocida строгой типичности морфологических и биологических свойств.According to the definition adopted in microbiology, a pure culture of bacteria isolated from any source at a certain time is called a strain [4, 6]. It is also known that the stability of the pathogenic properties of microorganisms is the most important indicator when using them [7, 21, 27]. However, for scientific and practical purposes, the isolated and used strains of P. multocida often do not meet these criteria, and the current methodology does not ensure their recovery in the passage through a susceptible organism. Based on this, the historically established traditional way of isolating a pure culture (strain) of the pasteurellosis pathogen Pasteurella multocida from any source at a certain time is taken as a prototype [4, 6]. As an indicator "source" is taken, as a rule, an infected organism or the corpse of a certain species and age that died in the infection of an organism. The “specific time” indicator is not disclosed in detail and most likely indicates the date of isolation of the pure culture of P. multocida. It is still empirically isolated from fallen and involuntarily killed patients, arbitrarily delivered from epizootic foci or reproduced in experimental infection. Cultures of P. multocida isolated from the same source (corpse) often differ in growth morphology, in particular, in the form of colonies (that is, an observable sign of the phenomenon of dissociation), in the formation and shape of the microbial cell, and also in virulence. Adaptation and variability of pasteurellas in the changing conditions of a corpse from the moment of death are not taken into account. In view of this, the term (timeliness) of the isolation of a pure culture (strain) of P. multocida and a number of other fundamentally important conditions are not methodically provided. However, the typicality of its properties and, as a consequence, the reliability of the research result depends on this. Obviously, the traditional method (prototype) does not provide the conditions for the isolation of a pure culture of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of strict typical morphological and biological properties.

Несмотря на диссеминацию (генерализацию) клеток P. multocida током крови по всему организму, ее чистую культуру выделяют произвольно в большом объеме посева проб патологического материала (разных органов, тканей) [1-3]. Такой подход влечет необоснованные затраты материальных средств и рабочего время, тогда как выделение чистой культуры P. multocida и наличие типичности ее свойств не во всех случаях исследования возможны. Нередко при культивировании посевов на плотной питательной среде нет роста культуры бактерий, а в питательном бульоне получают нетипичной морфологии «интенсивный» рост культуры. И в первом случае создается мнение о стерильности патологического материала, а во втором - подозрение на получение смешанной культуры, что соответственно влечет дополнительные манипуляции в исследованиях. Вызывают вопрос и случаи, когда культура P. multocida, выделенная при явно остром течении пастереллеза, в биологической пробе не проявляет патогенность. По этим причинам на бактериологическое исследование затрачивают до 10 суток или даже экспертизу повторяют на вновь доставленном материале. Чтобы оптимизировать условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза применяют разные обогащенные питательные среды, обычно тоже эмпирически подобранные. Однако P. multocida легко дает рост даже на обычной простой плотной и жидкой питательной среде для культивирования микроорганизмов, в частности, имеющей Технические условия (ТУ-9398-020-78095326-2006, ТУ9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4). Тем не менее, изменчивость бактерии обусловлена влиянием условий окружающей среды. Первые попытки сохранить возбудителя «куриной холеры» (P. multocida) in vitro предпринял Л. Пастер [32]. Лишенная контакта с атмосферным кислородом культура не потеряла вирулентности, а оставленная в обычных условиях ее утратила. Аналогично, выращенные и хранящиеся в 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом культуры P. multocida продолжительно сохраняют биологические свойства, на что не влияет содержание в среде сыворотки крови разных видов животных [25]. Однако, P. multocida - не только аэроб, но и факультативный анаэроб. Ее обмен веществ и энергии, ослабление вирулентных и других свойств в отсутствии свободного кислорода и при использовании атомарного лишь замедляются.Despite the dissemination (generalization) of P. multocida cells by blood flow throughout the body, its pure culture is randomly isolated in a large volume of seeding samples of pathological material (various organs, tissues) [1-3]. Such an approach entails unreasonable expenditures of material resources and working time, while the isolation of a pure culture of P. multocida and the presence of the typicality of its properties are not possible in all cases of research. Often, when cultivating crops on a dense nutrient medium, there is no growth in the culture of bacteria, and in the nutrient broth atypical morphology “intensive” growth of the culture is obtained. And in the first case, an opinion is created about the sterility of the pathological material, and in the second - the suspicion of receiving a mixed culture, which accordingly entails additional manipulation in research. There are also questions when the culture of P. multocida, isolated in a clearly acute course of pasteurellosis, does not show pathogenicity in a biological sample. For these reasons, up to 10 days are spent on bacteriological research or even the examination is repeated on newly delivered material. In order to optimize the conditions for the isolation of a pure culture of the pathogen of pasteurellosis, various enriched nutrient media are used, usually also empirically selected. However, P. multocida easily gives growth even on an ordinary simple dense and liquid nutrient medium for the cultivation of microorganisms, in particular, having the Technical conditions (TU-9398-020-78095326-2006, TU9398-021-78095326-2006, pH 7.2- 7.4). However, bacterial variability is due to environmental influences. The first attempts to preserve the causative agent of “chicken cholera” (P. multocida) in vitro were made by L. Pasteur [32]. Deprived of contact with atmospheric oxygen, the culture did not lose virulence, and left under normal conditions it lost. Similarly, cultures of P. multocida grown and stored in 1% peptone water under paraffin oil retain biological properties for a long time, which is not affected by the content of different animal species in the blood serum [25]. However, P. multocida is not only an aerobic, but also an optional anaerobic. Its metabolism and energy, the weakening of virulent and other properties in the absence of free oxygen and when using atomic only slow down.

Имеются сведения о том, что «носители» P. multocida - потенциальный источник инфекции [3, 17, 19, 20, 28]. Бактерия локализуется, переживает, колонизирует и проявляет инвазивность на слизистых оболочках полости носа, рта, глотки [6, 17, 18, 33]. Однако ее избирательность паразитирования в этой области не раскрыта. Кроме того, заболевание пастереллезом регистрируется в регионах с теплым и умеренным климатом, возникает неожиданно (в виде «молниеносного» течения или внезапной «взрывной вспышки») при ослаблении естественных защитных сил организма под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды, особенно резких колебаний температуры и дождей [3, 6, 8, 9, 26]. Однако традиционные представления о природе активизации и о происхождении инфекции носят гипотетический характер, так как механизм повышения вирулентности Р. multocida и заражения восприимчивых организмов естественным путем экспериментально не воспроизведен и, поэтому, не установлен.There is evidence that the “carriers” of P. multocida is a potential source of infection [3, 17, 19, 20, 28]. The bacterium is localized, survives, colonizes and exhibits invasiveness on the mucous membranes of the nasal cavity, mouth, and pharynx [6, 17, 18, 33]. However, its selectivity of parasitism in this area is not disclosed. In addition, pasteurellosis is registered in regions with a warm and temperate climate, it occurs unexpectedly (in the form of a “lightning” course or a sudden “explosive flash”) when the body's natural defenses are weakened by adverse environmental factors, especially sharp fluctuations in temperature and rain [ 3, 6, 8, 9, 26]. However, traditional ideas about the nature of activation and the origin of infection are hypothetical in nature, since the mechanism of increasing the virulence of P. multocida and infection of susceptible organisms in a natural way has not been experimentally reproduced and, therefore, has not been established.

