RU2700448C1 - Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds - Google Patents
Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700448C1 RU2700448C1 RU2018134799A RU2018134799A RU2700448C1 RU 2700448 C1 RU2700448 C1 RU 2700448C1 RU 2018134799 A RU2018134799 A RU 2018134799A RU 2018134799 A RU2018134799 A RU 2018134799A RU 2700448 C1 RU2700448 C1 RU 2700448C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ornithosis
- dna
- chlamydophila psittaci
- fragment
- control sample
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у птиц, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.The invention relates to veterinary microbiology, in particular to laboratory diagnosis of infectious pathogens, and in particular to means for diagnosing infection in birds, both in the practice of the veterinary service and for scientific research.
Известен набор для определения бактерий семейства Chlamydiaceae, (патент РФ 2486255, кл. C12Q 1/68, 2013 г.), включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя хламидий, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями.A known kit for the determination of bacteria of the family Chlamydiaceae, (RF patent 2486255, class C12Q 1/68, 2013), including plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, reaction buffer, a mixture of four deoxynucleotide triphosphates, an internal control sample, positive control - recombinant plasmid containing the gene fragment of the pathogen chlamydia, synthetic oligonucleotide primers and probes labeled with dyes.
Также известен тест-система для выявления хламидий в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2241042, C12Q 1/68, 2004 г. - прототип), включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci), синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями.Also known is a test system for the detection of chlamydia in clinical samples by multiplex PCR with real-time detection (RF patent No. 2241042,
Общим недостатком известных технических решений является не достаточная чувствительность и специфичность, что влияет на достоверность диагностики выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci), являющийся возбудителем широкого спектра орнитозов.A common drawback of the known technical solutions is the lack of sensitivity and specificity, which affects the reliability of the diagnosis of DNA identification of the pathogen ornithosis (Chlamydophila psittaci), which is the causative agent of a wide range of ornithoses.
Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц.The technical result is to obtain reliable diagnosis of the pathogen DNA ornithosis (Chlamydophila psittaci) in birds.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц, включающей пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец, рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci), синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is achieved by the fact that in the test system for detecting DNA of the causative agent of ornithosis (Chlamydophila psittaci) in birds, including plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, a reaction buffer, a mixture of four deoxynucleotide triphosphates, an internal control sample, a positive control sample , a recombinant plasmid containing a fragment of the gene of the causative agent of ornithosis (Chlamydophila psittaci), synthetic oligonucleotide primers and probes labeled with dyes, according to the invention for internal ntrolnogo sample using T4 bacteriophage suspension with a concentration of 5 × 10 March copies of nucleotide sequences to 1 l, and for the positive control - a mixture of recombinant plasmid DNA containing the genome DNA ornithosis fragment (Chlamydophila psittaci) and a fragment of the T4 bacteriophage genome in the ratio 1: 1, with the following nucleotide sequences:
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) птиц проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома орнитоза (Chlamydophila psittaci) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальномвремени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.The novelty of the claimed technical solution lies in the fact that in order to obtain a reliable diagnosis of the causative agent of DNA of ornithosis (Chlamydophila psittaci) birds conduct a reaction in one PCR tube (one-tube) using oligonucleotide primers of fluorescently labeled probes specific for the genome of the ornithosis (Chlamydophila psittaci) and different types of control for which various forms of T4 bacteriophage material are used: a suspension and a fragment of the genome with specific primers and a probe. Such a real-time PCR setup reduces and simplifies the analysis procedure, reduces the risk of contamination. In addition, fluorescence detection of amplification products is carried out using the principle of cleavage of the fluorescent label at the 5 'end of the oligonucleotide probe.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемая тест-система рекомендована использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive test system is recommended for use in veterinary virology, as it relates to diagnostic tools for ornithosis (Chlamydophila psittaci) in birds, which meets the criterion of "industrial applicability".
Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 Канал HEX - для тестирования наличия ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci), фиг. 3 - таблица количественных данные для Cycling A.Green (ВКО) и для Cycling A.Yellow ((Chlamydophila psittaci)).The invention is illustrated by drawings, which show screenshots of graphs, in FIG. 1 - the FAM channel is presented - for testing the signal from the internal control sample - CTP; in FIG. 2 HEX channel - for testing the presence of DNA of ornithosis (Chlamydophila psittaci), FIG. 3 is a table of quantitative data for Cycling A.Green (EKR) and for Cycling A.Yellow ((Chlamydophila psittaci)).
Тест-система для выявления ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц используется следующим образом.A test system for detecting DNA of ornithosis (Chlamydophila psittaci) in birds is used as follows.
Для постановки одноэтапной полимеразной цепной реакции используют тест-систему, в котором в качестве внутреннего положительного контроля, используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, если соотношение будет отклоняться в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Фрагмент генома ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и фрагмент генома бактериофага Т4 представлены следующими нуклеотидными последовательностями:For a one-stage polymerase chain reaction, a test system is used in which, as an internal positive control, a suspension of bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl is used, if the concentration of copies of the nucleotide sequences deviates up or down, then observed repetition of doubtful samples. For a positive control sample, a mixture of recombinant plasmid DNAs containing a fragment of the ornithosis DNA genome (Chlamydophila psittaci) and a fragment of the bacteriophage T4 genome taken in a 1: 1 ratio is used, if the ratio deviates up or down, then duplicate samples are observed. A fragment of the DNA genome of ornithosis (Chlamydophila psittaci) and a fragment of the genome of the bacteriophage T4 are represented by the following nucleotide sequences:
Далее по накоплению флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX)/Yellow для специфического сигнала ДНК орнитоза (Chlamydophila psittaci) и FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, т.к. присутствует ДНК орнитоза, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, ДНК орнитоза отсутствует.Further, the accumulation of the fluorescent signal is measured by the channels: JOE (HEX) / Yellow for the specific DNA signal of ornithosis (Chlamydophila psittaci) and FAM / Green for the internal control signal, if the accumulation curves of the fluorescent signal go out before the 35th cycle, the reaction result is considered positive, t .to. ornithosis DNA is present, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, then the reaction result is negative, ornithosis DNA is absent.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, что повышает чувствительность и специфичность, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.The use of different forms of T4 bacteriophage material for different types of control: a suspension and a genome fragment with specific primers and a probe, is due to the fact that it allows you to control the correct course of the reaction in each tube, which increases sensitivity and specificity, and also controls the stage of DNA extraction from samples .
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.Sequence selection and calculation of the primary structure of oligonucleotide primers and probes.
Праймеры, специфичные для ДНК Chlamydophila psittaci были отобраны на основе консервативного участка гена ompA (Uncultured Chlamydia sp. clone F09 major outer membrane protein (ompA) gene, partial cds, partial sequence, MH542161.1, участок между 44 и 217) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). Выбранные участки ДНК были исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI.Primers specific for Chlamydophila psittaci DNA were selected based on the conserved region of the ompA gene (Uncultured Chlamydia sp. Clone F09 major outer membrane protein (ompA) gene, partial cds, partial sequence, MH542161.1, region between 44 and 217) and designed with using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). Selected DNA regions were examined using BLAST to confirm their specificity. Thermodynamic analysis of the selected primers was performed using Vector NTI.
Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Ch-ps-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ch-ps-F и Ch-ps-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР, были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".For detection of amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled probe Ch-ps-Z (complementary to the portion of the nucleotide sequence limited by the annealing positions of the primers Ch-ps-F and Ch-ps-R) was selected. The probe was labeled with dye R6G. To quench spontaneous fluorescence, a BHQ-1 quencher is attached at the 3'-end of the oligonucleotide probe. The main properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR, were described using the Oligo 6.0 program.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.Bacteriophage T4 having genomic DNA of the order of 169-170 thousand nucleotide pairs (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1) was used as an internal control. As a result of the analysis, a region between 400 and 500 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected; primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested using BLAST to confirm their specificity.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.To detect amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled T4P probe was selected that is complementary to the portion of the nucleotide sequence limited to the annealing positions of the T4F and T4R primers. The probe was labeled with Fam. Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц.An example of a specific use of a test system for detecting DNA of the pathogen ornithosis (Chlamydophila psittaci) in birds.
