KR20230132599A - 인간화된 안티 칼리크레인-2 항체 - Google Patents

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아만다 투이 트란
아만다 투이 트란
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Abstract

본 발명은 인간 칼리크레인-2(hK2)에 대해 바인딩 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 상기 항체 폴리펩타이드는 (a) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및/또는 (b) SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하며, 그리고 여기서 상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위는 하나 이상의 인간 항체의 프래임워크 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 항체 폴리펩타이드를 전립선암의 진단 및 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

Description

인간화된 안티 칼리크레인-2 항체{HUMANISED ANTI KALLIKREIN-2 ANTIBODY}
본 발명은 일반적으로 특히 전립선암 분야에서 치료 및 진단 제제 및 방법의 분야에 관한 것이다.
전립선암은 현재 남성에게서 가장 흔한 형태의 암이다. 전립선은 정액에서의 한 성분인 유체를 생성하는 남성의 호두-크기의 샘(gland)이다. 전립선은 조직의 외부 층에 의해 에워싸인 2개 이상의 로브(lobe) 또는 섹션을 갖는다. 전립선은 직장의 앞에 그리고 방광(urine bladder) 바로 아래에 위치하며, 요도를 감싼다.
전립선암의 발생은 유럽의 북서부 및 미국에서 가장 많다. 종양의 성장은 통상적으로 장기간 동안 발생하는 과정이다. 전립선암은 보통 가벼운(mild) 형태의 암이다. 실제로, 전립선암으로 진단된 남성의 대다수는 생존하고 회복하며, 단지 소수의 남성만이 초기 단계에서 전이하는 더욱 공격적인 형태의 전립선암에 봉착하고 있다. 이 공격적인 형태의 전립선암은, 암이 피막외(extracapsular) 조직까지 퍼지기 전, 오직 초기 단계에서 진단되는 경우에만 치유 가능하다.
현재, 전립선암의 진단 및 모니터링은 전형적으로는 환자의 혈액에서 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen)(PSA)의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. PSA의 농도가 여러 시점들에서 수행된 몇몇의 연속적 측정에서 뚜렷하게 높은 경우, 그 평가는 전립선암의 개연성(probability)이 존재한다는 것이다. 이 시점에서, 전립선암을 검증하기 위해 생검(biopsy)이 수행될 수 있다.
PSA(칼리크레인 III(kallikrein III)으로서도 또한 공지되어 있음)는 전립선의 분비 세포에서 생성되는 237개의 아미노산들의 단일 쇄로 구성된 단백질이다. 이들 분비 세포는 전체 전립선 샘에서 발견될 수 있다. PSA는 전립선암에 대해 잘 확립되고 전반적으로 연구된 마커이다. 건강한 세포와 비교하면, PSA의 생성은 악성(malignant) 세포에서 더욱 낮으며, 과다형성(hyperplastic) 세포에서 더욱 높다. 따라서, PSA의 농도는 실제로 전립선암을 앓는 남성으로부터의 혈액에서 더욱 높은 것과는 오히려 모순되는 것이다. 그러나, 악성 세포가 악화된 세포 구조를 가지며, 이에 따라 PSA에 대해 더욱 투과 가능한 것이라고 하는 설명이 있을 수 있다.
전립선암의 요법을 위해 표적으로서 적합할 수 있는 또 다른 중요한 세린 프로테아제는 인간 샘 칼리크레인 2(human glandular kallikrein 2)(hK2)이다. hK2를 암호화하는 유전자는 PSA를 암호화하는 유전자와 함께 염색체 19에 위치한다. hK2는 단지 PSA와 같이 전립선 조직에서 주로 발현한다. 전립선에서, PSA는 비활성 프로-폼(pro-form)으로 존재하며, hK2의 펩티다아제 작용을 통해 활성화된다. hK2에 대한 면역조직화학 검사에서는, hK2가 분화의 수준과 관련하여 발현되는 것을 보여준다. 이는, hK2가 전립선암을 겪게 되는 조직과 같이 저 분화의 조직에서 더욱 높은 수율로 발현되며, 그리고 또 다른 통상적인 전립선 문제인 양성 전립선 과다형성(benign prostatic hyperplasia)(BPH)을 겪게 되는 조직과 같이 고 분화의 조직에서 더욱 낮은 수율로 발현되는 것을 의미한다.
전립선암의 현재 요법은 수술(예컨대, 근치 전립선절제술(radical prostatectomy)), 방사능 요법(근접치료(brachytherapy) 및 외부 방사선 요법을 포함함), 고강도 집속 초음파(high-intensity focused ultrasound)(HIFU), 화학요법, 경구 화학치료 약물, 냉동수술(cryosurgery)(종양을 동결시킴), 호르몬 요법(예컨대, 항안드로겐 요법), 거세, 또는 상술한 것들의 조합이다.
그러나, 이들 요법의 대부분(수술 및 외부 방사선 요법)은 일차 종양 및 대 전이의 치료에만 (또는 주로) 유용할 뿐이다. 화학요법은 암의 파종에 사용되지만 이들 환자의 대부분에 대해서는 아니며, 이는 일시적인 효과이고/이거나 생존을 지연시킨다. 따라서, 파종된 악성 질병, 특히 미소전이의 경우에 상당한 개선을 달성하기 위해서는, 다른 또는 보완적인 치료 양식이 필요하다.
항체 및 프래그먼트와 같은 표적 분자를 이용하는 요법, 예컨대 면역요법 또는 방사면역요법은 파종된 질병의 요법의 가능성을 제공할 수 있다.
따라서, 전립선암을 치료 및 진단하는 새로운 치료제들 및 치료방법들이 요구된다.
따라서, 본 발명은, 당해 분야에서 상기-확인된 것들 중 하나 이상의 결핍 및 단점들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 경감, 완화 또는 제거하고자 하며, 첨부된 특허청구범위에 따른 치료제들 및 치료방법들을 제공함으로써 상기 언급된 문제들을 해결한다.
본 발명은 항체는 건강한 조직이나 기관을 손상시키는 부작용이 증가하지 않으면서 전립선 암 치료에 더 효과적인 향상된 치료 효능을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 예시적인 인간화된 11B6 Fab 프래그먼트의 중쇄 및 경쇄 가변 부위들의 서열이다.
도 2는 뮤린 및 인간화된 11B6 항체들의 고유(native) 및 감소된 샘플들을 사용하는 SDS-PAGE 겔이다.
도 3은 칩 위에서 hK2에 대한 시험 11B6 항체들의 바인딩에 따른 결합 단계(association phase)들이다.
도 4는 시험 11B6 항체들의 해리 단계(dissociation phase)들이다.
도 5는 177Lu-표지된 인간화된 11B6 항체들의 생체분포(biodistribution)이다.
도 6은 마우스에서 전립선 종양에 대한 177Lu-표지된 h11B6의 바인딩을 나타내는 예시적 SPECT 이미지이다.
도 7은 종양 및 뼈에서 177Lu-표지된 h11B6 및 m11B6의 흡수 백분율(percentage uptake)이다.
도 8은 종양 내지 뼈에서 177Lu-표지된 h11B6 및 m11B6의 그램당 흡수 백분율의 비율이다.
도 9는 (a) 인간화된 11B6 항체 및 (b) 뮤린 11B6 항체의 동력학이다.
도 10은 혈액으로부터 177Lu-표지된 h11B6 및 m11B6의 제거(clearance)이다.
도 11은 177Lu-11B6으로 처치되기 전의 종양 크기의 대표 사진(위 이미지) 및 처치된 후의 종양 크기의 대표 사진(아래 이미지)이다.
도 12는 (a) 177Lu-11B6의 단일 방사선활성량 'D', (b) 177Lu-11B6의 이중 방사선활성량 '2 x D' 및 (c) LNCaP 이종이식편(xenograft)에서의 종양 크기에 대한 대조 처치의 효과를 요약한 것들이다.
도 13은 단일 투여량 177Lu-11B6으로 처치된 LNCaP 이종이식편 마우스에 관한 (a) 종양 성장 데이터 및 (b) SPECT 이미지이다.
도 14는 (a) 본 발명에 따른 177Lu-표지된 h11B6 항체를 수용한 동물들, (b) 177Lu-표지된 비특이적 IgG "동종형 대조(isotype control)' 항체를 수용한 동물들, 및 (c) 오직 NaCl만을 수용한 동물들에 관한 주사 후의 일자의 함수로서의 종양 부피이다. 0일자에 처치가 투여되었다. 하기 발생의 상황에서 동물들을 종결시켰다: 큰 종양 부피(직경 > 14nm); 큰 중량 손실(중량 손실 > 초기 중량과 비교하여 15%); 부정적인 영향을 받은 총체적 상태; 또는 이들 모든 파라미터의 조합. (오른쪽 숫자들은 각 동물의 ID 번호이다)
도 15는 도 14에서 제시된 3개의 처치 군들에 대한 Kaplan-Meier 곡선이다. 실선(solid line): 177Lu-h11B6; 파선(broken line): 177Lu-표지된 비특이적 IgG "동종형 대조' 항체; 점선(dotted line): NaCl.
본 발명의 제 1 견지는, 인간 칼리크레인-2(hK2)에 대한 바인딩 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 상기 항체 폴리펩타이드는
(a) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 가변(variable) 부위; 및/또는
(b) SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) 가변 부위
를 포함하며,
상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위는 하나 이상의 인간 항체들로부터의 프래임워크(framework) 아미노산 서열을 포함한다.
CDRH1: SDYAWN SEQ ID NO: 1
CDRH2: YISYSGSTTYNPSLKS SEQ ID NO: 2
CDRH3: GYYYGSGF SEQ ID NO: 3
CDRL1: KASESVEYFGTSLMH SEQ ID NO: 4
CDRL2: AASNRES SEQ ID NO: 5
CDRL3: QQTRKVPYT SEQ ID NO: 6
상기 6개의 아미노산 서열은, 문헌 [Kabat 등, (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH, Bethesda, MD](이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음)에 따라 한정된 바와 같이, 발명의 항체 폴리펩타이드의 상보-결정 부위(complementarity-determining region)(CDR)을 나타낸다.
"항체 폴리펩타이드(antibody polypeptide)"에 대하여, 우리는 실질적으로 무손상(intact) 항체 분자, 단쇄 항체, 이중체(diabody), 이중특이성(bispecific) 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머(homodimer) 및 헤테로다이머(heterodimer), 및 항원 바인딩 프래그먼트 및 이의 유도체들을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 20개의 표준 유전-코딩된 아미노산 및 이들의 상응하는 'D' 형태의 입체이성체들(자연 'L' 형태와 비교됨), 오메가-아미노산, 다른 자연-발생 아미노산, 비통상적인 아미노산(예컨대, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 등) 및 화학적으로 유도된 아미노산을 포함한다(이후 내용 참조).
예컨대 "알라닌" 또는 "Ala" 또는 "A"와 같이, 아미노산이 특별히 열거되는 경우, 상기 용어는 달리 명시적으로 진술되지 않는 한 L-알라닌 및 D-알라닌 둘다를 지칭한다. 원하는 기능의 성질이 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한, 다른 비통상적인 아미노산도 또한 본 발명의 폴리펩타이드들에 대해 적합한 성분일 수 있다. 제시된 펩타이들에 대하여, 각 코딩된 아미노산 잔기는 적절하다면 통상의 아미노산의 3문자(trivial) 이름에 상응하는 단일 문자 명칭으로 표시된다.
일 구현에서, 본원에 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드는 L-아미노산들을 포함하거나 또는 상기 것으로 이루어진다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 hK2에 대한 특이성을 나타낸다.
예시적인 hK2 서열은, 하기 월드-와이드-웹(world-wide-web) 주소에서 확인할 수 있는 전체(ensemble) 데이터베이스로 주어지는 바와 같이 Transcript: KLK2-201(ENST00000325321), 유전자 ENSG00000167751의 산물로서 나타내어지며, 하기 서열을 갖는다:
ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG00000167751; r=19:51376689-51383822;t=ENST00000325321
MWDLVLSIAL SVGCTGAVPL IQSRIVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC GGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL YNMSLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA KITDVVKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSI EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS NDMCARAYSE KVTEFMLCAG LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKVVHYR KWIKDTIAANP [SEQ ID NO:7]
(여기서, 성숙한 활성 hK2 단백질의 서열은 밑줄쳐져 있으며, 이는 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열에 의해 그의 N-터미널에서 선행된다)
정액장액(seminal plasma)에서 발견되는 대부분의 hK2는 비활성적이며, 단백질 C 억제제(protein C inhibitor)(PCI)와 착체화된다. 또한, hK2는 다른 세포외 프로테아제 억제제와의 착체를 형성하는 것이 가능하다. 시험관 내 연구에서는, hK2가 α2-항플라스민(α2-antiplasmin)(α2-AP), ACT, AMG, 항-트롬빈 III(anti-thrombin III)(ATIII), C1-불활성화제 및 플라스미노겐 활성화제 억제제-1(plasminogen activator inhibitor-1)(PAI-1)에 바인딩할 수 있음을 제시한다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 hK2의 착체화된 아이소폼(isoform)과 비교하여 hK2의 자유(free)(즉, 비-착체화된) 아이소폼에 대한 특이성을 갖는다. hK2의 자유 아이소폼에 대해 특이성을 갖는 바인딩 부분은 hK2의 자유 아이소폼에 노출되지만 hK2의 착체화된 아이소폼에 노출되지 않은 에피토프(epitope)에 대해 바인딩 특이성을 가질 수 있으며, 이는 선형 또는 배좌(conformational)(즉, 비-선형) 에피토프일 수 있다. 예를 들면, 항체 폴리펩타이드는, hK2가 PCI에 착체화되는 경우 정액에 존재하는 형태와 같이, 자유 hK2에서 노출되고 착체화된 아이소폼에서 노출되지 않은 hK2의 촉매 클레프트(catalytic cleft)의 일부인 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 대해 특이성을 가질 수 있다. hK2의 에피토프 맵핑(mapping)은 문헌 [Vaisanen 등, Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004)]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있다.
hK2 단백질의 추가 예들은 하기 기탁번호에 의해 동정된다:
(a) GenBank: AAF08277.1;
(b) GenBank: AAF08275.1; 및
(c) UniProtKB/Swiss-Prot: P20151.1
재조합 hK2의 제조는 문헌 [Lovgren 등, 1999, Eur. J. Biochem. 266:1050-5]에 기재되어 있다(이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음).
"특이성"에 대하여, 우리는, 항체 폴리펩타이드가 생체 내, 즉 hK2가 인체 내에 존재하는 생리학적 조건 하에서 hK2에 바인딩할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 항체 폴리펩타이드는 생체 내에서 임의의 다른 단백질에 바인딩하지 않는다.
이러한 바인딩 특이성은 당해 분야에 잘 공지된 방법들, 예컨대 ELISA, 면역조직화학, 면역침전, 웨스턴 블로팅(Western blots) 및 hK2를 발현하는 트랜스펙팅된(transfected) 세포를 사용하는 흐름 세포측정(flow cytometry)에 의해 결정될 수 있다. 유리하게는, 항체 폴리펩타이드는 hK2에 선택적으로 바인딩할 수 있다. 즉, 이것은 다른 단백질들(특히, 다른 칼리크레인, 예컨대 전립선 특이성 항원 또는 PSA)에 대해서보다 hK2에 대해 적어도 10배 강하게 바인딩한다. 바람직하게는, 항원 폴리펩타이드는 생체 내에서 PSA를 바인딩하지 않는다.
hK2에 대해 특이성을 갖는 뮤린 항체들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Vaisanen 등, 2004, Clinical Chemistry 50(9):1607-1617]에서는 hK2에 대해 특이성을 갖는 마우스에서 단핵 항체들의 생성을 기재하고 있다(이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음). "11B6" 및 "7D7"로 명명된 2개의 항체는 hK2에 대해 선택적인 것으로 진술되어 있다.
뮤린 항체 11B6의 성분 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은, 국제특허출원 PCT/GB2012/052675(WO 2013/061083; 이의 개시내용은 전반적으로 본원에 참고로 인용되고 있음)에 개시되어 있으며; 특히 그 안의 SEQ ID NO:4 및 5을 참조한다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 11B6 항체의 선택된 인간화된 버전에 기초하며, 이는 예기치않은 바람직한 성질들을 나타낸다.
특히, 본 발명의 인간화된 항체들은 이들의 CDR 서열들이 유도되는 모(parent) 뮤린 11B6 항체(m11B6)와 비교하여 향상된 치료율을 나타낸다(실시예 6 참조).
"향상된 치료율(enhanced therapeutic ratio)"에 대하여, 우리는, 본 발명의 항체 폴리펩타이드(11B6 항체의 인간화된 형태)가 전립선 종양을 앓는 환자에게 투여되는 경우 모 뮤린 11B6 항체보다 높은 비율의 종양 흡수된 투여량 대 (건강한) 골수 흡수된 투여량을 제공함을 의미한다(동일한 방사선활성 및 투여 경로에서 비교됨). 종양 대 골수 흡수된 투여량의 비율은 실시예 6에서 기재된 방법을 사용하여 계산될 수 있다.
본 발명의 항체들의 예기치않은 더욱 우수한 치료 프로파일은, 더욱 높은 방사선 선량(흡수된 선량)이 사용될 수 있도록 허용하며, 이로 인해 건강한 조직들 및 기관들에 대해 부작용 또는 '부수적 손상(collateral damage)'을 증가시키지 않고서 전립선암의 치료에서 더욱 우수한 효능을 초래한다.
