RU2687163C1 - Полипептиды антител и их применения - Google Patents

Полипептиды антител и их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2687163C1
RU2687163C1 RU2016124229A RU2016124229A RU2687163C1 RU 2687163 C1 RU2687163 C1 RU 2687163C1 RU 2016124229 A RU2016124229 A RU 2016124229A RU 2016124229 A RU2016124229 A RU 2016124229A RU 2687163 C1 RU2687163 C1 RU 2687163C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
antibody polypeptide
prostate cancer
seq
polypeptide
Prior art date
Application number
RU2016124229A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016124229A (ru
Inventor
Пяр Оскар Вильхельмссон ТИММЕРМАНД
Аманда Туй ТРАН
Свен-Эрик СТРАНД
Урпо Юхани ЛАММИНМАКИ
Кьелл СЬОСТРЁМ
Original Assignee
Фредакс Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB1320408.6A external-priority patent/GB2520353A/en
Priority claimed from GB201401973A external-priority patent/GB201401973D0/en
Application filed by Фредакс Аб filed Critical Фредакс Аб
Publication of RU2016124229A publication Critical patent/RU2016124229A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2687163C1 publication Critical patent/RU2687163C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1075—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению терапевтических и диагностических антител. Заявлен полипептид антитела со специфичностью связывания для калликреина-2 человека (hK2). Полипептид антитела включает (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи включают аминокислотные последовательности каркасного участка от одного или нескольких антител человека. Заявлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид антитела, кодирующая тяжелую цепь полипептида антитела, кодирующая легкую цепь полипептида антитела. Заявлены также рекомбинантная клетка-хозяин для экспрессии полипептида антитела, способ получения полипептида антитела, набор и фармацевтическая композиция для лечения рака предстательной железы. Изобретение дополнительно обеспечивает применение указанных полипептидов антител в диагностике и лечении рака предстательной железы. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для лечения и диагностики рака предстательной железы. 12 н. и 68 з.п. ф-лы, 15 ил., 7 табл., 9 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится, в целом, к области терапевтических и диагностических средств и способов, в особенности, в области рака простаты.
Уровень техники
Рак предстательной железы в настоящее время представляет собой наиболее распространенную форму рака среди мужчин. Предстательная железа у мужчин - это железа величиной с грецкий орех, которая производит жидкость, представляющую собой компонент спермы. Предстательная железа имеет две или более доли, или секции, покрытые наружным слоем ткани. Предстательная железа расположена впереди от прямой кишки и немного ниже мочевого пузыря, и окружает уретру.
Самая высокая частота возникновения рака предстательной железы отмечается в северо-западной части Европы и в Соединенных Штатах. Рост опухоли, как правило, представляет собой процесс, который происходит в течение длительного периода времени. Рак простаты, как правило, представляет собой мягкую форму рака. Фактически, большинство людей, у которых был диагностирован рак простаты, выживают и выздоравливают, только меньшинство мужчин сталкивается с более агрессивной формой рака простаты, который метастазирует на ранней стадии. Данная агрессивная форма рака простаты может быть излечима, если только она была диагностирована на ранней стадии, до того, как рак распространился на экстракапсулярные ткани.
На сегодня, диагностику и мониторинг рака простаты, как правило, осуществляют путем измерения концентрации специфического антигена предстательной железы (PSA) в крови пациента. Если концентрация PSA заметно повышена в нескольких последовательных измерениях, выполненных в различные моменты времени, то это оценивают как наличие вероятности рака простаты. В этот момент времени для проверки на наличие рака простаты может быть выполнена биопсия.
PSA (также известный как калликреин III) представляет собой белок, состоящий из единственной цели из 237 аминокислот, который производится в секреторных клетках предстательной железы. Данные секреторные клетки могут быть найдены во всей предстательной железе. PSA хорошо известный и тщательно исследованный маркер в отношении рака простаты. По сравнению со здоровыми клетками продукция PSA ниже в злокачественных клетках и выше в гиперпластических клетках. Это довольно противоречиво, но фактически концентрация PSA выше в крови у мужчин, страдающих от рака простаты. Однако одним из объяснений может служить тот факт, что злокачественные клетки имеют поврежденную клеточную структуру, и поэтому их проницаемость для PSA выше.
Другая важная серинпротеаза, подходящая в качестве мишени для терапии рака простаты, представляет собой человеческий гландулярный калликреин 2 (hK2). Ген, кодирующий hK2, локализован на хромосоме 19, вместе с геном, кодирующим PSA. hK2 экспрессируется, главным образом, в ткани предстательной железы, как и PSA. В простате PSA присутствует в виде неактивной проформы и активируется под действием пептидазы hK2. Иммуногистохимическое исследование в отношении hK2 показало, что hK2 экспрессируется в зависимости от уровня дифференциации. Это означает, что hK2 экспрессируется с более высоким выходом в ткани с низкой дифференциацией, такой как ткань, затронутая раком простаты, и со сниженным выходом в ткани с высокой дифференциацией, такой как ткань, подвергнувшаяся доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН), которая представляет собой еще одну распространенную проблему простаты.
Современные методы лечения рака простаты представляют собой хирургическое вмешательство (например, радикальную простатэктомию), радиационную терапию (включая, брахитерапию и наружную дистанционную радиационную терапию, терапию высокоинтенсивным фокусированным ультразвуком (HIFU), химиотерапию, пероральные химиотерапевтические лекарственные средства, криохирургию (замораживание опухоли), гормональную терапию (такую как антиандрогенная терапия), кастрацию или комбинации вышеупомянутого.
Однако большинство из этих методов лечения (хирургическое вмешательство и наружная дистанционная радиационная терапия) только (или преимущественно) полезны для лечения первичных опухолей и крупных метастазов. Химиотерапию применяют для диссеминированного рака, но для большинства таких пациентов, это обеспечивает паллиативный эффект и/или продление выживания. Следовательно, другие или дополнительные методики лечения необходимы для достижения значительных улучшений в лечении диссеминированных злокачественных заболеваний, в особенности, в случаях микрометастазов.
Такая терапия, как иммунотерапия или радиоиммунотерапия, с применением направленных молекул, таких как антитела и фрагменты, может открыть возможность для лечения диссеминированного заболевания.
Таким образом, существует необходимость в новых терапевтических средствах и способах лечения и диагностики рака простаты.
Раскрытие изобретения
Соответственно, настоящее изобретение направлено на смягчение, облегчение или ликвидацию одного или более из указанных выше недостатков в данной области техники и недостатков в отдельности или в любой комбинации и решает, по меньшей мере, упомянутые выше проблемы, предоставляя терапевтические средства и способы в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.
Первый аспект настоящего изобретения обеспечивает полипептид антитела со специфичностью связывания для калликреин-2 (hK2) человека, в котором полипептид антитела включает
(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID N:2 и SEQ ID NO:3
CDRH1: SDYAWN SEQ ID NO: 1
CDRH2: YISYSGSTTYNPSLKS SEQ ID NO: 2
CDRH3: GYYYGSGF SEQ ID NO: 3
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6
CDRL1: KASESVEYFGTSLMH SEQ ID NO: 4
CDRL2: AASNRES SEQ ID NO: 5
CDRL3: QQTRKVPYT SEQ ID NO: 6
и в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи включают аминокислотные последовательности каркасного участка из одного или нескольких антител человека.
Приведенные выше шесть аминокислотных последовательностей представляют собой определяющие комплементарность участки (CDR) полипептидов антител изобретения, как определено в соответствии с Kabat et al., (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH, Bethesda, MD (раскрытие которой включено в настоящее описание путем отсылки).
Под термином «полипептид антитела» мы включаем в значительной степени интактные молекулы антител, одноцепочечные антитела, димерные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антител, а также антигенсвязывающие фрагменты и производные того же самого.
Термин «аминокислота», как применен в настоящем документе, включает двадцать стандартных генетически кодируемых аминокислот и их соответствующих стереоизомеров в 'D'-форме (по сравнению с природной 'L'-формой), омега-аминокислоты, другие природные аминокислоты, нетрадиционные аминокислоты (например, α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкил-аминокислоты и т.п.) и химически дериватизированные аминокислоты (смотри ниже).
Если аминокислоту конкретно перечисляют, например, «аланин» или «Ala» или «A», то термин относится как к L-аланину, так и к D-аланину, если не указано в явном виде иное. Другие нетрадиционные аминокислоты также могут представлять собой подходящие компоненты для полипептидов настоящего изобретения, до тех пор, пока полипептид сохраняет желаемое функциональное свойство. Для показанного пептида, каждый кодируемый остаток аминокислоты, в соответствующих случаях, представлен однобуквенным обозначением, соответствующим тривиальному названию обычной аминокислоты.
В одном из воплощений, полипептиды, как определены в настоящем документе, включают или состоят из L-аминокислот.
Полипептиды антител изобретения проявляют специфичность в отношении hK2.
Иллюстративная последовательность hK2 описывается как транскрипт: KLK2-201 (ENST 00000325321), продукт гена ENSG 00000167751, как указано в объединенной базе данных, которую можно найти по следующему веб-адресу в:
ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG00000167751;r=19:5137668 9-51383822; t=ENST00000325321
и которая имеет следующую последовательность:
Figure 00000001
[SEQ ID NO:7]
(подчеркнута последовательность зрелого, активного белка hK2, которому предшествует сигнальный пептид на ее N-конце и последовательность пропептида)
Большая часть hK2, найденных в семенной плазме, неактивны и находятся в комплексе с ингибитором белка С (PCI). Также возможно, что hK2 образует комплексы с другими ингибиторами внеклеточных протеаз. In vitro исследования показали, что hK2 может связываться с α2-антиплазмином (α2-АР), ACT, AMG, антитромбином III (ATIII), C1-инактиватором и ингибитором активатора плазминогена-1 (PAI-1).
В одном из воплощений, полипептид антитела обладает специфичностью в отношении свободной (то есть, не в виде комплекса) изоформы hK2 по сравнению с изоформой hK2 в виде комплекса. Связывающие группировки со специфичностью в отношении свободной изоформы hK2 могут обладать специфичностью связывания в отношении эпитопа, который экспонирован на свободной изоформе hK2, но не экспонирован на комплексной изоформе hK2, и это может быть линейный или конформационный (то есть нелинейный) эпитоп. Например, полипептид антитела может иметь специфичность к эпитопу, включающему один или несколько аминокислотных остатков, которые представляют собой часть каталитической щели hK2, которые экспонированы в свободной форме hK2 и не экспонированы в изоформе в форме комплекса, такой как форма, присутствующая в семенной жидкости, если hK2 находится в комплексе с PCI. Картирование эпитопа hK2 описано в работе
Figure 00000002
et al, Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004), раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки.
Дополнительные примеры белков hK2 идентифицируют с помощью следующих номеров доступа:
(a) GenBank: AAF08277.1;
(b) GenBank: AAF08275.1; и
(c) UniProtKB/Swiss-Prot: Р20151.1
Получение рекомбинантного hK2 описано в работе Lovgren et al., 1999, Eur. J. Biochem. 266: 1050-5 (раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки).
Под «специфичностью» мы понимаем, что полипептид антитела способен связываться с hK2 in vivo, т.е. в физиологических условиях, в которых hK2 существует внутри организма человека. Предпочтительно, полипептид антитела не связывается с каким-либо другим белком in vivo.
Такая специфичность связывания может быть определена способами, хорошо известными в данной области техники, такими как ELISA, иммуногистохимия, иммунопреципитация, Вестерн-блоты и проточная цитометрия с помощью трансфицированных клеток, экспрессирующих hK2. Преимущественно, полипептид антитела способен избирательно связываться с hK2, т.е. он связывается, по меньшей мере, в 10 раз сильнее с hK2, чем с другими белками (в особенности, с другими калликреинами, такими как специфический антиген простаты или PSA). Предпочтительно, полипептид антигена не связывает PSA in vivo.
Мышиные антитела со специфичностью в отношении hK2 известны в этой области техники. Например,
Figure 00000002
et al., 2004, Clinical Chemistry 50(9): 1607-1617 описывает получение моноклональных антител у мышей со специфичностью в отношении hK2 (раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки). Два антитела, обозначенные как «11В6» и «7D7», заявлены как селективные для hK2.
Аминокислотные последовательности компонента тяжелых и легких цепей мышиного антитела 11В6 раскрыты в международной заявке на патент № No. PCT/GB2012/052675 (WO 2013/061083; раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте); смотри, в особенности, SEQ ID NOs: 4 и 5 в этом документе.
Полипептиды антител настоящего изобретения основаны на селективной гуманизированной версии антитела 11В6, которая демонстрирует неожиданные благоприятные свойства.
В частности гуманизированные антитела изобретения проявляют повышенный терапевтический индекс по сравнению с родительским мышиным антителом 11В6 (m11B6), из которого были получены их CDR последовательности (смотри пример 6).
Под термином «повышенным терапевтическим индексом» мы подразумеваем, что полипептид антитела изобретения (гуманизированная форма антитела 11В6), при введении пациенту с опухолью простаты, обеспечивает более высокое отношение дозы, поглощенной опухолью, к дозе, поглощенной (здоровым) костным мозгом, по сравнению с родительским мышиным антителом 11В6 (сравниваемом при той же радиоактивности и при том же пути введения). Отношение поглощенных доз между опухолью и костным мозгом может быть вычислено с помощью способа, описанного в примере 6.
Неожиданно лучший терапевтический профиль антител изобретения позволяет применять более высокие дозы излучения (поглощенные дозы), что приводит к большей эффективности при лечении рака простаты без усиления побочных эффектов или 'сопутствующего ущерба' здоровым тканям и органам.
Гуманизация (также называемая реконструирование или пересадка CDR) представляет собой методику для снижения иммуногенности моноклональных антител из ксеногенных источников (как правило, из грызунов, таких как мыши) и для улучшения их способности к активации иммунной системы человека (смотри обзор Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience 13:1619-1633; раскрытия которого включены в настоящий документ путем отсылки). Существует несколько гуманизированных моноклональных антител проходящих клинические испытания, и некоторые из них были одобрены для применения в качестве лекарственных средств. Хотя техника получения сконструированного моноклонального антитела с применением приемов молекулярной биологии относительно проста, простая пересадка областей, определяющих комплементарность (CDR), грызуна в каркасные участки человека не всегда воссоздает аффинность связывания и специфичность исходного моноклонального антитела. Для гуманизации антитела, конструирование гуманизированные антитела представляет собой критическую стадию в воспроизводстве функции исходной молекулы.
Конструирование гуманизированные антитела включает несколько ключевых решений, включая выбор протяженности CDR, которые будут применены, и каркасных участков человека, которые будут применены. Однако для того, чтобы сохранить специфичностью родительского антитела, также может быть очень важно заменить один или несколько остатков из mAb грызуна в областях каркасного участка человека (так называемые обратные мутации). Определение позиции необходимых обратных мутаций требует детального анализа последовательности/структурного анализа. В последнее время стали применять библиотеки фагов для изменения аминокислот в выбранных позициях. Аналогичным образом, применяли множество подходов для выбора наиболее подходящих каркасных участков человека, в которые пересаживали CDR грызунов. В ранних экспериментах применяли ограниченное подмножество хорошо охарактеризованных моноклональных антител человека (часто, когда структура была доступна), независимо от идентичности последовательности моноклональному антителу грызунов (так называемые подход с фиксированными каркасными участками). Некоторые группы применяют вариабельные области с высокой идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельными областями грызунов (определение совпадений по гомологии или наилучшее соответствие); другие применяют консенсусные или зародышевые последовательности, в то время как другие все еще выбирают фрагменты последовательности каркасного участка в пределах каждой вариабельной области легкой или тяжелой цепи из нескольких различных моноклональные антител человека. Также существуют подходы для развития гуманизации, в которых заменяют остатки грызунов на поверхности наиболее распространенными остатками, найденными в моноклональных антителах человека («изменение поверхности» или «рекомбинация поверхностных остатков»), и те, в которых применяют различные способы определения протяженности CDR.
Однако, несмотря на обширные исследования в области гуманизации антител, оказалось, что некоторые моноклональные антитела грызунов трудно гуманизировать.
Для разработки полипептидов антител изобретения необходимы обратные мутации не только в областях каркасного участка, но также в некоторых CDR (смотри пример 1 ниже). Таким образом, шесть CDR-последовательностей, представленных выше в SEQ ID NOS: от 1 до 6, получают из мышиных анти-hK2 антител 11В6, но они содержат мутации в CDRH2 (SEQ ID NO: 2) и CDRL1 (SEQ ID NO: 4) относительно родительского мышиного антитела. Эти мутации в CDR были сделаны для придания оптимальной специфичности и стабильности на гуманизированной версии 11В6.
В одном из воплощений, полипептиды антител изобретения связывают hK2 с KD больше чем 0,1×10-9М.
Способы измерения общей аффинности (KD) и скорости ассоциации (ka) и скорости диссоциации (kd) взаимодействия (такого как взаимодействие между антителом и лигандом) хорошо известны в данной области техники. Типичные in vitro способы описаны в примере 3 ниже. Кроме того, возможно применение способов, основанных на проточной цитометрии (Sklar et al., 2002, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31: 97-119; раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки).
Преимущественно, полипептид антитела изобретения имеет аффинность (KD) к hK2 ниже, чем 1,0×10-10 М, например, KD ниже, чем 9,0×10-11 М, 8,0×10-11 М, 7,0×10-11 М, 6,0×10-11 М, 5,0×10-11 М, 4,0×10-11 М, 3,0×10-11 М, 2,0×10-11 М или ниже чем 1,0×10-11 М.
Специалистам в данной области техники понятно, что полипептиды антител изобретения могут представлять собой тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антител, и антигенсвязывающие фрагменты и производные того же самого.
В одном из воплощений, полипептид антитела включает или состоит из интактного (т.е. полного) антитела, такой как молекула IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
Преимущественно, полипептид антитела включает или состоит из интактной молекулы IgG, или антиген-связывающего фрагмента или производного того же самого.
Молекула IgG может быть любого известного подтипа, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
Под термином «антиген-связывающие фрагменты и производные» антитела мы включаем Fv фрагменты (например, одноцепочечные Fv и связанные дисульфидными связями Fv), Fab-подобные фрагменты (например, Fab фрагменты, Fab' фрагменты и F(ab)2 фрагменты) и домен антитела (например, одиночные VH вариабельные домены или VL вариабельные домены).
Например, полипептид антитела может включать или состоять из фрагмента scFv или Fab.
Еще одна характерная особенность полипептидов антител настоящего изобретения заключается в присутствии аминокислотных последовательностей каркасного участка от одного или нескольких антител человека в вариабельных областях тяжелых и легких цепей.
Под термином «последовательности каркасного участка» мы включаем области вариабельных доменов тяжелых и легких цепей, отличные от CDR. Как правило, каждый вариабельный домен включает четыре области каркасного участка, обозначаемые как FR1-FR4, в пределах которых расположены последовательности CDR:
FR1----CDR1----FR2----CDR2----FR3----CDR3----FR4
Следует принять во внимание, что аминокислотные последовательности области каркасного участка могут быть полностью человеческими или могут содержать одну или несколько обратных мутаций (т.е. аминокислотная последовательность, присутствующая в каркасном участке человека, может быть замещена аминокислотой, обнаруженной в соответствующем положении в рамках родительского вариабельного домена грызуна, из которого были получены CDR). Вследствие этого, последовательности FR1, FR2, FR3 и/или FR4 вариабельного домена(вариабельных доменов) тяжелой и/или легкой цепи полипептида антитела изобретения могут быть отличными от встречающихся в природе.
В одном из воплощений, каркасный участок последовательности полипептида антитела имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с областью каркасного участка от одного или нескольких антител человека, например, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Таким образом, полипептид антитела может включать область FR1 тяжелой цепи, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с областью FR1 антитела человека. Однако следует принимать во внимание, что тяжелые и легкие цепи полипептида антитела могут иметь идентичность последовательности с областью каркасного участка различных антител человека.
Процент идентичности можно определить, например, с помощью программы LALIGN (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357) на сайте Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html), применяя в качестве параметров опцию глобального выравнивания, матрицу замен BLOSUM62, штраф на внесение делеции в выравнивание - 14, штраф за продолжение гэпа - 4. Альтернативно, процент идентичности последовательности между двумя полипептидами может быть определен с помощью подходящих компьютерных программ, например, программа GAP группы Генетического программирования Университета штата Висконсин, и следует принять во внимание, что процент идентичности рассчитывают по отношению к полипептидам, последовательность которых была выравнена оптимально.
Альтернативно, выравнивание может быть осуществлено с помощью программы Clustal W (как описано в работе Thompson et al., 1994, Nucl Acid Res. 22: 4673-4680, которая включена в настоящий документ путем отсылки). Примененные параметры может быть следующими:
- Параметры быстрого попарного выравнивания: размер участка (K-слова) максимального совпадения; 1, окно размерного допуска; 5, штраф за пропуск в последовательности; 3, число верхних диагоналей; 5. способ количественной оценки: x проценты.
- Параметры множественного выравнивания: штраф за внесение делеции; 10, штраф за продолжение делеции; 0,05.
- Матрица замен: BLOSUM.
Альтернативно, может быть применена программа BESTFIT для определения локальных выравниваний последовательности.
В одном из воплощений, каркасный участок последовательности тяжелого вариабельного домена полипептида антитела изобретения кодируются семейством генов иммуноглобулина человека VH4.
Например, каркасный участок последовательности может кодироваться, по меньшей мере, частично, геном VH4-28 зародышевого типа (например, FR1, FR2 и FR3 может кодироваться VH4-28, и FR4 может кодироваться JH1).
Таким образом, в одном из воплощений, полипептид антитела может включать или состоять из вариабельной области тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8:
Figure 00000003
[SEQ ID NO: 8]
В одном из воплощений, каркасный участок последовательности легкого вариабельного домена полипептида антитела изобретения кодируется семейством генов иммуноглобулина человека Каппа V4.
Например, каркасный участок последовательности может кодироваться, по меньшей мере, частично, геном IgkV4-B3 зародышевого типа (например, FR1, FR2 и FR3 может кодироваться IgkV4-B3, и FR4 может кодироваться JK2).
Таким образом, в одном из воплощений, полипептид антитела может включать или состоять из вариабельной области легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9:
Figure 00000004
[SEQ ID NO: 9]
Под термином «по меньшей мере, частично» мы включаем то, что каркасный участок последовательности включает, по меньшей мере, десять смежных аминокислот, кодируемых референсным геном, например, по меньшей мере, 20 смежных аминокислот. Мы также включаем, что одна или несколько, но не все, FR-области кодируются референсным геном (например, FR1 и FR2 может кодироваться референсным геном, но не FR3).
В предпочтительном воплощении, полипептид антитела включает вариабельную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
Необязательно, полипептид антитела изобретения дополнительно включает константную область тяжелой цепи или ее часть.
В одном из воплощений, полипептид антитела включает область CH1, СН2 и/или СН3 IgG тяжелой цепи (такую как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 тяжелой цепи). Таким образом, полипептид антитела может включать часть константной области или всю константную область из тяжелой цепи IgG1. Например, полипептид антитела может представлять собой Fab-фрагмент, включающий константные области CH1 и CL.
В одном из воплощений, полипептид антитела может включать Fc-область антитела. Специалисту понятно, что часть Fc может быть из антитела IgG, или из антитела другого класса (такого как IgM, IGA, IgD или IgE). В одном из воплощений, Fc-область была из антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
Fc-область может быть природной (например, часть эндогенно продуцируемого антитела) или может быть искусственной (например, включающей одну или несколько точечных мутаций относительно природной Fc-область и/или модификации углеводных группировок в рамках СН2-домена). Fc-области с точечными мутациями, улучшающие их способность к связыванию FcR, могут давать преимущества, например, путем изменения времени полужизни в сыворотке или путем модулирования (т.е. повышения или снижения) связывания с рецепторами Fcγ (FcγR), вовлеченными в ADCC и CDC.
Преимущественно, полипептид антитела может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или ее часть:
Figure 00000005
Figure 00000006
[SEQ ID NO: 10]
Необязательно, полипептид антитела изобретения дополнительно включает константную область легкой цепи или ее часть.
В одном из воплощений, полипептид антитела включает CL-область IgG легкой цепи (такой как легкая цепь каппа или лямбда).
Например, полипептид антитела может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или ее часть:
Figure 00000007
[SEQ ID NO: 11]
Преимущественно, полипептид антитела включает константную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и константную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
В одном из предпочтительных воплощений, полипептид антитела изобретения включает:
(а) тяжелую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 (в которой вариабельная область выделена жирным шрифтом, и последовательности CDR выделены курсивом в рамке)
Figure 00000008
Figure 00000009
[SEQ ID NO: 12]
и/или
(б) легкую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 (в которой вариабельная область выделена жирным шрифтом, и последовательности CDR выделены курсивом в рамке)
Figure 00000010
[SEQ ID NO: 13]
Например, полипептид антитела может включать или состоять из двух тяжелых цепей SEQ ID NO: 12 и двух легких цепей SEQ ID NO: 13, соединенных между собой дисульфидными мостиками с образованием типичной структуры антитела IgG.
Полипептиды антител изобретения могут включать или состоять из одной или нескольких аминокислот, которые были модифицированы или дериватизированы.
Химические производные одной или нескольких аминокислот могут быть получены за счет реакции с функциональной боковой группой. Такие дериватизированные молекулы включают, например, те молекулы, в которых свободные аминогруппы были дериватизированы с образованием амина гидрохлоридов, n-толуол-сульфонильных групп, карбоксибензильных групп, трет-бутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формальных групп. Свободные карбоксильные группы может быть дериватизированы с образованием солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других типов сложных эфиров и гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы с образованием О-ацилных или О-алкильных производных. Кроме того, в качестве химических производных включают те пептиды, которые содержат природные производные аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например: 4-гидроксипролин может быть заменен на пролин; 5-гидроксилизин может быть заменен на лизин; 3-метилгистидин может быть заменен на гистидин; гомосерин может быть заменен на серии и орнитин на лизин. Производные также включают пептиды, содержащие одну или несколько вставок или делеций до тех пор, пока сохраняется требуемая активность. Другие включенные модификации представляют собой амидирование, ацилирование концевого амина (например, ацетилирование или амидирование тиогликолевой кислоты), амидирование концевой карбоксильной группы (например, аммонием или метиламином), и подобные модификации концевых групп.
Кроме того, специалистам в этой области техники понятно, что пептидомиметические соединения также могут быть полезны. Термин 'пептидомиметический' относится к соединению, которое имитирует конформацию и желательные характеристики, в особенности, пептида в качестве терапевтического средства.
Например, указанный полипептид включает не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными (-CO-NH-) связями, но также молекулы, в которых пептидная связь обращена. Такие ретро-инверсо-пептидомиметики могут быть созданы с помощью способов, известных в этой области техники, например, таких как описаны в работе in Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, которая включена в настоящий документ путем отсылки. Данный подход включает создание псевдопептидов, содержащих изменения, связанные с остовом молекулы, а не с ориентацией боковых цепей. Ретро-инверсо-пептиды, которые содержат NH-CO связи вместо CO-NH пептидных связей, гораздо более устойчивы к протеолизу. Альтернативно, указанный полипептид может представлять собой пептидомиметическое соединение, в котором один или несколько аминокислотных остатков связаны между собой -y(CH2NH)- связью вместо обычный амидной связи.
В качестве дополнительной альтернативы, в целом можно обойтись без пептидной связи, при условии, что применяют соответствующую линкерную группировку, которая сохраняет расстояние между атомами углерода аминокислотных остатков; для линкерной группировки может быть выгодным иметь в значительной степени такое же распределение заряда и в значительной степени такую же планарность как в пептидной связи.
Следует принять во внимание, что указанный полипептид может легко быть заблокирован на своем N- или С-конце для того, чтобы помочь уменьшить восприимчивость к экзо-протеолитическому расщеплению.
Разнообразные некодируемые или модифицируемые аминокислоты, такие как D-аминокислоты и N-метилированные аминокислоты, также применяют для модификации пептидов млекопитающих. Кроме того, предполагаемая биологически активная конформация может быть стабилизирована посредством ковалентной модификации, такой как циклизация или путем включения лактама или мостиков других типов, например, смотри работы Veber et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 и Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111: 166, которые включены в настоящий документ путем отсылки.
Специалистам в этой области техники понятно, что полипептиды антител изобретения могут быть дополнены функциональной группировкой для облегчения их предполагаемого применения, например, в качестве in vivo визуализирующего средства или терапевтического средства.
Таким образом, в одном из воплощений, полипептид антитела связан, непосредственно или опосредованно, с терапевтической группировкой.
Может быть применена любая подходящая терапевтическая группировка. Подходящая терапевтическая группировка - это такая группировка, которая способна снижать или ингибировать рост, или в особенности, уничтожать клетки рака предстательной железы. Например, терапевтическое средство может представлять собой цитотоксическую группировку. Цитотоксическая группировка может включать или состоять из одного или нескольких радиоизотопов. Например, один или несколько радиоизотопов каждый независимо может быть выбран из группы, состоящей из бета-излучателей, Оже-излучателей, излучателей конверсионных электронов, альфа-излучателей и излучателей фотонов малой энергии. Может быть желательно, чтобы один или несколько радиоизотопов каждый независимо обладал паттерном излучения локально поглощенной энергии, что создает высокую поглощенную дозу в непосредственной близости от средства. Типичные радиоизотопы могут включать бета-излучатели дальнего радиуса действия, такие как 90Y, 32Р, 186Re/188Re; 1б6Но, 76As/77As, 89Sr, 153Sm; бета-излучатели среднего радиуса действия, такие как 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh; бета-излучатели малых энергий, такие как 45Са или 35S; конверсионные излучатели или Оже-излучатели, такие как 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 201Tl; и альфа-излучателей, такие как 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb и 221At. Доступны и другие радионуклиды, и их можно применять в терапии.
В другом воплощении, может быть желательно, чтобы терапевтическая группировка или цитотоксическая группировка не представляла собой такую группировку, как раскрыта в качеству «меченого элемента» в WO 2006/087374 А1, в особенности, на странице 11, строки 7-15 в этом документе.
В одном из предпочтительных воплощений, полипептид антитела связан с (или иным способом помечен) радиоизотопом 177Lu.
Альтернативно, терапевтическая группировка может включать или состоять из одного или нескольких терапевтических (таких как цитотоксические) лекарственных препаратов, например, цитостатический препарат; анти-андрогенный лекарственный препарат; кортизон и его производные; фосфонат; ингибитор тестостерон-5-α-редуктазы; присоединный бор; цитокин; тапсигаргин и его метаболиты; токсин (такой как сапорин или калихеамицин); химиотерапевтическое средство (такое как антиметаболит); или любой другой терапевтический или цитотоксический лекарственный препарат, применяемый при лечении карциномы предстательной железы.
Типичные терапевтические/цитотоксические лекарственные препараты могут, например, включать:
- Цитостатики, в особенности, с дозоограничивающими побочными эффектами, включая, без ограничений, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфана, ломустин, таксаны, эстрамустинфосфат и мустаргены, антибиотики (включая доксорубицин, калихеамицины и эсперамицин), алкалоиды барвинка, азиридины, содержащие платину соединения, эндостатин, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазины, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, ферменты, замещенную мочевину, производные метил-гидразина, даунорубицин, амфифильными амины,
- Антиандрогены, такие как флутамид и бикалутамид и их метаболиты;
- Кортизон и его производные;
- Фосфонаты, такие как дифосфонат и буфосфонат;
- Ингибиторы тестостерон-5-α-редуктазы;
- Адденды на основе бора;
- Цитокины;
- Тапсигаргин и его метаболиты;
- Другие средства, применяемые при лечении карциномы предстательной железы.
Альтернативно, цитотоксическая группировка может включать или состоять из одной или нескольких группировок, подходящих для применения в активационной терапии, такой как фотонно-активационная терапия, нейтронно-активационная терапия, нейтрон-индуцированная Оже-электронная активационная терапия, терапия синхротронным излучением или фотонно-активационная терапия с применением рентгеновского излучения с низкой энергией.
Например, с полипептидами антител изобретения появятся потенциальные возможности применения синхротронного излучения (или рентгеновского излучения с низкой энергией) для улучшения радиотерапии, главным образом, сфокусированной на так называемой фотоактивационной радиотерапии (PAT), в которой локальное депонирование энергии от внешнего рентгеновского излучения усиливается в раковой ткани в результате взаимодействия с предварительно введенным, направленным в опухоль агентом с большим атомным номером.
В методике лечения PAT применяют монохроматические рентгеновские лучи из источника синхротронного излучения, такого как обеспечиваемого биомедицинским каналом синхротронного излучения ID 17 в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, и, как ожидается, которое будет доступно на других объектах в будущем, таких как новая Шведская установка синхротронного излучения, Мах-IV.
В качестве еще одной потенциальной методики лечения, исследования по «опухолевой терапии индуцированными электронами Оже» представляют собой ожидаемый Европейский источник расщепления (ESS) в Лунде, который, будем надеяться, станет медицинской опытной станцией. Получаемые в реакторе тепловые и полутепловые нейтроны уже долгое время применяют для бор-нейтрон-захватной терапии, BNCT, как для проведения доклинических экспериментов, так и для лечения опухолей головного мозга индуцированными альфа-частицами и ядрами отдачи (L), которые дают высокую локально поглощенную энергию. Похожий подход заключается в применении нейтронов и подходящих направленных в опухоль молекулы, меченых стабильными ядрами с большим поперечным сечением для нейтронов. Антитела или пептиды могут, например, быть помечены стабильным гадолинием (157Gd) и действовать в качестве молекулы-мишени для нейтронов, которые захватываются Gd-ядром, так называемая гадолиний-нейтрон-захватная терапия (CdNCT). По методикам Монте-Карло, распределение дозы в опухоли и окружающих тканях рассчитывают как результат из γ-фотонов, нейтронов, отдачи ядер, а также характеристического рентгеновского излучения, внутренней конверсии и Оже-электронов от гадолиния или других возможных элементов.
Как уже обсуждалось выше, терапевтическая группировка (такая как радиоизотоп, цитотоксическая группировка или им подобные) может быть присоединена непосредственно, или опосредованно, к связывающей группировке (такой как антитело или его фрагмент). Подходящие линкеры известны в этой области техники и включают, например, простетические группы, нефенольные линкеры (производные N-сукцинимидил-бензоатов; додекаборат), хелатирующие группировки как макроциклических, так и ациклических хелаторов, таких как производные 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10,тетрауксусной кислоты (DOTA), дефероксамин (DFO), производные диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPA), производные S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA) и производные 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (ТЕТА), производные 3,6,9,15-тетраазабицикло[9,3,1]-пентадека-1(15),11,13-триен-4-(S)-(4-изотиоцианатобензил)-3,6,9-триуксусной кислоты (РСТА), производные 5-S-(4-аминобензил)-1-окса-4,7,10-триазациклододекан-4,7,10-трис(уксусной кислоты) (DO3A) и другие хелатирующие группировки. Применение таких линкеров может быть в особенности целесообразно в тех случаях, когда средство включает или состоит из антитела или его фрагмента в качестве присоединенной группировки связана, через линкер, с радиоизотопом в качестве терапевтической группировки.
DTPA представляет собой один из предпочтительных линкеров, например, применяемый в 177Lu-DTPA- [полипептид антитела изобретения].
Дополнительный предпочтительный линкер представляет собой дефероксамин, DFO, например, как применено в 89Zr-DFO-[полипептид антитела изобретения].
Необязательно, полипептид антитела изобретения дополнительно может включать (или может не включать) детектируемую группировку. Например, детектируемая группировка может включать или состоять из радиоизотопа, такого как радиоизотоп, который выбирают из группы, состоящей из 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I и 201Tl. Необязательно, средство может включать пару из детектируемого и цитотоксического радионуклидов, таких как 86Y/90Y или 124I/211At. Альтернативно, средство может включать радиоизотоп, который способен одновременно действовать мультимодальным образом, как детектируемая группировка, и также как цитотоксическая группировка, для обеспечения так называемой «мультимодальной терагностики». Связывающие группировки, таким образом, могут быть присоединены к наночастицам, которые позволяют проводить мульти-визуализацию (например, SPECT, PET, MRI, оптическую или ультразвуковую) вместе с терапевтической возможностью применения цитотоксических лекарственных препаратов, таких как радионуклиды или химиотерапевтические средства. Также в настоящее изобретение включают возможность лечения посредством гипертермии с помощью высокочастотных переменных магнитных полей и сопутствующей ультразвуковой визуализации.
Альтернативно, детектируемая группировка может включать или состоять из парамагнитного изотопа, такого как парамагнитный изотоп, который выбирают из группы, состоящей из 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr и 56Fe.
В том случае, когда полипептид антитела включает детектируемую группировку, впоследствии детектируемая группировка может быть обнаружена методиками визуализации, такими как SPECT, PET, MRI, оптическая или ультразвуковая визуализация.
Терапевтическая и детектируемая группировки могут быть соединены или другим способом объединены с полипептидом антитела с помощью способов, хорошо известных в данной области техники (например, существующая иммуноконъюгатная терапия, гемтузумаб озогамицина [торговое наименование: Mylotarg®], включает моноклональное антитело, связанное с цитотоксином калихеамицин).
В дополнительном воплощении, полипептид антитела изобретения применяют для лечения рака простаты в форме композиции, включающей популяцию полипептида антитела молекулы. В одном из вариантов, все (или в основном все, так как больше чем 90%, 95%, 99%, 99,9% или более, по массе) молекулы полипептида антитела в популяции включают одну и ту же терапевтическую группировку. В другом варианте, популяция включает смесь других агентов с различными терапевтическими группировками. Этот вариант создает возможности для улучшения эффектов терапии целевыми радионуклидами с помощью различных средств, таких как химиотерапевтические средства, средства гормональной терапии или другие комбинации способов лечения, в которых направленный агент не только доставляет терапевтически активные радионуклиды к ассоциированным с опухолью антигенам, но также одновременно радиосенсибилизирует клетки-мишени в опухоли путем модулирования (например, запуска или блокировки) внутриклеточных сигнальных каскадов. Этот вариант также полезен при лечении рака простаты смесью цитотоксических агентов, например, с помощью коктейля из альфа- и бета-излучателей различных диапазонов, или коктейля радионуклидов с различным диапазоном, LET (линейная передача энергии) и RBE (относительный биологический эффект), для комбинированного лечения крупных опухолей, микрометастазов и одиночных опухолевых клеток. В одном из воплощений, излучатели дальнего радиуса действия могут быть применены для лечения крупных опухолей, и излучатели ближнего радиуса действия могут быть применены для лечения опухолей небольшого размера, таких как микрометастазы, и одиночные опухолевые клетки.
Необязательно, полипептид антитела настоящего изобретения дополнительно может включать (или могут не включать) группировку для увеличения in vivo времени полужизни средства. Типичные группировки для увеличения in vivo время полужизни средства могут включать полиэтиленгликоль (PEG), человеческий сывороточный альбумин, группы гликозилирования, жирные кислоты и декстран. В особенности, может быть предложен PEG.
Следует принять во внимание, что полипептиды изобретения могут быть лиофилизированы для хранения, и восстановлены в подходящем носителе перед применением, например, посредством сублимационной сушки, распылительной сушки, распыления с охлаждением или с применение образования частиц (преципитацию) из сверхкритического диоксида углерода. Может быть применен любой подходящий способ лиофилизации (например, сублимационная сушка, распылительная сушка, сушка осадка) и/или любые методики восстановления. Специалистам в этой области техники будет понятно, что лиофилизация и восстановление может привести к различной степени потери активности и что для компенсации уровни применения, возможно, придется скорректировать в сторону увеличения. Предпочтительно, лиофилизированный (высушенный замораживанием) полипептид теряет не более, чем примерно 1% своей активности (до начала лиофилизации), при регидратации, или не более чем примерно 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или не более чем примерно 50% своей активности (до начала лиофилизации) при регидратации.
Способы получения полипептидов изобретения хорошо известны в данной области техники.
Удобно, если полипептид представляет собой или включает рекомбинантный полипептид. Подходящий способ получения таких рекомбинантных полипептидов хорошо известен в данной области техники, например, экспрессия в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах (например, смотри руководство Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York, соответствующие раскрытия в этом документе включены в настоящий документ путем отсылки).
Полипептиды антител изобретения также могут быть получены с помощью коммерчески доступной in vitro системы трансляции, такой как лизат ретикулоцитов кролика или лизат зародышей пшеницы (доступны в компании «Promega»). Предпочтительно, система трансляции представляет собой лизат ретикулоцитов кролика. Удобно, когда система трансляции может быть сопряжена с системой транскрипции, такой как система транскрипции-трансляции TNT («Promega»). Эта система имеет то преимущество, что с ее помощью получают подходящий транскрипт мРНК из кодирующей полинуклеотид ДНК в той же реакции, что и трансляция.
Специалистам в этой области техники понятно, что полипептиды изобретения могут быть альтернативно синтезированы искусственно, например, с помощью хорошо известных методик жидкофазного или твердофазного синтеза (таких как твердофазный синтез пептидов способами t-Boc или Fmoc).
Второй аспект изобретения обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид антитела изобретения, или компонент его полипептидной цепи. Под термином «молекула нуклеиновой кислоты» мы включаем молекулы ДНК (например, геномную ДНК или комплементарную ДНК) и мРНК, которые могут быть одиночными или двухцепочечный.
В одном из воплощений, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кДНК.
Специалистам в этой области техники понятно, что молекула нуклеиновой кислоты может быть кодон-оптимизированной для экспрессии полипептида антитела, в особенности, в клетке-хозяине, например, для экспрессии в клетках человека (например, смотри работу Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659). В предпочтительном воплощении, молекула нуклеиновой кислоты изобретения включает
(а) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14
Figure 00000011
Figure 00000012
[SEQ ID NO: 14]
и/или
(b) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15
Figure 00000013
[SEQ ID NO: 15]
Также включают в объем изобретения следующее:
(a) третий аспект изобретения обеспечивает вектор (такой как вектор экспрессии), включающий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения;
(b) четвертый аспект изобретения обеспечивает клетку-хозяина (такую как клетка млекопитающих, например, клетка человека), включающую молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения или вектор в соответствии с третьим аспектом изобретения; и
(c) пятый аспект изобретения обеспечивает способ изготовления полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения, включающий культивирование популяции клеток-хозяев в соответствии с четвертым аспектом изобретения в условиях, в которых экспрессируется указанный полипептид, и выделение полипептида из этого.
Шестой аспект изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически эффективное количество полипептида антитела по первому аспекту изобретения и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.
Дополнительные соединения также могут быть включены в фармацевтические композиции, включая, хелатирующие средства, такие как ЭДТА, цитрат, ЭГТА или глутатион.
Фармацевтические композиции могут быть получены известным в этой области техники способом, который обеспечивает достаточно стабильные при хранении и подходящие для введения человеку и животным композиции. Например, фармацевтические композиции может быть лиофилизированы, например, с помощью сублимационной сушки, распылительной сушки, распыления с охлаждением или применением образования частиц из сверхкритического образования частиц.
Под термином «фармацевтически приемлемый» мы подразумеваем нетоксичный материал, который не снижает эффективность связывания белка средством изобретения. Такие фармацевтически приемлемые буферы, носители или вспомогательные вещества хорошо известны в этой области техники (смотри руководства Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки).
Термин «буфер» предназначен для обозначения водного раствора, содержащего кислотно-основную смесь в целях стабилизации pH. Примеры буферов: Trizma, бицин, трицин, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, ACES, ADA, тартрат, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, какодилат, CHES, DIPSO, EPPS, этаноламин, глицин, HEPPSO, имидазол, имидазол, молочная кислота, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO и TES.
Термин «разбавитель» предназначен для обозначения водного или неводного раствора, применяемого для разбавления средства в фармацевтическом препарате. Разбавитель может представлять собой одно или несколько из следующего: солевой раствор, вода, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, этанол или масла (такие как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).
Термин «адъювант» предназначен для обозначения любого соединения, добавленного к композиции для увеличения биологического эффекта средства изобретения. Адъювант может представлять собой одно или несколько из следующего: соли цинка, меди или серебра с различными анионами, например, но без ограничений, с фторидом, хлоридом, бромидом, йодидом, тиоцианатом, сульфидом, гидроксидом, фосфатом, карбонатом, лактатом, гликолятом, цитратом, боратом, тартратом и ацетатами с различной ацильной композицией. Адъювант также может представлять собой катионные полимеры, такие как катионные простые эфиры целлюлозы, катионные сложные эфиры целлюлозы, деацетилированная гиалуроновая кислота, хитозан, катионные дендримеры, катионные синтетические полимеры, такие как поли(винилимидазол), и катионные полипептиды, такие как полигистидин, полилизин, полиаргинин, и пептиды, содержащие такие аминокислоты.
Вспомогательное вещество может представлять собой одно или несколько из следующего: углеводы, полимеры, липиды и минералы. Примеры углеводов включают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннитол и циклодекстрины, которые добавляют к композиции, например, для облегчения лиофилизации. Примеры полимеров: крахмал, эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагинаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксид/полипропиленоксид, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон, все различной молекулярной массы, которые добавляют к композиции, например, для контроля вязкости, для достижения биоадгезии или для защиты липида от химической и протеолитической деградации. Примеры липидов: жирные кислоты, фосфолипиды, моно-, ди- и триглицериды, церамиды, сфинголипиды и гликолипиды, все с различной длиной и насыщенностью ацильной цепи, яичный лецитин, соевый лецитин, гидрированный яичный и соевый лецитин, которые добавляют к композиции по тем же причинам, что и для полимеров. Примеры минералов: тальк, оксид магния, оксид цинка и оксид титана, которые добавляют к композиции для получения таких преимуществ, как снижение накопления жидкости или выгодные свойства пигментов.
Полипептиды антител изобретения могут быть составлены в виде фармацевтической композиции в любой форме, известной в этой области техники, которая подходит для их доставки.
В одном из воплощений, фармацевтические композиции изобретения могут быть в форме липосомы, в которой полипептид антитела объединен, кроме того, с другими фармацевтически приемлемыми носителями, с амфипатических агентами, такими как липиды, которые существуют в агрегированных формах, в виде мицелл, нерастворимых монослоев и жидких кристаллов. Подходящие липиды для липосомальной композиции включают, без ограничений, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и им подобные. Подходящая липиды также включают вышеперечисленные липиды, модифицированные поли(этиленгликолем) в полярной концевой группе для продления времени циркуляции в кровотоке. Получение таких липосомальных композиций можно найти, например, в US 4,235,871, раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки.
Фармацевтические композиции изобретения также могут быть в форме биоразлагаемых микросфер. Алифатические сложные полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) (PLA), поли(гликолевая кислота) (PGA), сополимеры PLA и PGA (PLGA) или поли(капролактон) (PCL) и полиангидриды получили широкое применение в качестве биодеградируемых полимеров при получении микросфер. Получения таких микросфер можно найти в US 5,851,451 ив ЕР 0213303, раскрытия которой включены в настоящий документ путем отсылки.
В дополнительном воплощении, фармацевтические композиции изобретения обеспечивают в форме полимерных гелей, в которых полимеры, такие как крахмал, эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагинаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, поливинилимидазол, полисульфонат, оксид полиэтиленгликоля/полиэтилена, сополимеры полиэтиленоксиа/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон применяют для загущения раствора, содержащего средство. Полимеры также могут включать желатин или коллаген.
Альтернативно, полипептиды антител могут быть просто растворены в солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле или масле (таком как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло), трагакантовой камеди и/или различных буферах.
Следует принять во внимание, что фармацевтические композиции изобретения могут включать ионы и иметь определенный pH для потенциирования действия активного полипептида антитела. Кроме того, композиции могут быть подвергнуты традиционным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать общепринятые вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажняющие средства, эмульгаторы, буферы, наполнители и т.п.
Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут быть введены с помощью любого подходящего пути, известной специалистам в этой области техники. Таким образом, возможные пути введения включают парентеральный (внутривенный, подкожный и внутримышечный), местный, окулярный, назальный, пульмональный, буккальный, пероральный, парентеральный и ректальный. Также возможно введение из имплантатов. Инфузия может представлять собой желаемый путь из-за потенциально высокой цитотоксичности вводимого средства.
В одном из воплощений, фармацевтические композиции вводят парентерально, например, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутриартикулярно, внутриартериально, внутрисуставно, интратекально, внутрижелудочково, внутригрудинно, интракраниально, внутримышечно или подкожно или они могут быть введены с помощью инфузионных методик. Их удобно применять в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозы, для того чтобы сделать раствор изотоническим с кровью. Водные растворы при необходимости должны быть соответствующим образом забуферены (например, до pH от 3 до 9). Получение подходящих парентеральныхкомпозиций в стерильных условиях легко осуществимо с помощью стандартных фармацевтических методик, хорошо известных специалистам в этой области техники.
Композиции, подходящие для парентерального введения включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают композиция изотоничной крови предполагаемого получателя; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители. Композиции могут быть представлены в контейнерах, содержащих дозу на один прием, или в многодозовых контейнерах, например, в запаянных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующим только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, незамедлительно перед применением. Приготовленные для немедленного приема растворы для инъекций и суспензии могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток, ранее описанного типа.
Таким образом, фармацевтические композиции изобретения, в особенности, подходят для парентерального, например, внутривенного введения или местного введения в опухоль пациента (например, внутриопухолево или околоопухолево).
Фармацевтические композиции вводят пациенту в фармацевтически эффективной дозе, т.е. терапевтически эффективной поглощенной дозе терапевтических радионуклидов.
В контексте терапевтического применения полипептидов антител изобретения, термин «фармацевтически эффективное количество», или «эффективное количество», или «терапевтически эффективное», как применен в настоящем документе, относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного условия и режима введения. Это заданное количество активного материала, рассчитанного для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым дополнительным веществом и разбавителем, т.е. носителем или растворителем для введения. Кроме того, он предназначен для обозначения количества, достаточного для снижения и/или предотвращения, клинически значимого дефицита в активности, функции и ответе реципиента. Альтернативно, терапевтически эффективная величина дозы достаточна, чтобы вызвать улучшение в клинически значимого состояния у реципиента. Как очевидно специалистам в этой области техники, количество соединения может изменяться в зависимости от его специфической активности. Подходящие величины доз могут содержать заданное количество активной композиции, рассчитанной для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым разбавителем. В способах и применении для производства композиций изобретения, обеспечивают терапевтически эффективную величину дозы активного компонента. Терапевтически эффективная величина дозы может быть определена медицинским работником обычной квалификации, основываясь на особенностях пациента, таких как возраст, вес, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.п., как это хорошо известно в данной области техники (смотри пример 8 ниже). Введение фармацевтически эффективной дозы может быть осуществлено как путем однократного введения в форме индивидуальной стандартной дозы, или путем введения нескольких более мелких стандартных доз, а также путем многократных введений разделенных доз с конкретными интервалами. Альтернативно, дозы могут быть обеспечены в виде непрерывной инфузии в течение длительного периода.
В контексте диагностического применения полипептидов антител изобретения, термин «фармацевтически эффективное количество», или «эффективное количество», или «диагностически эффективное», как применен в настоящем документе, относится к такому количеству, которое обеспечивает детектируемый сигнал для целей in vivo визуализации.
Полипептиды антител изобретения могут быть приготовлены в различных концентрациях, в зависимости от эффективности/токсичности соединений, которые предполагается применять. Композиция может включать полипептид в концентрации от 0,1 мкМ до 1 мм, от 1 мкМ до 500 мкМ, от 500 мкМ до 1 мм, от 300 мкМ до 700 мкМ, от 1 мкМ до 100 мкМ, от 100 мкМ до 200 мкМ, от 200 мкМ до 300 мкМ, от 300 мкМ до 400 мкМ, от 400 мкМ до 500 мкМ и примерно 500 мкМ.
Как правило, терапевтическая доза полипептида антитела (с терапевтической группировкой или без нее) у пациента-человека будет находиться в диапазоне от 100 мкг до 700 мг на введение (в расчете на массу тела, равную 70 кг). Например, максимальная терапевтическая доза может находиться в диапазоне от 0,1 до 10 мг/кг на введение, например, от 0,1 идо 5 мг/кг или от 1 до 5 мг/кг или от 0,1 до 2 мг/кг. Следует принять во внимание, что такая доза может быть введена на различных интервалах, как определено онкологом/врачом; например, доза может быть введена ежедневно, два раза в неделю, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно.
Специалистам в этой области техники понятно, что фармацевтические композиции изобретения могут быть введены в одиночку или в комбинации с другими терапевтическими средствами, применяемыми при лечении рака простаты, или до, после или в то же самое время, что и проведение лечения пациента другими терапевтическими способами для лечения рака простаты, такими как другие терапевтические антитела, хирургическое вмешательство (например, радикальная простатэктомия), терапия с помощью радионуклидов, брахитерапия, наружная дистанционная лучевая терапия, терапия высокоинтенсивным фокусированным ультразвуком (HIFU), химиотерапия, пероральные химиотерапевтические лекарственные средства, криохирургическое вмешательство (замораживание опухоли), гормональная терапия (такая как антиандрогенная терапия), кастрация или комбинации вышеупомянутого.
Седьмой аспект изобретения обеспечивает набор, включающий полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения или фармацевтическую композицию в соответствии с шестым аспектом изобретения, вместе с инструкциями для применения того же самого, как описано в настоящем документе.
Восьмой аспект изобретения обеспечивает полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения для применения в медицине.
Девятый аспект изобретения обеспечивает полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения для применения при лечении и/или диагностики рака простаты.
Десятый аспект изобретения обеспечивает способ лечения рака простаты у субъекта, способ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.
В термин «лечение» мы включаем как терапевтическое, так и профилактическое лечение пациента. Термин «профилактический» применяют для охвата применения агента, или его композиции, как описаны в настоящем документе, который или предупреждает или снижает вероятность рака простаты, или распространение, диссеминацию или метастазирование локализованного рака простаты у пациента или субъекта. Термин «профилактический» также охватывает применение средства, или его композиции, как описаны в настоящем документе, для предотвращения рецидива рака простаты у пациента, который ранее получал лечение рака простаты.
Одиннадцатый аспект изобретения обеспечивает способ диагностики рака простаты у субъекта, способ, включающий введение субъекту диагностически эффективного количества полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.
Под термином «диагностика» мы включаем обнаружение клеток рака простаты, или in vivo (т.е. внутри организма пациента), или ex vivo (т.е. в образцах ткани или клеток, извлеченных из организма пациента).
Рак предстательной железы, подлежащий лечению или диагностированию, может быть локализован в простате, или может представлять собой нелокализованный (т.е. диссеминированный) рак простаты. Рак простаты, локализованный в простате, может, например, быть классифицирован как клинические раки Т1 или Т2 в соответствии с системой TNM (сокращение от Опухоль/Узлы/Метастазы), в которой нелокализованный/диссеминированный рак простаты могут, например, классифицировать как клинические раки Т3 или Т4.
Рак предстательной железы, подлежащий лечению или диагностированию, может представлять собой метастатический рак простаты. Метастазирование относится к распространению рака из исходного местоположения в другие участки в организме. Например, метастатический рак простаты, подлежащий лечению или диагностированию, может представлять собой метастазы, присутствующие в лимфатической системе; в костях (включая позвоночник, позвонки, таз, ребра); метастазирование в области таза, прямой кишки, мочевого пузыря или мочеиспускательного канала. Метастазы, находящиеся в других, реже встречающихся, местах, также можно лечить с помощью настоящего изобретения. Метастазы могут представлять собой микрометастазы. Микрометастазы представляют собой форму метастазов, в которой вновь сформированные опухоли, как правило, слишком малы для обнаружения, или обнаруживаются с трудом. Например, настоящее изобретение обеспечивает специалиста в данной области способами лечения одиночных раковых клеток или клеточных кластеров, даже если присутствие таких клеток или кластеров не возможно диагносцировать, но они существуют, например, в качестве скрытого диссеминированного заболевания.
Соответственно, предполагается, что повышенная эффективность при лечении диссеминированного и/или метастатического (включая микрометастатического) рака простаты представляет собой в особенности важное техническое преимущество лечения, обеспечиваемого настоящим изобретением, по сравнению с лечением рака простаты предшествующего уровня техники.
Таким образом, в одном из воплощений, изобретение обеспечивает полипептиды антител и способы предупреждения или лечения метастазирования первичной опухоли простаты.
Рак предстательной железы имеет тенденцию к развитию у мужчин в возрасте старше пятидесяти лет, чаще всего у мужчин старше 60, 65 или 70, и хотя это один из наиболее распространенных видов рака у мужчин, многие никогда не имеют симптомов, не проходят лечения и, в конце концов, умирают от других причин. Это происходит потому, что рак предстательной железы в большинстве случаев представляет собой медленно растущий, бессимптомный рак, и поскольку люди с таким состоянием находятся в более старшем возрасте, они часто умирают от причин, не связанных с раком простаты, таких как заболевания сердца/системы кровообращения, пневмонии, других не связанных между собой видов рака или от старости. Примерно две трети случаев рака простаты представляют собой медленно растущие случаи, другая треть более агрессивные и быстро развивающиеся.
Соответственно, разработка эффективных способов лечения и диагностики рака простаты, в особенности, важна для контроля более агрессивных и быстро развивающихся форм рака, в особенности, у молодых пациентов. Соответственно, в одном из воплощений, изобретение относятся к лечению или диагностике рака простаты у пациента, который моложе 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 или менее лет, во время диагностики рака простаты и/или во время лечения.
Как полагают, риск развития рака предстательной железы в два раза выше у мужчин, имеющих ближайших родственников (отца или брата) с раком предстательной железы, и считается, что риск развития рака предстательной железы у тех, чьи ближайшие родственники поражены раком простаты, в пять раз выше по сравнению с мужчинами, не имеющих семейного анамнеза. Соответственно, изобретение может относиться к лечению или диагностированию рака простаты у пациента, который характеризуется тем, что у одного, двух или более членов семьи, в особенности, членов семьи первой степени родства (таких как отец или брат), ранее был поставлен диагноз рак простаты.
Изобретение также относится к лечению или диагностике рака простаты у пациента, у которого подлежащий лечению рак простаты, представляет собой резистентный к кастрации рак простаты (CRPC). CRPC может быть охарактеризован, как правило, по невосприимчивости к гормональному лечению после от одного до трех лет, и возобновление роста, несмотря на гормональную терапия.
В медицинских применениях и способах изобретения, полипептид антитела, как правило, вводят с помощью инъекции или инфузии в организм пациента. In vivo, полипептид антитела затем связывается с тканями, которые производят целевой антиген, hK2; главным образом, с клетками рака простаты и его метастазов. После связывания, полипептид антитела может непосредственно оказывать терапевтический эффект (например, вызывая гибель клеток посредством ADCC, CDC или благодаря тому, что несет радиоизотоп или другие цитотоксические группировки). Альтернативно, связанный полипептид антитела может служить в качестве инструмента диагностики (визуализации), которым можно руководствоваться при выборе терапии или который облегчает хирургическое удаление раковых клеток.
Специалистам в этой области техники понятно, что полипептиды антител изобретения могут быть применены в комбинации с другими терапевтическими и/или диагностическими средствами/способами лечения, такими как дистанционная радиотерапия, хирургическое вмешательство, лечения цитостатиками и андрогенами.
Приведенное выше описание сфокусировано на воплощениях настоящего изобретения, применимых к способам лечения и диагностики рака предстательной железы. Однако следует принять во внимание, что изобретение не ограничено такими применениями, но может быть полезно для послеоперационных обследований и обследований во время или после облучения, лечения цитостатиками и андрогенами.
В другом воплощении хирургическое вмешательство с управляемым радиоционным излучением (RGS) или хирургическое вмешательство с визуальным контролем (IGS) может быть применено для выявления меченых изотопными индикаторами полипептидов антител изобретения во время и/или до хирургического вмешательства. Таким образом, полипептид антитела, включающий детектируемую группировку, как обсуждена выше, может быть введен во время и/или до хирургического вмешательства. В данном воплощении полипептиды антител сначала могут быть введены с помощью инфузии. После этого, могут быть применены RGS/IGS для идентификации hK2-продуцирующей ткани с помощью инструмента обнаружения, чувствительного к детектируемой группировке, во время или до хирургического вмешательства. Детектируемая группировка, например, может представлять собой радиоактивную или чувствительную к магнитному полю детектируемую группировку; она, например, может представлять собой эмиттер излучения Черенкова и/или тормозного излучение; она может представлять собой флуоресцентную метку и/или магнитную или намагничивающуюся метку. Соответственно, RGS/IGS в соответствии с настоящим изобретением может, например, представлять собой способ, который основан на обнаружении оптического излучения, излучения Черенкова, тормозного или бета-излучения; обнаружении меток-радионуклидов и/или может включать магнитометрию. RGS хорошо известен специалисту в этой области техники как хирургический метод, который позволяет хирургу идентифицировать ткань, «меченую» детектируемой группировкой.
Визуализация, полученная в соответствии с приведенным выше способом, может быть скомбинирована с другими радиологическими способами визуализации, такими как SPECT/PET, компьютерная томография (СТ), ультразвуковая (US) и магнитно-резонансная визуализация (MRI).
Соответственно, в дополнительном аспекте, настоящее изобретение также обеспечивает полипептиды антител для применения в медицине путем введения пациенту с раком простаты до или во время хирургического вмешательства, такого как вмешательство с управляемым радиоционным излучением или хирургическое вмешательство с визуальным контролем.
Еще один аспект изобретения обеспечивает in vitro способ обнаружения клеток опухоли предстательной железы в крови субъекта, способ, включающий:
(a) обеспечение образца крови субъекта, подлежащего исследованию;
(b) необязательно, экстрагирование и/или очистка клеток, присутствующих в образце крови;
(c) контакт полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце крови;
(d) определение (непосредственно или опосредованно), связывается ли полипептид антитела со свободным (т.е. не в комплексе) hK2
в котором связывание полипептида антитела со свободным hK2 свидетельствует о наличии клеток опухоли предстательной железы в крови субъекта.
Таким образом, способ включает выполнение анализа для определения, содержит ли образец крови свободный hK2; присутствие свободного hK2 свидетельствует о присутствии клеток опухоли предстательной железы в крови субъекта.
Специалистам в этой области техники будет понятно, что существует много способов выполнения такого анализа. Например, иммуноанализ может быть или гомогенным, или, более предпочтительно, гетерогенным. Анализ также может быть выполнен или в конкурентном или, более предпочтительно, в неконкурентном формате.
В случае гетерогенного, неконкурентного анализа, типичный протокол может иметь следующий вид:
(a) обеспечение образца крови субъекта, подлежащего исследованию;
(b) необязательно, экстрагирование и/или очистка клеток, присутствующих в образце крови;
(c) контакт твердой фазы иммобилизованного полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце крови;
(d) промывание для удаления растворимых компонентов (несвязанных с твердой фазой);
(e) добавление меченого элемента, т.е. другого анти-hK2 специфического антитела, меченого молекулой-репортером/частицей-репортером;
(f) промывания для удаления несвязанного меченого антитела; и
(g) детектирование сигнала от меченого антитела
Между стадиями b и с или c и d, существует, как правило, инкубационный период, позволяющий клетке производить растворимый hK2, для того, чтобы затем его обнаруживать.
Дополнительный аспект изобретения обеспечивает in vitro способ обнаружения клеток опухоли предстательной железы в ткани субъекта, способ, включающий
(a) обеспечение образца ткани (такого как гистологический образец) из субъекта, подлежащего исследованию;
(b) необязательно, экстрагирование и/или очистку клеток, присутствующих в образце ткани;
(c) контакт полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце ткани;
(d) определение (непосредственно или опосредованно), связывается ли полипептид антитела со свободным (т.е. не в комплексе) hK2
в котором связывание полипептида антитела со свободным hK2 свидетельствует о присутствии клеток опухоли предстательной железы в ткани субъекта.
В одном из воплощений приведенных выше in vitro способов, стадию (d) проводят с помощью ELISA. Однако может быть применен любой анализ, подходящий детектировать взаимодействия антитело-антиген in vitro.
В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает количественное определение клеток опухоли предстательной железы в образце.
В дополнительном воплощении приведенных выше in vitro способов, способ предназначен для диагностики рака простаты у субъекта.
Слова, употребляемые в единственном числе, в сочетании с термином «включающий» в формуле изобретения и/или в описании, могут означать «один», но также это согласуется со значением «один или несколько», «по меньшей мере, один» и «один или более чем один».
Данные и другие воплощения изобретения будут лучше оценены и поняты при рассмотрении в сочетании с приведенным выше описанием и прилагаемыми чертежами. Однако следует понимать, что приведенное выше описание, указывая на различные воплощения изобретения и его многочисленные специфические детали, дано в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Множество замен, модификаций, вставок и/или перегруппировок может быть сделано в объеме изобретения без отступления от его сущности, и изобретение включает все такие замены, модификации, вставки и/или перегруппировки.
Следующие чертежи формируют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято при отсылке к одному или нескольким таким чертежам в комбинации с подробным описанием специфических воплощений, представленных в настоящем документе.
Фигура 1: Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей типичного гуманизированного фрагмента 11В6 Fab изобретения.
Фигура 2: Гель SDS-PAGE с нативными и восстановленными образцами мышиных и гуманизированных 11 В6 антител.
Фигура 3: Фазы ассоциации при связывании на чипе тестируемых 11В6 антител с hK2.
Фигура 4: Фазы диссоциации тестируемых 11В6 антител.
Фигура 5: Биораспределение 177Lu-меченых гуманизированных 11В6 антител.
Фигура 6: Типичные SPECT-визуализация, показывающая связывание 177Lu-меченого h11B6 с опухолью простаты у мышей.
Фигура 7: Поглощение в процентах 177Lu-меченого h11B6 и m11B6 в опухоли и в кости.
Фигура 8: Отношение поглощения опухоль к кости в процентах на грамм 177Lu-меченого h11B6 и m11B6.
Фигура 9: Кинетика (а) гуманизированного антитела 11В6 и (b) мышиного антитела 11В6.
Фигура 10: Выведение 177Lu-меченых h11B6 и m11B6 из крови.
Фигура 11: Типичные фотографии размера опухоли перед лечением (верхнее
изображение) и после лечения (нижнее изображение) с помощью 177Lu-11B6.
Фигура 12: Краткая информация об эффекте (а) одиночной радиоактивности 'D' 177Lu11B6, (b) двойной радиоактивности '2×D' 177Lu-11В6 и (с) контрольного лечения на размер опухоли в ксенотрансплантатах LNCaP.
Фигура 13: (а) данные о росте опухоли и (b) SPECT-визуализация для одного из ксенотрансплантатов LNCaP мыши, обработанного одиночный дозой 177Lu-11В6.
Фигура 14: Объем опухоли в зависимости от дней после инъекции для (а) животных, получавших 177Lu-меченое h11B6 антитело в соответствии с изобретением, (b) животных, получавших 177Lu-меченое специфическое IgG, антитело 'изотопического контроля' и (с) животных, получавших только NaCl. Лечение вводили на День 0. Животных забивали в случае следующих проявлений: большие объемы опухоли (диаметр > 14 мм); большая потеря массы (потеря массы > 15% по сравнению с исходной массой); отрицательно сказывается на общем состоянии; или сочетание всех этих трех параметров, (числа справа представляют собой ID-номер каждого животного)
Фигура 15: Кривая Каплана-Мейера для трех групп, получавших лечение, показана на фигуре 14. Сплошная линия: 177Lu-h11B6; прерывистая линия: 177Lu-меченое неспецифическое IgG, антитело 'изотипического контроля'; пунктирная линия: NaCl.
Следующие примеры включены для демонстрации конкретных воплощений изобретения. Специалистам в этой области техники должно быть понятно, что методики, раскрытые в примерах, которые следуют за представленными методиками, обнаруженными автором изобретения, хорошо функционируют при осуществлении изобретения, и, таким образом, могут считаться равносильными специфическим способам практической реализации. Однако специалисты в этой области техники, в свете настоящего описания, должны понимать, что многие изменения могут быть сделаны в конкретных воплощениях, которые раскрыты и по-прежнему получают подобный или аналогичный результат без отступления от сущности и объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Клонирование 11В6 из линии клеток гибридомы
Реагенты
Линию клеток гибридомы, продуцирующих моноклональное антитело 11В6, применяли для экстракции мРНК и продукции антител, которые дополнительно подвергали аффинной очистке для секвенирования белка (
Figure 00000014
et al., 2004).
Ферменты рестрикции, FastAP и Т4 ДНК лигаза были от компании «Fermentas», праймеры получали от Университета Турку, Отдел биотехнологии (WO252) и от компании «Thermo Scientific». Очистку ДНК выполняли путем экстракции на геле «Qiagen» и с помощью наборов для ПЦР-очистки.
Экстракция мРНК и синтез кДНК
мРНК экстрагировали из продуцирующих 11В6 MAb клеток гибридомы (5Е6 клетки) с помощью набор для очистки мРНК «QuickPrep Micro» («Amersham Biosciences») и синтез кДНК из мРНК выполняли с помощью высокопроизводительного набора "Hight-capacity cDNA Archive kit" компании «Applied Biosystems» в соответствии с инструкциями.
Амплификация генов антител из кДНК
N-концевые последовательности очищенных тяжелых (Н) и легких (L) цепей 11В6 MAb определяли методом деградации по Эдману в службе секвенирования белка Университета Хельсинки. Последовательность легкой цепи была следующей DIVLTQSPAS [SEQ ID NO: 16] и последовательность тяжелой цепи - DVQLQESGPG [SEQ ID NO: 17]. Сравнение баз данных IMGT аминокислот выявило гены: IGKV3 и IGHV3, соответственно. Комплементарные области для прямых ПЦР-праймеров (вырожденных) конструировали на основе последовательности ДНК (найденной с помощью NCBI BLAST), кодирующей N-концевые аминокислоты. Обратный праймер, примененный для клонирования тяжелой цепи, конструировали для связывания CH1. В случае легкой цепи, применяли два обратных праймера; один, примененный в первой ПЦР, связывался с CL, и другой, примененный во второй ПЦР, с границей VL и CL. Все праймеры также содержали сайты узнавания рестрикционных ферментов, необходимые для клонирования (буквы подчеркнуты).
Прямым праймером легкой цепи был
Figure 00000015
[SEQ ID NO: 16]:
Figure 00000016
; [SEQ ID NO: 18])
и обратными праймерами WO252
Figure 00000017
, XbaI; [SEQ ID NO: 19])
и CpoI_JK2
Figure 00000018
; [SEQ ID NO: 20]).
Прямым праймером тяжелой цепи был
Figure 00000019
[SEQ ID NO: 17]
Figure 00000020
; [SEQ ID NO: 21])
и обратным праймером asCH1_ SacI
Figure 00000021
; [SEQ ID NO: 22]).
Фрагмент VL+CL амплифицировали в ПЦР-реакции, содержавшей 100 нг кДНК в качестве матрицы, 0,2 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймеров SfiI DIVLTQSPAS [SEQ ID NO: 16] и WO252, 1x буфер Phusion HF и 0,6 Ед. ДНК полимеразы Phusion (Finnzymes). Амплификацию осуществляли по следующему протоколу: 98°C 30 сек, 30 циклов по 98°C 7 сек, 50°C 20 сек, 72°C 20 сек и заключительное удлинение 72°C 10 мин. После секвенирования ПЦР-продукт и обнаружения границы последовательности VL-CL, снова проводили ПЦР для фактического клонированя из кДНК в реакции, подобной описанной выше, за исключением применения праймеров
Figure 00000022
[SEQ ID NO: 16] и CpoI_JK2 только для клонирования части VL. Амплификацию осуществляли по следующему протоколу: 98°C 30 сек, 10 циклов по 98°C 7 сек, 60°C 20 сек, 72°C 20 сек, 25 циклов по 98°С 7 сек, 56°C 20 сек, 72°C 20 сек, и заключительное удлинение 72°C 10 мин.
Фрагмент VH+CH1 амплифицировали в такой же реакции как для VL за исключением того, что праймеры были
Figure 00000023
[SEQ ID NO: 17] и asCH1_SacI. Протокол амплификации был следующим: 98°C 30 сек, 30 циклов по 98°C 7 сек, 64°C 20 сек, 72°C 20 сек, и заключительное удлинение 72°C 10 мин.
Клонирование
Продукты правильного размера очищали из препаративного агарозного геля. VL расщепляли с помощью SfiI и CpoI, VH+CH1 - с помощью SacI и NotI. Вектор реципиента pAK400 5404 FAb Ich (модифицированный из pAK400, Krebber et al., 1997) расщепляли отдельно с обеими комбинациями ферментов, фрагменты дефосфорилировали с помощью FastAP и очищали из препаративного геля.
Расщепленный 11В6 VL и соответствующий фрагмент вектора лигировали с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформировали путем электропорации в Escherichia coli XL1-Blue клетки («Stratagene») для получения вектора pAK400-11B6-VL. Продукт лигирования SacI+NotI, расщепленный VH+CH1, и фрагмент вектора назвали pAK400-11B6-VH+CH1. Правильные клоны были подтверждены с помощью ДНК секвенирования и сравнения последовательностей с исходными последовательностями белка и с антителами, найденными в базе данных (поиск BLAST).
Для конструирования полного 11В6 Fab, обе ранее сделанные конструкции расщепляли с помощью NotI и SacI. Вектор pAK400-HB6-VL применяли в качестве вектора реципиента, в который был вставлен VH+CH1 из вектора pAK400-HB6-VH+CH1. Лигирование и трансформацию проводили, как указано выше. Сконструированный вектор pAK40011B6FAb lch был подтвержден рестрикционным анализом.
Ссылки
Barbas CF 3rd, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 7978-7982
Biomagnetic Techniques in Molecular Biology: Technical handbook. Dynal A.S, 2nd edition, 1995
Krebber A, Bornhauser S, Burmester J, Honegger A, Willuda J, Bosshard HR,
Figure 00000024
A. (1997) Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods. 201(1): 35-55
Lilja H, Christensson A, Dahlen U, Matikainen MT, Nilsson O, Pettersson K,
Figure 00000025
T. (1991) Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. Clin Chem. 37(9): 1618-25
Pajunen M, Saviranta P, Jauria P, Karp M, Pettersson K,
Figure 00000026
P, Lovgren T. (1997) Cloning, sequencing, expression and characterization of three anti-estradiol-17beta Fab fragments. Biochim Biophys Acta. 1351(1-2): 192-202
Figure 00000027
V, Eriksson S, Ivaska KK, Lilja H, Nurmi M, Pettersson K. (2004) Development of sensitive immunoassays for free and total human glandular kallikrein 2. Clin Chem. 50(9): 1607-17
Пример 2 - Гуманизация антитела 11B6
Вариабельный домен мышиного анти-hK2 антитела 11В6 гуманизировали способом пересадки CDR. В данном подходе, определяющие комплементарность области (CDR) мышиного антитела пересаживали на каркасные участки вариабельного тяжелого и легкого домена. Кроме того, остатки в CDR области, остатки в определенных критичных положениях в областях каркасного участка, сохраняли как подобные мышиным вместо того, чтобы превращать их в подобные человеческим с целью поддержания конформации пересаженных CDR-петель в состоянии, максимально схожим с их конформацией в родительских мышиных антителах.
Во всем данном описании применяют нумерацию Кэбота (Kabat et al., 1991).
Моделирование гомологии
Модель гомологии мышиного антитела 11В6 создавали с помощью автоматической доступной в интернете программы моделирования антител - сервер (variable heavy and light domain frameworks). Модель применяли для основанной на визуальном контроле оценки важности остатков, различающихся между последовательностями родительских мышиных антител и иммуноглобулинов человека, примененных в качестве каркасных участков для гуманизации вариабельного домена, соответственно.
Конструирование последовательностей V-домена гуманизированого 11В6
Конструирование VL домена
Аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного 11В6 сравнивали с базой данных зародышевой последовательности иммуноглобулина человека в NCBI с помощью программы выравнивания последовательностей ClustalW. Было обнаружено, что VL в 11В6 имеет наибольшее сходство с геном человека зародышевого типа B3 (IGKV4-1*01), единственным членом семействе человеческого Vk4. Что касается J-сегмента, кодирующего C-концевую часть последовательности вариабельного домена, то было найдено, что Jk2 человека был наиболее похожим на соответствующую область мышиного 11B6.
Ген человека В3 вместе с последовательностью IGKJ2 применяли в качестве каркасного участка для пересадки CDR-петель (фиг. 1) из легкой цепи родительского мышиного антитела 11В6.
Остаток мышиного происхождения (лейцин) вводили в положение 4 VL вместо находящегося в этом положении у человека метионина. Данный остаток зоны Вернье (Foote and Winter, 1992) локализован непосредственно под петлями CDR1 и CDR3 легкой цепи. В положении 54 в CDR-L2 применяли находящийся в этом положении у человека аргинин вместо находящийся в этом положении у мышей валина. В соответствии с моделированием, маловероятно, что остаток в этом положении формирует прямое взаимодействие с антигеном, однако, по-видимому, Arg54 образует солевой мостик с отрицательно заряженным аспартатом в положении 60 в каркасном участке человека. Считается маловероятным, что остаток в положении 24 в CDR-L1 вовлечен в контакт антигеном. Вследствие этого, находящийся в этом положении у человека лизин вводят в это положение вместо находящегося в этом положении у мыши аргинина.
Конструирование домена VH
Аминокислотную последовательность мышиного вариабельного домена тяжелой цепи 11В6 сравнивали с базой данных зародышевой последовательности иммуноглобулина человека в NCBI с помощью программы выравнивания последовательностей clustalW. Было найдено, что 11В6 VH имеет наибольшее сходство с членом семейства VH4-28 человеческого VH4. Что касается J-сегмента, кодирующего С-концевую часть последовательности вариабельного домена, то было найдено, что JH1 человека наиболее близок соответствующей области мышиного 11В6.
Ген человека VH4-28 вместе с последовательностью JH1 применяли в качестве каркасного участка для пересадки CDR-петель (фиг. 1) из тяжелой цепи родительского мышиного антитела 11В6.
Находящиеся в этих положениях у мыши остатки аспарагина и треонина вводили в положения 27 и 30 в VH, соответственно. Хотя они и не принадлежат к CDR-H1 в соответствии с определением Кэбота (Kabat et al., 1991; Fig. 1), их классифицируют как CDR-остатки с помощью некоторых других методик определения CDR, таких как методика по Chothia (1989). Остатки 27 и 30 могут повлиять на структуру других частей CDR-H1 и возможно, участвуют в прямых контактах с антигеном. Известно, что остаток в положении 71 играет важную роль в поддержании конформации CDR-H2 (Tramontano et al., 1990), и здесь вместо находящегося в этом положении у человека валина применяли находящийся в этом положении у мыши аргинин. В положение 94, предшествующее важной петле CDR-H3, полученный из мышиного 11В6 остаток треонина вводят вместо находящегося здесь у человеческого VH4-28 аргинина. Кроме того, считается маловероятным, что остаток в положении 60 в CDR-H2 вовлечен в контакт с антигеном. Следовательно, в это положение находящийся здесь у человека аспарагин вводят вместо находящегося здесь у мыши серина.
Гены, кодирующие гуманизированный 11В6 как Fab фрагмент, в котором сконструированные VH и VL домены присоединены к константным доменам человеческого CH1 и человеческого Ck, соответственно, были приобретены в качестве синтетической конструкции («Genscript», США). Гены клонировали в вектор экспрессии pAK400Fab, модифицированный из pAK400 (Krebber et al., 1997) с помощью рестриктазы SfiI, имеющей сайты узнавания на каждой стороне кассеты Fab. Вектор трансформировали в голубые клетки Е. coli XL-1 для экспрессии гуманизированного Fab-фрагмента.
На фигуре 1 показаны последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей типичного гуманизированного Fab-фрагмента 11В6 изобретения.
Ссылки
Chothia, С., Lesk, А. М., Tramontano, A., Levitt, М., Smith-Gill, S.J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E.A., Davies, D., Tulip, W.R., Colman, P.M., Spinelli, S., Alzari, P.M., and Poljak, R. J. (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions Nature, 342, 877-883
Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S and Foeller, С.(1991) Sequences of Immunoglogical Interest, 5th edit., NIH, Bethesda, MD
Krebber A, Bornhauser S, Burmester J, Honegger A, Willuda J, Bosshard HR,
Figure 00000028
A. (1997) Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods. 201(1): 35-55
Tramontano, A., Chothia, C. and Lesk, A. M. (1990) Framework Residue 71 is a Major Determinant of the Position and Conformation of the Second Hypervariable Region in the VH Domains of Immunoglobulins. J. Mol. Biol. 215, 175-182
Пример 3 - Экспрессия и очистка h11B6
Клетки HEK293 размножали в 2 л суспензионной культуры в среде для экспрессии FreeStyle 293 (Life Technologies). Плотность клеток в день трансфекции была равна 1×106 клеток/мл.
Последовательности нуклеотидов, кодирующие компонент тяжелых или легких цепей (т.е. SEQ ID NOs: 14 и 15, соответственно), были кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, синтезированы и клонированы в векторы экспрессии IgG. Плазмидную ДНК (вектор экспрессии), содержащую последовательности нуклеотидов для тяжелых и легких цепей затем перемешивали с агентом трансфеции и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Смесь ДНК-агент трансфеции медленно добавляли к культуре клеток, одновременно медленно взбалтывая колбу. Трансфицированную культуру клеток затем инкубировали при 37°C, 8% CO2 на платформе орбитального шейкера, вращавшегося при приблизительно 135 rpm, в течение семи дней.
Культуральную среду собирали центрифугированием и фильтровали через 5 мкм, 0,6 мкм и 0,22 мкм системы фильтров.
Антитела очищали хроматографией на белке G и буфер заменяли на PBS pH 7,4 диализом; в дальнейшем, антитела концентрировали с помощью ультрафильтрации.
Концентрацию измеряли по оптической плотности.
ДНК: Легкие цепи: количество p11B6VLhV1hk (4300 п. о.): 0,35 мг
Тяжелые цепи: количество p11B6VHhV1hIgG1(4900 п. о.): 0,6 мг
Количество ДНК не было оптимизированно.
Агент трансфеции: собственная разработка (однако подходящие коммерчески доступные агенты трансфеции легко доступны, такие как реагент для транфекции Xfect™ и (Clontech), липофектамин (Life Technologies), реагент для транфекции FuGENE® HD («Promega»), FreeStyle™ Max Reagent («Invitrogen»), DEAE-декстран, полиэтиленимин и фосфат кальция).
Общий выход: 13,1 мг (~ 6,5 мг/л)
Пример 4 - Характеристика h11B6: Аффинность.
Цели исследования
Цель исследования состояла в изучении кинетики связывания между четырьмя вариантами антитела 11В6 и антигена hK2 методикой поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью прибора «Biacore».
Для исследования качества образцов белка (антитела и антигена), прогоняли анализ на геле SDS-PAGE до начала SPR-экспериментов.
В предварительном исследовании, изучали различные параметры с целью найти подходящие условия для экспериментов в собственно исследовании.
В исследовании, проводили измерения множественного связывания для четырех антител и антигенов. Из собранных данных, рассчитывали константы скорости ассоциации и диссоциации (kon и koff) и константы диссоциации (KD), и представляли здесь.
Информация о реагентах и приборах
Следующие растворы четырех антител и одного антигена были предоставлены компанией «Diaprost АВ»:
- исходный раствор m11B6: a-ehk211B6 14,12013 РР, 3,41 мг/мл: 0,9% NaCl, 100 мкл
- исходный раствор h11B6: «Innovagen» Lot 90476,30 2013-04-12, 1 мг/мл: PBS pH 7,4, 320 мкл
- исходный раствор h11B6-DTPA: 0,2 М ацетат Na, pH 5,5, 0,9 мг/мл, 340 мкл
- исходный раствор h11B6-DFO: 5 мг/мл гентизиновая кислота в 0,2М ацетате аммония, pH 5,5,1,6 мг/мл, 400 мкл
- исходный раствор hK2: 26,6 мкг/мл frakt 2 fr 7 SL + белок inh 5/2-02 1% БСА
Все образцы разделяли на аликвоты и хранили в морозильной камере при -20°C до начала анализа.
Все эксперименты по связыванию проводили на чипе СМ4 с помощью прибора «Biacore 3000». Чип и все реагенты, необходимые для активации, имммобилизации, деактивации, связывания и регенерации, были приобретены в компании «GE Healthcare» и их применяли в соответствии с рекомендациями производителя.
SDS-PAGE
Описанием эксперимента
Реагенты, предоставленные компанией «Diaprost АВ», прогоняли в ТРИС-трициновом 10-20% акриламидном геле от компании «Novex» в соответствии с рекомендациями производителя.
Две серии белковых образцов, в нативных и восстанавливающих условиях, прогоняли одновременно на одном и том же геле вместе со стандартным образцом.
Каждый образец в нативных сериях содержал: 1-1,3 мкг белка, TRIS-буфер, pH 8,8, SDS и загрузочный буфер.
Каждый образец в восстановленных сериях содержал: 1-1,3 мкг белка, TRIS-буфер pH 8,8, SDS, загрузочный буфер и 0,04% (объем/объем) бета-2-меркаптоэтанол (восстанавливающий агент).
Окрашивание геля проводили в растворе кумасси бриллиантового синего в уксусной кислоте, этаноле и воде в соответствующих пропорциях 0,7, 3,0, 6,3.
Обесцвечивание геля проводили в растворе уксусной кислоты, этанола и воды в соответствующих пропорциях 0,7, 3,0, 6,3.
(а) Результаты и заключения
Результаты показаны на фигуре 2.
Как видно из данных результатов, образцы антитела и антигена были высокого качества и чистоты.
Исследование аффинности
(a) Иммобилизация антигена на чипе СМ4
Активацию чипа СМ4-2 проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя для связывания амином с помощью смеси EDC и NHS.
Раствор, содержащий 2,96 мкг/мл антигена hK2 (исходный раствор hK2, разведенный в 10 мМ NaAc-буфере, pH 3,8) протекал через каналы fc2-4 на чипе СМ4-2 для иммобилизации антигена на чипе. Скорость потока: 5 мкл/мин, объем: 200 мкл.
Целевой RU≤Mw/10 Mw(hk2)=25900 Да Целевой RU (hk2)≤2590
Канал fc1 применяли в качестве контрольной пробы.
Была достигнута следующая иммобилизация:
fc2=1104 RU fc3=731 RU fc4=688 RU
Все каналы (fc1-4) блокировали этаноламином после активации и иммобилизации. Эти данные свидетельствуют о том, что соответствующая иммобилизация была достигнута с помощью 2,96 мкг/мл антигена.
(b) Исследование фазы ассоциации
Фаза ассоциации четырех антител с чипом СМ4-2 наступает через 4-5 минут, когда растворы 5-ти различных концентраций каждого антитела (исходные растворы, разведенные в HSP-буфере) протекают через каналы fc2-4 на чипе СМ4-2 со скоростью, равной 30 мкл/мин.
Исследуемые концентрации для каждого антитела были равны: 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 нМ.
Дополнительно получали данные по ассоциации из экспериментов, в которых процесс диссоциации протекал в течение 480 минут.
В итоге, провели 18 индивидуальных экспериментов по ассоциации для каждого антитела.
Сигнал от контрольной пробы, fc1, вычитали для всех данных.
На фигуре 3, показаны фазы ассоциации в канале fc2 на чипе СМ-2 для каждого антитела в 5-ти различных концентрациях.
Мы обнаружили, что через 4-5 минут, мы были в состоянии аппроксимировать данные для процессов ассоциации.
(c) Исследование фазы диссоциации
Фаза диссоциации проходила в течение 480 минут для каждого антитела после пропускания раствора 50 нМ антитела в течение 5 минут через каналы fc2-4 на чипе СМ4-2 со скоростью, равной 30 мкл/мин (фигура 4).
Сигнал от контрольной пробы, fc1, вычитали из всех данных, взятых для расчетов константы скорости диссоциации.
Эти данные указывают на то, что процессы диссоциации протекают очень медленно. Для всех четырех антител, сигнал в канале fc4 дрейфовал, и в данном канале нельзя было следить за процессом диссоциации.
(d) Оценка константы скорости диссоциации (koff)
Данные для фазы диссоциации были аппроксимированы, и константы скорости диссоциации (koff) были оценены (смотри таблицу 2).
Figure 00000029
На основании двух измерений, выполненных для каждого антитела, похоже, нет никакой существенной разницы между константами скорости диссоциации (koff) протестированных антител.
(e) Оценка константы скорости ассоциации (kon)
С целью оценить константы скорости ассоциации, в уравнении аппроксимации применяли константы скорости диссоциации (таблица 2).
Все аппроксимированные данные применяли для расчета среднего значения константы скорости ассоциации и стандартного отклонения для каждого антитела (смотри таблицу 3).
Figure 00000030
На основании 15-18 измерений, выполненных для каждого антитела, похоже, нет никакой существенной разницы между константами скорости ассоциации (kon) протестированных антитела.
(f) Определение константы диссоциации (kD)
Константа диссоциации (KD) для каждого из протестированных антител показана в таблице 4.
Figure 00000031
Константы диссоциации (KD) находятся в диапазоне 10-12 М для всех четырех антител.
Не будучи статистически значимой, похоже, что константа диссоциации для гуманизированного антитела была выше, чем константа для родительского мышиного антитела.
Представляется, что конъюгация гуманизированного антитела заметно не влияет на аффинность, поскольку KD существенно не изменилась для h11B6-DTPA или h11B6-DFO.
Выводы
- Процессы ассоциации были очень быстрыми для всех четырех антител и все константы скорости ассоциации (kon) находятся в диапазоне 105 М-1 сек-1, на основании 15-18 экспериментов для каждого антитела.
- Процессы диссоциации были очень медленными и практически в диапазоне ограничения технических возможностей прибора «Biacore». Все константы скорости диссоциации (koff) находятся в диапазоне 10-5 сек-1, на основании двух экспериментов для каждого антитела.
- Константы диссоциации (KD) находятся в диапазоне 10-12 М для всех четырех антител.
Пример 5 - Характеристика h11B6: Агрегация
Основные выводы
Исследования способом динамического рассеяния света (DLS) осуществляли на 4 вариантах IgG для изучения их склонности к агрегации. Результаты DLS показали, что все конструкции имеют разумный размер (200 кДа или немного больше 200 кДа предполагая сферический белок), и агрегация была незначительной или отсутствовала.
Задача
Охарактеризовать четыре конструкции IgG с точки зрения олигомерного состояния с помощью динамического рассеяния света. В качестве контроля применяли инсулин.
Результаты
Динамическое рассеяние света
Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS pH 7,4) фильтровали через фильтр, с размером пор 0,22 микрон. Доставленный белок разводили до 0,1 мг/мл в PBS pH 7,4. Динамическое рассеяние света измеряли при 20°C в двух повторностях образцов с помощью оборудования «Malvern APS». Каждый образец измеряли три раза. Буфер разведения применяли в качестве контроля, чтобы убедиться, что буфер был в достаточной степени освобожден от пыли и агрегатов, фигура 1c. Все образцы можно было надежно измерить с помощью функцию распределения числа. Средний радиус наиболее распространенных видов рассчитывали наряду с полидисперсностью видов. Также рассчитывали распределение средней массы видов, смотри таблицу 5.
Figure 00000032
Инсулиновый контроль (4 мг/мл, 20 мМ Na2HPO4, 10 мМ Na3 ЭДТА) имел средний радиус, равный 2,8 нМ, что соответствует примерно 37 кДа. Известно, что в растворе инсулин формирует гексамеры, величиной примерно 35 кДа. Радиус в 5,7 нМ соответствует молекулярной массе, равной примерно 200 кДа, для белка, имеющего идеальную сферическую форму. Радиус в 6,1 нМ соответствует молекулярной массе, равной примерно 230 кДа, для белка, имеющего идеальную сферическую форму. Это достаточно близко к молекулярной массе 150 кДа для молекулы IgG, это означает, что большинство образцов состоят, главным образом, из мономерных и/или димерных молекул IgG. Причина, по которой не исключают димеры, состоит в том, что рассеяние света дает приблизительную оценку размера, на основании формы молекулы, и это затрудняет разделение мономеров и димеров, но облегчает отделение больших агрегатов от мономеров или мономеров от гексамеров (как в случае инсулина).
Заключения
Динамическое рассеяние света показало, что все конструкции имели разумный размер, и агрегация была незначительной или отсутствовала. Распределения по размерам для всех четырех конструкций перекрывали друг друга (данные не показаны).
Пример 6 - Характеристика h11B6: In vivo биораспределение
Данное исследование сравнивает in vivo биораспределение мышиного 11В6 и человеческого 11В6 при мечении 177Lu.
Материалы и методы
Материалы
177Lu был приобретен у компании «Mallinkrodt Medical BV», Петтен, Голландия.
Все химические реактивы получали от компании «Sigma-Aldrich» и буферы готовили самостоятельно, применяя воду аналитической степени чистоты (если не указано другое).
Родительское мышиное антитело m11B6, специфическое для калликреина 2 человека, получали от Университета Турку, Финляндия.
Тяжелые цепи m11B6 [SEQ ID NO: 23]:
Figure 00000033
Легкие цепи m11B6 [SEQ ID NO: 24]:
Figure 00000034
Гуманизированный аналог антитела, h11B6, получали, как описано выше, в примерах 2 и 3 (смотри фигуру 1).
Для in vivo исследований, применяли клеточные линии карциномы простаты LNCaP, экспрессирующие hK2 (АТСС, Манассас, VA, США) и DU145 (АТСС, Манассас, VA, США). Клеток культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и PEST (пенициллин 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки поддерживали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 и отделяли с помощью раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсин, 0,02% ЭДТА в буфере, «Thermo Scientific»). Матрикс матригель от компании «BD-biosciences» (Сан-Хосе, Калифорния, США) применяли при ксенотрансплантации клеток LNCaP. Мышам NMRI-Nu, («Charles River») и Balb/c-Nu (разводили в собственной лаборатории) инокулировали две клеточные линии.
Конъюгация и радиомечение
Конъюгация СНХ-А''-DTPA с 11В6: Растворы мышиного и гуманизированного 11 В6 mAbs в PBS доводили до pH 9,2 с помощью 0,07 М натрий-боратного буфера, перед концентрированием с помощью центрифужных фильтров «Amicon Ultra-2» (2 мл, 100 K). Полученный белковый раствор затем конъюгировали с хелатором СНХ-А''-DTPA «(«Macrocyclics», США) в молярном отношении хелатора к антителу 3:1 при 40°C. Реакцию останавливали через 4 часа, и CHX-A''-DTPA-11В6 (DTPA-11B6) отделяли от свободного хелата путем гель-хроматографии на колонке NAP-5 («GE Healthcare»), уравновешенной 20 мл 0,2 М ацетат-аммонийного буфера, pH 5,5. Конъюгированные антитела 11В6 элюировали 1 мл ацетат-аммонийного буфера.
Радиомечение DTPA-11B6: Мышиные и гуманизированные DTPA-11B6, в ацетат-аммонийном буфере, pH 5,5, перемешивали с заранее определенным количеством 177LuCl3. Для биораспределения применяли конечную активность, равную 0,5-0,6 МБк на субъекта, или конечную активность 18-20 МБк на субъекта применяли для SPECT-исследования. После инкубации при комнатной температуре в течение 2-х часов мечение прекращали и проводили очистку на колонке NAP-5, уравновешенной PBS.
Исследования на животных
Все эксперименты на животных проводили в соответствии с национальным законодательством по защите лабораторных животных.
Иммунодефицитных «голых» мышей-самцов, NMRI-Nu, (в возрасте 6-8 недель) и Balb/c-Nu, применяли для данного исследования. Всем мышам были ксенотрансплантированы клетки LNCaP или DU145 на их левый или правый бок, 8-10 миллионов клеток, в 100 мкл среды роста и 100 мкл матригеля.
Исследования биораспределения
Исследования биораспределения проводили как с h11 В6, так и с m11B6.
Шести группам (n=4) мышей вводили с помощью внутривенной инъекции или 20 мкг h11B6, или 20 мкг m11B6 меченого 177Lu. Животных умерщвляли через 24 часа после инъекции, 48 часов после инъекции и 72 часов после инъекции, и представляющие интерес органы анализировали с помощью автоматического счетчика лунок NaI(Tl) с 3-дюймовым детектором NaI(Тl) (1480 WIZARD, Wallac Oy, Турку, Финляндия).
Величину поглощения ткани, выраженную как проценты от введенной дозы на грамм ткани (% IA/г), рассчитывали как:
%IA/г = (радиоактивность ткани/введенная радиоактивность)/масса органа × 100 в которой для внутривенных инъекций:
Введенная радиоактивность = Средняя радиоактивность в контрольных шприцах - радиоактивность в использованных шприцах - радиоактивность в хвосте
Органы также взвешивали после диссекции.
Кинетические данные
Кривая время-%ID имела вид прямой линии
Figure 00000035
вплоть до 48 часов. На основании данных из второй и третьей временной точки (48, соответственно 72 часов), моно-экспоненциальную кривую
Figure 00000036
применили для временного интервала [48, ∞[. Если, однако, лямбда становилась отрицательной величиной, т.е. если ID росло между 48 и 72 часами, то кривую время-ID в данном интервале времени вместо этого моделировали как прямую линию, и предполагается, что фармацевтическое средство сохраняется в органе от 72 часов и дольше. Для получения кривых время-активность, применяли физическое время полужизни.
Примечание - на некоторых фигурах, ID обозначен как «IA»; эти выражения в данном документе применяют взаимозаменяемо.
Результаты
Биораспределение гуманизированного 177Lu-11В6
Биораспределение 177Lu-h11B6 показано на фигуре 5.
Антитело быстро накапливается в опухоли LNCaP в течение примерно 24 часов, и радиоактивность остается на высоком уровне до 72 часов.
Первоначально, высокие уровни h11В6 также наблюдали в крови и почках, которые уменьшались в течение следующего 48-часового периода, поскольку антитело выводилось из организма. Такая биокинетика представляет собой неизбежное и ожидаемое последствие внутривенной инъекции для любого радиомеченого антитела.
Все другие органы, такие как кости и мышцы, показали низкие уровни радиоактивности.
Эти данные свидетельствуют о том, что 177Lu-h11B6 может быть эффективно направлен к клеткам рака простаты in vivo.
На фигуре 6 показано типичное SPECT-изображение, на котором отчетливо видно связывание 177Lu-h11B6 с клетками опухоли LNCaP в мышах с ксенотрансплантатами.
177Lu-h11B6 демонстрирует неожиданно лучший терапевтический индекс
Сравнение данных по биораспределению для гуманизированного 177Lu-11В6 с данными для родительского мышиного антитела (177Lu-m11B6) выявило неожиданное и выгодное отличие.
Как показано на фигуре 7, поглощение 177Lu-h11B6 в опухоли LNCaP возрастает примерно на 20% на 72 часу после инъекции по сравнению с 177Lu-m11B6. Одновременно, поглощение 177Lu-h11B6 в здоровой кости снижается примерно на 40% на 72 часу после инъекции по сравнению с 177Lu-m11B6.
На Фигуре 8 показаны данные, выраженные как отношение поглощения антитела в опухоли против здоровой кости, на 24, 48 и 72 часу после инъекции. К 72 часам, данное отношение заметно возрастает для гуманизированного антитела 11В6.
Дозиметрические расчеты
Расчет поглощенной дозы обеспечивает более сложное измерение различий в кинетике гуманизированных антител изобретения относительно таковых в родительских мышиных антителах 11В6.
Поглощенную дозу рассчитывали в соответствии со MIRD-схемой
Figure 00000037
, где
Figure 00000038
представляет собой общее число распадов органе-источнике, и S представляет собой поглощенную дозу на единицу распадов (смотри Bolch et al., 2009, J. Nucl. Med. 50:477-484, раскрытие которой включены в настоящий документ путем отсылки).
Figure 00000038
рассчитывали как кривую время-интеграл против кривой время-активность. S-фактор был основан на специфическом для мышей моделировании Монте Карло с помощью Moby-phantom (смотри Larsson et al., 2011, Acta Oncol. 50:973-980 и Keenan et al., 2010, J. Nucl Med. 50:471-476). Для того чтобы получить общую поглощенную дозу, все органы рассматривали как источник, а также как целевые источники.
Рассчитанные величины поглощенной дозы для различных тканей показаны в таблице 6.
Figure 00000039
Как можно было видеть из таблицы 6, поглощенная доза опухоли возрастает от 1,21 Гр/МБк для m11B6 до 2,2 Гр/МБк для h11B6, т.е. увеличение на 80%. Отношения поглощенных доз опухоли к костному мозгу возрастает от 3,9 для m11B6 до 5,6 для h11B6, примерно на 40%. В настоящем документе, показана повышенная терапевтический эффективность для h11B6 по сравнению с m11B6, что указывает на то, что к опухоли могут быть применены более высокие поглощенные дозы с меньшей нормальной токсичностью для органов.
Выведение антитела из крови
Анализ уровней в крови для гуманизированного и мышиного антитела 11В6 показан на фигуре 10.
Результаты позволяют предположить, что h11B6 может быть выведен из крови немного быстрее, чем мышиное антитело 11В6. Если это так, то такая повышенная скорость выведения для гуманизированного антитела также может иметь терапевтическое преимущество с точки зрения безопасности, потенциально позволяя вводить более высокие активности.
Повышенная скорость выведения также может быть выгодной для наружной визуализации.
Заключения
Результаты данного исследования показали следующее:
- гуманизированное антитело 11В6, 177Lu-h11B6, эффективно направляется к опухолям простаты in vivo;
- гуманизированное антитело 11В6 демонстрирует неожиданно лучший терапевтический индекс, чем его родительское мышиное антитело (как определено по отношению поглощения в опухолях к поглощению в здоровой кости); и
- гуманизированное антитело 11В6 может быть выведено из крови немного быстрее, чем мышиное антитело 11В6.
Вместе взятые, эти данные убедительно свидетельствуют о повышенной терапевтической эффективности гуманизированного 11В6 антитела при лечении (и диагностики) рака простаты.
Поскольку гуманизированное и мышиное антитела нацелены на один и тот же антиген (а именно, калликреин 2 человека), рассчитанные различия в обновленном отношении в опухоли к здоровый костному мозгу не могут быть легко предсказаны или объяснены (в особенности, при условии, что гуманизированное антитело, по-видимому, обладает меньшей аффинностью для целевого антигена hK2 по сравнению с родительским мышиным антителом; смотри пример 4).
Различия в относительном поглощении в опухоли по сравнению со здоровой костью между гуманизированным и мышиным антителом 11В6 имеет существенное значение, поскольку данное сравнение обеспечивает меру терапевтического отношения. Более высокая величина для данного отношения (как это видно для гуманизированного антитела 11В6) свидетельствует о лучшем терапевтическом антителе. В особенности, более высокое терапевтический индекс означает, что более высокие поглощенные дозы терапевтически-радиомеченого h11B6 могут быть введены для достижения лучшего терапевтического эффекта (поскольку связывание гуманизированного антитела со здоровой тканью и органами значительно ниже, чем для мышиного антитела). Более высокое отношение также указывает на то, что h11B6 будет лучше, чем мышиное антитело для диагностических целей (поскольку оно соответствует более низкому отношению сигнал к шуму, позволяя осуществлять визуализацию опухолей меньшего размера, включая метастазы).
В заключении, данные показывают, что гуманизация антитела 11В6 повышает возможность ранней диагностики и дает неожиданно более высокую терапевтическую эффективность при лечении рака простаты.
Пример 7 - Демонстрация диагностической и терапевтической эффективности
Цель данного исследования заключалась в подтверждении полезности 11В6, mAb, которое специфически направляется к эпитопу внутри каталитической щели hK2, в качестве носителя для доставки высокотоксичных радионуклидов, специфически к участкам роста рака простаты. В этом подтверждении концепции исследования, мы метили родительское мышиное 11 В6 антитело 177Lu, бета-частицей с низкой энергией, которая также дает гамма-излучение, позволяя выполнять SPECT-визуализацию.
Материалы и методы
Материалы
177Lu был приобретен у компании «Mallinkrodt Medical BV», Петтен, Голландия. Систему с фосфором с длительным послесвечением Cyclone™ и программное обеспечение OptiQuant™ для анализа изображений (Perkin Elmer, Wellesley, MA, США) применяли для измерения радиоактивности на полосках ITLC (мгновенная тонкослойная хроматография) (Biodex, US) для определения кинетики мечения и радиохимической чистоты. Все химические реактивы были получены от «Sigma-Aldrich», а буферы готовили самостоятельно с помощью воды аналитической степени чистоты, если не указано другое. mAb 11В6 представляет собой антитело, специфическое для калликреина 2 человека с аффинностью для данного антигена, равным примерно 1,2 нМ; смотри фигуру 1 (получено от Университета Турку, Финляндия). Для in vivo исследования, применяли клеточные линии карциномы простаты LNCaP, экспрессирующие hK2 (АТСС, Манассас, VA, США). Клетки культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и PEST (пенициллин 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицин). Клетки поддерживали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 и отделяли с помощью раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсин, 0,02% ЭДТА в буфере, «Thermo Scientific»).
Конъюгация и радиомечение
Конъюгация СНХ-А''-DTPA с 11В6: Раствор mAb 11В6 в PBS доводили до pH 9,2 с помощью 0,07 М натрий-боратного буфера. Образец концентрировали на центрифужном фильтре «Amicon Ultra-2» (2 мл, 100 K). Белковый раствор конъюгировали с хелатором СНХ-А''-DTPA («Macrocyclics», США) в молярном отношении хелатора к антителу 3:1 при 40°C. Реакцию останавливали через 4 часа и СНХ-А''-DTPA-11В6, с этого момента называемый DTPA-11B6, отделяли от свободного хелата гель-хроматографией на колонке NAP-5 («GE Healthcare»), уравновешенной 20 мл 0,2 М ацетат-аммонийного буфера, pH 5,5. Конъюгированные 11В6 и 5А10 элюировали 1 мл ацетат-аммонийного буфера.
Радиомечение DTPA-11B6: DTPA-11B6 в ацетат-аммонийном буфере, pH 5,5, перемешивали с заранее определенным количеством 177LuCl3. После инкубации при комнатной температуре в течение 2-х часов, мечение прекращали, проводили очистку на колонке NAP-5, уравновешенной PBS. Эффективность мечения и кинетику мечения контролировали с помощью полосок ITLC, элюировали 0,2 М лимонной кислоты. В данной системе, радиомеченый конъюгат оставался на исходной линии, тогда как свободный Lu-177 мигрировал с фронтом растворителя. Распределение радиоактивности определяли в системе формирование изображения на люминесцентном фосфорном покрытии Phosphorlmager (Perkin Elmer, Wellesley, MA, США) с помощью Optiquant в качестве программного обеспечения для количественного определения (Perkin Elmer, Wellesley, MA, США).
Исследования на животных
Все эксперименты на животных проводили в соответствии с национальным законодательством по защите лабораторных животных. Исследование на животных было одобрено местным Комитетом по контролю этических норм в исследованиях на животных. Иммунодефицитных «голых» мышей-самцов, NMRI, (в возрасте 6-8 недель), приобретенных у компании «Taconic Europe» (Bomholt, Дания), применяли для данного исследования.
Ксенотрансплантаты hK2-экспрессирующих клеток карциномы простаты LNCaP подкожно имплантировали в правый бок и/или в левый бок в количестве примерно 10*106 клеток на инъекцию.
Животных, у которых развивались опухоли LNCaP, разделяли на группы, и им вводили или терапевтическое средство 177Lu-DTP-11B6, или контроль, смотри таблицу 7 ниже:
Figure 00000040
Всех включенных животных непрерывно измеряли и взвешивали в интервале 3-4 дней.
Первоначально, некоторые животные получили более низкую активность (8МБк) 177Lu-DTPA-11B6 для исследования локализации терапевтического средства с помощью SPECT. Одну мышь из группы 8 также исследовали с помощью SPECT. У этих животных извлекали органы, и применяли автоматизированный счетчик лунок NaI(Tl) с 3-дюймовым детектором NaI (Т1) (1480 WIZARD, Wallac Oy, Турку, Финляндия) для количественной оценки радиоактивности в данных образцах ткани.
Для исследования эффекта на костный мозг регулярно отбирали образцы крови (10 мкл). Образцы крови собирали два раза в неделю в течение 8 недель после инъекции и количество WBC, количество RBC и количество тромбоцитов анализировали с помощью анализатора Medonic Cell Analyzer-Vet CA530 Vet (Boule Medical, Стокгольм, Швеция). Во время отбора крови, контролировали массу и физическое состояние животных. Токсичность оценивали путем мониторинга животных на предмет потери массы тела, ухудшения, в целом, состояния, и гематологической токсичности.
Объем опухоли измеряли с помощью штангенциркуля. Измеряли длину 1, ширину w и толщину t и рассчитывали объем.
Планирование терапии
На основе взаимоотношений между поглощенной дозой и биологическим эффектом на костный мозг у крыс, подвергнутых радиоиммунотерапия 90Y и 177Lu (смотри Larsson et al., 2012, Med. Phys. 39(7):4434-43), можно оценить, что LD50 для костного мозга будет в порядке 12 Гр. В литературе LD50 при остром облучении крыс и мышей представляют собой такую же величину, примерно 9 Гр (например, смотри Radiobiology for the radiologist, Hall & Giacca (Eds), 2006, 6th edition).
Затем были разработаны терапии из предположения о переносимой поглощенной дозе 12 Гр для костного мозга. Затем, из дозиметрических расчетов рассчитывали активность соответствующую данной поглощенной дозе.
Соответствующие дозы/активности применяли для контролей.
Результаты
Сокращение опухоли у животных
На Фигуре 11 показано, как опухоль у одной из мышей (видная на боку животного, под кожей) сокращается в объеме вследствие лечения.
Результаты радиоиммунотерапии
На Фигуре 12 показаны результаты для группы исследования с введенными активностями (a) D, (b) 2×D и для (с) контрольной группы (где D=26,7 МБк).
Существует четко выраженная тенденция к снижению объема опухоли в обеих группах лечения. Начало сокращения опухоли видно уже через несколько дней после инъекции 177Lu-m11B6. В контрольной группе наблюдали увеличение объема опухоли после инъекции раствора NaI.
На Фигуре 13 (а) показаны результаты для одной из мышей в группе с введенной активностью А. Здесь, опухоль росла стабильно с первого дня до дня шесть, когда вводили активность А для 177Lu-m11B6. Вследствие лечения, наблюдали быстрое снижение объема опухоли.
В исследовании SPECT (8 d pi) был показан объем опухоли со все еще присутствующей активностью; смотри фигуру 13(b).
Заключение
Настоящее исследование с типичным антителом 177Lu-m11B6 ясно демонстрирует терапевтическую эффективность нацеленного на hK2 антитела против опухолей рака простаты in vivo.
Пример 8 - Терапевтическая эффективность типичного 177Lu-меченного гуманизированного антитела 11В6 изобретения в ксенотрансплантатах рака простаты
Материалы и методы
Антитела, конъюгация и радиомечение
Антитела: Типичное гуманизированное моноклональное антитело 11B6 (IgGl/каппа, кратковременная экспрессированное в клетках HEK 293), включающее тяжелую цепь в соответствии с SEQ ID NO:12 и легкую цепь в соответствии с SEQ ID NO:13, было предоставлено компанией «Innovagen АВ», Лунд (1 мг/мл в PBS, pH 7,4, Lot No. 90476.30). Неспецифическое IgG антитело применяли в качестве изотопного контроля (IgG антитело из мышиной сыворотки, «Sigma» I-8765).
Конъюгация: Типичное h11B6 неспецифическое контрольное антитело IgG конъюгировали с хелатором CHX-A''-DTPA («Macrocyclics», США) следующим образом: раствор антитела концентрировали на центрифужном фильтре «Amicon Ultra-2» (2 мл, 100 K) и затем доводили до pH 9,2 с помощью 0,07 М натрий-боратного буфера («Sigma-Aldrich»).
Связывание хелатирующего соединения СНХ-А''-DTPA с белковым раствором в молярном отношении приблизительно 3:1 (хелатор к антителу) проводили аналогично ранее описанному способу (смотри Almqvist et al). Эффективность связывания, т.е. количество полученных хелаторов на антитело может быть определено спектрофотометрическим способом (Pippin et al), но не было проанализировано в этом исследовании. Однако предпочтительно связывание не должно превышать 3 хелатора/антитело во избежание повреждения белка. Хелатор добавляли к белку, и раствор инкубировали при осторожном встряхивании при 40°C.
Реакцию останавливали через 4 часа и CHX-A-DTPA-h11B6, называемый DTPA-h11B6, отделяли от свободного хелата гель-хроматографией на колонке NAP-5 («GE Healthcare»), уравновешенной 20 мл 0,2 М ацетат-аммонийного буфера («Sigma-Aldrich»), H 5,5. Конъюгированные h11B6 элюировали 1 мл ацетат-аммонийного буфера и разделенные на аликвоты образцы хранили при -20°C.
Конъюгацию IgG контрольного антитела контролировали аналогичным образом, как описано выше.
Радиомечение: Конъюгированные h11B6 или IgG контрольное антитело (как правило, 200-300 мкл с концентрацией ~ 1 мкг/мкл в 0,2 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,5) перемешивали с заранее определенным количеством (~ 200-300 МБк) 177LuCl3 (IDB Голландия) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов. После инкубации, мечение прекращали и проводили очистку на колонке NAP-5 («GE Healthcare»), уравновешенной PBS («Thermo Scientific»). Эффективность мечения контролировали мгновенной тонкослойной хроматографией («Biodex», США), элюировали 0,2 М лимонной кислотой («Sigma-Aldrich»). В данной системе, радиомеченый конъюгат оставался на исходной линии, тогда как свободный 177Lu мигрировал с фронтом растворителя. Радиоактивное распределение определяли с помощью системы с фосфором с длительным послесвечением «Cyclone», применяя Optiquant в качестве программного обеспечения для количественного определения (оба от компании «Perkin Elmer»).
Радиомечение IgG контрольного антитела проводили аналогичным образом, как описано выше.
Исследование терапии
Клеточные линии: LNCaP (hK2+) были приобретены в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 («Thermo Scientific»), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой («Thermo Scientific») с пенициллином 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина («Thermo Scientific»). Клетки поддерживали при 37°C в увлажненном инкубаторе при 5% CO2 и отделяли с помощью раствора трипсин-ЭДТА («Thermo Scientific»).
Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с национальным законодательством по защите лабораторных животных, и с одобрения Комитета по контролю этических норм в исследованиях на животных (Университет Лунда, Швеция). Применяли полученных в собственной лаборатории иммунодефицитных «голых» мышей-самцов Balb/c (6-8-недельного возраста). Мышам ксенотранплантировали клетки LNCaP на их правый бок путем подкожной инъекции (8-10 миллионов клеток) в 100 мкл среды роста и 100 мкл матригеля (восстановленный фактор роста матрикса базальной мембраны, свободный от фенолового красного, BD Matrigel™, Cat No 356231). Мышей с установленными опухолями, с диаметром равным, по меньшей мере, ~ 3 мм, включали в исследование и разделяли на три группы, описанные ниже в таблице 8. Инъекции животным вводили внутривенно в хвостовую вену. Уровень активности, равный 20 МБк, был выбран потому, что дозы в данном количестве применяли в исследовании с m11B6, показавшем хороший терапевтический эффект (смотри пример 7).
Figure 00000041
Терапевтическую эффективность оценивали путем повторного измерения размера опухоли с помощью штангенциркуля. Объем опухоли рассчитывали путем измерения длины (L) и ширины (W) опухоли и затем рассчитывали объем V как 0,5×L×W×W.
Также, гематологические измерения (количество лейкоцитов, количество эритроцитов, количество тромбоцитов и количество гемоглобина) и измерения массы выполняли многократно для всех животные для идентификации любой потенциальной гематологической токсичности и для контроля общего состояния животных. Особенно важно следить за гематологической токсичностью при оценке радиоиммунотерапии, поскольку радиоактивность будет распределяться в крови и, в конце концов, достигнет костного мозга, где расположены стволовые клетки крови.
Мышей, у которых развивалась опухоль, по длине/ширине превышавшая 14 мм, или потеря массы, превышавшая 15% по сравнению с исходной массой, или иным образом имелось негативное воздействие на общее состояние, или была комбинация все этих трех параметров, забивали в соответствии с этическим руководством.
Результаты
Оценка терапевтической эффективности
Как показано на фигуре 14 (а), введение типичного гуманизированного антитела 11В6 изобретения (177Lu-h11B6) предотвращает рост опухоли у мышей (и приводит к выраженному снижению в объеме опухоли у всех, кроме одного, из протестированных животных). Напротив, опухоли продолжали быстро расти у мышей, обработанных или контрольным антителом IgG (смотри фигуру 14b) или NaCl (смотри фигуру 14с).
Результаты для индивидуальных животных, показанные на фигуре 14, суммированы в форме кривых Каплана-Мейера на фигуре 15. Введение 177Lu-h11B6 вызывает заметное увеличение в выживаемости мышей на протяжении всего срока эксперимента, более 80% животных были еще живы по окончанию эксперимента, в течение 60 дней после инъекции (по сравнению с 0% выживания в двух контрольных группах).
Оценка гематологической токсичности
Оценка количества лейкоцитов, количества эритроцитов, количества тромбоцитов и количества гемоглобина и массы не выявила эффекта токсичности при введении 177Lu-h11B6 (данные не показаны).
Обсуждение
Результаты данного исследования выявили значительный терапевтический эффект лечения 177Lu-h11B6 в модели с ксенотрансплантатом рака предстательной железы.
Активность, введенная мышам (20 МБк), соответствует поглощенной дозе в костном мозге, равной приблизительно 10 Гр, что хорошо переносится этими животными. Даже при таком низкой активности в 20 МБк, наблюдали большой терапевтический эффект. По предыдущим оценкам, можно ожидать поглощенную опухолью дозу, равную, по меньшей мере, 60 Гр.
Не наблюдали никаких указаний на гематологическую токсичность.
Ссылки
Almqvist Y., et al. In vitro and in vivo characterization of 177Lu-huA33: a radio-immunoconjugate against colorectal cancer. Nucl Med Biol. 2006; 33: 991-998.
Pippin CG et al. Spectrophotometric method for the determination of a bifunctional DTPA ligand in DTPA-monoclonal antibody conjugates. Bioconjug Chem. 1992; 3: 342-5.
Пример 9 - Планирование дозиметрии при терапии радионуклидами и лечение рака простаты у пациента
Для терапии радионуклидами (RNT), источник излучения распространяется в целом и радиоактивность, как правило, вводят системно в виде радиофармацевтического средства. Распределение радиоактивности зависит от количества радиофармацевтического средства, которое накапливается с течением времени в различных тканях, это то, что варьирует между пациентами (1).
RNT-лечение должно быть основано на предписанной поглощенной дозе (2). Следовательно, первоначально следует выполнить предварительное терапевтическое исследование с применением следовых количеств радиофармацевтического средства, и определить поглощенные дозе для опухоли и органа. Обычно, данную информацию выражают как фактор, описывающий поглощенную органом дозу на единицу введенной активности, в единицах мГр/МБк;
Figure 00000042
(орган).
Если затем проводят терапевтическое введение в тех же условиях, то данный фактор может быть применен для определения активности, необходимой для введения с целью доставки предписанной поглощенной дозы к данному органу, ткани или опухоли (4,6).
В случае лечения рака простаты с помощью радиомеченого h11B6 антитела, предварительное терапевтическое исследование должно быть основано на визуализация 111In с 111In-h11B6. 111In наилучшим образом подходит для количественной (плоскостной/SPECT) визуализации, тогда как 177Lu должен представлять собой терапевтический радионуклид. Если затем определяют величину
Figure 00000042
(орган), то терапия может быть дана с терапевтической активностью AT, дающей предписанный терапевтический эффект. Во время терапии, распределение активности и соответствующая мощность дозы должны быть рассчитаны на основании визуализации для достижения актуальной терапевтической поглощенной дозы, данной к опухоли и нормальным органам, необходимой для оценки лечения.
В случае терапии, при которой уровень токсичности для костного мозга будет достигнут как результат планирования лечение, в последствии будет необходима поддержка костного мозга, и на основании дозиметрических расчетов для полости костного мозга, должно быть определено время для реинфузии стволовых клеток.
Таким образом, соответственно должна планироваться следующая схема лечения:
Исследование дозиметрии для предварительной терапии
1. Инъекция 111In-меченных h11B6 (200-300 МБк)
2. Отбор образцов крови - концентрацию активности в крови и в плазме определяют в первую неделю.
3. Визуализация (SPECT/плоскостная) в течение 1-ой недели (7 раз)
4. Дозиметрия органа на основании схемы LundaDose (3)
5. Определена терапевтическая активность, ограниченная указанной поглощенной дозой для радиочувствительных органов, таких как костный мозг (2-3 Гр), почки (20-30 Гр) и печень (12-36 Гр).
Дозиметрия для терапии, включая интра-терапию
1. Введение 177Lu-меченных h11B6 (на основании предварительной терапевтической дозиметрии)
2. Отбор образцов крови - концентрация активности в крови и плазме
3. Визуализация в течение 1-ой недели (6 раз)
4. Дозиметрия органа => Проверка предписанной терапевтической поглощенной дозы.
Конкретные комментарии в отношении дозиметрии
Накопленная активность представляет собой число распадов, возникающих в определенной области в течение определенного периода времени. Единица представляет собой Бк s или Бк h. Когда ионизирующее излучение проходит через вещество, оно взаимодействует и выделяет энергию. Передача энергии представляет собой сумму всей выделенной энергии в данном объеме. Поглощенная доза представляет собой отношение средней переданной энергии и массы объема. Единица поглощенной дозы - это Грей (Гр), 1 Гр равен 1 Дж/кг.
Из величины активности в ткани в различные времена, кумулятивную активность определяют интегрированием, и может быть определена средняя поглощенная доза. Измерения активности выполняют с помощью плоскостной визуализации для дозиметрии целого органа. Количественный способ SPECT/CT позволяет проводить дозиметрию в маленьких объемах с помощью способов на воксельной основе.
Из 3D распределения величины концентрации активности, можно рассчитать распределение мощности поглощенной дозы с помощью, так называемых, зерен разовой локальной дозы или величины воксель S, описывающих образец выделения энергии вокруг точечного источника, расположенного в воде (или в кости). Данный способ предполагает, что анатомическая область однородна с точки зрения плотности, такая как мягкие ткани в туловище. Для области организма, где плотность неоднородна, как в легких, предпочтителен прямой расчет способом Монте-Карло. Здесь, распределение активности из SPECT или PET применяли в качестве вклада в коде расчета дозы способом Монте-Карло.
Ссылки
1. Strand S-E, Zanzonico Р, Johnson TK. Pharmacokinetic modeling. Med Phys 1993; 20(2): 515-27
2. ICRU report nr 67 - Dose Specifications in Nuclear Medicine. Adelstein SJ, DeLuca P, Feinendegen LE, Green L, Howell RW, Humm JL, Strand SE ICRU; 2002
3. The LundADose Method for Planar Image Activity Quantification and Absorbed-Dose Assessment in Radionuclide Therapy. Sjogreen,K., Ljungberg,M., Wingardh,K., Minarik,D., and Strand,S.E. (2005): Cancer Biother.Radiopharm., 20: 92-97
4. Quantitative imaging for clinical dosimetry.
Bardies M, Flux G, Lassman M, Monsieurs N, Savolainen S, Strand S-E
Nucl Instr and Methods 2006:569:467-471.
5. 177Lu-[DOTA0,Tyr3] octreotate therapy in patients with disseminated neuroendocrine tumors: Analysis of dosimetry with impact on future therapeutic strategy.
Garkavij Michael, Nickel Mattias,
Figure 00000043
Katarina, Ljungberg Michael, Ohlsson Tomas,
Figure 00000044
Karin, Strand Sven-Erik, Tennvall Jan.
Cancer 2010:116(4 Suppl): 1084-92.
6. Dosimetry in patients with B-cell lymphoma treated with [(90)Y]ibritumomab tiuxetan or [(131)I]tositumomab
Figure 00000043
K., Dewaraja YK., Chisea C, Tennvall J.,
Figure 00000045
O., Strand SE, Ljungberg M..Q J Nucl Med Mol Imaging, 2011 April; 55(2): 126-54.

Claims (85)

1. Полипептид антитела со специфичностью связывания в отношении калликреина-2 человека (hK2), в котором полипептид антитела содержит
(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и
(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6,
и в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи включают аминокислотные последовательности каркасного участка от одного или нескольких антител человека.
2. Полипептид антитела по п. 1, в котором полипептид антитела демонстрирует увеличенный терапевтический индекс по сравнению с мышиным антителом 11В6.
3. Полипептид антитела по п. 1 или 2, включающий или состоящий из интактного антитела.
4. Полипептид антитела по любому из пп. 1-3, включающий или состоящий из антиген-связывающего фрагмента, который выбирают из группы, состоящей из Fv фрагментов (например, одноцепочечных Fv и связанных дисульфидными связями Fv), Fab-подобных фрагментов (например, Fab фрагментов, Fab' фрагментов и F(ab)2 фрагментов).
5. Полипептид антитела по п. 4, в котором антиген-связывающий фрагмент представляет собой scFv.
6. Полипептид антитела по п. 1, в котором каркасный участок включает последовательности из семейства генов человеческого иммуноглобулина VH4.
7. Полипептид антитела по п. 6, в котором последовательности каркасного участка происходят из гена зародышевого типа VH4-28.
8. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, в котором каркасные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи неприродного происхождения.
9. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
10. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий вариабельную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
11. Полипептид антитела по п. 9 или 10, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
12. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий константную область тяжелой цепи или ее часть.
13. Полипептид антитела по п. 12, в котором константная область тяжелой цепи принадлежит к подтипу иммуноглобулина, который выбирают из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
14. Полипептид антитела по п. 12, в котором константная область тяжелой цепи принадлежит к подтипу иммуноглобулина IgG1.
15. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий константную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 или ее части.
16. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий константную область легкой цепи или ее часть.
17. Полипептид антитела по п. 16, в котором константная область легкой цепи представляет собой легкую цепь типа каппа или лямбда.
18. Полипептид антитела по п. 17, в котором константная область легкой цепи представляет собой легкую цепь типа каппа.
19. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий константную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или ее части.
20. Полипептид антитела по п. 18 или 19, включающий константную область тяжелой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и константную область легкой цепи, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
21. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий тяжелую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.
22. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, включающий легкую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13.
23. Полипептид антитела по п. 21 или 22, включающий тяжелую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13.
24. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, в котором полипептид антитела связан, непосредственно или опосредованно, с терапевтической группировкой.
25. Полипептид антитела по п. 24, в котором терапевтическая группировка представляет собой цитотоксическую группировку, которая включает или состоит из одного или нескольких радиоизотопов.
26. Полипептид антитела по п. 25, в котором один или несколько радиоизотопов, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из бета-излучателей, Оже-излучателей, излучателей конверсионных электронов, альфа-излучателей и излучателей фотонов малой энергии.
27. Полипептид антитела по п. 26, в котором один или несколько радиоизотопов, каждый независимо, обладает образцом излучения локально поглощенной энергии, что создает высокую поглощенную дозу в непосредственной близости от средства.
28. Полипептид антитела по п. 26 или 27, в котором один или несколько радиоизотопов, каждый независимо, выбирают из группы, состоящей из бета-излучателей дальнего радиуса действия, таких как 90Y, 32Р, 186Re/186Re; 166Ho, 76As/77As, 153Sm; бета-излучателей среднего радиуса действия, таких как 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb; низкоэнергетических бета-излучателей, таких как 45Са, 35S или 14С; конверсионных излучателей или Оже-излучателей, таких как 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 123In, 125I, 201Tl; и альфа-излучателей, таких как 212Bi, 213Bi, 223Ас, 225Ас и 221At.
29. Полипептид антитела по п. 28, в котором радиоизотоп представляет собой 177Lu.
30. Полипептид антитела по п. 24, в котором терапевтическая группировка представляет собой цитотоксическую группировку, которая включает или состоит из одного или нескольких цитотоксических лекарственных препаратов.
31. Полипептид антитела по п. 30, в котором одну или несколько терапевтических группировок, каждую независимо, выбирают из группы, состоящей из цитостатического препарата; антиандрогенного лекарственного препарата; кортизона и его производных; фосфоната; ингибитора тестостерон-5-α-редуктазы; аддендов на основе бора; цитокина; тапсигаргина и его метаболитов; токсина (такого как сапорин или калихеамицин); химиотерапевтического средства (такого как антиметаболит); или любого другого цитотоксического лекарственного препарата, применяемого при лечении карциномы предстательной железы.
32. Полипептид антитела по п. 24, в котором терапевтическая группировка включает или состоит из одной или нескольких группировок, подходящих для применения в активационной терапии, такой как фотонно-активационная терапия, нейтронно-активационная терапия, нейтрон-индуцированная Оже-электронная терапия, терапия синхротронным излучением или фотонно-активационная терапия с применением рентгеновского излучения с низкой энергией.
33. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, в котором полипептид антитела дополнительно включает детектируемую группировку.
34. Полипептид антитела по п. 33, в котором детектируемая группировка включает или состоит из радиоизотопа.
35. Полипептид антитела по п. 34, в котором радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I и 201Tl.
36. Полипептид антитела по п. 34, в котором радиоизотоп представляет собой 89Zr.
37. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, в котором полипептид антитела включает пару детектируемого и цитотоксического радионуклидов, такую как 86Y/90Y или 124I/211At.
38. Полипептид антитела по п. 37, в котором радиоизотоп способен одновременно действовать мультимодальным образом в качестве детектируемой группировки, и также в качестве цитотоксической группировки.
39. Полипептид антитела по п. 33, в котором детектируемая группировка включает или состоит из парамагнитного изотопа.
40. Полипептид антитела по п. 34, в котором парамагнитный изотоп выбирают из группы, состоящей из 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr и 56Fe.
41. Полипептид антитела по пп. 33-40, в котором детектируемую группировку обнаруживают с помощью такой методики визуализации, как SPECT, PET, MRI, оптическая или ультразвуковая визуализация.
42. Полипептид антитела по пп. 24-41, в котором терапевтическая группировка и/или детектируемая группировка присоединены к полипептиду антитела опосредованно, через связывающую группировку.
43. Полипептид антитела по п. 34, в котором связывающая группировка представляет собой хелатор.
44. Полипептид антитела по п. 34, в котором хелатор выбирают из группы, состоящей из производных 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), дефероксамина (DFO), производных диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), производных S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA) и производных 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (ТЕТА).
45. Полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов, в котором полипептид антитела дополнительно включает группировку для увеличения in vivo времени полужизни агента.
46. Полипептид антитела по п. 45, в котором группировку для увеличения in vivo времени полужизни выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (PEG), человеческого сывороточного альбумина, групп гликозилирования, жирных кислот и декстрана.
47. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид антитела по любому из предшествующих пунктов.
48. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая компонент, представляющий собой тяжелую полипептидную цепь полипептида антитела по любому из пп. 1-46.
49. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая компонент, представляющий собой легкую полипептидную цепь полипептида антитела по любому из пп. 1-46.
50. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 47-49, в котором молекула представляет собой молекулу кДНК.
51. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 47 или 50, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15.
52. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 48 или 50, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.
53. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 49 или 50, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15.
54. Рекомбинантная клетка-хозяин для экспрессии полипептида антитела по любому из пп. 1-46, где указанная рекомбинантная клетка-хозяин содержит
a) молекулу нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 47, 50 и 51 или
b) молекулу нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 48, 50 и 52 и молекулу нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 49, 50 и 53.
55. Клетка-хозяин по п. 54, в котором клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
56. Клетка-хозяин по п. 54, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающих.
57. Клетка-хозяин по п. 56, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку человека.
58. Способ получения полипептида антитела по любому из пп. 1-46, где способ включает культивирование клетки-хозяина, как определена в любом из пп. 54-57, в условиях, позволяющих осуществление экспрессии кодируемого полипептида антитела.
59. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения рака предстательной железы, включающая полипептид антитела по любому из пп. 1-46, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель или носитель.
60. Фармацевтическая композиция по п. 59, подходящая для парентерального введения.
61. Набор для лечения рака предстательной железы, где указанный набор включает фармацевтическую композицию по п. 59 или 60.
62. Полипептид антитела по любому из пп. 1-46 для применения в медицине для лечения и диагностики рака предстательной железы.
63. Полипептид антитела по любому из пп. 1-46 для применения при лечении и диагностике рака предстательной железы.
64. Полипептид антитела по п. 63, где подлежащий лечению рак простаты представляет собой нелокализованный (т.е. диссеминированный) рак предстательной железы.
65. Полипептид антитела по п. 64, где подлежащий лечению рак предстательной железы представляет собой метастатический рак предстательной железы, необязательно, микрометастатический рак предстательной железы.
66. Полипептид антитела по п. 65, где подлежащий лечению метастатический рак предстательной железы представляет собой метастазы лимфатической системы; метастазы кости (включая позвоночник, позвонки, таз, ребра); метастазы в области таза, прямой кишки, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала.
67. Полипептид антитела по любому из пп. 63-66, где пациент имеет рак предстательной железы и возраст менее чем 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 или меньше лет во время диагностики и/или во время лечения рака предстательной железы.
68. Полипептид антитела по любому из пп. 63-67, в котором пациент характеризуется тем, что члену его семьи, такому как отец или брат, был ранее поставлен диагноз рак простаты.
69. Полипептид антитела по любому из пп. 63-68, в котором подлежащий лечению рак предстательной железы представляет собой резистентный к кастрации рак предстательной железы (CRPC).
70. Применение полипептида антитела по любому из пп. 1-46 в производстве лекарственного средства для лечения рака предстательной железы.
71. Применение полипептида антитела по любому из пп. 1-46 в производстве лекарственного средства для диагностики рака предстательной железы.
72. Способ лечения рака предстательной железы у пациента, где способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества полипептида антитела по любому из пп. 1-46.
73. Способ диагностирования рака у пациента, где способ включает стадию введения пациенту диагностически эффективного количества полипептида антитела по любому из пп. 1-46.
74. Способ по п. 72 или 73, в котором подлежащий лечению рак предстательной железы представляет собой нелокализованный (т.е. диссеминированный) рак предстательной железы.
75. Способ по п. 74, в котором подлежащий лечению рак предстательной железы представляет собой метастатический рак предстательной железы, необязательно, микрометастатический рак предстательной железы.
76. Способ по п. 75, в котором подлежащий лечению метастатический рак предстательной железы представляет собой метастазы лимфатической системы; метастазы кости (включая позвоночник, позвонки, таз, ребра); метастазирование в области таза, прямой кишки, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала.
77. Способ по любому из пп. 72-76, в котором пациент имеет рак предстательной железы и возраст менее 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 или меньше лет во время диагностики и/или во время лечения рака предстательной железы.
78. Способ по любому из пп. 72-77, в котором пациент характеризуется тем, что члену его семьи, такому как отец или брат, был ранее поставлен диагноз рак предстательной железы.
79. Способ по любому из пп. 72-78, в котором подлежащий лечению рак предстательной железы представляет собой резистентный к кастрации рак предстательной железы (CRPC).
80. Способ по любому из пп. 72-79, в котором радионаправленное хирургическое вмешательство проводят на пациенте после введения полипептида антитела с целью удаления клеток рака предстательной железы.
RU2016124229A 2013-11-19 2014-11-19 Полипептиды антител и их применения RU2687163C1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1320408.6A GB2520353A (en) 2013-11-19 2013-11-19 Antibody polypeptides and uses thereof
GB1320408.6 2013-11-19
GB1401973.1 2014-02-05
GB201401973A GB201401973D0 (en) 2014-02-05 2014-02-05 Antibody polypeptides and uses thereof
PCT/GB2014/053420 WO2015075445A1 (en) 2013-11-19 2014-11-19 Humanised anti kallikrein-2 antibody

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2016124229A RU2016124229A (ru) 2017-12-25
RU2687163C1 true RU2687163C1 (ru) 2019-05-07

Family

ID=52114029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016124229A RU2687163C1 (ru) 2013-11-19 2014-11-19 Полипептиды антител и их применения

Country Status (22)

Country Link
US (3) US10100125B2 (ru)
EP (2) EP3553088A1 (ru)
JP (3) JP6599859B2 (ru)
KR (3) KR102442738B1 (ru)
CN (2) CN112898431A (ru)
AU (3) AU2014351611B2 (ru)
BR (1) BR112016011025B1 (ru)
CA (1) CA2930493A1 (ru)
CY (1) CY1121900T1 (ru)
DK (1) DK3071595T3 (ru)
ES (1) ES2728515T3 (ru)
HR (1) HRP20191095T1 (ru)
HU (1) HUE043875T2 (ru)
IL (3) IL297678A (ru)
LT (1) LT3071595T (ru)
MX (2) MX2016006561A (ru)
PL (1) PL3071595T3 (ru)
PT (1) PT3071595T (ru)
RS (1) RS58831B1 (ru)
RU (1) RU2687163C1 (ru)
SI (1) SI3071595T1 (ru)
WO (1) WO2015075445A1 (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3553088A1 (en) * 2013-11-19 2019-10-16 Fredax AB Humanised anti kallikrein-2 antibody
MX2016012667A (es) 2014-03-28 2017-01-09 Opko Diagnostics Llc Composiciones y metodos relacionados con el diagnostico de cancer de prostata.
CN107406510B (zh) 2015-03-27 2022-02-18 欧普科诊断有限责任公司 前列腺抗原标准品及其用途
US20180326102A1 (en) * 2015-11-18 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Systems, methods, and compositions for imaging androgen receptor axis activity in carcinoma, and related therapeutic compositions and methods
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
CN110650974B (zh) 2017-02-10 2024-04-19 瑞泽恩制药公司 用于免疫-pet成像的放射性标记的抗-lag3抗体
SG11201908997UA (en) 2017-03-30 2019-10-30 Ecs Progastrin Sa Compositions and methods for detecting prostate cancer
US10730944B2 (en) 2017-07-24 2020-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD8 antibodies and uses thereof
KR20220006613A (ko) 2019-05-10 2022-01-17 얀센 바이오테크 인코포레이티드 마크로사이클릭 킬레이터 및 이의 사용 방법
CA3148735A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Janssen Biotech, Inc. Anti-hk2 chimeric antigen receptor (car)
CR20220025A (es) 2019-07-26 2022-05-04 Janssen Biotech Inc Proteínas que comprenden dominios de unión al antígeno de la peptidasa 2 relacionada con la calicreína y sus usos
PE20230389A1 (es) 2020-05-27 2023-03-06 Janssen Biotech Inc Proteinas que comprenden dominios de union al antigeno de cd3 y usos de estas
WO2022013818A1 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 Janssen Biotech, Inc. Anti-idiotypic antibodies against anti-klk2 antibodies
MX2023005462A (es) * 2020-11-10 2023-05-22 Janssen Biotech Inc Compuestos macrociclicos y metodos para usarlos.
CN112608365B (zh) * 2020-12-22 2021-07-30 吉林省特医食品生物科技有限公司 一种减轻体重的发酵型小分子肽及其制备方法和应用
CN114790245A (zh) * 2021-01-25 2022-07-26 成都康弘生物科技有限公司 一种抗体及其用途
WO2022162549A2 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Janssen Biotech, Inc. Immunoconjugates comprising kallikrein related peptidase 2 antigen binding domains and their uses
AU2022282866A1 (en) * 2021-05-27 2024-01-18 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of prostate cancer
WO2023084397A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Janssen Biotech, Inc. Macrocyclic compounds and diagnostic uses thereof
WO2023084396A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Janssen Biotech, Inc. Macrocyclic compounds and methods of making the same
WO2023144723A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Janssen Biotech, Inc. Immunoconjugates comprising kallikrein related peptidase 2 antigen binding domains and their uses

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009128218A (ru) * 2006-12-22 2011-01-27 Фадиа Аб (Se) Новый аллерген-простатический калликреин
WO2013061083A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Fredax Ab Therapeutic agents and uses thereof

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
SE459005B (sv) 1985-07-12 1989-05-29 Aake Rikard Lindahl Saett att framstaella sfaeriska polymerpartiklar
US5807978A (en) 1995-06-07 1998-09-15 Kokolus; William J. Immunogenic peptides of prostate specific antigen
US6379669B1 (en) 1995-08-04 2002-04-30 Akhouri A. Sinha Targeting of organs by immunoconjugates
CA2192782C (en) 1995-12-15 2008-10-14 Nobuyuki Takechi Production of microspheres
AU737659B2 (en) 1996-11-14 2001-08-23 Hybritech Incorporated Method for detection of metastatic prostate cancer
US7053042B1 (en) 1999-07-29 2006-05-30 Samuel Denmeade Activation of peptide prodrugs by hK2
WO2001012218A1 (en) 1999-08-16 2001-02-22 Zonagen, Inc. Methods and materials for the treatment of prostatic carcinoma
FI20002127A0 (fi) 2000-09-27 2000-09-27 Artic Partners Oy Ab Uusi vasta-aine, immunomääritys ja menetelmä eturauhassyövän havaitsemiseksi
JP4619651B2 (ja) 2001-06-01 2011-01-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用
AU2002362447A1 (en) * 2001-10-03 2003-04-14 University Of Rochester Human glandular kallikrein (hk2)-specific monoclonal antibodies that enhance or inhibit the enzymatic activity of hk2
WO2003080672A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
JP2007525416A (ja) 2003-01-31 2007-09-06 アルボア バイオロジクス， インコーポレイテッド 早期活性化分子のターゲティングに基づく免疫調節
EP1610818A4 (en) * 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
CN101094869A (zh) * 2004-08-03 2007-12-26 戴埃克斯有限公司 Hk1结合蛋白
US7462697B2 (en) * 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
US8663600B2 (en) * 2005-02-17 2014-03-04 Diaprost Ab Diagnosis of prostate cancer
US7875278B2 (en) * 2005-02-18 2011-01-25 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (PSMA) lacking in fucosyl residues
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
BRPI0717902A2 (pt) 2006-12-01 2013-10-29 Medarex Inc "anticorpo monoclonal humano isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceria, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para prepar um anticorpo anti-cd22, método para inibir o desenvolvimento de uma célula tumoral que expressa cd22 e método para tratar uma doença inflamatória ou autoimuneem um indivíduo"
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
EP3553088A1 (en) * 2013-11-19 2019-10-16 Fredax AB Humanised anti kallikrein-2 antibody

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009128218A (ru) * 2006-12-22 2011-01-27 Фадиа Аб (Se) Новый аллерген-простатический калликреин
WO2013061083A2 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Fredax Ab Therapeutic agents and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
LT3071595T (lt) 2019-05-10
RU2016124229A (ru) 2017-12-25
HUE043875T2 (hu) 2019-09-30
KR102574537B1 (ko) 2023-09-06
JP6599859B2 (ja) 2019-10-30
WO2015075445A1 (en) 2015-05-28
US10100125B2 (en) 2018-10-16
MX2016006561A (es) 2016-12-12
IL297678A (en) 2022-12-01
HRP20191095T1 (hr) 2019-09-20
PT3071595T (pt) 2019-06-11
AU2014351611A1 (en) 2016-06-30
CY1121900T1 (el) 2020-10-14
JP7051777B2 (ja) 2022-04-11
KR20220020406A (ko) 2022-02-18
US20190169312A1 (en) 2019-06-06
EP3071595B1 (en) 2019-03-20
CN112898431A (zh) 2021-06-04
IL245617A0 (en) 2016-06-30
KR20160096621A (ko) 2016-08-16
BR112016011025B1 (pt) 2024-01-23
AU2014351611B2 (en) 2020-04-23
KR102442738B1 (ko) 2022-09-15
US11230609B2 (en) 2022-01-25
JP2022062048A (ja) 2022-04-19
CN105980404A (zh) 2016-09-28
PL3071595T3 (pl) 2019-09-30
CN105980404B (zh) 2021-01-12
KR20230132599A (ko) 2023-09-15
IL278493B2 (en) 2023-04-01
AU2023222879A1 (en) 2023-09-14
JP2016540503A (ja) 2016-12-28
MX2021007006A (es) 2021-09-08
DK3071595T3 (da) 2019-07-01
IL245617B (en) 2021-02-28
SI3071595T1 (sl) 2019-08-30
RS58831B1 (sr) 2019-07-31
US20160369009A1 (en) 2016-12-22
EP3071595A1 (en) 2016-09-28
AU2020207775A1 (en) 2020-08-06
EP3553088A1 (en) 2019-10-16
BR112016011025A8 (pt) 2018-01-30
ES2728515T3 (es) 2019-10-25
AU2020207775B2 (en) 2023-06-15
JP2020022470A (ja) 2020-02-13
IL278493A (en) 2022-12-01
BR112016011025A2 (pt) 2017-12-05
CA2930493A1 (en) 2015-05-28
US20220064333A1 (en) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220064333A1 (en) Humanised Anti Kallikrein-2 Antibody
US20220242969A1 (en) Antibody polypeptides and uses thereof
GB2520353A (en) Antibody polypeptides and uses thereof
JP2018531045A6 (ja) 抗体ポリペプチド及びそれらの使用