Для тест-системы используют наборы, состоящие из комплектов реагентов для проведения ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).For the test system, kits are used, consisting of sets of reagents for PCR (set No. 1) and a set of control samples (set No. 2).
Наборы выпускаются в двух вариантах:Kits are available in two versions:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);1) For analysis of 55 samples (including control samples);
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Составы наборов приведены в Таблицах 1 и 2.2) For analysis of 110 samples (including control samples). The compositions of the kits are shown in Tables 1 and 2.
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению «ПЦР-ОРНИТО3-ФАКТОР», набора реагентов для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. ТУ 21.10.60-107-51062356-2015. Для диагностики in vitro http://www.vetfaktor.ru/.The kits are used in accordance with the instructions for use of “PCR-ORNITO3-FACTOR”, a set of reagents for detecting DNA of the pathogen ornithosis (Chlamydophila psittaci) in biological material by polymerase chain reaction with fluorescence detection in real time. TU 21.10.60-107-51062356-2015. For in vitro diagnostics http://www.vetfaktor.ru/.
Для исследования используют от инфицированных возбудителем орнитоза (Chlamydophila psittaci) птиц по выбору следующий материал:For the study, birds of the choice of the following material are used from birds infected with the pathogen Ornithosis (Chlamydophila psittaci):
Мазки и соскобы слизистых оболочек (ротоглотки, конъюнктивы, клоаки). Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора; Smears and scrapings of the mucous membranes (oropharynx, conjunctiva, cloaca). Removed using a sterile probe, the probe is placed in a plastic microtube with a volume of 1.5 ml with 0.5 ml of sterile saline;
- фрагменты тканей и паренхиматозных органов павших или вынужденно убитых птиц (миндалины, селезенка, легкие, печень, кусочки плодовых оболочек). Отбирают в стерильный контейнер;- fragments of tissues and parenchymal organs of dead or compelled dead animals (tonsils, spleen, lungs, liver, pieces of fruit membranes). Selected in a sterile container;
- помет птиц, массой не менее 0,5 г, в сухой стерильный контейнер.- droppings of birds, weighing at least 0.5 g, in a dry sterile container.
Затем проводят подготовку проб. Соскобы со слизистых конъюнктивы и ротоглотки в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.Then carry out sample preparation. Scrapes from the mucous membranes of the conjunctiva and oropharynx in physiological saline are examined without prior preparation.
Исследуемые пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют пятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и отстаивают в течение 5-7 мин после чего откручивают на миницентрифуге при 1,5-2,0 тыс.об/мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.The test samples of tissues and organs are homogenized using sterile porcelain mortars and pestles, a five-fold volume of sterile saline or phosphate buffer is added and mixed thoroughly. The suspension is transferred into a test tube of 1.5 ml volume and settled for 5-7 minutes, after which it is unscrewed in a mini centrifuge at 1.5-2.0 thousand rpm. An aliquot of the supernatant (0.1 ml) is used for DNA extraction.