인간화(humanisation)(재형성(reshaping) 또는 CDR-이식(grafting)이라고도 또한 지칭됨)는, 이종발생성 공급원(xenogeneic source)으로부터(통상적으로, 설치류, 예컨대 마우스로부터)의 단핵 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위한 그리고 인간 면역계의 활성화를 개선시키기 위한 기술이다(문헌 [Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience 13:1619-1633]에 의한 검토를 참고하고; 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음). 임상적 시도에서의 인간화된 단핵 항체들이 몇몇 존재하며, 일부가 약물로서 사용되는 것이 승인되었다. 비록 분자생물학의 기술을 사용하는 공학처리된(engineered) 단핵 항체를 생성시키는 기술은 상대적으로 간단할지라도, 인간 프래임워크로의 설치류 상보-결정 부위(CDR)의 단순한 이식은 항상 본래 단핵 항체의 바인딩 친화성 및 특이성을 재구성하지는 않는다. 항체를 인간화하기 위하여, 인간화된 항체의 디자인은 본래 분자의 기능을 재생성시키는 데 있어 결정적인 단계이다.
인간화된 항체의 디자인은 사용될 CDR의 정도 및 사용될 인간 프래임워크의 정도를 포함하는 몇몇 주요 선택들을 포함한다. 그러나, 모 항체의 특이성을 유지하기 위하여, 설치류 mAb로부터 하나 이상의 잔기를 인간 프래임워크 부위 내로 치환시키는 것(소위 역돌연변이(backmutation))이 결정적일 수 있다. 필요한 역돌연변이의 위치를 동정하는 것에서는 상세한 서열/구조적 분석이 요구된다. 최근, 선택된 위치들에서 아미노산을 변화시키는 데 있어서 파지 라이브러리(phage library)가 사용되어 왔다. 유사하게, 설치류 CDR을 이식하는 대부분의 적절한 인간 프래임워크를 선택하는 데 있어서 다수의 접근이 사용되어 왔다. 초기 실험들에서는, 설치류 단핵 항체에 대한 서열 동일성(identity)과 관계없이(소위 고정된 프래임워크 접근) 잘-특성화된 인간 단핵 항체의 제한된 하위세트를 사용하였다(종종 구조가 입수 가능한 경우). 일부 군들에서는 설치류 가변 부위들에 대한 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 가변 부위들을 사용하고(상동성(homology) 매칭 또는 최적(best-fit)); 다른 것들에서는 공통(consensus) 또는 생식세포계열(germline) 서열을 사용하지만, 여전히 다른 것들은 몇몇 상이한 인간 단핵 항체들로부터의 각 경쇄 또는 중쇄 가변 부위 내에서 프래임워크 서열의 프래그먼트를 선택한다. 표면 설치류 잔기를 인간 단핵 항체들에서 발견되는 대부분의 통상의 잔기들로 대체하는 개발된 인간화에 대한 접근들("리서피싱(resurfacing)" 또는 "비니어링(veneering)") 및 CDR의 정도의 여러 정의들을 사용하는 것들이 또한 존재한다.
그러나, 항체 인간화의 광범위한 연구에도 불구하고, 일부 설치류 단핵 항체들에서는 인간화가 곤란한 것으로 입증되었다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드의 개발에서는 프래임워크 부위에서뿐만 아니라 CDR 일부에서도 역돌연변이가 요구되었다(하기 실시예 1 참조). 따라서, SEQ ID NO:1 내지 6에서의 앞서 나타낸 6개의 CDR 서열은 뮤린 안티-hK2 항체 11B6로부터 유도되지만, 모 뮤린 항체와 비교하여 CDRH2(SEQ ID NO:2) 및 CDRH1(SEQ ID NO:4)에서의 돌연변이를 함유한다. 11B6의 인간화된 버젼에 대한 최적의 특이성 및 안정성을 제공하기 위하여 CDR에서의 이들 돌연변이가 이루어졌다.
일 구현에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 1.0 x10-9 M 초과의 KD를 갖는 hK2를 바인딩한다.
상호작용(예컨대, 항체와 리간드 사이의 상호작용)의 전체 친화성(KD) 및 온-레이트(on-rate)(ka) 및 오프-레이트(off-rate)(kd)를 측정하는 방법들은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 시험관 내 방법들은 하기 실시예 3에 기재되어 있다. 또한, 흐름 세포측정 기초한 방법들을 사용하는 것도 또한 생각할 수 있다(문헌 [Sklar 등, 2002, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31:97-119]; 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용됨).
유리하게는, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 1.0 x10-10 M 미만의 hK2에 대한 친화도(KD), 예컨대 9.0 x10-11 M 미만, 8.0 x10-11 M, 7.0 x10-11 M, 6.0 x10-11 M, 5.0 x10-11 M, 4.0 x10-11 M, 3.0 x10-11 M, 2.0 x10-11 M 또는 1.0 x10-11 M 미만의 KD를 갖는다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드가 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머 및 헤테로다이머, 및 항원 바인딩 프래그먼트 및 이의 유도체들을 구성할 수 있음은 당해 분야의 통상의 기술자에게 인정받을 것이다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 무손상(즉, 완전한) 항체, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 분자를 포함하거나 또는 상기 분자로 이루어진다.
유리하게는, 항체 폴리펩타이드는 무손상 IgG 분자, 또는 항원 바인딩 프래그먼트 및 이의 유도체들을 포함하거나 또는 상기 것들로 이루어진다.
IgG 분자는 임의의 공지된 하위유형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
항체의 "항원-바인딩 프래그먼트(antigen-binding fragment) 및 유도체(derivative)"에 대하여, 우리는 Fv 프래그먼트(예컨대, 단일쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 프래그먼트(예컨대, Fab 프래그먼트, Fab' 프래그먼트 및 F(ab)2 프래그먼트) 및 도메인 항체(단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)를 포함한다.
예를 들면, 항체 폴리펩타이드는 scFv 또는 Fab 프래그먼트를 포함하거나 또는 상기 프래그먼트로 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드의 추가의 특징은 중쇄 및 경쇄 가변 부위들에서 하나 이상의 인간 항체들로부터의 프래임워크 아미노산 서열의 존재이다.
"프래임워크 서열(framework sequence)"에 대하여, 우리는 CDR 이외의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 부위들을 포함한다. 전형적으로, 각 가변 도메인은 상기 CDR 서열들이 하기와 같이 위치하는 FR1 내지 FR4로 명명된 4개의 프래임워크 부위를 포함할 것이다.
FR1 ---- CDR1 ---- FR2 ---- CDR2 ---- FR3 ---- CDR3 ---- FR4
프래임워크 부위들의 아미노산 서열들은 완전하게 인간일 수 있거나 또는 하나 이상의 역돌연변이들을 함유할 수 있는 것(즉, 인간 프래임워크에 존재하는 아미노산 서열은 CDR이 유도되는 모 설치류 가변 도메인 내의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환될 수 있는 것)이 인정받을 것이다. 결론적으로, 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들)의 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 서열은 비-자연-발생일 수 있다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드의 프래임워크 서열은 하나 이상의 인간 항체들로부터의 프래임워크 부위들과의 적어도 70% 서열 동일성, 예컨대 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 공유한다. 따라서, 항체 폴리펩타이드는 인간 항체의 FR1 부위와의 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 중쇄 FR1 부위를 포함할 수 있다. 항체 폴리펩타이드의 중쇄 및 경쇄는 여러 인간 항체들의 프래임워크 부위들과의 서열 동일성을 나눌 수 있다.
백분율 동일성은, 예컨대 파라미터로서 global alignment option, scoring matrix BLOSUM62, opening gap penalty -14, extending gap penalty -4를 사용하는 Expasy facility site(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)에서의 LALIGN 프로그램(Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 2개의 폴리펩타이드들 사이의 백분율 서열 동일성은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 University of Wisconsin Genetic Computing Group의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것은 서열이 최적으로 정렬되는 폴리펩타이드와 관련하여 백분율 동일성이 계산되는 것으로 인정받을 것이다.
대안적으로, 정렬은 (본원에 참고로 인용되고 있는 문헌 [Thompson 등, 1994, Nucl. Acid Res. 22:4673-4680]에서 기재된 바와 같이) Clustal W 프로그램을 사용하여 실시될 수 있다. 사용된 파라미터들은 하기와 같을 수 있다:
- Fast pair-wise alignment parameters: K-tuple(word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent.
- Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0.05.
- Scoring matrix: BLOSUM.
대안적으로, 국소 서열 정렬을 결정하는 데 있어서 BESTFIT 프로그램이 사용될 수 있다.
일 구현에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 무거운 가변 도메인의 프래임워크 서열은 인간 면역글로불린 VH4 유전자 패밀리에 의해 암호화된다.
예를 들면, 프래임워크 서열은 적어도 부분적으로 VH4-28 세포계열 유전자에 의해 암호화될 수 있다(예컨대, FR1, FR2 및 FR3은 VH4-28에 의해 암호화될 수 있으며, FR4는 JH1에 의해 암호화될 수 있다).
따라서, 일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 중쇄 가변 부위를 포함하거나 또는 상기 부위로 이루어질 수 있다:
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO: 8]
일 구현에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 가벼운 가변 도메인의 프래임워크 서열들은 인간 면역글로불린 Kappa V4 유전자 패밀리에 의해 암호화된다.
예를 들면, 프래임워크 서열들은 적어도 부분적으로 lgkV4-B3 세포계열 유전자에 의해 암호화될 수 있다(예컨대, FR1, FR2 및 FR3은 lgkV4-B3에 의해 암호화될 수 있으며, FR4는 JK2에 의해 암호화될 수 있다).
따라서, 일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 가변 부위를 포함하거나 또는 상기 부위로 이루어질 수 있다:
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYT FGQGTKLEIK
[SEQ ID NO: 9]
"적어도 부분적으로"에 대하여, 프래임워크 서열들이 레퍼런스 유전자에 의해 암호화된 적어도 10개의 연속 아미노산, 예컨대 적어도 20개의 연속 아미노산을 포함하는 것을 포함한다. 또한, 우리는 FR 부위에서 전부는 아니지만 하나 이상은 레퍼런스 유전자에 의해 암호화되는 것을 포함한다(예컨대, FR3이 아닌, FR1 및 FR2는 레퍼런스 유전자에 의해 암호될 수 있다).
바람직한 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 중쇄 가변 부위 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 가변 부위를 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 중쇄 불변(constant) 부위 또는 이의 일부를 추가로 포함한다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 IgG 중쇄(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄)의 CH1, CH2 및/또는 CH3 부위를 포함한다. 따라서, 항체 폴리펩타이드는 IgG1 중쇄로부터의 불변 부위 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 폴리펩타이드는 CH1 및 CL 불변 부위들을 포함하는 Fab 프래그먼트일 수 있다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 항체 Fc-부위를 포함할 수 있다. 숙련자에게는, Fc 부분이 IgG 항체로부터 기인할 수 있거나, 또는 여러 부류의 항체(예컨대, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)로부터 기인할 수 있음이 인정받을 것이다. 일 구현에서, Fc 부위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체로부터 기인한다.
Fc 부위는 자연-발생적일 수 있거나(예컨대, 내인성 생성된 항체의 일부), 또는 인위적일 수 있다(예컨대, 자연-발생 Fc 부위와 비교되는 하나 이상의 점 돌연변이 및/또는 CH2 도메인 내의 탄수화물 잔기에 대한 변형들을 포함함). FcR을 바인딩하는 이들의 능력을 개선시키는 점 돌연변이를 갖는 Fc-부위들은 예컨대 혈청 반감기를 변경시킴으로써 또는 ADCC 및 CDC에 수반된 Fcγ 수용기(FcγR)에 대한 바인딩을 조정함으로써(즉, 향상시키거나 또는 감소시킴으로써) 유리할 수 있다.
유리하게는, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다:
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
[SEQ ID NO: 10]
선택적으로, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 경쇄 불변 부위 또는 이의 일부를 추가로 포함한다.
일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 IgG 경쇄(예컨대, 카파 또는 람다 경쇄)의 CL 부위를 포함한다.
예를 들면, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다:
R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C
[SEQ ID NO: 11]
유리하게는, 항체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 중쇄 불변 부위, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 불변 부위를 포함한다.
일 바람직한 구현에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는
(a) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 중쇄(여기서, 가변 부위는 볼드체로 존재하고, CDR 서열은 박스 이탤릭체로 존재함); 및/또는
(b) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄(여기서, 가변 부위는 볼드체로 존재하고, CDR 서열은 박스 이탤릭체로 존재함)
를 포함한다.
예를 들면, 항체 폴리펩타이드는 이황화 가교(disulphide bridge)에 의해 함께 연결된 SEQ ID NO:12의 2개의 중쇄와 SEQ ID NO:13의 2개의 경쇄를 포함하거나 또는 상기 쇄로 이루어져서 전형적인 IgG 항체 구조를 형성할 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 개질되거나 또는 유도된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 또는 상기 아미노산으로 이루어질 수 있다.
하나 이상의 아미노산의 화학적 유도체들은 작용성 측기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유도된 분자들은, 예컨대 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 기, 카복시벤즈옥시 기, t-부틸옥시카보닐 기, 클로로아세틸 기 또는 포르밀 기를 형성하도록 유도체화되어 있는 분자들을 포함한다. 자유 카복실 기는 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 및 하이드라자이드를 형성하도록 유도체화될 수 있다. 자유 하이드록실 기는 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하도록 유도체화될 수 있다. 또한, 화학적 유도체로서 20개의 표준 아미노산의 자연-발생 아미노산 유도체들을 함유하는 펩타이드인 것이 포함된다. 예를 들면, 4-하이드록시프롤린은 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-하이드록시라이신은 라이신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린은 세린에 대해 치환될 수 있고, 오르니틴은 라이신에 대해 치환될 수 있다. 또한 유도체는, 필수 활성이 유지되는 한, 하나 이상의 부가 또는 삭제를 함유하는 펩타이드들을 포함한다. 기타 개질로는 아미드화, 아미노 터미널 아실화(예컨대, 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화), 터미널 카복실아미드화(예컨대, 암모니아 또는 메틸아민 사용), 및 기타 터미널 개질이 포함된다.
당해 분야의 통상의 기술자에게는, 펩티도미메틱(peptidomimetic) 화합물이 또한 유용할 수 있음이 추가로 인정받을 것이다. 용어 '펩티도미메틱(peptidomimetic)'은 치료제로서 특정 펩타이드의 변형 및 원하는 특징을 흉내내는 화합물을 지칭한다.
예를 들면, 상기 폴리펩타이드는, 아미노산 잔기들이 펩타이드(-CO-NH-) 연결기(linkage)에 의해 연결되어 있는 분자들뿐만 아니라, 펩타이드 결합이 역전되어 있는 분자들을 포함한다. 이러한 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티도미메틱은 당해 분야에 공지된 방법들, 예컨대 본원에 참고로 인용되고 있는 문헌 [Meziere 등 (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237]에 기재된 바를 사용하여 제조될 수 있다. 이 접근은 주쇄에 수반되는 변화들을 함유하는 슈도-펩타이드를 제조하는 것을 포함하지만, 측쇄의 배향은 포함하지 않는다. CO-NH- 펩타이드 결합들 대신에 NH-CO 결합들을 함유하는 레트로-인버스(retro-inverse) 펩타이드는 단백질분해에 대해 매우 크게 저항적이다. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드는, 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 통상적인 아미드 연결기 대신에 -y(CH2NH)- 결합에 의해 연결되어 있는 펩티도미메틱 화합물일 수 있다.
추가 대안에서, 펩타이드 결합은 함께 제공되지만, 아미노산 잔기들의 탄소 원자들 사이의 이격을 유지하는 적절한 링커(linker) 잔기가 사용될 수 있으며; 이것은 링커 잔기에 대하여 펩타이드 결합과 실질적으로 동일한 챠지(charge) 분배 및 실질적으로 동일한 평탄도(planrity)를 갖는 데 있어 유리할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 엑소-단백질분해 소화(exo-proteolytic digestion)에 대한 감수성을 감소시키는 데 도움을 주기 위하여 이의 N- 또는 C-터미널에서 편의상 블록킹될 수 있는 것으로 인정받을 것이다.
다양한 비-코딩된 또는 개질된 아미노산, 예컨대 D-아미노산 및 N-메틸 아미노산이 또한 포유류 펩타이드를 개질시키기 위하여 사용되어 왔다. 추가로, 추정된 생체활성 입체형태(bioactive conformation)는 공유 개질화, 예컨대 고리화(cyclisation)에 의해 또는 락탐 또는 다른 유형의 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있으며, 예컨대 본원에 참고로 인용되고 있는 문헌 [Veber 등, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636] 및 문헌 [Thursell 등, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166]을 참조한다.
당해 분야의 통상의 기술자에게는, 본 발명의 항체 폴리펩타이드가 그들의 의도된 용도를 예컨대 생체 내 조영제(imaging agent) 및 치료제로서 촉진시키기 위해 작용 부분으로 증대될 수 있음이 인정받을 것이다.
따라서, 일 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 치료 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
임의의 적절한 치료 부분이 사용될 수 있다. 적절한 치료 부분은 전립선 암세포의 성장을 감소 또는 저해하거나, 또는 특별히 사멸시킬 수 있는 것이다. 예를 들면, 치료제는 세포독성 부분일 수 있다. 세포독성 부분은 하나 이상의 방사성 동위원소(radioisotope)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 방사성 동위원소는 베타-이미터, 아우거(Auger)-이미터, 컨버전 전자-이미터, 알파-이미터 및 저 광자 에너지-이미터로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 하나 이상의 방사성 동위원소는, 제제의 부근에 고 흡수된 투여량을 생성하는 국소 흡수된 에너지의 방출 패턴을 각각 독립적으로 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 방사성 동위원소는 90Y, 32P, 186Re/188Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm과 같은 장거리 베타-이미터; 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh와 같은 중거리 베타-이미터; 45Ca 또는 35S와 같은 저-에너지 베타-이미터; 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 201Tl와 같은 컨버전 또는 아우거-이미터; 및 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb 및 221At와 같은 알파-이미터를 포함할 수 있다. 다른 방사성 핵종(radionuclide)이 이용 가능하며, 치료용으로 사용가능할 것이다.
다른 구현에서, 치료 부분 또는 세포독성 부분은 WO 2006/087374 A1, 특히 이의 11면, 7-15줄에서 "트레이서(tracer)"로 개시된 부분이 아닌 것이 바람직할 수 있다.
일 바람직한 구현에서, 항체 폴리펩타이드는 방사성 동위원소 177Lu에 연결된다(또는 그렇지 않으면 이로 표지화된다).
대안적으로, 치료 부분은 하나 이상의 치료(예컨대, 세포독성) 약물, 예컨대 세포증식억제(cytostatic) 약물; 항-안드로겐 약물; 코르티손 및 이의 유도체; 포스포네이트; 테스토스테론-5-α-환원효소 억제제; 보론 어덴드(boron addend); 사이토카인; 탭시가긴(thapsigargin) 및 이의 대사물; 독소(예컨대, 사포린(saporin) 또는 칼리키아미신(calicheamicin)); 화학요법제(예컨대, 항대사물질(antimetabolite)); 또는 전립선 암종의 치료에 유용한 임의의 다른 치료 또는 세포독성 약물을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
예시적인 치료/세포독성 약물은 예컨대 하기 것들을 포함할 수 있다:
세포증식억제제, 구체적으로는 시클로포스아미드, 클로람부실, 이포스파미드, 부설판, 로무스틴, 탁산, 에스트라무스틴, 포스페이트 및 다른 질소 머스타드, 항생제(독소루비신, 칼리키아미신 및 에스퍼라마이신 포함), 빈카 알칼로이드, 아자리딘, 플라티늄-함유 화합물, 엔도스타틴, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 폴릭산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 효소, 치환된 우레아, 메틸-히드라진 유도체, 다우노루비신, 암피파틱 아민을 포함하지만 이에 국한되지 않는 투여량-제한 부작용을 갖는 것들,
플루타미드 및 비칼루타미드 및 이의 대사물과 같은 항-안드로겐;
코르티손 및 이의 유도체;
디포스포네이트 및 부포스포네이트와 같은 포스포네이트;
테스토스테론-5-α-환원효소 억제제;
보론 어덴드;
사이토카인;
탭시가긴 및 이의 대사물;
전립선 암종의 치료에 사용되는 다른 제제들.
대안적으로, 세포독성 부분은 광자 활성화 요법, 중성자 활성화 요법, 중성자 유도된 아우거 전자 요법, 싱크로트론 조사(synchrotron irradiation) 요법 또는 저 에너지 X-선 광자 활성화 요법과 같은 활성화 요법에 사용하기에 적절한 하나 이상의 부분을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항체 폴리펩타이드로, 사전-투여된 고-Z 종양-표적 제제(targeting agent)와의 상호작용에 의해 외부 X-선 조사로부터 국소 에너지 침적이 암 조직에서 향상되는 소위 광-활성화 방사선요법(photo-activation radiotherapy)(PAT)에 주로 초점을 맞춘 방사선요법의 진보를 위해 싱크로트론 방사(또는 저 에너지 X-선)을 이용하는 포텐셜이 존재할 것이다.
PAT 치료 양상(modality)은 그레노블(Grenoble)에 있는 유럽 싱크로트론 방사 설비(European Synchrotron Radiation Facility)(ESRF)에서 ID17 바이오메디컬 빔라인(ID17 biomedical beamline)에 의해 제공되는 바와 같은 싱크로트론 공급원으로부터 얻어지는 단색 X-선을 이용하며, 앞으로는 새로운 스웨덴식 싱크로트론 설비, Max-IV과 같은 다른 설비에서 이용 가능한 것으로 기대된다.
추가 잠재적인 치료 양상으로서, "유도된 아우거 전자 종양 요법(induced Auger electron tumour therapy)"에 대한 연구가 이번 룬드(Lund)에서의 유럽 파쇄 소스(European Spallation Source)(ESS)이며, 희망적으로 의학적 실험 장소(station)이다. 리액터-생성된 열 및 반-열 중성자는 보론-중성자-캡쳐-요법(BNCT, Boron-Neutron-Capture-Therapy)에 오랫동안 사용되어 왔으며, 고 국소 흡수 에너지를 제공하는 유도 알파-파티클 및 리코일 핵(7L)으로 사전-임상 실험 및 뇌 종양의 치료 모두에 사용되어 왔다. 유사한 접근법은 중성자를 사용하는 것이며, 중성자에 대한 고 단면적을 갖는 안정한 핵으로 표지된 적절한 종양-표적 분자를 사용하는 것이다. 항체 또는 펩타이드는 예를 들면, 안정한 가돌리늄(157Gd)으로 표지될 수 있으며, 소위 Gadolinium Neutron Capture Therapy(GdNCT)라 불리는 Gd-핵에 의해 포획되는 중성자에 대한 표적 분자로 작용한다. 몬테 카를로(Monte Carlo) 기술에 의하면, 종양 및 그 주위의 조직에서의 투여량 분포는, γ-광자, 중성자, 핵 리코일(nuclear recoil) 뿐만 아니라 가돌리늄 또는 다른 잠재적 원소로부터 특징적(characteristic) x-선, 내부 전환 및 아우거-전자로부터 형성됨에 따라 계산된다.
상술한 바와 같이, 치료 부분(예컨대, 방사성 동위원소, 세포독성 부분 등)은 바인딩 부분(예컨대, 항체 또는 이의 프래그먼트)에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 적절한 링커는 당해 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 보결 분자단, 비-페놀성 링커(N-숙시이미딜- 벤조에이트의 유도체; 도데카보레이트), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 디에틸렌트리아민펜타아세트 아비드(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자시클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체, 3,6,9,15-테트라아자비시클로[9.3.1]-펜타데카-1(15),11,13-트리엔-4-(S)-(4-이소티오시아나토벤질)-3,6,9-트리아세트산(PCTA)의 유도체, 5-S-(4-아미노벤질)-1-옥사-4,7,10- 트리아자시클로도데칸-4,7,10-트리스(아세트산)(DO3A)의 유도체와 같은 마크로시클릭 및 아시클릭 킬레이터(chelator) 모두의 킬레이팅 부분 및 다른 킬레이팅 부분 포함한다. 이러한 링커의 사용은, 특히 제제가 링커를 통해 치료 부분으로서 방사성 동위원소에 결합되는 바인딩 부분으로서 항체 또는 이의 프래그먼트를 포함하거나 이로 이루어진 분위기에서 적절할 수 있다.
일 바람직한 링커는 예컨대 177Lu-DTPA-[본 발명의 항체 폴리펩타이드]에 사용되는 것과 같은 DTPA이다.
추가의 바람직한 링커는 예컨대 89Zr-DFO-[본 발명의 항체 폴리펩타이드]에 사용되는 것과 같은 데페록사민, DFO이다.
선택적으로, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 검출 가능한 부분을 추가로 포함할 수 있다(또는 포함하지 않을 수 있다). 예를 들면, 검출 가능한 부분은 방사성 동위원소, 예컨대 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 123I 및 201TI로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함하거나 또는 상기 방사성 동위원소로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 제제는 86Y/90Y 또는 124I/211At와 같은 한 쌍의 검출 가능하며 세포독성인 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제제는 소위 "복합성 테라그노스틱(Multimodality theragnostics)"을 제공하기 위해 검출 가능한 부분으로서 그리고 또한 세포독성 부분으로서 다중 모드(multi-modal) 방식으로 동시에 작용할 수 있는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 따라서, 바인딩 부분은 방사성 핵종 또는 화학요법제와 같은 세포독성 약물을 이용한 치료 능력과 함께 다중-이미지의 능력을 갖는 나노입자에 결합될 수 있다(예컨대, SPECT, PET, MRI, Optical 또는 Ultrasound). 또한, 고주파 교호 자계(alternating magnetic field) 및 수반된 초음파 영상을 이용한 온열요법에 의한 치료의 가능성이 본 발명에 포함된다.
대안적으로, 검출 가능한 부분은 상자성(paramagnetic) 동위원소를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있으며, 이러한 상자성 동위원소는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체 폴리펩타이드가 검출 가능한 부분을 포함하는 경우, 검출 가능한 부분은 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 영상화(imaging)와 같은 영상 기술에 의해 검출될 수 있다.
치료 및 검출 가능한 부분은 당해 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 항체 폴리펩타이드와 컨주게이트되거나 또는 다르게는 이와 조합될 수 있다(예컨대, 현존하는 면역컨주게이트(immunoconjugate) 요법, 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)[상표명: Mylotarg(등록상표)]은 세포독성 칼리키아미신(calicheamicin)에 연결된 단핵 항체를 포함한다).
추가 구현에서, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 항체 폴리펩타이드 분자의 집단을 포함하는 제형의 형태로 전립선암을 치료하는 데 사용된다. 일 옵션에서, 집단에서 모든(또는 90중량%, 95중량%, 99중량%, 99.9중량% 이상과 같이 실질적으로 모든) 항체 폴리펩타이드는 동일한 치료 부분을 포함한다. 다른 옵션에서, 상기 집단은 다른 제제들과 여러 치료 부분들의 혼합물을 포함한다. 이 옵션은, 화학요법제, 호르몬 요법제, 또는 표적 제제가 치료 활성 방사성 핵종을 종양 관련 항원으로 운반할 뿐만 아니라 동시에 세포내 신호전달 캐스케이드를 조정함으로써(예컨대, 촉발하거나 또는 블로킹함으로써) 표적된 종양 세포를 방사선 증감화하는(radiosensitize) 요법들의 다른 조합과 같은, 다양한 제제들을 사용하여 표적된 방사성 핵종 치료의 효과를 증진시키는 가능성을 제공할 것이다. 또한, 이 옵션은 큰 종양, 미소전이 및 단일 종양 세포의 조합된 치료를 위해, 예를 들면, 알파- 및 다른 범위의 베타-이미터의 칵테일, 또는 다른 범위를 갖는 방사성 핵종의 칵테일, LET(선형 에너지 트랜스퍼(linear energy transfer)) 및 RBE(상대적인 생물학적 효과(relative biological effect))를 이용하여 세포독성제들의 혼합물로 전립선암을 치료하는 데 유용하다. 일 구현에서, 장거리 이미터가 큰 종양의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 단거리 이미터가 미소전이 및 단일 종양 세포와 같은 더욱 작은 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 제제의 생체 내 반감기를 증가시키는 부분을 추가로 포함할 수 있다(또는 포함하지 않을 수 있다). 제제의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 예시적인 부분은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화 기, 지방산 및 덱스트란을 포함할 수 있다. PEG가 특별히 고려될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 예컨대 동결 건조, 분무 건조, 분무 냉각 또는 초임계 이산화탄소로부터의 입자 형성의 사용(침전)을 통해서, 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법(예컨대, 동결-건조, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술들이 사용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게는, 동결건조 및 재구성이 활성 손실의 가변 정도를 초래할 수 있으며 사용 수준이 상향 조정되어서 보상할 수 있어야 함이 인정받을 것이다. 바람직하게는, 동결건조된(lyophilised)(냉동 건조된(freeze dried)) 폴리펩타이드는 재수화되는(rehydrate) 경우 (동결건조 전에) 그의 활성의 약 1% 이하가 손실되거나, 또는 재수화되는 경우 (동결건조 전에) 그의 활성의 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 이하, 또는 약 50% 이하가 손실된다.
본 발명의 폴리펩타이드의 제조방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
편의상, 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이거나 또는 이를 포함한다. 이러한 재조합 폴리펩타이드의 적합한 제조방법들은 당해 분야에서 예컨대 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서의 발현과 같이 잘 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York], 이 문서의 관련 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음).
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 또한 상업적으로 입수 가능한 시험관 내 해독 시스템, 예컨대 토끼 망상적혈구 용해질(reticulocyte lysate) 또는 밀발아 용해질(Promega로부터 입수 가능함)을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 해독 시스템은 토끼 망상적혈구 용해질이다. 편의상, 해독 시스템은 전사 시스템, 예컨대 TNT 전사-해독 시스템(Promega)에 커플링될 수 있다. 이 시스템은 해독과 동일한 반응에서 암호화 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 적합한 mRNA 전사를 제조하는 장점을 갖는다.
당해 분야의 통상의 기술자에게는, 대안적으로는 본 발명의 폴리펩타이드가 인위적으로, 예컨대 잘 공지된 액상 또는 고상 합성 기술(예컨대, t-Boc 또는 Fmoc 고상 펩타이드 합성)을 사용하여 합성될 수 있음이 인정받을 것이다.
본 발명의 제 2 견지는 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 또는 이의 성분 폴리펩타이드 쇄를 제공한다. "핵산 분자(nucleic acid molecule)"에 대하여, 우리는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 DNA(예컨대, 게놈 DNA 또는 상보성 DNA) 및 mRNA 분자를 포함한다.
일 구현에서, 핵산 분자는 cDNA 분자이다.
당해 분야의 통상의 기술자에게는, 핵산 분자가 특정 숙주 세포에서 항체 폴리펩타이드의 발현을 위해, 예컨대 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있음이 인정받을 것이다(예컨대, 문헌 [Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659] 참조).
바람직한 구현에서, 본 발명의 핵산 분자는 (a) SEQ ID NO:14의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 (b) SEQ ID NO:15의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
CAG GTT CAG CTG CAG GAA AGC GGA CCT GGC TTG GTG AAA CCC AGC GAT ACC CTT AGC CTG ACA TGT GCT GTG TCT GGC AAT TCC ATC ACT TCC GAC TAT GCG TGG AAC TGG ATT CGG CAA CCA CCG GGA AAA GGG CTC GAG TGG ATA GGG TAC ATC AGC TAT TCT GGT TCA ACC ACG TAC AAT CCC TCA CTG AAG AGT AGG GTT ACC ATG TCC AGA GAC ACC TCC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AAG CTG AGT AGT GTG ACA GCC GTA GAT ACA GCC GTC TAT TAC TGC GCA ACA GGG TAC TAC TAT GGC TCT GGC TTT TGG GGT CAA GGA ACT CTC GTC ACT GTG TCA AGC
[SEQ ID NO: 14]
GAC ATA GTG CTC ACT CAG AGC CCT GAT AGC TTG GCT GTC AGT CTT GGG GAA AGA GCC ACC ATC AAC TGC AAA GCG TCC GAA AGC GTC GAG TAT TTC GGG ACT AGC CTG ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCC GGA CAA CCG CCT AAG CTG CTG ATC TAT GCA GCC TCT AAT CGC GAA AGT GGC GTT CCA GAC AGG TTT TCC GGT TCT GGA TCA GGC ACA GAC TTC ACC CTC ACG ATT TCC TCA CTG CAA GCT GAG GAT GTA GCC GTG TAC TAC TGT CAG CAG ACA CGG AAA GTG CCC TAC ACC TTT GGT CAG GGC ACA AAG CTG GAG ATT
[SEQ ID NO: 15]
또한, 본 발명의 범위 내에 하기의 것들이 포함된다:
(a) 본 발명의 제 3 견지는 본 발명의 제 2 견지에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공하고;
(b) 본 발명의 제 4 견지는 본 발명의 제 2 견지에 따른 핵산 분자 또는 본 발명의 제 3 견지에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 인간 세포와 같은 포유류 세포)를 제공하고;
(c) 본 발명의 제 5 견지는, 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 생성시키기 위한 것이며, 본 발명의 제 4 견지에 따른 숙주 세포의 집단을 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제 6 견지는 본 발명의 제 1 견지의 항체 폴리펩타이드 치료 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, EDTA, 시트레이트, EGTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함하는 부가적인 화합물들이 약학 조성물에 포함될 수 있다.
약학 조성물은 충분하게 보관 안정성이 있으며 인간 및 동물에게 투여하기에 적절한 당해 분야에 알려진 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 약학 조성물은 예컨대 냉동 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해 또는 초임계 입자 형성으로부터의 입자 형성의 사용을 통해 동결건조될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"에 대하여, 우리는 본 발명의 제제의 칼리크레인 단백질-바인딩 활성의 효과를 감소시키지 않는 무독성 물질을 의미한다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 버퍼, 담체 또는 부형제는 당해 분야에 잘 알려져 있다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990)] 및 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000)] 참조, 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있음).
용어 "버퍼"는 pH를 안정화시키고자 하는 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 버퍼의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약학 제조물에서 제제를 희석시키고자 하는 목적으로 수성 또는 비수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 하나 이상의 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름)일 수 있다.
용어 "보조제(adjuvant)"는 본 발명의 제제의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 보조제는 예컨대 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오드, 티오시아네이트, 설피트, 하이드록시드, 포스페이트, 카보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 여러 아실 조성물의 아세테이트와 같은 여러 음이온을 갖는 하나 이상의 아연, 구리 또는 은 염일 수 있다. 또한, 보조제는 양이온성 셀룰로즈 에테르, 양이온성 셀룰로즈 에스테르, 데아세틸레이티드 히알루론산, 키토산과 같은 양이온성 폴리머, 양이온성 덴드리머(dendrimer), 폴리(비닐 이미다졸)과 같은 양이온성 합성 폴리머, 및 폴리히스티딘, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 이들 아미노산을 함유하는 펩타이드와 같은 양이온성 폴리펩타이드일 수 있다.
부형제는 하나 이상의 탄수화물, 폴리머, 지질 및 미네랄일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토즈, 글루코즈, 수크로즈, 만니톨 및 시클로덱스트린일 수 있으며, 이들은 예컨대 동결건조를 촉진하기 위해 조성물에 첨가된다. 폴리머의 예는 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카르복시메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 히드록시에틸 셀룰로즈, 에틸히드록시에틸 셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 코폴리머, 여러 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이며, 여러 분자량 모두를 포함하며, 이들은 예컨대 점도 조절을 위해, 생체접착(bioadhesion)을 달성하기 위해, 또는 화학 및 단백질분해로부터 지질을 보호하기 위해 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드, 세라마이드, 여러 아실 쇄 길이 및 포화도의 스핑고리피드 및 글리코리피드, 에그(egg) 레시틴, 소이(soy) 레시틴, 수소화된 에그 및 소이 레시틴이며, 이들은 폴리머에 대한 것과 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 마그네슘 옥사이드, 아연 옥사이드 및 티타늄 옥사이드이며, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 성질과 같은 이점을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
본 발명의 제제는 이의 운반에 적절한 당해 분야에 알려진 임의 유형의 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
일 구현에서, 본 발명의 약학 조성물은 리포좀의 형태로 존재할 수 있으며, 여기서 항체 폴리펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 담체에 덧붙여 미셀(micelle)로서의 응집된 형태로 존재하는 지질, 불용성 단층(monolayer) 및 지질 결정(lipid crystal)과 같은 양친매성 제제와 조합된다. 리포좀 제형에 적절한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 포스포리피드, 사포닌, 담즙산 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 적절한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드 기(headgroup) 내의 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 지질을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 예컨대 US 4,235,871에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 생분해성 마이크로스피어의 형태로 존재할 수 있다. 폴리(락틱산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA와 PGA의 코폴리머(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL) 및 폴리안하이드리드와 같은 지방족 폴리에스테르가 마이크로스피어의 생성시 생분해 가능한 폴리머로서 널리 사용되어 왔다. 이러한 마이크로스피어의 제조는 US 5,851,451 및 EP 0 213 303에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 인용되고 있다.
다른 구현에서, 본 발명의 약학 조성물은 폴리머 겔의 형태로 제공되며, 여기서 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카르복시메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 히드록시에틸 셀룰로즈, 에틸히드록시에틸 셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 코폴리머, 여러 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머가 상기 제제를 함유하는 용액의 농축을 위해 사용된다. 폴리머는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 항체 폴리펩타이드는 간단히 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름), 트라간쓰 검, 및/또는 여러 버퍼에 용해될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 활성 항체 폴리펩타이드의 활성의 잠재화를 위해 이온 및 한정된 pH를 포함할 수 있음이 인정받을 것이다. 또한, 조성물은 멸균과 같은 통상적인 약학 작업에 가해질 수 있으며 그리고/또는 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 버퍼, 필러 등과 같은 통상적인 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 비경구(정맥내, 피하 및 근육내), 경피, 눈, 비강, 폐, 협측(buccal), 구강, 경구, 비경구 및 직장을 포함한다. 또한, 이식물로부터의 투여가 가능하다. 인퓨전(Infusion)은 투여 제제의 잠재적으로 높은 세포독성 때문에 원하는 경로일 수 있다.
일 구현에서, 약학 조성물은 예컨대 정맥내, 뇌혈관내, 관절내, 동맥내, 복강내, 척수내, 심실내, 흉골내, 두개강내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구 투여되거나, 또는 이들은 인퓨전 기술에 의해 투여될 수 있다. 이들은 편의상 예컨대 혈액과 등장성인 용액을 형성하기 위해 충분한 염 또는 포도당과 같은 다른 물질들을 함유할 수 있는 멸균 수용액 형태로 사용된다. 수용액은 필요에 따라 적절히 완충된다(예컨대, pH 3 내지 9). 멸균 조건하에서의 적절한 비경구 제형의 제조는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 약학 기술에 의해 용이하게 달성된다.
비경구 투여에 적절한 제형은 항산화제, 버퍼, 세균발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 서스펜션화제(suspending agent) 및 농조화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 서스펜션(suspension)을 포함한다. 제형은 예컨대 밀봉된 앰플 및 바이얼과 같은 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기에 존재할 수 있으며, 예컨대 사용 직전에 주사용 물과 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석(extemporaneous) 주사액 및 서스펜션은 앞서 언급된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 특히 환자의 종양에 대해(예컨대, 종양 내(intra-tumourally) 또는 종양 주변(peri-tumourally)) 정맥내 투여 또는 국소 투여와 같은 비경구 투여에 적절하다.
약학 조성물은 약학적으로 효과적인 투여량으로, 즉 치료 방사성 핵종을 치료 효과 흡수된 투여량으로 환자에게 투여될 것이다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드의 치료 용도에서, 본원에 사용되는 바와 같이, '치료 유효량' 또는 '유효량' 또는 '치료 효과적'은 주어진 상태 및 투여 요법에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이는 필요한 첨가제 및 희석제, 즉 담체 또는 투여 비이클과 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하는 것으로 계산된 활성 물질의 사전 결정된 양이다. 또한, 이는 숙주의 활동성, 기능 및 반응에서 임상적으로 유의적인 결손을 감소 및/또는 방지하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의적인 상태에서의 개선을 일으키기에 충분하다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 특이적 활성에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량은 필요한 희석제와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하는 것으로 계산된 활성 조성물의 사전 결정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조 방법 및 용도에서, 활성 성분의 치료 유효량이 제공된다. 치료 유효량은, 당해 분야에 알려져 있는 바와 같이, 나이, 체중, 성별, 상태, 합병증, 다른 질병 등과 같은 환자 특성에 기초하여 통상의 숙련된 의료인에 의해 결정될 수 있다(하기 실시예 8 참조). 약학적으로 효과적인 투여량의 투여는 개별 투여량 단위 또는 그렇지 않으면 더욱 작은 투여량 단위들의 형태로 단일 투여에 의해 그리고 또한 특정 간격으로 세분화된 투여량의 다중 투여에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 장기간에 걸쳐 연속 인퓨전으로서 제공될 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드의 진단 용도에서, 본원에 사용되는 바와 같이, '약학 유효량' 또는 '유효량' 또는 '진단 효과적'은 생체 내 영상 목적을 위해 검출 가능한 신호를 제공하는 양을 지칭한다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 사용되는 화합물의 효능/독성에 따라 다양한 농도로 제형화될 수 있다. 제형은 0.1μM 내지 1mM, 1μM 내지 500μM, 500μM 내지 1mM, 300μM 내지 700μM, 1μM 내지 100μM, 100μM 내지 200μM, 200μM 내지 300μM, 300μM 내지 400μM, 400μM 내지 500μM 및 약 500μM의 농도로 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
전형적으로, 인간 환자에게서 (치료 부분을 포함하거나 또는 포함하지 않는) 항체 폴리펩타이드의 치료 투여량은 (70kg의 체중에 기초하여) 투여당 100μg 내지 700mg의 범위로 존재할 것이다. 예를 들면, 최대 치료 투여량은 투여당 0.1 내지 10mg/kg, 예컨대 0.1 내지 5mg/kg 또는 1 내지 5mg/kg 또는 0.1 내지 2mg/kg의 범위일 수 있다. 이러한 투여량은, 방사선종양전문의(oncologist)/내과의사(physician)에 의해 결정되는, 여러 간격으로 투여될 수 있으며, 예컨대 투여량은 매일, 매주 2회, 매주, 2주마다 또는 매달 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 단독으로 투여되거나 또는 전립선암의 치료에 사용되는 다른 치료제와 조합되어, 또는 다른 치료 항체들, 수술(예컨대, 근치적 전립선절제술), 방사성핵종 요법, 근접요법, 외부 빔 방사성 요법, 고강도 촛점화 초음파(high-intensity focused ultrasound)(HIFU), 화학요법, 경구 화학치료 약물, 동결수술(종양 동결), 호르몬 요법(예컨대, 항안드로겐 요법), 거세 또는 이들의 조합과 같은, 전립선암의 치료를 위한 다른 치료 양상으로 환자를 치료하기 전, 후 또는 이와 동시에 투여될 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 인정받을 것이다.
본 발명의 제 7 견지는, 본원에 기재된 바와 동일한 것의 용도에 관한 지시사항과 함께, 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드 또는 본 발명의 제 6 견지에 따른 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 제 8 견지는 약제에서의 사용을 위한 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 제 9 견지는 전립선암의 치료 및/또는 진단에서의 사용을 위한 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 제 10 견지는, 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 치료 유효량 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 전립선암을 치료하는 방법을 제공한다.
'치료(treatment)'에 대하여, 우리는 환자의 치료적 및 예방적 치료 둘다를 포함한다. 용어 '예방적(prophylactic)'은, 본원에서 기재된 바와 같은 제제 또는 이의 제형을 환자 또는 대상에게서 전립선암의 가능성 또는 국소화된 전립선암의 확산, 파종 또는 전이를 방지 또는 감소시키는 데 사용하는 것을 포함하는 것으로 사용된다. 또한, 용어 '예방적'은 본원에서 기재된 바와 같은 제제 또는 이의 제형을 이전에 전립선암에 대해 치료받은 적이 있는 환자에게서 전립선암의 재발을 방지하는 데 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 제 11 견지는, 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 진단 유효량 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 전립선암을 진단하는 방법을 제공한다.
"진단(diagnosis)"에 대하여, 우리는 생체 내(즉, 환자의 신체 내) 또는 생체외(즉, 환자의 신체로부터 제거된 세포 샘플 또는 조직 내) 전립선암 세포의 검출을 포함한다.
치료 또는 진단되는 전립선암은 전립선에 국소화되거나, 또는 비-국소화된(즉, 파종된(disseminated)) 전립선암일 수 있다. 전립선에 국소화된 전립선암은 예컨대 TNM 시스템(종양/결절/전이(Tumor/Nodes/Metastases)의 약어)에 따라 임상 T1 또는 T2 암으로 분류될 수 있으며, 비-국소화된/파종된 전립선암은 예컨대 임상 T3 또는 T4 암으로 분류될 수 있다.
치료 또는 진단되는 전립선암은 전이성 전립선암일 수 있다. 전이는 체내에서 이의 본래 위치로부터 다른 부위로의 암 확산을 지칭한다. 예를 들면, 치료 또는 진단되는 전이성 전립선암은 림프계에서 존재하는 전이: 뼈(척추(spine), 척추뼈(vertebrae), 골반, 갈비뼈 포함)에서 존재하는 전이; 골반, 직장, 방광 또는 요도 내의 전이일 수 있다. 다른 덜 일반적인 위치에 존재하는 전이도 또한 본 발명으로 치료될 수 있다. 전이는 미소전이(micrometastases)일 수 있다. 미소전이는 새로 형성된 종양이 일반적으로 검출되기에 너무 작거나 또는 어렵게 검출되는 형태의 전이이다. 예를 들면, 본 발명은, 이러한 세포 또는 클러스터(cluster)의 존재가 불가사의한 파종된 질병과 같이 존재는 하지만 진단하기에는 가능하지 않은 경우에도, 단일 암 세포 또는 세포 클러스터를 치료하기 위한 수단으로 통상의 기술자에게 제공한다.
따라서, 전립선암의 종래 치료와 비교되는 본 발명에 의해 제공된 치료의 특히 중요한 기술적 이점은, 파종된 및/또는 전이성(미소전이성 포함) 전립선암의 치료에 향상된 효능인 것으로 기대된다.
따라서, 일 구현에서, 본 발명은 일차 전립선 종양의 전이를 예방 또는 치료하는 제제 및 방법을 제공한다.
전립선암은 50세 이상, 더욱 통상적으로 60, 65 또는 70세 이상의 남성에게서 발달하는 경향이 있으며, 남성에게서 가장 널리 퍼져있는 유형 중 하나임에도 불구하고, 대다수가 증상을 가지고 있지 않고, 어떠한 요법도 경험하지 않아, 결국 다른 원인으로 사망하게 된다. 이는 전립선암이 대부분의 경우 느리게 성장하고 증상이 없기 때문이며, 이러한 상태를 갖는 남성들은 더욱 나이가 많으므로, 이들은 흔히 심장/순환기 질병, 폐렴, 다른 무관한 암, 또는 노령과 같이 전립선암과 무관한 원인으로 사망한다. 전립선암 경우의 약 3분의 2는 느린 성장을 나타내며, 나머지 3분의 1은 더욱 공격적이고 빠르게 발달한다.
따라서, 전립선암의 치료 및 진단에 대한 효과적인 방법의 개발은 특별히 더욱 공격적이고 빠른 발달 형태의 암을 특히 더욱 젊은 환자에게서 관리하는 것이 중요하다. 따라서, 일 구현에서, 본 발명은 전립선암의 진단시 및/또는 치료시에 90세 미만, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40세 또는 그 미만의 연령인 환자에게서의 전립선암의 치료 또는 진단와 관련된다.
전립선암에 걸린 제 1 친족관계(first-degree relative)를 가진 남성(아버지 또는 남자형제)은 전립선암 발달의 위험이 2배인 것으로 생각되며, 영향을 받은(affected) 2명의 제 1 친족관계를 가진 남성은 가족력이 없는 남성에 비해 5배 이상의 위험을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 1명, 2명 또는 그 이상의 가족원, 특히 제 1 가족원(first-degree family member)(예컨대, 아버지 또는 남자형제)이 전립선암으로 이전에 진단받았던 것을 특징으로 하는 환자에게서 전립선암을 치료 또는 진단하는 것과 관련될 수 있다.
또한, 본 발명은 환자에게서 전립선암의 치료 또는 진단과 관련되며, 여기서 치료되는 전립선암은 거세-저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancer)(CRPC)이다. CRPC는 전형적으로 1 내지 3년 후 호르몬 치료에 난치성이 되고, 호르몬 요법에도 불구하고 성장을 재개하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 의약 용도 및 발법에서, 항체 폴리펩타이드는 전형적으로 환자의 신체 내에 주입 또는 인퓨전된다. 그 다음, 생체 내에서, 항체 폴리펩타이드는 표적 항원, hK2; 주로 전립선암 세포 및 이의 전이를 생성시키는 조직에 바인딩한다. 바인딩함에 따라, 항체 폴리펩타이드는 치료 효과(예컨대, ADCC, CDC를 통해 또는 방사성 동위원소 또는 다른 세포독성 부분을 운반함으로써 세포 사명을 유도함)를 직접적으로 발휘할 수 있다. 대안적으로, 바인딩된 항체 폴리펩타이드는 진단(영상) 도구로서 작용할 수 있으며, 이것은 암 세포의 수술적 제거를 도와주거나 또는 요법의 선택을 안내할 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 다른 치료 및/또는 진단 제제/치료, 예컨대외부 방사성요법, 수술, 세포증식억제 및 안드로겐 치료와 조합하여 사용될 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 인정받을 것이다.
상기 설명에서는 전립선암의 치료 및 진단을 위한 방법들에 적용 가능한 본 발명의 구현들에 집중하고 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 적용들에 국한되지 않으며, 수술후 검사, 및 방사선, 세포증식억제 및 안드로겐 치료 도중 또는 이후의 검사에 유용할 수 있다.
다른 구현에서, 방사선유도 수술(RadioGuided Surgery)(RGS) 또는 영상유도 수술(Image-Guided Surgery)(IGS)이 수술 도중 및/또는 이전에 본 발명의 트레이서-표지된 항체 폴리펩타이드를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 검출 가능한 부분을 포함하는 항체 폴리펩타이드는 수술 도중 및/또는 이전에 투여될 수 있다. 이 구현에서, 항체 폴리펩타이드가 우선 인퓨전될 수 있다. 그 후, RGS/IGS가 수술 도중 또는 이전에 검출 가능한 부분에 민감한 검출 기구로 hK2-생성 조직을 확인하는 데 사용될 수 있다. 검출 가능한 부분은 예컨대 방사선 방출 또는 자기-민감성 검출 가능한 부분일 수 있고; 이는 예컨대 세렌코프(Cerenkov) 방사선 및/또는 브렘스트라렁(Bremsstrahlung)의 이미터일 수 있으며; 이는 형광 표지 및/또는 자기 또는 자기화 가능한 표지일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RGS/IGS는 예컨대 광학, 세렌코프, 브렘스트라렁 또는 베타 방사선의 검출; 방사성 핵종 표지의 검출에 기초한 방법일 수 있고/있거나, 자기측정을 포함할 수 있다. RGS는, 검출 가능한 부분에 의해 "마킹된(marked)" 조직을 외과의사가 확인할 수 있는 외과 기술로서 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
상기 방법에 따라 얻어진 시각화(visualisation)는 SPECT/PET, 컴퓨터 단층촬영(computed tomography)(CT), 초음파(ultrasound)(US) 및 자기 공명 단층촬영(magnetic resonance imaging)(MRI)와 같은 다른 방사선(radiological) 시각화 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 추가 견지에서, 또한 본 발명은, 방사선유도 또는 영상유도 수술과 같은 수술 도중 및/또는 이전에 전립선암을 앓는 환자에게 투여하는, 약제에서의 용도를 위한 항체 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 추가 견지는, 대상의 혈액에서 전립선 종양 세포의 검출을 위한 시험관 내 방법으로서, 상기 방법은
(a) 시험되는 대상으로부터의 혈액의 샘플을 제공하고;
(b) 선택적으로는, 상기 혈액 샘플에 존재하는 세포를 추출하고/하거나 정제하고;
(c) 상기 혈액 샘플에 존재하는 세포와 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 접촉시키고;
(d) 상기 항체 폴리펩타이드가 자유(즉, 비착체화된) hK2에 바인딩하는 지를 (직접적으로 또는 간접적으로) 결정하는 것
을 포함하며,
여기서, 상기 항체 폴리펩타이드가 자유 hK2에 바인딩하는 것은 대상의 혈액에서의 전립선 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 방법을 제공한다.
따라서, 방법은, 혈액 샘플이 자유 hK2를 함유하는지를 검출하는 검정을 실시하는 것을 포함하며, 자유 hK2의 존재는 대상의 혈액에서의 전립선 종양 세포의 존재를 나타내는 것이다.
당해 분야의 숙련자는 이러한 검정을 실시하기 위한 방식들이 다수 존재함을 이해할 것이다. 예를 들면, 면역검정은 균질하거나 또는 더욱 바람직하게는 이질적일 수 있다. 검정은 또한 경쟁적이거나 또는 더욱 바람직하게는 비경쟁적 포맷으로 실시될 수 있다.
이질적이고 비경쟁적 검정의 경우, 예시적인 프로토콜은
(a) 시험되는 대상으로부터의 혈액의 샘플을 제공할 수 있고;
(b) 선택적으로는, 상기 혈액 샘플에 존재하는 세포를 추출하고/하거나 정제할 수 있고;
(c) 상기 혈액 샘플에 존재하는 세포와 본 발명의 제 1 견지에 따른 고상 고정된 항체 폴리펩타이드를 접촉시킬 수 있고;
(d) (고체 표면에 바인딩하지 않은) 가용성 성분들을 세척하여 제거할 수 있고;
(e) 트레이서, 즉 리포터(reporter) 분자/입자로 표지된 또 다른 안티-hK2 특이적 항체를 첨가할 수 있고;
(f) 바인딩되지 않은 트레이서 항체를 세척하여 제거할 수 있고;
(g) 상기 트레이서 항체로부터 신호를 검출할 수 있다.
단계 b와 c 또는 c와 d 사이에서, 세포에 대하여 가용성 hK2를 제조하며, 이어서 검출될 수 있는 항온처리 단계이어야 한다.
본 발명의 또 다른 추가 견지는, 대상의 조직에서 전립선 종양 세포의 검출을 위한 시험관 내 방법으로서, 상기 방법은
(a) 시험되는 대상으로부터의 조직의 샘플(예컨대, 조직학적 샘플)을 제공하고;
(b) 선택적으로는, 상기 조직 샘플에 존재하는 세포를 추출하고/하거나 정제하고;
(c) 상기 조직 샘플에 존재하는 세포와 본 발명의 제 1 견지에 따른 항체 폴리펩타이드를 접촉시키고;
(d) 상기 항체 폴리펩타이드가 자유(즉, 비착체화된) hK2에 바인딩하는 지를 (직접적으로 또는 간접적으로) 결정하는 것
을 포함하며,
여기서, 상기 항체 폴리펩타이드가 자유 hK2에 바인딩하는 것은 대상의 조직에서의 전립선 종양 세포의 존재를 나타내는 것인 방법을 제공한다.
상기 시험관 내 방법들의 일 구현에서, 단계 (d)는 ELISA에 의해 실시된다. 그러나, 시험관 내 항체-항원 상호작용을 검출하는 데 적합한 검정이 사용될 수 있다.
추가 구현에서, 방법은 샘플에서 전립선 종양 세포의 정량화를 추가로 포함한다.
상기 시험관 내 방법들의 추가 구현에서, 방법은 대상에게서 전립선암의 진단을 위한 것이다.
단어 "하나의(a 또는 an)"의 사용은 특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우 "하나(one)"를 의미할 수도 있고, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 구현들은 상기 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 고려되는 경우 더욱 잘 인정받고 이해될 것이다. 그러나, 상기 설명은 본 발명의 다양한 구현 및 이의 다수의 특정 상세설명을 나타내면서 예시적이지만 제한적이지 않은 방식으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 다수의 치환, 개질, 부가 및/또는 재배열은 본 발명의 취지를 벗어나지 않고서 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 모든 치환, 개질, 부가 및/또는 재배열을 포함한다.
하기 도면은 본원의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 견지를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현들의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현들을 설명하기 위해 포함된다. 뒷따르는 실시예들에 개시된 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자에 의해 발견된 기술들을 나타내며, 따라서 그의 실시를 위해 특정 모드들을 구성하도록 고려될 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 인정받아야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 본 개시내용의 견지에서 개시된 특정 구현들에서 다수의 변화들이 이루어질 수 있으며, 여전히 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고서 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 인정해야 한다.
실시예
실시예 1 - 하이브리도마 세포주로부터 11B6의 클로닝
시약
하이브리도마 세포주를 생성하는 모노클로날 항체 11B6을 mRNA 추출 및 항체의 생성에 사용하였으며, 이는 단백질 시퀀싱을 위해 더욱 친화 정제(affinity purified)되었다(Vaisanen 등, 2004).
제한효소, FastAP 및 T4 DNA 리가아제는 Fermentas로부터 획득하여 사용하였고, 프라이머는 터쿠(Turku) 대학교, 생명공학부(WO252) 및 Thermo Scientific으로부터 획득하여 사용하였다. DNA 정제는 퀴아젠 겔 추출(Qiagen's Gel extraction) 및 PCR 정제 키트로 수행하였다.
mRNA 추출 및 cDNA 합성
mRNA는 QuickPrep Micro mRNA 정제 키트(Amersham Biosciences)를 사용하여 하이브리도마 세포(5E6 세포)를 생성하는 11B6 MAb로부터 추출하였으며, 상기 mRNA로부터 cDNA 합성은 어플라이드 바이오시스템스 고성능 cDNA 아카이브 키트(Applied Biosystems' High-capacity cDNA archive kit)를 사용하여 지시에 따라 수행하였다.
cDNA로부터 항체 유전자의 증폭
정제된 11B6 MAb 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 N-말단 서열들은 헬싱키 단백질 시퀀싱 서비스에서 애드만 분해법에 의해 검출되었다. 경쇄 서열은 DIVLTQSPAS[SEQ ID NO: 16]이었고, 증쇄 서열은 DVQLQESGPG[SEQ ID NO: 17]이었다. 아미노산의 IMGT 데이타베이스 비교로 유전자들, IGKV3 및 IGHV3을 각각 확인하였다. 포워드 PCR 프라이머(디제너레이트)에 대한 상보적 부위는 상기 N-말단 아미노산을 코딩하는 (NCBI BLAST에 의해 발견된) DNA 서열에 기초하여 디자인되었다. 중쇄를 클로닝하는데 사용된 리버스 프라이머는 CH1에 바인딩하도록 디자인되었다. 경쇄의 경우에, 두 개의 리버스 프라이머가 사용되었으며; 제 1 PCR에 사용된 것은 CL에 바인딩하며, 제 2 PCR에 사용된 다른 하나는 VL과 CL의 경계에 바인딩하는 것이었다. 또한 모든 프라이머들은 클로닝에 필요한 제한 효소 인식부(이후에 밑줄 그어짐)를 함유한다.
경쇄 포워드 프라이머는 SfiI_DIVLTQSPAS[SEQ ID NO: 16]:
(5'-TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAYATHGTRYTVACNCARTCTCC-3'; [SEQ ID NO: 18])이었고,
리버스 프라이머는 WO252
(5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3', XbaI; [SEQ ID NO: 19])
및 CpoI_JK2
(5'-GATACAGTTGGTGCAGCATCGGTCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT-3'; [SEQ ID NO: 20])이었다.
중쇄 포워드 프라이머는 NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID NO: 17]
(5'-TGCTGCTGGCGGCCGCTCCAGCCATGGCTGAYGTVCARCTKCAGGAGTCDGG-3'; [SEQ ID NO: 21])이었고,
리버스 프라이머는 asCH1_SacI
(5'-CGCCACCAGAGCTCTCACAATCCCTGGGCACAATTTTC-3'; [SEQ ID NO: 22])이었다.
VL+CL 프래그먼트는 템플레이트로서 cDNA 100ng, dNTP's 0.2mM, 프라이머 SfiI DIVLTQSPAS[SEQ ID NO: 16] 및 WO252 0.5μM, 1x Phusion HF 버퍼 및 0.6 U Phusion DNA 폴리머라아제(Finnzymes)를 함유하는 PCR 반응에서 증폭되었다. 증폭은 98℃ 30 sec; 98℃ 7 sec, 50℃ 20 sec, 72℃ 20 sec의 30 사이클; 및 72℃ 10min의 파이널 익스텐션의 프로토콜에 의해 수행되었다. PCR 산물을 시퀀싱하고, VL-CL 경계의 서열을 확인한 후, 실제 클로닝을 위한 PCR을, VL 부분만 클로닝하기 위해 플라이머로서 SfiI_DIVLTQSPAS[SEQ ID NO: 16] 및 CpoI_JK2가 사용된 것을 제외하고 상기와 같은 반응에서 cDNA로부터 다시 수행하였다. 증폭은 98℃ 30 sec; 98℃ 7 sec, 60℃ 20 sec, 72℃ 20 sec의 10 사이클; 25 cycles of 98℃ 7 sec, 56℃ 20 sec, 72℃ 20 sec의 25 사이클; 및 72℃ 10 min의 파이널 익스텐션의 프로토콜에 의해 수행되었다..
VH+CH1 프래그먼트는 프라이머로서 NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID NO: 17] 및 asCH1_SacI이 사용된 것을 제외하고 VL과 같은 반응에서 증폭되었다. 증폭 프로토콜은 98℃ 30 sec; 98℃ 7 sec, 64℃ 20 sec, 72℃ 20 sec의 30 사이클; 및 72℃ 10 min의 파이널 익스텐션이었다.
클로닝
올바른 사이즈의 산물을 제조용 아가로즈겔로부터 정제하였다. VL은 Sfil 및 Cpol로 절단되었고, VH+CH1은 SacI 및 NotI로 절단되었다. 리시피언트 벡터 pAK400 5404 FAb Ich(pAK400으로부터 변형됨, Krebber 등, 1997)는 모든 효소 복합으로 개별적으로 절단되고, 프래그먼트는 FastAP로 디포스포릴레이트되고, 상기 제조용 겔로부터 정제되었다.
절단된 11B6 VL 및 이에 상응하는 벡터 프래그먼트는 T4 DNA 리가아제로 라이게이트되고, 일렉트로포레이션에 의해 에스케리차 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue 세포(Stratagene) 내로 변형되어 벡터 pAK400-11B6-VL가 생성되었다. SacI+NotI 절단된 VH+CH1과 벡터 프래그먼트의 라이게이션 산물을 pAK400-11B6-VH+CH1으로 칭하였다. 올바른 클론들은 DNA 시퀀싱에 의해 그리고 본래의 단백질 서열에 대한 서열과 데이터베이스(BLAST 서치) 상에서 발견된 항체들에 대한 서열들을 비교함으로써 확인하였다.
완전한 11B6 Fab를 제작하기 위해, 이전에 제조된 구조체를 NotI 및 DacI으로 절단하였다. 벡터 pAK400-11B6-VL은 리시피언트 벡터로서 사용되었으며, 이에 벡터 pAK400-11B6-VH+CH1의 VH+CH1이 삽입되었다. 라이게이션 및 트랜스포메이션이 상기와 같이 수행되었다. 제작된 pAK400 11B6 FAb lch 벡터는 제한 효소 분석으로 확인되었다.
참고문헌
실시예 2 - 11B6 항체의 인간화
뮤린 항-hK2 항체 11B6의 가변 도메인을 CDR-그래프팅법을 사용하여 인간화하였다. 이 접근법에서, 뮤린 항체의 상보성 결정 부위(complementarity determining regions)는 가변 중 및 경 도메인(variable heavy and light domain) 프래임워크에 그래프팅되었다. CDR 부위에 있는 잔기에 부가적으로, 상기 프래임워크 부위에 있는 특정 중요한 위치에 있는 잔기들은 그래프팅된 CDR 루프의 형태가 모(parental) 뮤린 항체에서 이들의 형태와 가능한 한 유사하게 유지되도록 인간-성(human-like)으로 되기보다는 뮤린-성(murine-like)으로 유지되었다.
Kabat 넘버링 스킴(Kabat 등, 1991)이 본 분석에 사용된다.
호몰로지 모델링
뮤린 11B6 항체의 호몰로지 모델은 자동 Web 항체 모델링 -Server(VAM; http://antibody.bath.ac.uk/index.html)를 사용하여 생성되었다. 상기 모델은 각각, 가변 도메인 인간화를 위해 프래임워크로 사용된 모 뮤린 항체와 인간 면역글로블린 서열 사이에 있어서 상이한 잔기들의 중요성의 외관 검사에 기초한 평가에 사용되었다.
11B6 인간화 V-도메인 서열의 디자인
V L 도메인 디자인
뮤린 11B6 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 ClustalW 서열 정렬 프로그램을 사용하여 NCBI에서 인간 면역글로블린 생식세포계열 서열의 데이터베이스와 비교하였다. 11B6 VL은 인간 VK4과(family)의 유일한 멤버인, 인간 생식세포계열 유전자 B3(IGKV4-1*01)와 가장 높은 유사성을 공유한 것으로 나타났다. 가변 도메인 서열의 C-말단 부분을 인코딩하는 J-세그먼트와 관련하여, 인간 JK2는 뮤린 11B6의 이에 상응하는 부위와 가장 유사한 것으로 나타났다.
IGKJ2의 서열과 함께 인간 B3 유전자는 모 뮤린 항체 11B6의 경쇄로부터 CDR-루프(도 1)의 그라프팅을 위한 프래임워크로 사용되었다. 뮤린 오리진의 잔기(루신)가 인간-성 메티오닌 대신에 VL의 위치 4에 도입되었다. 이 버니어 구역(Vernier zone)(Foote 및 Winter, 1992) 잔기는 경쇄의 CDR1 및 CDR3 루프 바로 아래에 위치한다. CDR-L2 내의 위치 54에서, 인간-성 아르기닌이 뮤린-성 발린 대신에 사용되었다. 모델링에 따라, 이 위치에 있는 잔기는 상기 항원과 직접적인 상호작용을 형성하지 않을 것으로 보이나, Arg54는 인간 프래임워크 내 위치 60에서 음 하전된 아스파테이트와 염다리(salt bridge)를 형성하는 것으로 보인다. 이는 CDR-L1 내 위치 24에 있는 잔기가 항원 접촉에 관련되는 것으로 보이지 않았다. 결론적으로, 인간-성 리신이 뮤린-성 아르기닌 대신에 이 위치에 도입되었다.
V H 도메인 디자인
뮤린 11B6 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 clustaIW 서열 정렬 프로그램을 사용하여 NCBI에서 인간 면역글로블린 생식세포계열 서열의 데이터베이스와 비교되었다. 11B6 VH는 인간 VH4과 멤버 VH4-28과 가장 높은 유사성을 갖는 것으로 나타났다. 가변 도메인 서열의 C-말단부를 인코딩하는 J-세그먼트와 관련하여, 인간 JH1은 뮤린 11B6의 이에 상응하는 부위와 가장 많이 유사한 것으로 나타났다.
JH1의 서열과 함께 인간 VH4-28 유전자는 모 뮤린 항체 11B6의 중쇄로부터 CDR-루프(도 1)의 그래프팅을 위한 프래임워크로서 사용되었다.
뮤린-성 잔기 아스파라긴 및 트레오닌은 각각, VH의 위치 27 및 30에 도입되었다. 이들은 Kabat 정의에 따른 CDR-H1(Kabat 등, 1991; 도 1)에 속하지 않지만, 이들은 Chothia(1989)에 의한 정의와 같이 일부 다른 CDR 정의법에 의해 CDR 잔기로 분류된다. 잔기 27 및 30은 CDR-H1의 다른 일부의 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 아마도 그 항원과 직접적인 접촉에 참여하는 것으로 보여진다. 위치 71에 있는 잔기는 CDR-H2의 형태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Tramontano 등, 1990), 뮤린-성 아르기닌은 여기서 인간-성 발린 대신에 사용되었다. 중요한 CDR-H3 루프에 선행하는 위치 94에서, 뮤린 11B6 유래 잔기 트레오닌은 인간 VH4-28성(VH4-28 like) 아르기닌 대신에 도입되었다. 또한, CDR-H2 내 위치 60에 있는 잔기는 항원 접촉에 관련되는 것으로 보이지 않았다. 따라서, 인간-성 아스파라긴이 뮤린-성 세린 대신에 이 위치에 도입되었다.
디자인된 VH 및 VL 도메인이 각각 인간 CH1 및 인간 CK 불변 도메인에 연결된, Fab 프래그먼트로서 인간화 11B6을 인코딩하는 유전자들을 합성 구조물(Genscript, US)로서 구입하였다. 상기 유전자들은 상기 Fab 카세트의 양쪽 상에 인지 부위를 가진 Sfil 제한 효소를 이용하여 pAK400(Krebber 등, 1997)으로부터 변형된 발현 벡터 pAK400Fab 내로 클로닝되었다. 상기 벡터는 인간화 Fab 프래그먼트의 발현을 위해 이. 콜라이(E. coli) XL-1 blue 세포 내로 트랜스포밍되었다.
본 발명의 예시적인 인간화 11B6 Fab 프래그먼트의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 서열을 도 1에 나타내었다.
참고문헌
실시예 3 - h11B6의 발현 및 정제
HEK293 세포를 FreeStyle 293 Expression Medium(Life Technologies)에서 2L 서스펜션 배양으로 증식시켰다. 트랜스펙션을 위한 날에 세포 밀도는 1 × 106 cells/ml이었다.
성분 중쇄 혹은 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(즉, 각각 SEQ ID NOs: 14 및 15)은 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화되고, 합성되고 IgG 발현 벡터로 클로닝되었다. 그 다음, 상기 중쇄 및 경쇄에 대한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드 DNA(발현 벡터)를 트랜스펙션 제제와 혼합하고 RT에서 10분간 배양하였다. 플라스크를 서서히 흔들면서 DNA-트랜스펙션 제제-혼합물을 세포 배양물에 서서히 첨가하였다. 그 다음, 트랜스펙션된 세포 배양물을 7일 동안, 약 135rp으로 회전하는 오비탈 쉐이커 플랫폼에서 37℃, 8% CO2에서 배양하였다.
원심분리에 의해 배지를 수거하고, 5μm, 0.6μm 및 0.22μm 필터 시스템을 통해 여과하였다.
항체들은 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제되고, 버퍼는 투석에 의해 PBS pH 7.4로 바뀌고; 후속적으로, 항체들은 한외여과에 의해 농축되었다.
농도는 흡광도에 의해 측정되었다.
DNA: 경쇄: p11B6VLhV1hk (4300 bp) 양: 0.35mg
중쇄: p11B6VHhV1hIgG1 (4900 bp) 양: 0.6mg
DNA 양은 최적화되지 않았다.
트랜스펙션 제제: 소유권이 있는 물품(하지만, XfectTM Transfection Reagent(Clontech), Lipofectamine(Life Technologies), FuGENE® HD Transfection Reagent(Promega), FreeStyleTM Max Reagent(Invitrogen), DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민 및 칼슘 포스페이트와 같이 적절히 상업적으로-구입가능한 트랜스펙션 제제가 쉽게 이용가능하다.)
전체 수율: 13.1mg(~6.5mg/L)
실시예 4 - h11B6의 특성화: 친화도
시험 목적
본 시험의 목적은 바이아코어(Biacore) 기기상에서 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)의 기술을 사용하여 항체 11B6 및 항원 hK2의 4개의 변이체들 사이의 바인딩 동역학을 조사하기 위한 것이었다.
단백질 시료(항체 및 항원)의 질을 조사하기 위해, SPR 실험 전에 SDS-PAGE 겔을 수행하였다.
예비-시험으로, 본 시험에서의 실험을 위한 적절한 조건들을 알아내기 위해 다양한 파라미터들을 조사하였다.
본 시험으로, 상기 4개의 항체들 및 상기 항원에 대해 다중 바인딩 측정을 수행하였다. 수집된 데이터로부터, 결합 및 해리 속도 상수(kon 및 koff) 및 해리 상수(KD)를 산출하고 이를 기록하였다.
시약 및 기기 정보
상기 4개의 항체들 및 하나의 항원으로 이루어진 하기 용액들이 Diaprost AB에 의해 제공되었다:
m11B6 스톡: a-ehk211B6 14.12013 PP, 3.41 mg/ml: 0.9% NaCl, 100μl
h11B6 스톡: Innovagen Lot 90476.30 2013-04-12, 1 mg/ml: PBS pH 7.4, 320μl
h11B6-DTPA 스톡: 0.2M Na-아세테이트 pH 5.5, 0.9 mg/ml, 340μl
h11B6-DFO 스톡: 0.2M 암모늄 아세테이트 pH 5.5에 용해된 5mg/ml 젠티신산, 1.6 mg/ml, 400μl
hK2 스톡: 26.6 μg/ml frakt 2 fr 7 SL + 단백질 inh 5/2-02 1% BSA
모든 시료들을 분액하고, 분석 전에 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
모든 바인딩 실험은 Biacore 3000 기기에서 CM4 칩 상에서 수행하였다. 활성화, 고정, 불활성화, 바인딩 및 재생이 필요한 칩 및 모든 시약들은 GE Healthcare로부터 구입하였고, 제조자의 가이드라인에 따라 사용하였다.
SDS-PAGE
(a) 실험의 설명
Diaprost AB에 의해 제공된 시약들을 제조자의 가이드라인에 따라 Novex의 Tris-트리신 10-20% 아크릴아미드겔 상에 작동시켰다.
본래의 것(native)과 환원된 것(reduced)의 2 시리즈의 단백질 시료들을 표준 시료와 함께 동일한 겔 상에 동시에 작동시켰다.
본래의 것의 시리즈 내의 각 시료는 1-1.3μg의 상기 단백질, TRIS-버퍼 pH 8.8, SDS 및 로딩 버퍼를 함유하였다.
환원된 것의 시리즈 내의 각 시료는 1-1.3μg의 상기 단백질, TRIS-버퍼 pH 8.8, SDS, 로딩 버퍼 및 0.04% v/v 베타2-머캅토에탄올(환원제)을 함유하였다.
겔의 염색은 아세트산, 에탄올 및 물을 0.7, 3.0, 6.3의 비율로 함유하는 쿠마시 브릴리언트 블루 용액에서 수행하였다.
겔의 디스테이닝(destaining)은 아세트산, 에탄올 및 물을 0.7, 3.0, 6.3의 비율로 함유하는 용액에서 수행하였다.
(b) 결과 및 결론
그 결과를 도 2에 나타내었다.
이러한 결과로부터 상기 항체 및 항원 시료들이 고 품질 및 고 순도의 것임이 분명하다.
친화도 시험
(a) CM4 칩 상에 항원의 고정
상기 칩 CM4-2의 활성화는 EDC 및 NHS 혼합물을 사용하여 아민 결합을 위해 제조자의 가이드라인에 따라 수행하였다.
2.96μg/ml의 상기 항원 hK2(10mM NaAc-버퍼 pH 3.8에 희석된 hK2의 스톡 용액)을 함유하는 용액을, 상기 칩 CM4-2에 상기 항원을 고정하기 위해 상기 칩 상에 채널 fc2-4에 걸쳐 흐르게 하였다. 흐름 속도: 5μl/min, 용량: 200μl.
표적 RU ≤ Mw/10 Mw(hk2) = 25 900 Da 표적 RU (hk2) ≤ 2590
채널 fc1은 블랭크로 사용되었다.
하기의 고정화가 달성되었다:
fc2 = 1104 RU fc3 = 731 RU fc4 = 688 RU
모든 채널(fc1-4)은 활성화 및 고정화 후에 에탄올아민에 의해 블로킹되었다.
이러한 데이터는 2.96μg/ml의 상기 항원을 이용하여 적절한 고정화가 달성되었음을 입증한다.
(b) 결합 단계의 조사
각 항체의 5 가지 다른 농도의 용액(HSP-버퍼에 희석된 스톡 용액)을 30μl/min의 속도로 상기 칩 CM4-2 상의 채널 fc2-4에 걸쳐 흘려 보냈을 때, 상기 4개 항원의 상기 칩 CM4-2에 대한 결합 단계가 4-5분 동안 후속되었다.
각 항체에 대해 조사된 농도는 100, 50, 25, 12.5 및 6.25nM이었다.
또한 결합 데이터는 해리 프로세스가 450분 동안 후속된 실험으로부터 획득되었다.
전체적으로, 각 항체에 대해 18개의 개별 결합 실험을 수행하였다.
블랭크, fc1으로부터의 신호는 모든 데이터에 대해 감하여졌다.
도 3에, 5가지의 다른 농도의 각 상기 항체에 대해 칩 CM-2 상의 채널 fc2에서의 결합 단계를 나타낸다.
4-5분 후에 결합 프로세스에 대한 데이터를 피팅하는 것이 가능하였음을 알아내었다.
(c) 해리 단계의 조사
50nM의 상기 항체의 용액을 3030μl/min의 속도로 상기 칩 CM4-2 상의 채널 fc2-4에 걸쳐 흘려 보낸 후, 각 상기 항체에 대해 480분 동안 해리 단계가 후속되었다(도 4).
블랭크, fc1으로부터의 신호는 해리 속도 상수의 산출에 사용된 모든 데이터에서 감하여졌다.
그 데이터는 해리 프로세스가 매우 느림을 보여준다. 4가지 모든 항체에 대하여, 채널 fc4에서의 신호는 드리프트하였으며, 해리 프로세스는 그 채널에서 뒤따를 수 없었다.
(d) 해리 속도 상수(koff)의 산정
해리 단계 데이터를 피팅하고, 해리 속도 상수(koff)를 산정하였다(표 2 참조).
항체 Koff(10-5s-1)fc2 Koff(10-5s-1)fc3 Koff(10-5s-1)fc4 평균 표준편차
m11B6 1.9 4.9 - 3.4 ±2.1
h11B6 6.4 6.9 - 6.7 ±0.4
h11B6-DTPA 6.3 19.1 - 12.7 ±9.1
h11B6-DFO 5.8 5.5 - 5.7 ±0.2
각 항체에 대해 취해진 두 측정에 기초하여, 시험된 항체들의 해리 속도 상수들(koff) 사이에 현저한 차이는 없는 것으로 보인다.
(e) 결합 속도 상수(kon)의 산정
결합 속도 상수를 산정하기 위해, 해리 속도 상수(표 2)가 피팅된 식에 사용되었다.
피팅된 모든 데이터는 각 항체에 대한 결합 속도 상수 및 표준편차의 평균값을 산출하기 위해 사용되었다(표 3 참조).
항체 피팅된 실험의 번호 평균 kon(105M-1s-1) 표준편차
m11B6 18/18 2.48 ±0.85
h11B6 15/18 1.17 ±0.38
h11B6-DTPA 17/18 1.82 ±0.54
h11B6-DFO 18/18 1.11 ±0.22
각 항체에 대해 취해진 15-18 측정에 기초하여, 시험된 항체들의 결합 속도 상수들(kon) 사이에 현저한 차이는 없는 것으로 보인다.
(f) 해리 상수(kD)의 산정
시험된 각 항체들에 대한 해리 상수(kD)를 표 4에 나타내었다.
항체 평균 KD 10-11 M 표준편차
m11B6 19 ±15
11B6 65 ±25
11B6-DTPA 93 ±78
11B6-DFO 54 ±13
해리 상수(kD)는 4개의 모든 항체들에 대해 10-12 M 범위 내에 존재한다.
통계학적으로 유의하지 않지만, 인간화된 항체에 대한 해리 상수는 모 뮤린 항체의 해리 상수에 비해 더 높은 것으로 보인다.
인간화된 항체의 컨주게이션은 KD가 h11B6-DTPA 또는 h11B6-DFO에 대해 현저히 변하지 않기 때문에, 친화도에 현저히 영향을 주는 것으로 나타나지 않는다.
요약
결합 프로세스는 4개의 모든 항체에 대해 매우 신속하며, 결합 속도 상수(kon)는 각 항체에 대해 15-18 실험에 기초하여 모두 105 M-1 s-1에 있다.
해리 프로세스는 매우 느리며, 거의 대부분 Biacore의 기술적 한계의 범위 내이다. 해리 속도 상수(koff)는 각 항체에 대해 두 실험에 기초하여 모두 105 s-1 범위 내이다.
해리 상수(KD)는 4개의 모든 항체에 대해 10-12 M 범위 내이다.
실시예 5 - h11B6의 특성화: 집합성(aggregation)
중요사항 요약
상기 IgG의 4 변이체에 대해 이들의 응집에 대한 성향을 조사하기 위해, 동적 광산란(DLS) 시험을 수행하였다. DLS 결과는 모든 구조체들이 상당한 크기(구형 단백질로 추정되는 200kDa 또는 200kDa 보다 약간 큼)를 가지며 거의 집합성이 없거나 전혀 집합성이 없는 것으로 보여준다.
목적
동적 광산란을 이용하여 올리고머 상태와 관련되어 4개의 IgG 구조체를 특성화하기 위한 것을 목적으로 한다. 인슐린이 컨트롤로서 사용되었다.
결과
동적 광산란
인산완충용액(PBS pH 7.4)을 0.22 미크론 필터를 통해 여과하였다. 운반된 단백질은 PBS pH 7.4에 0.1mg/ml로 희석되었다. 동적 광산란은 Malvern APS 장치를 이용하여 이중 시료에서 20℃에서 측정하였다. 각 시료는 3회 측정하였다. 희석 버퍼는 그 버퍼가 합리적으로 더스트 및 집합체를 함유하지 않았는지 확실히 하기 위해 컨틀롤로서 사용되었다. 도 1c. 모든 시료들은 수 분포 함수를 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 가장 풍부한 종의 평균 반지름은 그 종의 다분산성에 따라 산출되었다. 이 종의 평균 질량 분포가 또한 산출되었다. 표 5 참조.
크기 분포로부터 유도된 동적 광산란 데이터
구조체 평균 반지름(nm) 다분산성(%) 질량 분포(%)
인슐린 2.8 28 100
h11B6 5.7 15 99.2
M11B6 5.7 17 100
DFO-h11B6 6.0 22 99.9
H11B6-DTPA 6.1 22 100
다분산성 = 반지름의 표준편차/평균 반지름 × 100%
인슐린 컨트롤(4 mg/ml 20 mM Na2HPO4, 10 mM Na3EDTA)은 약 37kDa이며, 2.8nm의 평균 반지름을 갖는다. 용액에서 인슐린은 약 35kDa의 헥사머를 형성하는 것으로 알려져 있다. 5.7nm의 반지름은 완전한 구형상을 갖는 단백질에 대해 약 200kDa의 분자량에 상응한다. 6.1nm의 반지름은 완전한 구형상을 갖는 단백질에 대해 약 230kDa의 분자량에 상응한다. 이는 IgG 분자량에 대해 150kDa의 분자량에 상당히 가까운 것이며, 이는 그 시료의 대부분이 주로 모노머 및/또는 다이머 IgG 분자로 구성됨을 의미한다. 다이머를 배제하지 않은 이유는, 광산란은 분자 형태에 기초하여 대략적인 크기 추정을 제공하며, 이는 모노머와 다이머를 분리하기 어렵게 만들지만 (인슐린 경우에서와 같이) 모노머로부터 큰 집합체 또는 헥사머로부터 모노머를 분리하기는 쉽기 때문이다.
결론
동적 광산란은 모든 구조체들이 상당한 크기를 가지며, 집합체를 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않음을 보여준다. 4개의 모든 구조체들에 대한 크기 분포는 중복되어 있다(데이터로는 나타내지 않음).
실시예 6 - h11B6의 특성화: 생체 내 생체분포(in vivo biodistribution)
본 시험은 177Lu로 표지된 경우에 뮤린 11B6 및 인간 11B6의 생체 내 생체분포를 비교한다.
재료 및 방법
재료
177Lu는 Mallinkrodt Medical BV, Petten(네덜란드)로부터 구입하였다.
(달리 표기하지 않는 한) 모든 화학물질은 Sigma Aldrich로부터 구입하였으며, 버퍼는 분석등급수를 이용하여 인-하우스에서 제조하였다.
인간 칼리크레인 2에 대해 특이적인 모 뮤린 항체 m11B6을 터쿠 대학교(핀란드)로부터 획득하였다.
m11B6 중쇄[SEQ ID NO: 23]:
m11B6 경쇄[SEQ ID NO: 24]:
대응되는 인간화된 항체, h11B6은 상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 제조되었다(도 1 참조).
생체 내 시험을 위해, hK2를 발현하는(ATCC, Manassas, VA, USA) 그리고 DU145를 발현하는(ATCC, Manassas, VA, USA) 전립선 암종 세포주 LNCaP가 사용되었다. 세포들을 10% 소태아혈청 및 PEST(페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 세포들을 5% CO2, 가습 배양기 내에 37℃로 유지하고, 트립신-EDTA 용액(버퍼에 용해된 0.25% 트립신, 0.02% EDTA, Thermo Scientific)으로 떼어내었다. LNCaP 세포들을 이종이식(xenografting)할 때에, BD-biosciences(San-Jose, California, USA)로부터 구입한 Matrigel 매트릭스가 사용되었다. NMRI-Nu(Charles River) 및 Balb/c-Nu(사내 브랜드) 마우스에 상기 두 세포주를 접종하였다.
컨주게이션 및 방사성표지
CHX-A"-DTPA와 11B6의 컨주게이션: PBS에 담긴 뮤린 및 인간화된 11B6 mAbs의 용액을 0.07M 소듐 보레이트 버퍼를 이용하여 pH 9.2로 조절한 다음, Amicon Ultra-2 원심분리 필터(2 ml, 100 K)로 농축하였다. 그 다음, 그 결과물인 단백질 용액을 40℃에서 킬레이터 대 항체, 3:1의 몰비로 킬레이터 CHX-A"-DTPA(Macrocyclics, USA)와 컨주게이트하였다. 4시간 후에 반응을 종료하고, CHX-A"-DTPA-11B6(DTPA-11B6)를 20ml의 0.2M 암모늄 아세테이트 버퍼, pH 5.5로 평형화된 NAP-5 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 유리 킬레이트로부터 분리하였다. 컨주게이트된 11B6 항체를 1ml의 암모늄 아세테이트 버퍼로 용출하였다.
DTPA-11B6의 방사성표지: 암모늄 아세테이트 버퍼 pH 5.5에 담긴 뮤린 및 인간화된 DTPA-11B6을 미리 정해진 양의 177LuCl3와 혼합하였다. 생체 내 생체분포(in vivo biodistribution)를 위해 대상자당 0.5-0.6 MBq의 최종 활성이 사용되거나, 또는 SPECT 시험을 위해 대상자당 18-20 MBq의 최종 활성이 사용되었다. 실온에서 2시간 배양한 후, 표지를 종료하고, PBS로 평형화된 NAP-5 컬럼 상에서 정제하였다.
동물 시험
동물 실험은 실험실 동물 보호에 대한 국가적 법률에 따라 수행하였다.
수컷의 면역결핍 누드 마우스, NMRI-Nu(6-8주령) 및 Balb/c-Nu를 본 시험에 사용하였다. 모든 마우스들은 LNCaP 세포 또는 DU145로, 이들의 좌측 또는 우측 옆구리에 100μl 성장 배지 및 100μl 매트리겔(Matrigel)에 함유된 8만 내지 1천만 세포로 이종이식되었다.
생체 내 생체분포(in vivo biodistribution) 시험
생체 내 생체분포 시험은 h11B6 및 m11B6 모두에서 수행하였다.
6개 그룹(n=4)의 마우스들에게 177Lu로 표지된 20μg의 h11B6 또는 20μg의 m11B6을 정맥주사하였다. 동물들을 24h p.i., 48h p.i. 및 72h p.i.에서 희생시키고, 관심있는 기관들을 3-인치 Nal(TI) 검출기가 장착된 자동화 Nal(TI) 웰-카운터(1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finland)로 분석하였다.
조직 그램당 주입된 투여량 퍼센트로 표기된, 조직 흡수값(tissue uptake value)은 다음과 같이 산출되었다:
%IA/g = (조직 방사능/주입된 방사능)/기관 중량 × 100
여기서, iv 주입에 대해:
주입된 방사능 = 컨트롤 주사기 내 평균 방사능 - 사용된 주사기 내 방사능 - 꼬리 내 방사능
또한 기관들은 칭량되어진 다음 절개되었다.
운동역학 데이터
DThe 시간-%ID 곡선은 48시간까지 직선 ID(t) = k * t + m으로 표현된다. 제 2 및 제 3 시점(각각 48, 72h)으로부터의 데이터에 기초하여, 모노익스포넨셜(mono-exponential) 곡선(ID(t) = ID(0)e-λt)이 시간 간격[48,∞]에 대해 적용된다. 하지만, 만일 람다가 음값이 되는 경우에, 즉, ID가 48시간과 72시간 사이에 증가하는 경우에, 이 시간-간격에 있는 시간 ID 곡선이 대신에 직선으로 모델링되며, 그리고 그 약제는 72시간 및 그 이후에 얻어진 기관에서 유지된 것으로 추정된다. 시간-활성 곡선을 얻기 위해, 물리적 반감기가 적용된다.
주의 - 일부 도면에서, ID는 "IA"로 표현되며; 이러한 표현은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
결과
인간화된 177Lu-11B6의 생체분포
177Lu-h11B6의 생체분포를 도 5에 나타내었다.
항체는 24시간 내에 LNCaP 종양에 급속히 축적되고, 방사능은 72시간에 높게 유지된다.
초기에, 또한 높은 수준의 h11B6이 혈액 및 신장에서 분명하였으며, 이는 항체가 몸에서 없어짐에 따라 후속 48시간의 기간에 걸쳐 감소하였다. 이러한 생물동력학은 어느 방사성표지된 항체의 정맥 내 주사의 필연적이며 예측된 결과이다.
뼈 및 근육과 같은 다른 모든 기관은 낮은 수준의 방사성을 나타내었다.
이러한 데이터는 177Lu-h11B6이 생체 내에서 전립선암 세포들을 효과적으로 표적할 수 있음을 입증한다.
도 6은 예시적인 SPECT 이미지를 나타내며, 여기서 이종이식된 마우스 내에서 LNCap 종양 세포에 대한 177Lu-h11B6의 바인딩은 명확히 입증된다.
177 Lu-h11B6은 예기치 않게 보다 우수한 치료율을 나타낸다.
인간화된 177Lu-11B6에 대한 생체분포와 모(parent) 뮤린 항체(177Lu-m11B6)에 대한 생체분포의 비교는 예기치 않으며 유리한 차이를 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 177Lu-h11B6의 LNCap 종양 내로의 흡수는 주사 후 72시간에 177Lu-m11B6에 비해 약 20% 증가하였다. 부수적으로, 177Lu-h11B6의 건강한 뼈 내로의 흡수는 주사 후 72시간에 177Lu-m11B6에 비해 약 40% 감소하였다.
도 8은 주사 후 24, 48 및 72시간에서 종양 대 건강한 뼈에서의 항체 흡수율로 나타낸 데이터를 보여준다.
72시간까지, 이 비율은 인간화된 11B6 항체에 대해 현저히 증가하였다.
선량 측정 산출
흡수 선량의 산출은 모 뮤린 11B6 항체의 동역학에 대하여 본 발명의 인간화된 항체의 동역학의 차이의 보다 정교한 측정을 제공한다.
흡수 선량은 MIRD-스키마 에 따라 산출되었으며, 여기서 는 공급 기관에서 총 붕괴수이며, 그리고 S는 붕괴단위당 흡수 선량이다(Bolch 등, 2009, J. Nucl. Med. 50:477-484, 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 는 시간-활성 곡선에 걸친 시간-간격으로 산출되었다. S-인자는 모비-팬텀(Moby-phantom)을 사용하여 마우스-특이적 몬테 카를로 시뮬레이션(Monte Carlo simulation)에 기초하였다(Larsson 등, 2011, Acta Oncol. 50:973-980 및 Keenan 등, 2010, J. Nucl. Med. 50:471-476 참조). 총 흡수 선량을 구하기 위해, 모든 기관들은 공급원뿐만 아니라 표적 공급원에 존재하는 것으로 간주되었다.
다양한 조직들에 대해 산출된 흡수 선량값을 표 6에 나타내었다.
표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 종양 흡수 선량은 m11B6에 대해 1.21 Gy/MBq에서 h11B6에 대해 2.2 Gy/MBq로 증가하였다. 즉, 80% 증가하였다. 종양 대 골수 흡수 선량의 비율은 m11B6에 대해 3.9에서 h11B6에 대해 5.6으로 약 40% 증가하였다. 여기서, m11B6과 비교하여 h11B6에 대해 증가된 치료 효능이 나타났으며, 이는 종양에 대해 더 높은 흡수 선량이 보다 적은 일반 기관 독성으로 주어질 수 있음을 나타낸다.
혈액으로부터 항체 클리어런스
인간화된 및 뮤린 11B6 항체에 대한 혈액 수준의 분석을 도 10에 나타내었다.
그 결과는 h11B6가 뮤린 11B6 항체보다 약간 더 빠르게 혈액으로부터 없어질 수 있음을 제시한다. 그렇다면, 인간화된 항체에 대해 이렇게 증가된 클리어런스 속도는 안전성 관점에서 치료적 이득이 될 수 있으며, 잠재적으로 보다 높은 활성이 투여되도록 할 수 있다.
증가된 클리어런스 속도는 또한 외부 이미지에 유익할 수 있다.
결론
본 시험의 결과는 다음과 같은 사항들을 입증한다:
인간화된 11B6 항체, 177Lu-h11B6는 생체 내에서 전립선 종양을 효과적으로 표적하며;
인간화된 11B6 항체는 (종양에서의 흡수 대 건강한 뼈에서의 흡수의 비율로 측정된 바와 같이) 이의 뮤린 항체보다 예기치 않게 더 우수한 치료율을 나타내며; 그리고
인간화된 11B6 항체는 뮤린 11B6 항체보다 약간 더 빠르게 혈액으로부터 없어질 수 있다.
이를 모두 고려하면, 이러한 발견은 전립선암의 치료 (및 진단)시에 인간화된 11B6 항체의 증가된 치료 효능의 강력한 증거를 제공한다.
인간화된 항체 및 뮤린 항체는 동일한 항원(즉, 인간 칼리크레인 2)에 대해 표적하기때문에, (특히 인간화된 항체는 모 뮤린 항체에 비해 표적 hK2 항원에 대해 보다 낮은 친화도를 보이는 것으로 나타난 것을 고려하면(실시예 4 참조)) 종양 대 건강한 골수에서의 흡수율의 산출된 차이는 쉽게 예측되거나 설명될 수 없다.
인간화된 및 뮤린 11B6 항체 사이의 건강한 뼈와 비교한 종양에서의 상대적인 흡수율의 차이는, 이러한 비교가 치료 계수의 측정을 제공하기때문에 상당히 중요한 것이다. (인간화된 11B6 항체에 대해 분명한 바와 같이) 이러한 비율의 보다 높은 값은 보다 우수한 치료 항체를 나타낸다. 특히, 보다 높은 치료 계수는 (상기 인간화된 항체의 건강한 조직 및 기관과의 바인딩은 상기 뮤린 항체에 비해 훨씬 더 낮기때문에) 치료적으로-방사성표지된 h11B6의 보다 높은 흡수 선량이 보다 우수한 치료 효과를 달성하도록 투여될 수 있음을 의미한다. (이는 노이즈 비율에 대하여 보다 낮은 신호에 해당하며, 전이를 포함하여 보다 작은 종양들의 이미징을 가능케 하기 때문에) 이러한 보다 높은 비율은 또한 h11B6이 진단 목적으로 상기 뮤린 항체보다 더 우수할 것임을 나타낸다.
결론적으로, 상기 데이터는 11B6 항체의 인간화가 조기 진단을 위해 증가된 가능성을 제공하며, 전립선암 치료시 예기치 않게 보다 높은 치료 효능을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 7 - 진단 및 치료 효능의 입증
본 시험의 목적은 hk2의 촉매 클레프트 내부의 에피토프를 특이적으로 표적하는 mAB인, 11B6의 전립선압 성장 부위에 특이적으로 고 독성 방사성 핵종을 운반하는 비이클로서의 유용성을 확인하기 위한 것이었다. 이러한 개념 연구의 증거로, 모 뮤린 11B6 항체를 감마선 방출을 또한 이용하는 저 에너지 베타 파티클인 177Lu로 표지하였으며, 이는 SPECT-이미징 수행을 가능케 하였다.
재료 및 방법
재료
177Lu는 Mallinkrodt Medical BV, Petten(네덜란드)로부터 구입하였다. 표지 동역학 및 방사 화학적 순도를 검출하기 위해 CycloneTM Storage Phosphor System 및 OptiQuantTM image analysis software(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 사용하여 ITLC(instant thin layer chromatography, 순간 박층 크로마토그래프법) 스트립(Biodex, US)을 측정하였다. 달리 표기하지 않는 한, 모든 화학물질은 Sigma Aldrich로부터 구입하였으며, 버퍼는 분석등급수를 이용하여 인-하우스에서 제조하였다. mAb 11B6은 인간 칼리크레인 2에 대해, 이러한 항원에 대해서 약 1.2nM의 친화도로 특이적인 항체이다. 도 1 참조(이는 터쿠 대학교(핀란드)로부터 획득하였음). 생체 내 시험을 위해, hK2를 발현하는 전립선 암종 세포주 LNCaP(ATCC, Manassas, VA, USA)가 사용되었다. 세포들을 10% 소태아혈청 및 PEST(페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 세포들을 5% CO2, 가습 배양기 내에 37℃로 유지하고, 트립신-EDTA 용액(버퍼에 용해된 0.25% 트립신, 0.02% EDTA, Thermo Scientific)으로 떼어내었다.
컨주게이션 및 방사성표지
CHX-A"-DTPA와 11B6의 컨주게이션: PBS에 담긴 상기 mAbs의 용액을 0.07M 소듐 보레이트 버퍼를 이용하여 pH 9.2로 조절하였다. 그 시료를 Amicon Ultra-2 원심분리 필터(2 ml, 100 K)로 농축하였다. 그 단백질 용액을 40℃에서 킬레이터 대 항체, 3:1의 몰비로 킬레이터 CHX-A"-DTPA(Macrocyclics, USA)와 컨주게이트하였다. 4시간 후에 반응을 종료하고, CHX-A"-DTPA-11B6(이하, DTPA-11B6으로 칭함)를 20ml의 0.2M 암모늄 아세테이트 버퍼, pH 5.5로 평형화된 NAP-5 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 유리 킬레이트로부터 분리하였다. 컨주게이트된 11B6 항체를 1ml의 암모늄 아세테이트 버퍼로 용출하였다.
DTPA-11B6의 방사성표지: 암모늄 아세테이트 버퍼 pH 5.5에 담긴 DTPA-11B6을 미리 정해진 양의 177LuCl3와 혼합하였다. 실온에서 2시간 배양한 후, 표지를 종료하고, PBS로 평형화된 NAP-5 컬럼 상에서 정제하였다. 표지 효율 및 표지 동역학은 0.2M 시트르산으로 용출된 ITLC 스트립으로 모니터되었다. 이 시스템에서, 방사성표지된 컨주게이트는 본래의 세포주에서 유지되고, 한편 유리 Lu-177은 용매의 앞부분과 함께 이동한다. 방사능 분포는 정량화 소프트웨어로서 Optiquant(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 PhosphorImager system (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)로 측정되었다.
동물 시험
동물 실험은 실험실 동물 보호에 대한 국가적 법률에 따라 수행하였다. 동물 연구는 동물 연구를 위한 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다. Taconic Europe(Bomholt, Denmark)로부터 구입한 수컷 면역결핍 누드 마우스, NMRI(6-8주령)를 본 시험에 사용하였다.
hK2-발현 LNCaP 전립선암세포의 이종이식을 우측 옆구리 및/또는 좌측 옆구리에 주사당 약 10x106 cells로 피하 이식하였다.
LNCaP 종양이 발달된 동물들을 그룹으로 나누고, 치료제 177Lu-DTP-11B6 또는 컨트롤로 주사하였다. 하기 표 7 참조:
동물들 그룹 번호 처리

5마리/그룹

11그룹

총 = 55마리




 1 NaCl(컨트롤)
2 177Lu로 표지된 비특이적 Ab - 저 흡수 선량
3 177Lu로 표지된 비특이적 ab - 고 흡수 선량
4 177Lu 단독 - 저 흡수 선량
5 177Lu 단독 - 고 흡수 선량
6 177Lu-DTPA-m11B6: A/4
7 177Lu-DTPA-m11B6: A/2
8 177Lu-DTPA-m11B6: A
9 177Lu-DTPA-m11B6:2*A
10 177Lu-DTPA-m11B6:3*A
11 m11B6 단독
A = 26.7 MBq
포함된 모든 동물들은 3-4일 간격으로 연속적으로 측정 및 무게를 재었다.
초기에 일부 동물들은 SPECT을 이용한 치료 제제의 국소화의 조사에 대해 177Lu-DTPA-11B6의 저 활성(8MBq)을 가졌다. 그룹 8의 한 마리를 또한 SPECT로 조사하였다. 이러한 동물들은 장기 제거되고 3-인치 Nal(TI) 디텍터가 장착된 자동화 Nal(TI) 웰-카운터(1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finland)를 사용하여 이러한 조직 시료들에서 방사능을 정량화하였다.
골수에 대한 영향을 조사하기 위해, 혈액 시료(10μL)를 정기적으로 취하였다. 혈액 시료를 주사 후 8주간 일주일에 2회 수집하고, WBC 카운트, RBC 카운트 및 혈소판 카운트를 Medonic Cell Analyzer-Vet CA530 Vet(Boule Medical, Stockholm, Sweden)에서 분석하였다. 혈액 샘플링시에, 동물의 무게 및 신체적 컨디션을 모니터하였다. 체중 감소, 일반적 컨디션의 감소 및 혈액학적 독성에 대해 동물을 모니터하여 독성을 평가하였다.
종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다. 길이 l, 폭 w 및 두께 t를 측정하고, 부피를 산출하였다.
치료 계획
90Y 및 177Lu를 이용한 방사 면역 치료를 받은 랫트에서 흡수 선량과 골수에 대한 생물학적 효과의 관계에 기초하여(Larsson 등, 2012, Med. Phys. 39(7):4434-43), 골수에 대한 LD50이 12 Gy의 순서로 존재할 수 있는 것으로 추정될 수 있다. 문헌에서, 랫트 및 마우스의 급성 조사에 대한 LD50은 동일하게 약 9 Gy이다(예, Radiobiology for the radiologist, Hall & Giacca(Eds), 2006, 6th edition 참조).
그 다음, 치료는 골수에 대한 12 Gy의 허용되는 흡수 선량의 추정으로부터 디자인되었다. 그 다음, 선량 측정 산출로부터, 이러한 흡수 선량에 상응하는 활성도를 산출하였다.
이에 상응하는 투여량/활성도가 컨트롤에 대해 사용되었다.
결과
동물 종양 수축
도 11은 마우스 한 마리에서 종양(동물의 옆구리에서 가시적인, 피부 아래의)이 치료 후 부피가 얼마나 감소되는지 보여준다.
방사 면역 치료 결과
도 12는 투여된 활성도를 갖는 시험 그룹 (a) D, (b) 2 x D 및 (c) 컨트롤 그룹(여기서 D = 26.7 MBq)에 대한 결과를 보여준다.
두 처리 그룹 모두에서 종양 부피의 분명한 감소 경향이 있다. 종양 수축의 시작은 177Lu-m11B6의 주사 후 며칠에 이미 나타났다. 컨트롤 그룹에서는 Nal 용액의 주사 후 종양 부피의 증가가 있었다.
도 13 (a)는 활성도 A로 주사된 그룹에서 마우스 한 마리에 대한 결과를 보여준다. 여기서, 177Lu-m11B6의 활성도 A가 투여된 경우에 종양은 1일부터 6일까지 안정되게 성장하였다. 치료 후, 종양 부피의 신속한 저하가 관찰되었다.
SPECT 시험에서(8d pi), 종양 부피는 활성도가 존재할 때까지 나타났다. 도 13 (b) 참조.
결론
예시적인 항체 177Lu-m11B6을 이용한 본 시험은 생체 내에서 전립선암 종양에 대한 hK2-표적 항체의 치료 효과를 분명히 입증한다.
실시예 8 - 전립선암 이종이식에서 본 발명의 예시적인 177 Lu-표지된 인간화된 11B6 항체의 치료 효능
재료 및 방법
항체, 컨주게이션 및 방사성표지
항체: 상기 예시적인 인간화된 모노클로날 항체 11B6(IgG1/카파, HEK 293 세포에서 일시적으로 발현됨)는 SEQ ID NO:12에 따른 중쇄 및 SEQ ID NO:13에 따른 경쇄를 포함하였으며, 이는 Innovagen AB, Lund(PBS pH 7.4에 함유된 1 mg/ml, Lot No. 90476.30)에 의해 제공되었다. 비-특이적 IgG 항체는 아이소타입 컨트롤로서 사용되었다(마우스 혈청으로부터 얻은 IgG 항체, Sigma I-8765).
컨주게이션: 상기 예시적인 h11B6 비-특이적 IgG 컨트롤 항체를 다음과 같이 킬레이터 CHX-A"-DTPA(Macrocyclics, USA)와 컨주게이트하였다: 상기 항체의 용액을 Amicon Ultra-2 원심분리 필터(2 mL, 100 K) 상에서 농축하고, 그 후 0.07 M 소듐 보레이트 버퍼(Sigma Aldrich)를 사용하여 pH 9.2로 조절하였다.
약 3:1(킬레이터 대 항체)의 몰비로 상기 킬레이터 화합물 CHX-A"-DTPA 대 상기 단백질 용액의 커플링을 기존에 기재된 방법(Almqvist 등 참조)과 유사하게 수행하였다. 커플링 효율, 즉 항체당 획득된 킬레이터의 수는 분광측정법(Pippin 등)에 의해 검출될 수 있으나, 본 시험에서는 분석되지 않았다. 그렇지만, 상기 커플링은 상기 단백질에 대한 손상을 피하기 위해 3 킬레이터/항체를 초과하지 않아야 한다. 상기 킬레이터는 상기 단백질에 첨가되고, 그 용액은 부드럽게 쉐이킹하면서 40℃에서 배양되었다.
4시간 후에 반응을 종료하고, DTPA-h11B6으로 칭하여지는 CHX-A"-DTPA-h11B6를 20ml의 0.2M 암모늄 아세테이트 버퍼(Sigma Aldrich), pH 5.5로 평형화된 NAP-5 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 유리 킬레이트로부터 분리하였다. 컨주게이트된 h11B6 항체를 1ml의 암모늄 아세테이트 버퍼로 용출하고, 분액한 시료들을 -20℃에 보관하였다.
상기 IgG 컨트롤 항체의 컨주게이션은 상기와 유사한 방식으로 조절되었다.
방사성표지: 컨주게이트된 h11B6 또는 IgG 컨트롤 항체(전형적으로 0.2M 소듐 아세테이트 버퍼 pH 5.5 내에 함유된 ~1μg/μL의 200-300μL)를 미리 정해진 양(~200-300MBq)의 177LuCl3(IDB Holland)와 혼합하고, 실온에서 1.5-2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 표지를 종료하고, PBS(Thermo Scientific)로 평형화된 NAP-5 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 표지 효율은 인스턴트 박층 크로마토그래피(Biodex, USA)로 모니터하고, 0.2M 시트르산(Sigma Aldrich)으로 용출하였다. 이 시스템에서, 방사성표지된 컨주게이트는 본래의 세포주에 유지되고, 한편 유리 177Lu는 용매의 앞으로 이동한다. 방사능 분포는 정량화 소프트웨어로서 Optiquant를 이용하여 Cyclone Storage Phosphor System으로 측정하였다(두 가지 모두 Perkin Elmer사의 것임).
상기 IgG 컨트롤 항체의 방사성표지는 상기와 유사한 방식으로 수행되었다.
치료 시험
세포주: LNCaP(hK2+)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 구입하였다. 세포들은 10% 소태아혈청(Thermo Scientific), 페니실린 100 IU/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL(Thermo Scientific)이 보충된 RPMI 1640 배지(Thermo Scientific)에서 배양되었다. 상기 세포들을 5% CO2, 가습 배양기 내에 37℃로 유지하고, 트립신-EDTA 용액(Thermo Scientific)으로 떼어내었다.
모든 동물 실험은 실험실 동물 보호에 대한 국가적 법률 및 동물 연구를 위한 지방 윤리 위원회의 승인에 따라 수행하였다(Lund University, Sweden). 인-하우스 브레드 수컷 면역결핍 Balb/c 누드 마우스(6-8주령)를 사용하였다. 마우스들은 100μL 성장 배지 및 100μL Matrigel(BD MatrigelTM　 Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, Phenol Red Free, Cat No 356231)에 함유된 s.c. 주사(8백만 내지 1천만 세포)에 의해 이들의 우측 옆구리에 LNCaP 세포들로 이종이식되었다. 적어도 ~3mm 직경의 확립된 종양을 가진 마우스가 본 시험에 포함되었으며, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 3 그룹으로 나누었다. 동물들은 꼬리 정맥에 i.v. 주사를 받았다. 20 MBq 활성-수준이 선택되었는데, 그 이유는 이러한 양에서의 투여량이 m11B6을 이용한 시험에 사용되었으며, 우수한 치료 효과를 나타내었기 때문이다(실시예 7 참조).
3 그룹의 동물들이 포함되었다: 한 그룹은 177Lu-h11B6으로 주사받았으며, 또 한 그룹은 (h11B6의 특이성을 보여주기 위해) 177Lu-비특이적 mAb로 주사받았으며, 그리고 다른 한 그룹은 (컨트롤 그룹으로서) NaCl로 주사받았다.
그룹 n 치료 활성(MBq)
1 12 177Lu-h11B6 20
2 10 177Lu-비특이적 mAb 20
3 10 NaCl -
치료 효능은 캘리퍼를 사용하여 종양 크기의 반복된 측정으로 평가되었다. 종양의 길이(L) 및 폭(W)를 측정한 다음 부피 V를 0.5 × L × W × W로서 산출함으로써 종양 부피를 산출하였다.
또한, 어느 잠재적인 혈액학적 독성을 확인하기 위해 그리고 동물들의 일반적인 컨디션을 모니터하기 위해, 혈액학적 측정(백혈구 세포수, 적혈구 세포수, 혈소판수 및 헤모글로빈수) 및 중량 측정을 모든 동물들에 대해 반복적으로 취하였다. 혈액학적 독성은, 특히 방사성면역치료 평가시 모니터하는데 중요한데, 그 이유는 방사능이 혈액 내에 분포될 것이며, 그리고 결국 혈액 줄기세포가 위치하는 골수에 도달할 것이기 때문이다.
길이/폭이 14mm를 초과하거나, 또는 초기 중량에 비해 중량 감소가 15%를 초과하는 종양이 발달되거나, 또는 부정적으로 영향을 받은 일반적인 컨디션을 가지거나, 또는 이들 3가지 파라미터 모두의 조합을 가진, 마우스들은 윤리적 가이드라인에 따라 종료되었다.
결과
치료 효능의 평가
도 14(a)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 예시적인 인간화된 11B6 항체(177Lu-h11B6)의 투여는 마우스에서 종양 성장을 억제하였다(그리고 전체는 아니지만 시험된 동물 중 한 마리에서 종양 부피의 두드러진 감소를 일으켰다.). 이와 상반적으로, IgG 컨트롤 항체(도 14b 참조) 또는 NaCl(도 14c 참조)로 처리된 마우스에서는 종양이 계속해서 빨리 성장하였다.
도 14에 나타낸 각 동물들로부터 얻어진 데이터를 도 15에 카플란-마이어 곡선의 형태로 요약하였다. 177Lu-h11B6의 투여는 실험 기간에 걸쳐 마우스의 생존율에 있어서 현저한 증가를 나타내었으며, (두 컨트롤 그룹에서의 0% 생존율에 비해) 동물들의 80% 이상이 주사 후 실험 60일의 종료시 여전히 살아있었다.
혈액학적 독성의 평가
백혈구 세포수, 적혈구 세포수, 혈소판수, 헤모글로빈수 및 중량의 평가는 177Lu-h11B6의 투여의 어느 독성 효과를 나타내지 않았다(데이터로 나타내지 않음).
디스커션
본 시험의 결과는 전립선암 이종이식 모델에서 177Lu-h11B6 처리의 현저한 치료 효과를 나타낸다.
상기 미코(mico)에 투여된 활성은 골수에 대해 약 10 Gy의 흡수 선량에 상응하는 것이며, 이는 이러한 동물들에 의해 잘 용인되었다. 20 MBq의 이러한 낮은 활성에서도, 큰 치료 효과가 관찰되었다. 앞서 평가된 바와 같이, 적어도 60 Gy의 종양 흡수 선량이 예측될 수 있다.
혈액학적 독성의 징후는 관찰되지 않았다.
참고문헌
실시예 9 - 방사성핵종 치료 선량 측정 계획 및 환자에게서 전림선암의 치료
방사성핵종 치료(RNT)를 위해, 방사선 공급원은 전체적으로 분포되며, 방사능은 일반적으로 방사성 의약품으로서 전신성으로 투여된다. 방사능 분포는 여러 조직들에서 시간 경과에 따라 축적되는 방서성 의약품의 양에 따라 달라지며, 일부는 환자들 간에 차이가 있다(1).
RNT 치료는 미리 정해진 흡수 선량에 기초하여야 한다(2). 그 다음, 첫 번째 치료는 추적자량(tracer amount)의 방사성 의약품을 사용하여 예비-치료 시험을 수행해야 하고, 그리고 종양 및 기관 흡수 선량을 정해야 한다. 일반적으로, 이러한 정보는 mGy/MBq 유니트로 단위 투여 활성당 기관 흡수 선량을 나타내는 인자, DP T(기관)으로 표현된다.
그 다음, 치료 투여가 유사한 조건하에 주어지면, 이 인자는 주어진 기관, 조직 또는 종양에 미리 정해진 흡수 선량을 운반하도록 투여하는데 필요한 활성을 결정하는데 사용될 수 있다(4,6).
방사성표지된 h11B6 항체를 이용한 전립선암 치료의 경우에, 예비-치료 시험은 111In-h11B6을 이용한 111In 이미징에 기초하여야 한다. 177Lu가 치료 방사성핵종인 경우에 111In은 정량적(평면/SPECT) 이미징에 가장 적합하다. 그 다음, DP T(기관)이 정해지면, 치료는 소정의 치료 효과를 제공하는 치료 활성 AT로 주어질 수 있다. 치료 중에, 활성 분포 및 이에 상응하는 투여 속도는 치료 평가에 필요한 종양 및 정상 기관에 주어진 실제 치료 흡수 선량을 얻기 위한 이미징에 기초하여 산출되어야 한다.
치료 계획의 결과로서 골수 독성 수준에 이르고, 골수 지원이 필요하며 또한 골수강에 대한 선량 측정에 기초한 치료의 경우에, 줄기 세포의 재주입을 위한 시간을 결정해야 한다.
요약하면, 이에 따라 하기의 치료 스킴이 계획되어야 한다:
예비-치료 선량 측정 시험
1. 111In-표지된 h11B6(200-300 MBq) 주입
2. 혈액 샘플링 - 혈액 및 혈장 내에서 활성 농도를 첫 주에 측정함.
3. 1주에 걸친(7회) 이미징(SPECT/평면)
4. LundaDose 스킴(3)에 기초한 기관 선량 측정
5. 골수(2-3Gy), 신장(20-30Gy) 및 간(12-36Gy)과 같은 방사능 감수성 기관에 대해 특정 흡수 선량으로 제한된 치료 활성을 결정함.
내부-치료(intra-therapy) 선량 측정을 포함하는 치료
1. (예비치료 선량 측정에 기초하여) 투여된 177Lu-표지 h11B6
2. 혈액 샘플링 - 혈액 및 혈장에서의 활성 농도
3. 1주에 걸친 이미징(6회)
4. 기관 선량 측정 ==> 미리 정해진 치료 흡수 선량의 검증
선량 측정에 대한 특정 커멘트
산출된 활성은 시간 경과에 따라 주어진 부위에서 일어나는 붕괴의 수이다. 단위는 Bq s 또는 Bq h이다. 이온화 방사선이 물질을 통과해 이동하는 경우에, 이는 에너지와 상호작용하며 에너지를 디포짓(deposits)한다. 부여된 에너지는 주어진 부피 내에서 모든 에너지 디포짓의 합이다. 흡수 선량은 부여된 평균 에너지와 상기 부피의 질량의 비율이다. 흡수 선량의 단위는 Gray(Gy)이며, 1Gy는 1J/kg과 같다.
다양한 시간에서 조직의 활성값으로부터 산출된 활성은 적분에 의해 검출되어, 평균 흡수 선량이 검출될 수 있다. 활성도 측정은 전-기관 선량 측정을 위한 평면 이미징을 사용하여 이루어진다. 정량 SPECT/CT는 복셀-기반 방법(voxel-based methods)을 사용하여 보다 작은 양에서 선량 측정이 가능하도록 한다.
활성 농도값의 3D 분포로부터, 흡수 선량률 분포가 소위 포인트 도즈 커넬(point dose kernels) 또는 복셀 S값을 사용하여 산출될 수 있으며, 이는 물(또는 뼈)에 위치한 포인트 소스 주변의 에너지 디포지션 패턴을 나타낸다. 이 방법은 몸통(trunk) 내의 연조직과 같이 해부학적 부위가 밀도면에서 균일한 것으로 가정한다. 폐에서와 같이 밀도가 균일하지 않은 신체 부위에 대해서는, 직접 몬테 카를로 산출법(direct Monte Carlo calculation)이 바람직하다. 여기서, SPECT 또는 PET로부터의 활성 분포는 몬테 카를로 선량 산출 코드에 대한 입력으로 사용된다.
참고문헌
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Met 340 345 350 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 355 360 365 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 370 375 380 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 405 410 415 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 420 425 430 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 24 <211> 218 <212> PRT <213> Mus <mouse, genus> <220> <223> m11B6 light chain <400> 24 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile Gln 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Phe Ser Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 195 200 205 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (30)

  1. 인간 칼리크레인-2(human kallikrein-2)(hK2)에 대한 바인딩 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드로서,
    상기 항체 폴리펩타이드는
    (a) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 가변 부위; 및
    (b) SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) 가변 부위
    를 포함하며,
    상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위는 하나 이상의 인간 항체들로부터의 프래임워크(framework) 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 항체 폴리펩타이드는 방사성 동위원소에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 임의로, 상기 방사성 동위원소는 225Ac인, 항체 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 무손상 항체, 또는 Fv 프래그먼트 및 Fab-유사 프래그먼트로 이루어진 군으로부터 선택된 항원-바인딩 프래그먼트를 포함하거나 또는 이로 이루어진 항체 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 폴리펩타이드가 cDNA 분자를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 불변 부위 또는 이의 일부 및/또는 경쇄 불변 부위 또는 이의 일부를 추가로 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입의 중쇄 불변 부위를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, IgG1 서브타입의 중쇄 불변 부위를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄의 CH1, CH2 및/또는 CH3 부위가 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 IgG 중쇄의 CH1, CH2 및/또는 CH3 부위와 각각 100% 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 불변 부위를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3 부위가 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 IgG 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3 부위와 각각 100% 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 불변 부위를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄의 CH1, CH2 및/또는 CH3 부위가 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 IgG 중쇄의 CH1, CH2 및/또는 CH3 부위와 각각 100% 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3 부위가 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 IgG 중쇄의 CH1, CH2 또는 CH3 부위와 각각 100% 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  11. 제4항에 있어서, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 중쇄 불변 부위, 및/또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄 불변 부위를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 중쇄, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체 폴리펩타이드.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 링킹 부분(linking moiety)을 통해 간접적으로 상기 항체 폴리펩타이드에 연결된 것인, 항체 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링킹 부분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 데페록스아민(DFO), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자시클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이터(chelator)인, 항체 폴리펩타이드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO:23의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:24의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교하여 향상된 치료율을 나타내는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 치료율이, 이식된 인간 전립선암 세포를 포함하는 마우스에서 건강한 골에서의 흡수에 대한 종양에서의 흡수의 비로 정의되는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 이식된 인간 전립선암 세포를 포함하는 마우스에서 건강한 골에서의 흡수에 대한 종양에서의 흡수의 비는 상기 항체 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NO:23의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:24의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체의 주사 후 72 시간에 결정되는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  18. 제16항에 있어서, 상기 이식된 인간 전립선암 세포가 LNCaP 세포인, 항체 폴리펩타이드.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 향상된 치료율은 치료율이 적어도 40% 증가한 것으로 정의되는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 치료율이, 이식된 인간 전립선암 세포를 포함하는 마우스에서 건강한 골에서의 흡수에 대한 종양에서의 흡수의 비로 정의되고, 상기 항체 폴리펩타이드의 투여 후 72 시간에서의 치료율은 SEQ ID NO:23의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:24의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체의 투여 후 72 시간에서의 치료율보다 적어도 40% 더 높은 것인, 항체 폴리펩타이드.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 향상된 치료율은, 전립선 암을 가진 환자에게 투여되고 동일한 방사선 및 투여경로에서 비교했을 때, 상기 항체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO:23의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:24의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체에 비해, 골수 흡수된 선량에 대한 종양 흡수된 선량의 비가 더 높은 것으로 정의되는 것인, 항체 폴리펩타이드.
  22. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서, SEQ ID NO:14 및 SEQ ID NO:15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  24. 제1항 또는 제2항에 따른 항체 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는, 전립선암의 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 치료되는 상기 전립선암은 전이성(metastatic) 전립선암 및/또는 거세 저항성(castration-resistant) 전립선암(CRPC)인, 약학 조성물.
  26. 인간 칼리크레인-2(human kallikrein-2)(hK2)에 대한 바인딩 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드로서,
    상기 항체 폴리펩타이드는
    (a) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 가변 부위; 및
    (b) SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) 가변 부위
    를 포함하며,
    상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위는 하나 이상의 인간 항체들로부터의 프래임워크(framework) 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 항체 폴리펩타이드는 킬레이터(chelator)를 통해 225Ac에 연결되고, 임의로 상기 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체인, 항체 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 전립선암의 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 것인 항체 폴리펩타이드.
  28. 제27항에 있어서, 치료되는 상기 전립선암은 전이성(metastatic) 전립선암 및/또는 거세 저항성(castration-resistant) 전립선암(CRPC)인, 항체 폴리펩타이드.
  29. 제26항에 따른 항체 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는, 전립선암의 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 치료되는 상기 전립선암은 전이성(metastatic) 전립선암 및/또는 거세 저항성(castration-resistant) 전립선암(CRPC)인, 약학 조성물.
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