По нашим наблюдениям заболевание действительно часто и внезапно возникает при резких колебаниях температуры и дождливой погоде, характеризуясь, как правило, сверхострым течением в начале эпизоотии [15]. Смерть наступает так быстро, что классические патологоанатомические изменения, кроме геморрагий, не успевают развиться. Первые погибшие наиболее упитанные и крепкие на вид особи, поэтому всякие предположения об ослаблении естественных защитных сил организма как условия возникновения пастереллеза исключаются. Не находят объяснения случаи быстрого угасания эпизоотии, когда без видимых причин число погибших за сутки значительно уменьшается, а динамика снижения падежа выглядит волнообразной. Гибель в очаге резко прекращается и на слизистых оболочках верхних дыхательных путей и глотки остаются потенциально патогенные пастереллы («здоровое носительство»). Однако эпизоотическая ситуация становится чрезвычайно опасной, а течение болезни сверхострым, если распространение инфекции и заражение происходят через воду. При проведении опытов нами отмечена зависимость морфологических и биологических свойств P. multocida от пути заражения организма, инфицирующего материала, температуры и жидкой фазы окружающей среды [23, 24, 13]. В динамике размножения P. multocida в крови зараженных и погибших, а также в пробах крови, на жидкой и плотной питательной среде изучен морфогенез (формообразование), в т.ч. формирование капсулы и биполярности [12, 14, 16, 22]. Это позволило впервые установить функциональную морфо- и термолабильность P. multocida, объяснить условия вирулентности и диссоциации бактерии, раскрыть природный механизм пастереллеза [11, 14, 15]. P. multocida выделяет экзометаболит. Из него при снижении температуры формируется капсула и, соответственно, повышается вирулентность бактерии. Изолированная в стерильной (чистой) воде бактерия сохраняет, а при контакте с питательной средой быстро утрачивает капсулу и вирулентность. Температура, как фактор воздействия на формирующуюся и сформированную капсулу P. multocida, предопределяет возможность проявления бактерией патогенных свойств и обусловливает закономерность возникновения пастереллеза в периоды резких колебаний температуры и выпадения дождей. Внезапное появление и неожиданное угасание эпизоотий пастереллеза - результат прямо противоположного резкого влияния низкой, умеренной и повышенной температуры окружающей среды на капсулу и патогенные свойства Р. multocida. Слизистые оболочки носовой, ротовой и глоточной полостей -природная область естественного носительства P. multocida (локализации, длительного переживания, колонизации и инвазивности), где бактерии свойственна функциональная морфо- и термолабильность в зависимости от температуры окружающей среды (в основном воздуха и питьевой воды). Именно здесь взаимодействие P. multocida и восприимчивого организма при ключевой роли температурного фактора определяет возможность начала воспалительного процесса (первичный аффект) и представляет собой естественный путь (механизм) заражения пастереллезом [15]. С раскрытием природных условий развития пастереллеза окончательно определены недостатки традиционного способа и основополагающие отличительные признаки нового решения на способ выделения чистой культуры (штамма) Р. multocida и ее оценки. Ввиду функциональной морфо- и термолабильности Р. multocida, принципиальное значение в выделении и оценке ее чистой культуры (штамма) представляют: путь заражения, масса тела восприимчивого организма, инфицирующий материал, температура окружающей среды (при заражении организма и при остывании трупа соответственно), время вскрытия трупа после смерти организма, глубина точки отбора инфекционного материала из трупа для бактериологического исследования.According to our observations, the disease really often and suddenly occurs during sharp fluctuations in temperature and rainy weather, characterized, as a rule, by a super-acute course at the beginning of epizootics [15]. Death occurs so quickly that the classic pathological changes, except hemorrhages, do not have time to develop. The first dead are the most well-fed and strong-looking individuals, so any assumptions about the weakening of the body's natural defenses as a condition for the appearance of pasteurellosis are excluded. Cases of rapid extinction of the epizootic, when for no apparent reason the number of deaths per day is significantly reduced, and the dynamics of the decrease in the case looks wave-like, do not find an explanation. The death in the outbreak abruptly stops and the potentially pathogenic pasteurella (“healthy carriage”) remains on the mucous membranes of the upper respiratory tract and pharynx. However, the epizootic situation becomes extremely dangerous, and the course of the disease is super acute if the spread of infection and infection occurs through water. During the experiments, we noted the dependence of the morphological and biological properties of P. multocida on the pathway of infection of the body, infectious material, temperature, and the liquid phase of the environment [23, 24, 13]. In the dynamics of multiplication of P. multocida in the blood of infected and dead, as well as in blood samples, in a liquid and solid nutrient medium, morphogenesis (morphogenesis) was studied, including capsule formation and bipolarity [12, 14, 16, 22]. This made it possible for the first time to establish the functional morpho- and thermolability of P. multocida, to explain the conditions of virulence and dissociation of bacteria, and to reveal the natural mechanism of pasteurellosis [11, 14, 15]. P. multocida secretes exometabolite. From it, with a decrease in temperature, a capsule is formed and, accordingly, the virulence of the bacterium increases. The bacterium isolated in sterile (clean) water retains, and when it comes in contact with a nutrient medium, it quickly loses its capsule and virulence. Temperature, as a factor of influence on the forming and formed capsule of P. multocida, determines the possibility of the manifestation of pathogenic properties by the bacterium and determines the pattern of pasteurellosis during periods of sharp fluctuations in temperature and rainfall. The sudden appearance and unexpected extinction of the epizootics of pasteurellosis is the result of the directly opposite sharp influence of low, moderate and elevated ambient temperatures on the capsule and pathogenic properties of P. multocida. The mucous membranes of the nasal, oral and pharyngeal cavities are a natural region of the natural carriage of P. multocida (localization, prolonged experience, colonization and invasiveness), where bacteria are characterized by functional morphological and thermal lability depending on the ambient temperature (mainly air and drinking water). It is here that the interaction of P. multocida and the susceptible organism with the key role of the temperature factor determines the possibility of the onset of the inflammatory process (primary affect) and represents the natural pathway (mechanism) of infection with pasteurellosis [15]. With the disclosure of the natural conditions for the development of pasteurellosis, the disadvantages of the traditional method and the fundamental distinguishing features of the new solution to the method for isolating a pure culture (strain) of P. multocida and its evaluation have been finally determined. In view of the functional morphological and thermolability of P. multocida, the following are important in isolating and evaluating its pure culture (strain): the path of infection, the body weight of the susceptible organism, the infectious material, the ambient temperature (during infection of the body and cooling of the corpse, respectively), time autopsy after the death of the body, the depth of the point of selection of infectious material from the corpse for bacteriological research.

Задачей изобретения является выделение и оценка чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida путем обеспечения единства условий методологии на природной основе.The objective of the invention is the selection and evaluation of a pure culture (strain) of the causative agent of pasteurellosis Pasteurella multocida by ensuring the unity of the conditions of the methodology on a natural basis.

Поставленная задача достигается тем, что в заражении естественным путем или близким к нему способом (интраназально или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей) павший от пастереллеза восприимчивый организм массой тела около 350 г (оптимум) с момента смерти остывает при температуре 20±1°С (оптимум). Через 3 ч его труп вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду (20±1°С) 1:9 по объему, осадок встряхивают и переводя во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10^-1, разводят до 10^-2, 10^-3 и соответственно высевают на питательный бульон и питательный агар при температуре 20±1°С (оптимум). Посевы культивируют и получают 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) культуру пастерелл первой генерации после организма. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.The task is achieved by the fact that in a natural infection or in a manner close to it (intranasally or orally on the mucous membrane of the nasal, oral, pharyngeal cavities), a susceptible organism weighing about 350 g (optimum) fallen from pasteurellosis cools from the moment of death at a temperature of 20 ± 1 ° C (optimum). After 3 hours, his body is opened, a blood sample is taken from the heart and introduced into sterile water (20 ± 1 ° C) 1: 9 by volume, the precipitate is shaken and suspended, then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. The supernatant as a pasteurella isolate from blood at a dilution of 10 ^-1 , diluted to 10 ^-2 , 10 ^-3 and, respectively, seeded on nutrient broth and nutrient agar at a temperature of 20 ± 1 ° C (optimum). Crops are cultivated and receive a 10-20 - hour (9-19 h at 37 and 1 h at 20 ± 1 ° C) pasteurellum culture of the first generation after the body. The resulting culture is evaluated pure by strictly typical continuous growth morphology and S-shaped colonies of the same type, by identical cocco- and diplococcus-like encapsulated cells in the fields of view of the microscope, and also by high virulence for susceptible laboratory animals and birds and with a characteristic pronounced property of microbial antagonism.

Существенным отличием является то, что в заражении естественным путем или близким к нему способом (интраназально или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей) павший от пастереллеза восприимчивый организм массой тела около 350 г (оптимум) с момента смерти остывает при температуре 20±1°С (оптимум). Через 3 ч его труп вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду (20±1°) 1 : 9 по объему. Осадок встряхивают и переводят во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считают изолятом пастерелл из крови в разведении 10^-1, готовят его разведения 10^-2, 10^-3 и соответственно высевают на питательный бульон и питательный агар при температуре 20±1°С (оптимум). Посевы культивируют и получают 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) культуру пастерелл первой генерации после организма. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.A significant difference is that in a natural infection or in a manner close to it (intranasally or orally on the mucous membrane of the nasal, oral, or pharyngeal cavities), a susceptible organism weighing about 350 g (optimum) that has fallen from pasteurellosis cools down from the moment of death at a temperature of 20 ± 1 ° C (optimum). After 3 hours, his corpse is opened, a blood sample is taken from the heart and introduced into sterile water (20 ± 1 °) 1: 9 by volume. The precipitate is shaken and suspended, then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. The supernatant is considered to be a pasteurella isolate from blood at a dilution of 10 ^-1 , a dilution of 10 ^-2 , 10 ^-3 is prepared, and accordingly it is plated on nutrient broth and nutrient agar at a temperature of 20 ± 1 ° C (optimum). Crops are cultivated and receive a 10-20 - hour (9-19 h at 37 and 1 h at 20 ± 1 ° C) pasteurellum culture of the first generation after the body. The resulting culture is evaluated pure by strictly typical continuous growth morphology and S-shaped colonies of the same type, by identical cocco- and diplococcus-like encapsulated cells in the fields of view of the microscope, and also by high virulence for susceptible laboratory animals and birds and with a characteristic pronounced property of microbial antagonism.

В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта условий заражения восприимчивого организма пастереллезом, выделения и оценки чистой культуры (штамма) P. multocida.In the work, it is advisable to adhere to a certain standard of the conditions of infection of the susceptible organism by pasteurellosis, isolation and evaluation of the pure culture (strain) of P. multocida.

Примеры и сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Examples and information confirming the possibility of carrying out the invention.

Пример 1Example 1

Бактериологическому исследованию на предмет выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза P. multocida подлежал произвольно доставленный из очагов пастереллеза инфекционный материал: клинически больные, трупы, а также внутренние органы и ткани (в т.ч. кровь сердца на чистой воде) от павших и вынужденно убитых. Кроме этого исследованию подлежал инфекционный материал, воспроизведенный при восстановлении в пассаже через восприимчивый организм штаммов Р. multocida, длительно хранящихся на питательном бульоне под столбиком вазелинового масла высотой 1 см при 18-22°С и в сахарозо-желатиновой среде под вакуумом при 4-6°С. В частности, это выделенные в разное время и из разных регионов штаммы: эталонный Х-73 (коллекция Хеддлестоуна, США), контрольно-производственные №55, №115, №712, №915, №1931 (ВГНКИ ветпрепаратов) и пять вирулентных полевых, относящиеся к типичному серовару A:1 P. multocida, наиболее распространенному и вызывающему заболевание птиц (по нашим данным, в 89% случаев эпизоотий), а также производственные штаммы №116, №656, №796 (ВГНКИ ветпрепаратов), относящиеся к типичному серовару В Р. multocida, вызывающему заболевание млекопитающих.Bacteriological examination for the isolation of a pure culture (strain) of the causative agent of pasteurellosis P. multocida was subject to the infectious material arbitrarily delivered from the foci of pasteurellosis: clinically ill, corpses, as well as internal organs and tissues (including heart blood in clean water) from dead and forcibly killed. In addition, infectious material reproduced during the restoration of passages of a susceptible organism of P. multocida strains, which were stored on a nutrient broth under a column of vaseline oil 1 cm high at 18-22 ° C and in a sucrose-gelatinous medium under vacuum at 4-6, was also subject to investigation. ° C. In particular, these are strains isolated at different times and from different regions: reference X-73 (Hedlestone collection, USA), production control No. 55, No. 115, No. 712, No. 915, No. 1931 (VGNKI of veterinary preparations) and five virulent field related to a typical serovar A: 1 P. multocida, the most common and causing bird disease (according to our data, in 89% of cases of epizootics), as well as production strains No. 116, No. 656, No. 796 (VGNKI of veterinary preparations) related to a typical serovar B. P. multocida, a mammalian disease causing disease.

Во всех случаях бактериологического исследования инфекционного материала, содержащийся в нем спонтанно изменившийся (в разном состоянии морфологических и биологических свойств) возбудитель пастереллеза P. multocida восстанавливали в пассаже через восприимчивый организм, что показано в последующем примере 3. Микроорганизмы по источнику происхождения от птиц пассировали через голубя, крайне изредка - через цыпленка или утенка, а от млекопитающих - через кролика. Восприимчивые организмы подбирали по массе тела около 350 г (оптимум).In all cases of a bacteriological study of infectious material, the spontaneous pathogen P. multocida contained in it spontaneously changed (in a different state of morphological and biological properties) was restored in the passage through a susceptible organism, as shown in the following example 3. Microorganisms were passivated through a pigeon , extremely rarely - through a chicken or duckling, and from mammals - through a rabbit. Susceptible organisms selected about 350 g in body weight (optimum).

Исходные культуры микроорганизмов в посевах подлежащего исследованию инфекционного материала, в т.ч. непосредственно из условий хранения в коллекции (т.е. не пассированные через восприимчивый организм), в каждом случае бактериологического исследования соответственно служили в качестве контроля.Initial cultures of microorganisms in the crops of the infectious material to be studied, incl. directly from storage conditions in the collection (i.e., not passivated through a susceptible organism), in each case, bacteriological studies respectively served as controls.

Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.Preparations for microscopy were stained according to Gins, Romanovsky-Giemsa, Gram.

Пример 2Example 2

Изучали морфогенез (формообразование) P. multocida в крови зараженных и погибших в естественном и экспериментальном заражении.We studied the morphogenesis (morphogenesis) of P. multocida in the blood of infected and died in natural and experimental infection.

В искусственном заражении (на слизистую носовой, ротовой и глоточной полостей) инфицирующим материалом служила кровь, содержащая пастереллы при наиболее выраженной их биполярности и капсулы. Восприимчивый организм заражали при 20±1°С и затем сразу содержали при 10±1°С, а с момента его гибели и по взятие крови из сердца труп остывал 3 ч при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. Исследуемым материалом от зараженных особей были пробы слизи со слизистой в области небной щели и пробы крови из вены крыла, а от павших - пробы крови из сердца. Индикацию и идентификацию клеток P. multocida вели посредством световой и электронной микроскопии препаратов, последовательно приготавливаемых при инфекционном процессе и в посмертном периоде по общепринятым методам.In artificial infection (on the mucous membrane of the nasal, oral and pharyngeal cavities), the infectious material was blood containing pasteurella, with their most pronounced bipolarity and capsules. The susceptible organism was infected at 20 ± 1 ° С and then immediately kept at 10 ± 1 ° С, and from the moment of its death and taking blood from the heart, the corpse cooled down for 3 hours at 20 ± 1 ° С (optimum) environment. The studied material from infected individuals was mucus samples from the mucous membrane in the palatal fissure and blood samples from the vein of the wing, and from the fallen, blood samples from the heart. P. multocida cells were indicated and identified by light and electron microscopy of preparations sequentially prepared during the infectious process and in the post-mortem period according to generally accepted methods.

Формообразование бактерии P. multocida в естественном заражении и в экспериментальном (близком к естественному заражению) было одинаковым. В частности, на слизистой в воротах инфекции при резком изменении температуры окружающей среды (в основном воздуха и питьевой воды) пастереллы быстро утрачивали капсулу, биполярность, уменьшались, принимали вид относительно равных по величине маленьких коккобактерий и проникали в кровь (кровоток) густой сети капилляров соединительнотканного слоя слизистых оболочек. С развитием септицемии, при повышенной температуре тела организма, P. multocida выявляли в виде бескапсульной коккобактерии. Ей непрерывно характерно деление и диссеминация (генерализация) гематогенным путем с признаком свободного выделения экзометаболита (по данным электронной микроскопии то же вещество, что и капсульное) в смертельной для птицы дозе. С момента смерти зараженной особи, по мере остывания ее трупа, синхронно снижению температуры экзометаболит принимает вязкую консистенцию и его все больше остается на клетке P. multocida в виде формирующейся капсулы. При этом бактерия делится пополам на две дочерние, которые, вокруг и противоположно выделяя экзометаболит, пластично и в напряжении принимают выпукло-вогнутую форму. Традиционно это ошибочно характеризуют избирательным окрашиванием полюсов и не окрашенной середины бактерии, обозначая «биполярная палочка», «биполяр» или просто «феномен биполярности». Однако на признак биполярности P. multocida очень влияет жидкая фаза среды. «Биполяры» в крови из сердца трупа при внесении в обычную воду и другие жидкие среды быстро (за 3-5 с) распадаются. Выпукло-вогнутые по форме и в напряжении клетки Р. multocida сразу же утрачивают парное расположение и оформляются в кокко- и диплококкоподобные. После легкого встряхивания материала в жидкой среде диплококкоподобные формы бактерий распадаются на коккоподобные. Поэтому «биполяр» или «биполярная палочка» P. multocida - это структура из двух клеток в капсуле, легко и быстро утрачивающих взаимосвязь и принимающих шаровидную форму (особенно в жидкой среде). Однако при индикации и идентификации P. multocida капсулу и признак биполярность следует по-прежнему считать важными для диагностики и таксономии показателями. Тем не менее, из-за распада парной структуры пастерелл, выявляемый возбудитель пастереллеза птиц чаще представлен в форме кокка разной величины, что затрудняет индикацию и идентификацию как первый этап диагностики. Формообразование клетки P. multocida (в том числе формирование капсулы) происходит при изменении температуры окружающей среды и обусловлено функциональным состоянием бактерии. Выраженность капсулы и биполярности P. multocida в трупе естественно зараженной особи зависит от срока после ее смерти, массы тела и глубины отбора из него пробы инфекционного материала, от температуры окружающей среды и фазы среды (плотной или жидкой). На основе установленной закономерности формообразования P. multocida, для точности выявления этой бактерии подобран и рекомендуется для применения в лабораторной практике стандарт оптимальных условий отбора и исследования патологического материала. В заражении близком естественному при массе тела павшей особи около 350 г, остывшей при температуре окружающей среды 20±1°С (оптимум), труп вскрывают через 3 ч с момента смерти, берут пробу крови из сердца и готовят препараты с окраской по общепринятым методам (Бурри, Романовского-Гимза, Грама). При микроскопии препаратов регистрируют грамотрицательные клетки Р. multocida, их выраженную капсулу и биполярность. В сравнении с традиционным вариантом, предлагаемую методологию отличают объективность исследования, достоверность результата, минимизация материальных затрат и рабочего время.The morphogenesis of P. multocida bacteria in the natural infection and in the experimental (close to natural infection) was the same. In particular, on the mucosa at the gates of infection with a sharp change in the ambient temperature (mainly air and drinking water), the pasteurella quickly lost the capsule, bipolarity, decreased, took the form of relatively equal in size small coccobacteria and penetrated into the blood (bloodstream) of a dense network of capillaries of the connective tissue layer of mucous membranes. With the development of septicemia, at elevated body temperature, P. multocida was detected as capsule-free coccobacteria. It is continuously characterized by hematogenous division and dissemination (generalization) with a sign of free secretion of exometabolite (according to electron microscopy, the same substance as capsular) in a lethal dose to the bird. Since the death of an infected individual, as its corpse cools, and the temperature decreases simultaneously, the exometabolite takes on a viscous consistency and remains more and more on the P. multocida cell in the form of a forming capsule. In this case, the bacterium is divided in half into two daughter ones, which, around and oppositely excreting the exometabolite, take on a convex-concave shape, plastic and in tension. Traditionally, this is mistakenly characterized by selective staining of the poles and the unstained middle of the bacterium, meaning “bipolar bacillus”, “bipolar” or simply “bipolarity phenomenon”. However, the liquid phase of the medium greatly affects the sign of bipolarity of P. multocida. "Bipolar" in the blood from the heart of a corpse, when introduced into ordinary water and other liquid media, quickly (within 3-5 s) disintegrate. P. multocida cells that are convexly concave in shape and in tension immediately lose their pairing and are formed into cocco- and diplococcus-like. After lightly shaking the material in a liquid medium, the diplococco-like forms of bacteria break up into cocco-like ones. Therefore, the “bipolar" or "bipolar bacillus" of P. multocida is a two-cell structure in a capsule that quickly and easily loses its relationship and takes a spherical shape (especially in a liquid medium). However, for the indication and identification of P. multocida, the capsule and sign of bipolarity should still be considered indicators important for diagnosis and taxonomy. Nevertheless, due to the decay of the pair structure of pasteurellae, the detected pathogen of pasteurellosis of birds is more often presented in the form of cocci of different sizes, which complicates the indication and identification as the first stage of diagnosis. The formation of P. multocida cells (including capsule formation) occurs when the ambient temperature changes and is due to the functional state of the bacterium. The severity of the capsule and bipolarity of P. multocida in the corpse of a naturally infected individual depends on the period after its death, body weight and the depth of sampling of infectious material from it, on the ambient temperature and the phase of the medium (solid or liquid). Based on the established regularity of the formation of P. multocida, for the accuracy of detection of this bacterium, the standard of optimal conditions for the selection and study of pathological material is selected and recommended for use in laboratory practice. In an infection close to natural with a body mass of a fallen specimen of about 350 g, cooled at an ambient temperature of 20 ± 1 ° С (optimum), the corpse is opened after 3 hours from the moment of death, a blood sample is taken from the heart and preparations are prepared with staining according to generally accepted methods ( Burri, Romanovsky-Giemsa, Gram). Microscopy of the preparations records gram-negative cells of P. multocida, their pronounced capsule and bipolarity. Compared with the traditional version, the proposed methodology is distinguished by the objectivity of the study, the reliability of the result, minimization of material costs and working time.

Пример 3Example 3

Возбудитель пастереллеза P. multocida (в разном состоянии морфологических и биологических свойств по причине диссоциации), содержащийся в подлежащем исследованию инфекционном материале (пример 1), восстанавливали в пассаже через восприимчивый организм. Ввиду функциональной морфо- и термолабильности P. multocida, принципиальное значение в восстановлении ее штаммов представляли: путь заражения, масса тела восприимчивого организма, инфицирующий материал, температура окружающей среды (при заражении организма и при остывании трупа соответственно), время вскрытия трупа после смерти организма, глубина точки отбора материала из трупа для бактериологического исследования. Во всех случаях инфицирующим материалом служила кровь сердца в объеме 0,1 см³ (две капли), взятая у зараженного голубя/кролика массой тела около 350 г через 3 ч после смерти при температуре хранения трупа 20±1°С (оптимум). Для ее получения подлежащий исследованию инфекционный материал, отмеченный в примере 1, в каждом случае соответственно дробно высевали на плотную питательную среду (ТУ 9398-020-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С и культивировали при 37°С. Из выросших колоний (чаще М- и реже S- и R-форм) отбирали типичную М-формы и пересевали на питательный бульон (ТУ 9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С. Посев культивировали 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20±1°С. Клонированную таким способом 10-20 - часовую бульонную культуру внутримышечно вводили голубю/кролику в дозе 0,3-0,5 мл (вспомогательный пассаж). Кровью сердца погибшего голубя/кролика заражали следующего голубя/кролика способом близким к естественному инфицированию - на слизистую оболочку носовой и глоточной полостей (основной пассаж). Восприимчивый организм заражали при 20±1°С, а затем содержали при 10±1°С. С момента его гибели и по взятие крови из сердца труп остывал 3 ч при температуре 20±1°С окружающей среды. Наличие выражено капсулированных клеток P. multocida в крови сердца трупа принимали за косвенный показатель восстановления микроорганизма и как признак своевременной его изоляции.The causative agent of pasteurellosis P. multocida (in a different state of morphological and biological properties due to dissociation) contained in the infectious material to be studied (Example 1) was restored in the passage through a susceptible organism. In view of the functional morphological and thermolability of P. multocida, the principal role in the restoration of its strains was: the path of infection, the body weight of the susceptible organism, the infectious material, the ambient temperature (during infection of the body and cooling of the corpse, respectively), the time of opening the corpse after the death of the organism, depth of the point of selection of material from the corpse for bacteriological research. In all cases, the infective material was heart blood in a volume of 0.1 cm ³ (two drops) taken from an infected pigeon / rabbit weighing about 350 g 3 hours after death at a storage temperature of the corpse of 20 ± 1 ° C (optimum). To obtain it, the infectious material to be studied, noted in Example 1, in each case, respectively, was fractionally sown on a solid nutrient medium (TU 9398-020-78095326-2006, pH 7.2-7.4) at 20 ± 1 ° C and cultivated at 37 ° C. Typical M-forms were selected from grown colonies (usually M- and less often S- and R-forms) and transferred to nutrient broth (TU 9398-021-78095326-2006, pH 7.2-7.4) at 20 ± 1 ° WITH. Sowing was cultivated for 9-19 hours at 37 ° C and 1 hour at 20 ± 1 ° C. A 10-20 hour broth culture cloned in this way was injected intramuscularly with a pigeon / rabbit at a dose of 0.3-0.5 ml (auxiliary passage). The blood of the heart of the dead pigeon / rabbit was infected with the next pigeon / rabbit in a manner close to natural infection - on the mucous membrane of the nasal and pharyngeal cavities (main passage). The susceptible organism was infected at 20 ± 1 ° C, and then kept at 10 ± 1 ° C. From the moment of his death and taking blood from the heart, the corpse cooled down for 3 hours at a temperature of 20 ± 1 ° С of the environment. The presence of expressed encapsulated P. multocida cells in the blood of a corpse heart was taken as an indirect indicator of the microorganism's recovery and as a sign of its timely isolation.

Пример 4Example 4

Восстановленный микроорганизм, в виде выражено капсулированных клеток P. multocida (пример 3), биологически изолировали в условия анабиоза для сохранения исходной идентичности на момент получения, оценки и применения его в качестве чистой культуры. В частности, через 3 ч с момента смерти голубя/кролика при 20±1°С (оптимум) окружающей среды (основной пассаж, пример 3) брали пробу крови из сердца трупа и 0,2 мл (4 капли) ее сразу вносили в 1,8 мл стерильной воды (20±1°С). Содержимое пробирки встряхивали 1 мин, переводя во взвесь, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость считали изолятом выражено капсулированных пастерелл из крови в разведении 10^-1 и готовили его разведения 10^-2 и 10^-3 на стерильной воде. Изолят пастерелл из разведений 10^-2 и 10^-3 соответственно высевали на питательный агар (ТУ 9398-020-78095326-2006, рН 7,2-7,4) и питательный бульон (ТУ 9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4) при 20±1°С. Посевы культивировали и получали 10-20 - часовую (9-19 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) чистую культуру пастерелл первой генерации после организма, которую оценивали по морфологическим и биологическим свойствам. Кроме того, изолят пастерелл на чистой воде в разведении 10^-2 и 10^-3 изолировали от атмосферного воздуха, запаивая в предварительно приготовленные из пастеровских пипеток ампулы, что обеспечивало возможность сохранять идентичность его морфологических и биологических свойств в течение 10 суток (срок наблюдений). В результате было доступно получить повторно чистую культуру микроорганизма в исходном (восстановленном) его качестве и провести дополнительные исследования.The recovered microorganism, in the form of pronounced encapsulated P. multocida cells (Example 3), was biologically isolated under suspended animation conditions to preserve the original identity at the time of its preparation, evaluation and use as a pure culture. In particular, 3 hours after the death of the pigeon / rabbit at 20 ± 1 ° C (optimum) of the environment (main passage, example 3), a blood sample was taken from the heart of the corpse and 0.2 ml (4 drops) was immediately added to 1 8 ml of sterile water (20 ± 1 ° C). The contents of the tube were shaken for 1 min, suspended, then centrifuged for 5 min at 1500 rpm. The supernatant was considered an isolate of expressed encapsulated pasteurellas from blood at a dilution of 10 ^-1 and dilutions of 10 ^-2 and 10 ^-3 were prepared in sterile water. Pasteurella isolate from dilutions 10 ^-2 and 10 ^-3, respectively, was plated on nutrient agar (TU 9398-020-78095326-2006, pH 7.2-7.4) and nutrient broth (TU 9398-021-78095326-2006, pH 7 , 2-7.4) at 20 ± 1 ° С. Crops were cultivated and received a 10-20 - hour (9-19 h at 37 and 1 h at 20 ± 1 ° C) pure culture of pasteurellas of the first generation after the organism, which was evaluated by morphological and biological properties. In addition, the pasteurella isolate in pure water at a dilution of 10 ^-2 and 10 ^{-3 was} isolated from atmospheric air, sealed in ampoules previously prepared from Pasteur pipettes, which made it possible to maintain the identity of its morphological and biological properties for 10 days (observation period). As a result, it was possible to obtain a re-pure culture of the microorganism in its original (restored) quality and to conduct additional research.

Пример 5Example 5

На основе единой (стандартизированной) методологии выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллеза P. multocida из инфекционного материала (согласно примерам 3 и 4) результаты оценки ее морфологических и биологических свойств в каждом случае бактериологического исследования, как правило, не отличались.Based on a unified (standardized) methodology for isolating a pure culture (strain) of the pathogen of pasteurellosis P. multocida from infectious material (according to examples 3 and 4), the results of evaluating its morphological and biological properties in each case of bacteriological research, as a rule, did not differ.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии роста на плотной питательной среде. В посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза (по примеру 3 и 4) регистрировали строго типичной морфологии сплошной рост популяции и однотипные колонии пастерелл. В частности, на ровно застывшем в чашках Петри питательном агаре это весьма нежный, прозрачный, чуть с голубоватым опенком в косо проходящем свете сплошной рост культуры P. multocida и гладкие, прозрачные, круглые, 0,5-1,5 мм в диаметре, отдельно растущие колонии бактерий S-формы. На скошено застывшей среде в пробирках устанавливали такие же отдельно растущие колонии в виде «росинок» и сплошной так называемый «росинчатый» рост чистой культуры P. multocida. Все изоляты пастерелл первой генерации после организма имели идентичную морфологию роста - в виде S-формы.A pure culture (strain) of the pathogen of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of the first generation after the organism was evaluated by the morphology of growth in a dense nutrient medium. In the crops of the isolate / isolates of the causative agent of pasteurellosis (according to examples 3 and 4), a strictly typical morphology was recorded continuous growth of the population and the same type of colonies of pasteurellosis. In particular, on nutrient agar evenly frozen in Petri dishes, this is a very delicate, transparent, slightly bluish open-air mushroom in oblique light continuous growth of P. multocida culture and smooth, transparent, round, 0.5-1.5 mm in diameter, separately growing colonies of S-shaped bacteria. The same separately growing colonies in the form of “dewdrops” and the continuous so-called “dewdrop” growth of a pure culture of P. multocida were established on testified stubborn solidified medium in test tubes. All isolates of pasteurellas of the first generation after the organism had identical growth morphology - in the form of an S-form.

Контрольные посевы инфекционного материала, отмеченного в примере 1, при традиционном методе бактериологического исследования показали отличие морфологии роста выделяемых чистых культур Р. multocida. В частности, в посеве проб органов и тканей от павших и вынужденно убитых из очагов пастереллеза в основном наблюдали сплошной рост культуры и отдельно растущие колонии пастерелл S-формы. Однако среди такого роста нередко регистрировали единичные колонии пастерелл М-формы (слизистые, непрозрачные, не чисто белого цвета на естественном свету, круглые, 1,5-3,0 мм в диаметре) и R-формы (шероховатые, непрозрачные, не чисто белого цвета на естественном свету, с неровными краями). Также и в аналогичных бактериологических посевах проб инфекционного материала, но непосредственно, а прямо из вскрытых трупов, регистрировали тоже разное соотношение этих форм колоний пастерелл, что не находило объективного объяснения. Поэтому, учитывая функциональную морфо- и термолабильность P. multocida, в последующем выполняли посев инфекционного материала только при наибольшей глубине точки его отбора из трупа, то есть - пробу крови сердца, взятую и сразу используемую при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. В случаях, если отбор и посев проб материала выполняли сразу же после (или же в момент) естественной смерти или вынужденного убоя зараженного, то на газоне питательной среды получали, как правило, слабый рост популяции или единичные колонии пастерелл только S-формы. Однако в посеве проб крови сердца, отобранных из почти остывших трупов, получали выраженный сплошной рост и много отдельно растущих колоний пастерелл S-формы, среди которых лишь изредка наблюдали единичные колонии пастерелл М-формы. В посевах проб крови сердца, отобранных после полного остывания и окоченения трупов и далее через разное посмертное время (с каждым последующим учетом результатов), среди большинства колоний пастерелл S-формы с каждым разом все больше обнаруживали колонии пастерелл М-формы. Затем, еще позже, с каждым последующим посевом инфицированной крови сердца трупа, среди доминирующих в популяции колоний пастерелл S-и М-форм все больше обнаруживали колонии пастерелл R-формы.The control cultures of the infectious material noted in Example 1 with the traditional method of bacteriological studies showed a difference in the growth morphology of the secreted pure cultures of P. multocida. In particular, in the sowing of samples of organs and tissues from fallen and forcibly killed from the foci of pasteurellosis, continuous growth of the culture and separately growing S-shaped pasteurell colonies were mainly observed. However, among such growth, single M-shaped pasteurell colonies were often recorded (mucous, opaque, not pure white in natural light, round, 1.5-3.0 mm in diameter) and R-forms (rough, opaque, not pure white colors in natural light, with uneven edges). Also in similar bacteriological crops of samples of infectious material, but directly, and directly from the opened corpses, a different ratio of these forms of pasteurella colonies was also recorded, which did not find an objective explanation. Therefore, taking into account the functional morphological and thermolability of P. multocida, the infectious material was subsequently inoculated only at the maximum depth of the point of its selection from the corpse, i.e., a heart blood sample taken and immediately used at 20 ± 1 ° С (optimum) environment . In cases where the sampling and sowing of material samples was carried out immediately after (or at the time) the natural death or forced slaughter of the infected, then, as a rule, a weak population growth or only S-shaped pasteurell colonies were obtained on the nutrient medium lawn. However, in the sowing of heart blood samples taken from almost cooled corpses, a pronounced continuous growth and many separately growing S-shaped pasteurell colonies were obtained, among which only a few M-shaped pasteurell colonies were observed. In the cultures of heart blood samples taken after complete cooling and rigor mortis of the corpses and then after different posthumous time (with each subsequent consideration of the results), among the majority of S-shaped pasteurell colonies, M-shaped pasteurell colonies were more and more found each time. Then, even later, with each subsequent sowing of the infected blood of the corpse’s heart, among the colonies of pasteurellas S and M forms dominating in the population, colonies of pasteurellas of R form were increasingly found.

В контрольных посевах экспериментально воспроизведенного в заражении инфекционного материала (без соблюдения условий восстановления и биологической изоляции штаммов P. multocida) получали примерно такие же результаты исследований, как и в посевах материала из очагов пастереллеза. Кроме того, если трупы хранили при 6-8°С в холодильнике, то с течением время (до 2-5 суток), с каждым последующим отбором и посевом проб крови сердца наблюдали среди по-прежнему доминирующих в популяции колоний пастерелл S-формы значительное увеличение численности колоний пастерелл М-формы. В целом это позволило утверждать, что после организма P. multocida быстро адаптируется к меняющимся условиям в трупе, сравнительно быстро изменяясь по морфологии роста, что на питательной среде наглядно проявляется явлением диссоциации (появления в популяции бактерий особей, отличающихся от исходного типа внешним видом и структурой колоний).In the control crops of experimentally reproduced infectious material in infection (without observing the conditions of recovery and biological isolation of P. multocida strains), approximately the same research results were obtained as in crops of material from foci of pasteurellosis. In addition, if the corpses were stored at 6-8 ° C in the refrigerator, then over time (up to 2-5 days), with each subsequent sampling and sowing of blood samples of the heart, among the S-form pasteurell colonies still dominant in the population, a significant increase in the number of colonies of pasteurellar M-form. On the whole, this allowed us to state that after the organism P. multocida quickly adapts to changing conditions in the corpse, changing relatively rapidly in growth morphology, which on the nutrient medium is clearly manifested by the phenomenon of dissociation (appearance of individuals in the bacterial population that differ from the initial type in appearance and structure colonies).

В контрольных посевах длительно хранящихся в коллекции штаммов Р. multocida (т.е. непосредственно из условий их хранения) наблюдали рост колоний только М- и R-форм. В частности, при длительном хранении культур микроорганизмов в сахарозо-желатиновой среде (под вакуумом при 4-6°С) в посевах регистрировали, как правило, колонии пастерелл М-формы, а при хранении на питательном бульоне (под столбиком 1 см вазелинового масла при 18-22°С) - колонии пастерелл М- и R-форм.In the control crops for a long time stored in the collection of P. multocida strains (i.e., directly from the storage conditions), only M- and R-type colonies were observed to grow. In particular, during long-term storage of microorganism cultures in a sucrose-gelatinous medium (under vacuum at 4-6 ° С) colonies of pasteurellum M-form were usually recorded in crops, and when stored in nutrient broth (under a column of 1 cm of liquid paraffin 18-22 ° C) - pasteurell colonies of M- and R-forms.

Практически важным результатом установили, что P. multocida (при S-форме колоний в контроле) в изоляции от атмосферного воздуха на стерильной воде сохраняется по морфологии микробной клетки и морфологии роста на питательной среде идентичной исходной в течение 10 суток (срок наблюдений). Это обусловлено временным прекращением ее обмена веществ и энергии, то есть явлением анабиоза, что использовано в примере 4.A practically important result was found that P. multocida (in the S-form of colonies in control) is isolated from atmospheric air in sterile water by the morphology of the microbial cell and the growth morphology on the nutrient medium identical to the initial one for 10 days (observation period). This is due to the temporary cessation of its metabolism and energy, that is, the phenomenon of suspended animation, which is used in example 4.

Таким образом, морфология роста P. multocida в контрольных посевах на плотной питательной среде показывает выраженную (быстро происходящую) изменчивость бактерии в инфекционном материале, что подтверждает целесообразность выделения ее чистой культуры с соблюдением условий восстановления и биологической изоляции согласно примерам 3 и 4.Thus, the growth morphology of P. multocida in control crops on a solid nutrient medium shows the expressed (rapidly occurring) variability of the bacterium in the infectious material, which confirms the feasibility of isolating its pure culture in compliance with the recovery conditions and biological isolation according to examples 3 and 4.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии роста на жидкой питательной среде. В посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза (по примеру 3 и 4) регистрировали строго типичной морфологии рост популяции пастерелл на бульоне. В частности, это весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий P. multocida при 37°С, в обычных условиях при 15-25 (оптимум 20±1)°С оседающих на дно пробирки не ранее чем через 5, а под столбиком вазелинового масла - через 10 суток. Важно, что в первом случае осадок бактерий слизистый, при легком встряхивании пробирки поднимающийся в виде «нежной косички», а во втором - в виде «пуговки» диаметром до 2-3 мм, при легком встряхивании пробирки свободно переходящий в исходную их взвесь. Оба морфологических признака чистой культуры P. multocida первой генерации после организма, формирующихся в зависимости от доступа атмосферного воздуха и температуры окружающей среды, имеют существенное диагностическое и таксономическое значение. Все изоляты пастерелл первой генерации после организма идентифицировали по морфологии роста в S-форме.A pure culture (strain) of the pathogen of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of the first generation after the organism was evaluated by the morphology of growth in a liquid nutrient medium. In the crops of the isolate / isolates of the causative agent of pasteurellosis (according to examples 3 and 4), a strictly typical morphology of the growth of the pasteurella population in the broth was recorded. In particular, this is a very gentle growth of P. multocida bacterial culture at 37 ° С, especially distinguished by a turquoise hue, under normal conditions, at 15–25 (optimum 20 ± 1) ° С, the tubes settling to the bottom of the tube no earlier than after 5, but under the column Vaseline oil - after 10 days. It is important that in the first case, the bacterial sediment is mucous, with a slight shaking of the tube rising in the form of a “soft pigtail”, and in the second - in the form of a “button” with a diameter of up to 2-3 mm, with light shaking of the tube freely passing into their original suspension. Both morphological characters of the pure culture of P. multocida of the first generation after the organism, which are formed depending on the access of atmospheric air and ambient temperature, have significant diagnostic and taxonomic significance. All isolates of the first generation pasteurells after the organism were identified by S-form growth morphology.

Контрольные посевы инфекционного материала, отмеченного в примере 1, в частности, проб органов и тканей от павших и вынужденно убитых из очагов пастереллеза и в экспериментальном заражении, при традиционном методе бактериологического исследования в основном показали типичной морфологии рост культуры P. multocida. Тем не менее, изредка наблюдали и интенсивное помутнение среды, что можно было бы принять за рост смешанной культуры. Однако, в таких случаях, в контрольных посевах на ровно застывшем в чашках Петри питательном агаре устанавливали, как правило, рост колоний пастерелл S-, М- и R-форм. Кроме этого подобное интенсивное помутнение среды получали в контрольных посевах длительно хранящихся в коллекции культур микроорганизмов, непосредственно из условий их хранения (обычно на питательном бульоне под столбиком вазелинового масла). Дробным методом посева этих культур на питательном агаре каждый раз получали рост колоний пастерелл М- и R-форм.The control cultures of the infectious material noted in Example 1, in particular, samples of organs and tissues from fallen and forcibly killed from the foci of pasteurellosis and in experimental infection, using the traditional method of bacteriological research mainly showed a typical morphology of the growth of P. multocida culture. Nevertheless, an intense turbidity of the medium was occasionally observed, which could be mistaken for the growth of a mixed culture. However, in such cases, in control crops on nutrient agar evenly frozen in Petri dishes, as a rule, the growth of S-, M- and R-shaped pasteurell colonies was established. In addition, such intense turbidity of the medium was obtained in control crops of microorganisms stored for a long time in the culture collection, directly from the conditions of their storage (usually on a nutrient broth under a column of liquid paraffin). Fractional method of sowing these cultures on nutrient agar each time received the growth of colonies of pasteurell M-and R-forms.

Сделан вывод: рост культуры P. multocida в виде интенсивного помутнения среды - есть признак ее диссоциации (переход из S- формы в М- и R-формы). Выраженная изменчивость P. multocida в пробах патологического материала (в органах и тканях) и в целом трупе подтверждает необходимость выделения ее чистой культуры с соблюдением условий восстановления и биологической изоляции согласно примерам 3 и 4.The conclusion is drawn: the growth of P. multocida culture in the form of intense turbidity of the medium is a sign of its dissociation (transition from S-form to M- and R-forms). The pronounced variability of P. multocida in samples of pathological material (in organs and tissues) and in the whole corpse confirms the need to isolate its pure culture in compliance with the recovery conditions and biological isolation according to examples 3 and 4.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали по морфологии микробной клетки. Индикацию клеток P. multocida вели посредством световой и электронной микроскопии препаратов по общепринятым методам. В частности, по примеру 4, в посевах изолята/изолятов возбудителя пастереллеза на питательном бульоне, в 9-19 - часовой чистой бактериальной культуре (в конце культивирования при 37°С) выявляли строго типичной морфологии клетки пастерелл. Это были грамотрицательные, относительно равные по величине маленькие коккобактерии, не имеющие капсулу (при окраске по методу Бурри) и биполярность (при окраске по Романовскому-Гимза). В бактериальной культуре по истечении 1 ч снижения температуры культивирования с 37°С на 20±1°С (оптимум) у пастерелл в виде маленьких коккобактерий сформировывалась капсула. Во всех случаях исследования морфологии клетки P. multocida первой генерации после организма в посевах изолята/изолятов по примеру 4 результаты микроскопии были идентичными.A pure culture (strain) of the pathogen of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of the first generation after the organism was evaluated by the morphology of the microbial cell. P. multocida cells were indicated by light and electron microscopy of the preparations according to generally accepted methods. In particular, according to example 4, in the cultures of the isolate / isolates of the causative agent of pasteurellosis in nutrient broth, in a 9-19 hour clean bacterial culture (at the end of cultivation at 37 ° C), a strictly typical morphology of pasteurella cells was revealed. These were gram-negative, small coccobacteria relatively equal in size, lacking a capsule (when stained by the Burri method) and bipolarity (when stained according to Romanovsky-Giemsa). In a bacterial culture, after 1 hour of lowering the cultivation temperature from 37 ° C to 20 ± 1 ° C (optimum), a capsule was formed in the form of small coccobacteria in pasteurella in the form of small coccobacteria. In all cases of the morphology of the cell of P. multocida of the first generation after the organism in the cultures of the isolate / isolates according to example 4, the microscopic results were identical.

Согласно примеру 4, при культивировании изолята/изолятов возбудителя пастереллеза P. multocida на питательном бульоне (9-19 ч при 37°С и 1 ч 20±1°С) брали пробы культур и готовили препараты с окраской по общепринятым методам (Бурри, Романовского-Гимза, Грама). По каждому препарату исследовали не менее 10 полей зрения микроскопа. В каждом случае исследования бактериальной культуры (при 37°С культивирования) выявляли строго типичной морфологии клетки пастерелл. Это были грамотрицательные, относительно равные по величине маленькие коккобактерии, не имеющие капсулу (при окраске по Бурри) и биполярность (при окраске по Романовскому-Гимза). Однако в приготовленных препаратах из этих же культур через 1 ч при 20±1°С, как правило, выявляли диплококкоподобные бактерии в капсуле. Это обусловлено тем, что экзометаболит P. multocida, обретая при снижении температуры культивирования вязкую консистенцию, остается на поверхности клетки бактерии в виде капсулы. При этом бактериальная клетка успевает поделиться на две дочерние.According to example 4, when culturing the isolate / isolates of the causative agent of pasteurellosis P. multocida on nutrient broth (9-19 h at 37 ° C and 1 h 20 ± 1 ° C), culture samples were taken and preparations with staining were prepared according to generally accepted methods (Burri, Romanovsky Giemsa, Gram). For each preparation, at least 10 fields of view of the microscope were examined. In each case, bacterial culture studies (at 37 ° C cultivation) revealed a strictly typical morphology of pasteurell cells. These were gram-negative, small coccobacteria relatively equal in size, lacking a capsule (when stained according to Burri) and bipolarity (when stained according to Romanovsky-Giemsa). However, in prepared preparations from the same cultures, after 1 h at 20 ± 1 ° С, as a rule, diplococcus-like bacteria in a capsule were detected. This is due to the fact that the exometabolite P. multocida, acquiring a viscous consistency when the cultivation temperature is lowered, remains on the surface of the bacterial cell in the form of a capsule. In this case, the bacterial cell manages to be divided into two daughter cells.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали на патогенность. При интраназальном заражении птиц (разных видов и возрастов) на слизистую оболочку носовой и ротоглоточной полостей в дозе 0,5 мл (по 0,25 мл в обе ноздри) чистой бульонной культуры пастерелл первой генерации наблюдали характерные клинические признаки заболевания пастереллезом. Как правило, через 10-36 ч после заражения птицы погибали. При вскрытии трупов устанавливали типичные патологоанатомические изменения острого течения пастереллеза. Гибель белых мышей, зараженных при интраназальном введении культуры в дозе 0,1 мл, отмечали через 16-24 ч.A pure culture (strain) of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of the first generation after the organism was evaluated for pathogenicity. During intranasal infection of birds (of different species and ages) on the mucous membrane of the nasal and oropharyngeal cavities at a dose of 0.5 ml (0.25 ml in each nostril) of pure broth culture of the first generation pasteurellas, characteristic clinical signs of pasteurellosis were observed. Typically, 10-36 hours after infection, the birds died. At autopsy, typical pathological changes in the acute course of pasteurellosis were established. The death of white mice infected with intranasal culture at a dose of 0.1 ml was noted after 16-24 hours.

Чистую культуру (штамм) возбудителя пастереллеза P. multocida первой генерации после организма оценивали на микробный антагонизм. Изолят/изоляты пастереллы из крови сердца на стерильной воде в разведении 10^-3 (согласно примеру 3 и 4) высевали по 0,5 мл на 4,5 мл питательного бульона в пробирках и, не закрывая ватно-марлевыми пробками, оставляли открытыми. Часть посевов сразу помещали в термостат на культивирование при 37°С, а часть оставляли при 15-25°С окружающей среды на 20-24 ч для контаминации микрофлорой воздуха и далее также культивировали. Как правило, в обоих случаях бактериологического исследования получали чистую культуру P. multocida первой генерации после организма, типичной морфологии роста и типичной морфологии микробной клетки, характеризующуюся высокой вирулентности. В контрольном посеве на плотной питательной среде в чашках Петри культура подтверждалась чистотой.A pure culture (strain) of the causative agent of pasteurellosis P. multocida of the first generation after the body was evaluated for microbial antagonism. Isolates / isolates of pasteurella from the blood of the heart in sterile water at a dilution of 10 ^-3 (according to examples 3 and 4) were sown in 0.5 ml per 4.5 ml of nutrient broth in test tubes and, not closing with cotton-gauze plugs, left open. Part of the crops was immediately placed in a thermostat for cultivation at 37 ° C, and part was left at 15-25 ° C of the environment for 20-24 hours to be contaminated with air microflora and then also cultivated. As a rule, in both cases of bacteriological research, a pure culture of P. multocida of the first generation after the organism, typical growth morphology and typical microbial cell morphology, characterized by high virulence, was obtained. In the control culture on solid nutrient medium in Petri dishes, the culture was confirmed by purity.

Источники информацииSources of information

1. Бакулин В.А. Кн.: Болезни птиц. - Санкт-Петербург, 2006. С. 256, 270.1. Bakulin V.A. Book: Diseases of birds. - St. Petersburg, 2006.S. 256, 270.

2. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза птиц. - М.: Россельхозиздат, 1979. С. 4-5; 41-44.2. Borisenkova A.N. Prevention of bird pasteurellosis. - M .: Rosselkhozizdat, 1979.P. 4-5; 41-44.

3. Буткин Е.И. Пастереллез (холера) птиц. - М.: Колос, 1972. С. 48, 50, 61-66, 92-97.3. Butkin E.I. Pasteurellosis (cholera) of birds. - M .: Kolos, 1972.P. 48, 50, 61-66, 92-97.

4. Вет. энциклопедия. - М., 1972. Т. 3. С. 773.4. Vet. encyclopedia. - M., 1972.Vol. 3.P. 773.

5. Вет. энциклопедия. - М., 1973. Т. 4. С. 836-837.5. Vet. encyclopedia. - M., 1973. T. 4.P. 836-837.

6. Вет. энциклопедический словарь. - М., 1981. С. 50; 160; 257; 378-379.6. Vet. encyclopedic Dictionary. - M., 1981.P. 50; 160; 257; 378-379.

7. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин // Сельскохозяйственная биология. - 1987. №12. С. 100-104.7. Grigoryeva G.I., Ignatov P.E. Pathogenicity factors as protective antigens in the design of vaccines // Agricultural Biology. - 1987. No. 12. S. 100-104.

8. Дейчман A.M. Природа происхождения и активизации инфекций // Энвайронментальная эпидемиология. 2011. №5. С. 813.8. Deutschman A.M. The nature of the origin and activation of infections // Environmental epidemiology. 2011. No5. S. 813.

9. Домарадский И.В. Кн.: Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М.: Медицина, 1971. С. 15-18, 32-33, 41, 46, 230.9. Domaradsky I.V. Book: Causative agents of pasteurellosis and related diseases. - M .: Medicine, 1971.P. 15-18, 32-33, 41, 46, 230.

10. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по капсульному антигену и патогенности / Каширин В.В. // Сборник научных трудов ВГНКИ ветпрепаратов. - Методы и средства диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней животных. - М. - 1985. - С. 96-99.10. Kashirin V.V. Characterization of avian strains of Pasteurella multocida by capsular antigen and pathogenicity / Kashirin V.V. // Collection of scientific works of VGNKI veterinary drugs. - Methods and tools for the diagnosis, prevention and treatment of infectious diseases of animals. - M. - 1985. - S. 96-99.

11. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по морфологии и вирулентности / Каширин В.В. // Известия Северо-Кавказского научного центра высшей школы. Естественные науки. - Ростов-на-Дону. - 1989. - №3. - С. 109-15.11. Kashirin V.V. Morphology and virulence of avian strains of Pasteurella multocida / Kashirin V.V. // Bulletin of the North Caucasian Scientific Center of Higher Education. Natural Sciences. - Rostov-on-Don. - 1989. - No. 3. - S. 109-15.

12. Каширин В.В. Объяснение феномена биполярности бактерий Pasteurella multocida// Доклады Россельхозакадемии. - 1996. - №5. С. 32-35.12. Kashirin V.V. Explanation of the phenomenon of bipolarity of bacteria Pasteurella multocida // Reports of the Russian Agricultural Academy. - 1996. - No. 5. S. 32-35.

13. Каширин В.В. Биологический принцип стандартизации штаммов бактерий возбудителя пастереллеза птиц / Каширин В.В. // «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов». Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. Департамент ветеринарии МСХ РФ, ВГНКИ ветпрепаратов. 14-15 февраля 2001 г. - М. - 2001. - С. 57-58.13. Kashirin V.V. The biological principle of standardization of bacterial strains of the causative agent of bird pasteurellosis / Kashirin V.V. // "Improving the methods of control, standardization and certification of veterinary drugs." Abstracts of the All-Russian Scientific Conference. Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation, VGNKI of Veterinary Medicines. February 14-15, 2001 - M. - 2001. - S. 57-58.

14. Каширин В.В. Морфогенез бактерий Pastrurella multocida, патогенных для птиц // Ветеринария. - 2012. №8. С. 26-30.14. Kashirin V.V. Morphogenesis of bacteria Pastrurella multocida pathogenic for birds // Veterinary medicine. - 2012. No. 8. S. 26-30.

15. Каширин В.В. Влияние температуры на патогенность Pastrurella multocida - природный механизм пастереллеза // Ветеринария. - 2014. №3. С. 28-32.15. Kashirin V.V. The effect of temperature on the pathogenicity of Pastrurella multocida - a natural mechanism of pasteurellosis // Veterinary Medicine. - 2014. No. 3. S. 28-32.

16. Каширин В.В. Методология выявления Pasteurella multocida в крови зараженных и погибших птиц // Ветеринарная патология. - 2015. №3. С. 43-49.16. Kashirin V.V. Methodology for identifying Pasteurella multocida in the blood of infected and dead birds // Veterinary pathology. - 2015. No. 3. S. 43-49.

17. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц-пастереллоносителей // Ветеринария. - 1971. №2. С. 106-107.17. Kozhevnikov EM Localization of P. multocida in the body of pasteuron carrier birds // Veterinary Medicine. - 1971. No. 2. S. 106-107.

18. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц // Ветеринария. - 1974. №1. С. 59-61.18. Kozhevnikov EM Localization of P. multocida in the body of birds // Veterinary medicine. - 1974. No. 1. S. 59-61.

19. Коркишко В.П. Роль пастереллоносительства в эпизоотологии холеры птиц // Сб. работ СКЗНИВИ. - Новочеркасск, 1968. Вып. 14. С. 35-42.19. Korkishko V.P. The role of pasteurellosis in the epizootology of bird cholera // Sat. SKZNIVI works. - Novocherkassk, 1968. Issue. 14. S. 35-42.

20. Луницин В.Г. Пастереллоносительство у пантовых оленей, некоторых видов грызунов и птиц в горном Алтае // Научн. тр. НИИ пушного звероводства и кролиководства. - Пантовое оленеводство. - М., 1984. Т. 30. С. 160-168.20. Lunitsin V.G. Pasteurellocation in antler deer, some species of rodents and birds in the Altai Mountains // Scientific. tr Research Institute of fur farming and rabbit breeding. - Antler reindeer husbandry. - M., 1984. T. 30.S. 160-168.

21. Панин А.Н., Татаринцев Н.Т. Основные требования к производственным и контрольным штаммам микроорганизмов // Ветеринария. - 1993. №4. С. 28-29.21. Panin A.N., Tatarintsev N.T. Basic requirements for production and control strains of microorganisms // Veterinary medicine. - 1993. No. 4. S. 28-29.

22. Патент на изобретение №2051970. Способ выявления бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 10 января 1996 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №5049557/13 заявл. 24.06.1992, опубл. 10.01.1996, Бюл. №1.22. Patent for the invention No. 2051970. A method for detecting bacteria Pasteurella multocida in the pasteurellosis process in birds / Zareg. in the state. image register RF January 10, 1996 // Author Kashirin V.V., Applicant and patent holder of the North Caucasus Zonal Scientific. - research. vet. institute - No. 5049557/13 stated 06/24/1992, publ. 01/10/1996, Bull. No. 1.

23. Патент на изобретение №2123531. Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 20 декабря 1998 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №93029701/13 заявл. 15.06.1993, опубл. 20.12.1998, Бюл. №35.23. Patent for invention No. 2123531. A method of increasing the virulence of bacteria Pasteurella multocida / Zareg. in the state. image register RF December 20, 1998 // Author Kashirin V.V., Applicant and patent holder of the North Caucasus Zonal Scientific. - research. vet. institute - No. 93029701/13 stated 06/15/1993, publ. 12/20/1998, Bull. Number 35.

24. Патент на изобретение №2286391. Способ биологический изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования / Зарег. в Гос. реестре изобр. РФ 27 октября 2006 г. // Автор Каширин В.В., заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский зональный науч. - исслед. вет. ин-т. - №2004122269/13 заявл. 19.07.2004, опубл. 27.10.2006, Бюл. №30.24. Patent for invention No. 2286391. The method of biological isolation of pathogenic pasteurellas to preserve at the time of use / Zareg. in the state. image register RF October 27, 2006 // Author Kashirin V.V., Applicant and patent holder of the North Caucasus Zonal Scientific. - research. vet. institute - No. 2004122269/13 stated 07/19/2004, publ. 10/27/2006, Bull. No. 30.

25. Писковой Ф.Р., Кравченко З.Н. Сохранность птичьих пастерелл на жидких средах под вазелиновым маслом // Тр. Краснодарской НИВС. Т. 3. - Краснодарское книжное издательство, 1965. С. 219-220.25. Piskovoy F.R., Kravchenko Z.N. Preservation of bird pasteurellas on liquid media under liquid paraffin // Tr. Krasnodar NIVS. T. 3. - Krasnodar Book Publishing House, 1965.S. 219-220.

26. Пустовит Г.Л. Геоклиматические факторы и пастереллез птиц // Птицеводство. 1965. №12. С. 22-24.26. Pustovit G.L. Geoclimatic factors and bird pasteurellosis // Poultry farming. 1965. No. 12. S. 22-24.

27. Селиванов А.В., Кириллов Л.В., Борисович Ю.Ф. Требования к штаммам микроорганизмов для изготовления биопрепаратов // Ветеринария. - 1980. №4. С. 33-35.27. Selivanov A.V., Kirillov L.V., Borisovich Yu.F. Requirements for microorganism strains for the manufacture of biological products // Veterinary medicine. - 1980. No. 4. S. 33-35.

28. Сердюк Н.Г., Цимох П.Ф. Роль свободноживущих птиц и грызунов в распространении пастереллеза // Ветеринария. 1970. №6. С. 53-54.28. Serdyuk N.G., Tsimokh P.F. The role of free-living birds and rodents in the spread of pasteurellosis // Veterinary Medicine. 1970. No. 6. S. 53-54.

29. Carter G.R., Rigland С.Н. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions // Canad. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1953. Vol. 17. P. 473-479.29. Carter G.R., Rigland S.N. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions // Canad. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1953. Vol. 17. P. 473-479.

30. Carter. G.R. Studies on Pasteurella multocida. 2. Identification of antigenic characteristics and colonial variants // Amer. J. Vet. Res. 1957. Vol. 18. N 66. P. 210-213.30. Carter. G.R. Studies on Pasteurella multocida. 2. Identification of antigenic characteristics and colonial variants // Amer. J. Vet. Res. 1957. Vol. 18. N 66. P. 210-213.

31. Namioka S., Murata M. Serological studies on P. multocida. 2. Characteristics of somatic (O) antigen of the organism // Cornell Vet. 1961. Vol. 51. №4. P. 507-521.31. Namioka S., Murata M. Serological studies on P. multocida. 2. Characteristics of somatic (O) antigen of the organism // Cornell Vet. 1961. Vol. 51. No. 4. P. 507-521.

32. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles // C.R. Acad. Sci. 1880. 91. P. 637-680.32. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles // C.R. Acad Sci. 1880. 91. P. 637-680.

33. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults // Avian Diseases. 1990. - Vol. 34. - P. 381-383.33. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults // Avian Diseases. 1990. - Vol. 34. - P. 381-383.

34. Rosenbusch C.T., Merchant I.A. A study of the haemorrhagic septicaemia Pasteurella // J. Bacteriology. 1939. - Vol. 37. - №1. - P. 69-89, 232-234. 16. N 4. P. 925-936.34. Rosenbusch C.T., Merchant I.A. A study of the haemorrhagic septicaemia pasteurella // J. Bacteriology. 1939. - Vol. 37. - No. 1. - P. 69-89, 232-234. 16. N 4. P. 925-936.

Claims

A method for isolating a pure culture of Pasteurella multocida pasteurellosis pathogen, including obtaining the first generation of a microorganism on an artificial medium, characterized in that an individual selected from a bird or rabbit infected from the mucous membrane of the nasal, oral, pharyngeal cavities and fallen from pasteurellosis , weighing 350 g after 3 hours, open, take a blood sample from the heart and add it to sterile water at a temperature of 20 ± 1 ° C in a ratio of 1: 9 by volume, shake the sediment and transfer it into suspension, then entrifugiruyut at 1500 rev / min 5 min; the supernatant as a pasteurella isolate from blood at a dilution of 10 ^{-1 is} diluted to 10 ^-2 , 10 ^-3 and plated at a temperature of 20 ± 1 ° C on nutrient broth and nutrient agar, the crops are cultivated for 9-19 hours at 37 ° C and 1 hour at 20 ° C.