Из помета птиц готовят 10% суспензию в физиологическом растворе, центрифугируют при 1,5 тыс об/мин в течение 5 мин, 100 мкл надосадочной жидкости используют для экстракции ДНК. Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:A 10% suspension in physiological saline is prepared from bird droppings, centrifuged at 1.5 thousand rpm for 5 minutes, 100 μl of the supernatant is used for DNA extraction. Next, carry out an analysis consisting of three stages:
экстракция нуклеиновых кислот (НК); nucleic acid (NK) extraction;
проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени; real-time PCR reaction of RS with fluorescence detection;
учет результатов анализа. accounting of analysis results.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое - количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.For extraction (isolation) of NK from the test samples, the necessary quantity is taken - the number of disposable test tubes with a volume of 1.5 ml, including a negative control of isolation. Pipette 10 ml of an internal control sample (CKD) of the ornithosis pathogen (Chlamydophila psittaci) into each test tube containing the test sample, including a test tube for negative control (OKO), which uses a suspension of bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl
Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке. Для проведения ПЦР используют наборы позволяющие специфически амплифицировать фрагмент генома возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) и ДНК внутреннего положительного контроля (бактериофага Т4) в мультиплексной полимеразной цепной реакции. Детекция продуктов амплификации осуществляется в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.Perform one-stage PCR RT in one test tube. For PCR, kits are used that specifically amplify a fragment of the genome of the pathogen ornithosis (Chlamydophila psittaci) and DNA of the internal positive control (bacteriophage T4) in a multiplex polymerase chain reaction. Amplification products are detected in real time using the principle of cleavage of the fluorescent label at the 5 'end of the oligonucleotide probe.
Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят отрицательный контрольный образец (ОКО) (пробирку обозначают как ВК-).The test samples are introduced in the volume according to the instructions for the set for ND extraction; a negative control sample (OKO) is introduced into the test tube of the negative control of the selection instead of the test sample (the tube is designated as VK-).
Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.DNA is isolated from the analyzed and control samples according to the protocol of the manufacturer's instructions for the kit for the selection of NK.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С. Подготавливают образцы к проведению ПЦР следующим образом. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют используя положительный контрольный образец (ПКО) (Chlamydophila psittaci), внутренний контрольный образец (ВКО) (Chlamydophila psittaci) и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК (Chlamydophila psittaci) фрагмент генома бактериофага Т4 в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).Isolated DNA can be stored for one week at a temperature of 2 ° C to 8 ° C or for a year at a temperature not exceeding minus 16 ° C. Prepare samples for PCR as follows. The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the DNA sample is 10 μl. The success of the reaction is monitored using a positive control sample (PKO) (Chlamydophila psittaci), an internal control sample (CKO) (Chlamydophila psittaci) and BUFFER DNA, where a bacteriophage T4 suspension with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide is used sequences per 1 μl, and for a positive control sample (FFP), a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the DNA genome (Chlamydophila psittaci) fragment of the genome of the bacteriophage T4 in a ratio of 1: 1, taken in 5000 copies of specific fragment in 10 μl (in the ratio 1: 1).
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate tube mix the components of the kit based on each reaction:
5 мкл ПЦР смесь Chlamydophila psittaci5 μl PCR mixture of Chlamydophila psittaci
10 мкл смеси ПЦР БУФЕР Chlamydophila psittaci10 μl of PCR mixture BUFFER Chlamydophila psittaci
0,5 мкл TAQ POLYMERASE0.5 μl TAQ POLYMERASE
Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:Then mix the mixture on a vortex and drop off droplets by short centrifugation. Select the required number of tubes for amplification of the DNA of the investigated and control samples. Add 15 μl of the prepared reaction mixture. Using tips with a filter in prepared tubes make:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;a) in a test tube negative control PCR (K-) 10 μl of DNA buffer;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;b) in a series of test tubes for the samples under study - 10 μl of the DNA of the corresponding sample is added to each;
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО Chlamydophila psittaci.c) in vitro, positive PCR control (K +) - 10 μl of PKO Chlamydophila psittaci.
Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.The PCR reaction of RS is carried out with fluorescence detection.
Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor-Gene Q»For amplification was used the device "Rotor-Gene Q"
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя.Prepare the tubes prepared for PCR in the amplifier cells. Program the device according to the manufacturer's instructions.
Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фиг. 1, 3). В четырех пробах, включая клинический образец k88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фиг. 2, 3).Next, an interpretation of the analysis results is performed. In all samples except for the sample - negative sample - (K-), a fluorescence growth curve is observed (Fig. 1, 3). In four samples, including clinical sample k88_3668 and a positive control sample (+) in duplicate, a fluorescence growth curve was observed. In vitro - negative sample - (K-) - there is no fluorescence growth curve (Fig. 2, 3).
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The data obtained - the fluorescence signal accumulation curves are analyzed using the software of the device used for real-time PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The results of PCR analysis are taken into account by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value “Ct” for the test sample).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable in the case of the correct passage of positive and negative controls for amplification and DNA extraction in accordance with table 4.
Для доказательства эффективности использования предлагаемой тест-системы с применением разных видов контроля с различными формами материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом проводился сравнительный анализ чувствительности и специфичности заявляемого с прототипом. В результате исследований чувствительность и специфичность заявляемого тест-системы на 1,5-2% выше, чем у прототипа.To prove the effectiveness of the proposed test system using different types of control with different forms of material of the bacteriophage T4: suspension and a fragment of the genome with specific primers and probe, a comparative analysis of the sensitivity and specificity of the claimed prototype was carried out. As a result of the studies, the sensitivity and specificity of the claimed test system is 1.5-2% higher than that of the prototype.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018134799A RU2700448C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018134799A RU2700448C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2700448C1 true RU2700448C1 (en) | 2019-09-17 |
Family
ID=67990003
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018134799A RU2700448C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2700448C1 (en) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2241042C1 (en) * | 2003-05-08 | 2004-11-27 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for differential diagnosis of chlamydia species, chlamydophila pneumoniae and pathogens of zoonotic chlamydiosis |
RU2486255C1 (en) * | 2011-10-13 | 2013-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НаноДиагностика" | OLIGONUCLEOTIDES AND METHOD OF DETERMINING DNA OF BACTERIA BELONGING TO FAMILY Chlamydiaceae |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134799A patent/RU2700448C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2241042C1 (en) * | 2003-05-08 | 2004-11-27 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for differential diagnosis of chlamydia species, chlamydophila pneumoniae and pathogens of zoonotic chlamydiosis |
RU2486255C1 (en) * | 2011-10-13 | 2013-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НаноДиагностика" | OLIGONUCLEOTIDES AND METHOD OF DETERMINING DNA OF BACTERIA BELONGING TO FAMILY Chlamydiaceae |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2680094C1 (en) | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals | |
RU2700480C1 (en) | Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
RU2694558C1 (en) | Method for genome detection of coronavirus infection causative agent in cattle | |
RU2703401C1 (en) | Test system for detecting and genotyping rna of swine reproductive-respiratory syndrome virus | |
RU2703394C1 (en) | Method for detecting and genotyping rna of porcine reproductive-respiratory syndrome virus | |
RU2700448C1 (en) | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds | |
RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
RU2700456C1 (en) | Method for detecting dna of avnithosis agent (chlamydophila psittaci) in birds | |
RU2689718C1 (en) | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals | |
RU2701332C1 (en) | Test system for detecting chlamydial dna in livestock animals and birds | |
RU2694501C1 (en) | Test system for genome detection of rotavirus agent of type a in agricultural animals by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
RU2698662C1 (en) | Test system for detecting rna of agent of arteritis virus in horses | |
RU2700481C1 (en) | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses | |
RU2700247C1 (en) | Test system for detecting salmonella (salmonella spp.) dna in animal biological material, food products and animal and vegetable fodders | |
RU2700254C1 (en) | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
RU2700479C1 (en) | Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
RU2700381C1 (en) | Method for detecting dna of chlomydia in farm animals and birds | |
RU2700449C1 (en) | Method for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
RU2700476C1 (en) | Method for detecting salmonella (salmonella spp) dna in biological material of animals, food and animal and vegetable fodders | |
RU2703400C1 (en) | Method for detecting a genome of a brucella infection agent (brucella speciales) in farm animals | |
RU2700255C1 (en) | Test system for detecting the brucella infection agent (brucella spp) genome in farm animals | |
RU2726432C1 (en) | Test system for determining dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in biological material of animals by pcr with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel | |
RU2694499C1 (en) | Test system for detecting coronavirus infection pathogen genome in cattle by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
RU2694719C1 (en) | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |